Nr katal

αβχ
Chloramfenikol
ELISA
Nr katal.
CN 1469
1 x 96 testów
7.
Mikropłytki
Bufor rozcieńczającopłuczący (koncentrat)
Konjugat (koncentrat)
Substrat
Bufor Mleczny
Standardy
Roztwór zatrzymujący
reakcję
12 x 8 wgłębień
1 x 32 ml
1 fiolka
1 x 15 ml
1 x 10 ml
6 x 2 ml
1 fiolka
Zasada
Do wgłębień mikropłytek opłaszczonych oczyszczonymi
swoistymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko
chloramfenikolowi dodane zostają badane próbki oraz
znakowany peroksydazą konjugat. Zawarty w próbce
chloramfenikol zostaje związany przez opłaszczające
wgłębienia przeciwciała i powstaje kompleks immunologiczny
[antygen]. [przeciwciało]. [antygen- peroksydaza]. Po
przemyciu płytki zostaje dodany substrat i powstaje barwny
związek kompleksowy. Intensywność powstającego
zabarwienia mieszaniny reakcyjnej jest odwrotnie
proporcjonalna do ilości chloramfenikolu w badanej próbce. Po
zatrzymaniu reakcji roztworem ją zatrzymującym intensywność
zabarwienia w mieszaninie reakcyjnej jest mierzona
spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm (przy
pomiarze bichromatycznym wtórna długość fali – 620 nm).
Badany materiał
Mleko, miód, pasza, tkanki (ryb, tłustych ryb i krewetek),
surowica i mocz.
Przygotowanie do badania tkanek:
Mięśnie (ryb, tłustych ryb i krewetek)
1. Do 3 g tkanki dodać 6 ml octanu etylowego.
2. Homogenizować przez 1 min.
3. Wirować przez 15 min. przy 2000 obrotów na min.
4. Odciągnąć 4 ml górnej fazy, a pozostałą część wysuszyć
w temp. + 70°C.
5. Suchą pozostałość rozpuścić w 2 ml mieszaniny
izooktanu i chloroformu w proporcji 2:3, a następnie
dobrze mieszać przy użyciu vorteksu przez 1 min.
6. Dodać 2 ml rozcieńczonego buforu rozcieńczającopłuczącego i dobrze mieszać przez 2 min.
7. Powstałą emulsję umieścić na 20 minut w temp. 80°C do
momentu powstania warstw, a następnie odwirować
przez10 minut przy 2000 obrotów na min.
Górna faza stanowi materiał do wykonywania oznaczeń przy
użyciu mikropłytek.
Procedura z zastosowaniem tkanek wątroby i nerek:
1. Dodać 3ml buforu octanowego (0,1 M; pH 5) do
3 g tkanki.
2. Dodać 8000 U β-glukoronidazy (ze ślimaka winniczka Helix pomatia: Sigma G-0876 ) i homogenizować ok. 30
sekund.
3. Inkubować przez 2 godz. w temp. 37°C.
4. Dodać 12 ml octanu etylowego i homogenizować przez 1
minutę.
5. Wirować przez 15 min. przy 2000 obrotów na min.
6. Odciągnąć 1 ml górnej fazy, a pozostałą część wysuszyć
w temp. + 70°C.
Suchą pozostałość rozpuścić w 2 ml mieszaniny
izooktanu i chloroformu w proporcji 2:3, a następnie
dobrze mieszać przy użyciu vorteksu przez 1 min.
8. Dodać 1 ml rozcieńczonego buforu rozcieńczającopłuczącego dobrze mieszać przez 2 min.
9. Powstałą emulsję umieścić na 20 minut w temp. 80°C do
momentu powstania warstw, a następnie odwirować
przez10 minut przy 2000 obrotów na min.
Górna faza stanowi materiał do wykonywania oznaczeń przy
użyciu mikropłytek.
Procedura z zastosowaniem próbek paszy:
1. Do 3 g paszy dodać 6 ml octanu etylowego.
2. Homogenizować przez 1 min.
3. Wirować przez 15 min. przy 2000 obrotów na min.
4. Odciągnąć 2 ml górnej fazy, a pozostałą część wysuszyć
w temp. + 70°C.
5. Suchą pozostałość rozpuścić w 1 ml mieszaniny
izooktanu i chloroformu w proporcji 2:3, a następnie
dobrze mieszać przy użyciu vorteksu przez 1 min.
6. Dodać 1 ml rozcieńczonego buforu rozcieńczającopłuczącego i dobrze mieszać przy użyciu vorteksu przez 2
min.
