docPraca magisterska - Wydział Biologii UW
download 
Reklamacja Transkrypt
Praca magisterska - Wydział Biologii UW
Praca magisterska Struktura chromatyny rejonu promotorowego genu CTA1 drożdży Saccharomyces cerevisiae Takao Ishikawa Uniwersytet Warszawski 2003 Struktura chromatyny rejonu promotorowego genu CTA1 drożdży Saccharomyces cerevisiae Takao Ishikawa Praca magisterska wykonana pod kierunkiem dr. hab. Jana Fronka Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii, Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski 2003 Serdecznie dziękuję dr. hab. Janowi Fronkowi za opiekę, życzliwość, cierpliwość i zawsze konstruktywne rady mgr Urszuli Bulkowskiej dr Joannie Trzcińskiej-Danielewicz za życzliwość i praktyczne rady Agacie Jacewicz za nieocenioną pomoc w pracy laboratoryjnej wszystkim pracownikom i studentom Zakładu Biologii Molekularnej za stworzenie wspaniałej atmosfery pracy Spis treści 1. Streszczenie...................................................................................................................1 2. Wstęp.........................................................................................................................2 3. Założenia i cel pracy................................................................................................13 4. Materiały i metody...................................................................................................14 Informacje ogólne....................................................................................................14 Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane do doświadczeń.....14 Pojemność stosowanych kolb Erlenmeyera i objętość hodowli........................15 Badanie aktywności promotora genu CTA1 za pomocą genu reporterowego.................16 Konstrukcja genu reporterowego oraz wektory.................................................16 Otrzymywanie DNA plazmidowego z bakterii.................................................17 Transformacja S.cerevisiae i selekcja transformantów......................................18 Pożywki użyte do regulacji aktywności genu CTA1.........................................19 Hodowla S.cerevisiae.........................................................................................19 Schemat doświadczenia.....................................................................................21 Sporządzenie ekstraktów...................................................................................22 Oznaczenie poziomu aktywności promotora genu CTA1..................................23 Oznaczanie stężenia białka w otrzymanym ekstrakcie........................23 Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy............................................24 Obliczanie aktywności właściwej β-galaktozydazy............................25 Analiza statystyczna............................................................................26 Badanie struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1.......................................27 Pożywki użyte w części doświadczenia dotyczącej ustalania struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1....................................................28 Hodowla S.cerevisiae.........................................................................................28 Izolacja jąder