7. Powstałą emulsję umieścić na 20 minut w temp. 80°C do
momentu powstania warstw, a następnie odwirować przez
10 minut przy 2000 obrotów na min.
Górna faza stanowi materiał do wykonywania oznaczeń przy
użyciu mikropłytek.
Procedura z zastosowaniem próbek mleka:
1. Mleko chude można bezpośrednio użyć do badania.
2. Mleko półchude i pełnotłuszczowe należy odwirować
przez 15 minut przy 2000 obrotów/min, a następnie
usunąć warstwę tłuszczową.
Uzyskany w ten sposób materiał można odmierzać do
wgłębień płytki.
Przygotowanie moczu:
1. Mocz należy wirować przez 10 minut przy 2500
obrotów na min.
2. Próbkę moczu należy rozcieńczyć 5- krotnie
rozcieńczonym buforem rozcieńczająco-płuczącym
np. 100 μl moczu + 0,4 ml buforu. Wymieszać.
Uzyskany w ten sposób materiał można odmierzać do
wgłębień płytki.
Przygotowanie surowicy:
1. Surowicę rozcieńczyć 10-krotnie w rozcieńczonym
buforze rozcieńczająco-płuczącym, np. 50 μl surowicy
+ 0,45 ml buforu. Wymieszać.
Uzyskany w ten sposób materiał można odmierzać do
wgłębień płytki.
Procedura z zastosowaniem próbek miodu:
Szybka procedura skriningowa
1. Do 1 g miodu dodać 9 ml rozcieńczonego buforu
rozcieńczająco-płuczącego (ogrzanego do temp. 37°C)
2. Mieszać przy pomocy mieszadła obrotowego do chwili
całkowitego rozpuszczenia.
3. Filtrować przez filtr o oczkach 0,2 μm.
Uzyskany w ten sposób materiał można odmierzać do
wgłębień płytki.
RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY
Tel:CRUMLIN (028)94422413 Fax.No.INT.44 (028)94452912 UK (028)94452912
Email: [email protected] Website: www.randox.com
ΑΒΧ
αβχ
Chloramfenikol
ELISA
C18 Procedura ekstrakcyjna
1. 0.5 g miodu rozpuścić w 4 ml 0.05M buforu octanowego,
pH 5.
2. Kolumnę C18 zrównoważyć 5 ml wody podwójnie
destylowanej, 3 ml metanolu i 5 ml podwójnie
destylowanej wody.
3. Nanieść badaną próbkę (szybkość przepływu 4 ml/min).
4. Przemyć 5 mililitrami 0.05M buforu octanowego, pH 5 i
10 mililitrami wody podwójnie destylowanej.
5. Przemyć 3 mililitrami mieszaniny metanolu i wody
podwójnie destylowanej w proporcjach objętościowych
30:70, a następnie odciągnąć z kolumny do wysuszenia.
6. Eluować 8 mililitrami metanolu przy szybkości przepływu
1 ml/min.
7. Zebraną frakcję odparować w temp. 70°C.
8. Ponownie zawiesić w objętości 0.5 ml rozcieńczonego
buforu rozcieńczająco-płuczącego (wstępnie ogrzanego do
temp. 50°C). Mieszać 3 minuty przy użyciu vorteksu.
Postępowanie:
Zalecane jest, aby przed użyciem doprowadzić wszystkie
odczynniki do temperatury pokojowej (+19-25°C).
W celu zminimalizowania tzw. "efektu brzegowego"
spowodowanego wysychaniem zaleca się przykrycie
przylegającą folią uszczelniającą, zapobiegającą
wyparowywaniu odczynników z wgłębień płytki.
Badanie należy przeprowadzić w podwójnych próbkach wg
zaleconego niżej schematu, na którym każde okienko
odpowiada dwóm wgłębieniom-pozycjom.
S1
S2
S3
S4
S5
S6
QC
QC
Przygotowanie i trwałość odczynników roboczych:
Mikropłytki (12 x 8 pasków)
Gotowe do użycia. Przechowywane w temperaturze +2 - 8ºC,
trwałe do daty podanej na opakowaniu. Jeśli potrzebna jest
tylko jedna część płytki, pozostałą część włożyć z powrotem do
foliowego opakowania ze środkiem osuszającym i po usunięciu
z niego pęcherzyków powietrza szczelnie zamknąć.
Bufor rozcieńczająco-płuczący (stęż.)
Rozcieńczyć zawartość butelki z buforem rozcieńczającopłuczącym w 970 ml wody podwójnie destylowanej. Roztwór
jest trwały 30 dni w temp. +2 - 8ºC.
Konjugat (stęż.)
Dostarczony w postaci stężonej. Rozcieńczyć rozcieńczonym
buforem rozcieńczająco-płuczącym zgodnie z instrukcją
podaną w załączonej ulotce. Rozcieńczony konjugat użyć
natychmiast. Konjugat należy przechowywać w zaciemnionym
miejscu.
Substrat jednoodczynnikowy
Odczynnik gotowy do użycia. Przechowywany w temperaturze
+2 - 8ºC, trwały do daty podanej na opakowaniu. Nie zawiera
żadnych szkodliwych organicznych rozpuszczalników.
Bufor Mleczny
Zawartość jednej fiolki buforu mlecznego rekonstytuować
w 10 ml podwójnie destylowanej wody. Przechowywać 2 dni
w temperaturze +2 - 8ºC.
Standardy
Gotowe do użycia. Przechowywane w temperaturze +2 - 8ºC,
trwałe do daty podanej na opakowaniu.
Odczynnik zatrzymujący reakcję
Gotowy do użycia. Przechowywany w temperaturze +2 - 8ºC,
trwały do daty podanej na opakowaniu.
Materiały i aparatura (nie zawarte w zestawie)
β-glukoronidaza (Sigma G-0876)
Oktan etylowy – Czysty do analizy
2,2,4- trójmetylopentan (Izooktan) – Czysty do analizy
Chloroform - Czysty do analizy
Oktan sodowy - Czysty do analizy
czytnik mikropłytek ( 450 nm )
łaźnia wodna lub inkubator o temp. 37°C
pipety od 10 μl do 125 μl
folia uszczelniająca
filtr 0,2 μm
Kolumny C18
Metanol – wysoki stopień rozpuszczalności
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
S1 - S6
QC
T
T9
T10
T11
T12
T13
T14
T15
T16
T17
T18
T19
T20
T21
T22
T23
T24
T25
T26
T27
T28
T29
T30
T31
T32
T33
T34
T35
T36
T37
T38
T39
T40
= Standardy 1 – 6
= Kontrole
= Próbki badane
Procedura oznaczania w tkankach, surowicy, miodzie
i paszy:
a) Odpipetować do odpowiednich wgłębień mikropłytki:
Standard
Próbka badana
Kontrola
Konjugat
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Standard
25 μl
100 μl
Próbka badana
25 μl
100 μl
Kontrola
25 μl
100 μl
Przykryć mikropłytkę folią uszczelniającą.
Delikatnie stukając kilka sekund ręką w płytkę wymieszać
zawartość studzienek, a następnie inkubować 1 godzinę w
temperaturze pokojowej (+20 - 25°C), w zaciemnionym
miejscu.
Po zakończeniu inkubacji odwrócić mikropłytkę i
delikatnie stukając usunąć resztki roztworów z wgłębień.
Rozcieńczonym buforem rozcieńczająco-płuczącym
przemyć sześciokrotnie mikropłytkę w ciągu 10-15 minut
(upewniając się, że każde wgłębienie jest wypełnione). Po
ostatnim myciu obrócić mikropłytkę na bibułę i lekko nią
stukając, dokładnie osuszyć.
Natychmiast do każdego wgłębienia dodać 125 μl
substratu za pomocą wielokanałowej pipety. Zawartość
wgłębień mikropłytki wymieszać delikatnie stukając w jej
boki, a następnie inkubować 20 (±2) minut w ciemnym
pomieszczeniu, w temperaturze +19-25°C.
Zatrzymać reakcję barwną dodając do każdego wgłębienia
po 100 μl odczynnika zatrzymującego reakcję. Zmiana
zabarwienia z niebieskiej na żółtą powinna być wyraźnie
widoczna.
W ciągu 10 minut zmierzyć gęstość optyczną badanych
prób przy dł. fali 450 nm.
RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY
Tel:CRUMLIN (028)94422413 Fax.No.INT.44 (028)94452912 UK (028)94452912
Email: [email protected] Website: www.randox.com
ΑΒΧ
αβχ
Chloramfenikol
ELISA
Procedura oznaczania w mleku:
a)
Odpipetować do odpowiednich studzienek mikropłytki:
Standard
Próbka badana
Kontrola
Bufor mleczny
Rozcieńcz.bufor
rozcienczającopłuczący
Konjugat
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Standard
25 μl
25 μl
Próbka badana
25 μl
-
Kontrola
25 μl
-
-
25 μl
25 μl
75 μl
75 μl
75 μl
Przykryć mikropłytkę folią uszczelniającą.
Delikatnie stukając kilka sekund ręką w płytkę wymieszać
zawartość studzienek, a następnie inkubować 1 godzinę w
temperaturze pokojowej (+20 - 25°C) w zaciemnionym
miejscu.
Po zakończeniu inkubacji odwrócić mikropłytkę i
delikatnie stukając usunąć resztki roztworów z wgłębień.
Rozcieńczonym buforem rozcieńczająco-płuczącym
przemyć sześciokrotnie mikropłytkę w ciągu 10-15 minut
(upewniając się, że każde wgłębienie jest wypełnione). Po
ostatnim myciu obrócić mikropłytkę na bibułę i lekko nią
stukając, dokładnie osuszyć.
Natychmiast do każdego wgłębienia dodać 125 μl
substratu za pomocą wielokanałowej pipety. Zawartość
wgłębień mikropłytki wymieszać delikatnie stukając w jej
boki, a następnie inkubować 20 (±2) minut w ciemnym
pomieszczeniu, w temperaturze 19-25°C.
Zatrzymać reakcję barwną dodając do każdego wgłębienia
po 100 μl odczynnika zatrzymującego reakcję. Zmiana
zabarwienia z niebieskiej na żółtą powinna być wyraźnie
widoczna.
W ciągu 10 minut zmierzyć gęstość optyczną badanych
prób przy dł. fali 450 nm.
Obliczanie wyników
a) Wyliczyć średnią wartość absorbancji z równoległych
pomiarów standardów, surowic badanych i surowic
kontrolnych.
b) Wykreślić krzywą wzorcową odkładając na osi y wartość
absorbancji, a na osi x log 10 ze stężenia standardu.
c) Odczytać z krzywej kalibracyjnej wartości kontroli i prób
badanych.
d) Bezpośrednio z krzywej kalibracyjnej odczytać wartość
stężenia chloramfenikolu w próbce mleka.
e) Aby zamienić wyniki badań dla próbek w mięśniach z
ng/ml na ng/g należy użyć mnożnika 1,2.
f) Aby zamienić wyniki badań dla próbek w wątrobie i
nerkach z ng/ml na ng/g należy użyć mnożnika 4.
g) Dla próbek oznaczanych w moczu wynik otrzymany na
krzywej uwzględniając rozcieńczenie pomnożyć przez 5.
h) Dla próbek oznaczanych w surowicy, wynik otrzymany na
krzywej uwzględniając rozcieńczenie pomnożyć przez 10.
i) Aby zamienić wyniki uzyskane metodą skriningową w
próbkach miodu z ng/ml na ng/g należy użyć mnożnika 10.
j) Dla próbek miodu uzyskanych do badań na kolumienkach
C18 wartość w ng/ml odpowiada wartości w ng/g
k) Dla próbek oznaczanych w paszy wynik otrzymany w ng/ml
odpowiada wartości w ng/g.
Dodatnie wyniki badań należy potwierdzić inną
metodą.
Uwagi
Do użytku diagnostycznego. Nie pipetować ustami. Należy
zachować zwykłe środki ostrożności wymagane przy
obchodzeniu się z odczynnikami laboratoryjnymi.
Bufor diluent/środek płuczący zawiera środki konserwujące.
Unikać kontaktu ze skórą i błonami śluzowymi.
Odczynniki mogą być używane wyłącznie w celu, do którego
są przeznaczone, przez odpowiednio przeszkolony personel
laboratorium w odpowiednich warunkach laboratoryjnych.
Swoistość testu
Zbadano reakcje krzyżowe chloramfenikolu z następującymi
Składniki
% reakcja krzyżowa
Chloramfenikol
100
Glukuronian Chloramfenikolu
100
Chloramfenikol Base
< 0.1
Palmitynian Chloramfenikolu
0.5
Stearynian Chloramfenikolu
0.1
Tiamfenikol
< 0.5
Sulfametazyna
< 0.01
Monensin
< 0.01
Chlortetracyklina
< 0.01
Penicylina
< 0.01
Tylozyna
< 0.01
Avoparcyna
< 0.01
Nitrofurazyna
< 0.01
Nitrofurantyna
< 0.01
Furazolidyna
< 0.01
Ograniczenia czułości:
0.1 ng chloramfenikol/ml mleku
0.1 ng chloramfenikol/g mięśni
1.5 ng chloramfenikol/g wątroby/nerek
0.25 ng chloramfenikol/ml moczu
0.5 ng chloramfenikol/ml surowicy
1.5 ng chloramfenikol/g miodu (szybka metoda skriningowa)
0.1 ng chloramfenikol/g miodu (C18 ekstrakcja)
0.2 ng chloramfenikol/g paszy
RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY
Tel:CRUMLIN (028)94422413 Fax.No.INT.44 (028)94452912 UK (028)94452912
Email: [email protected] Website: www.randox.com
ΑΒΧ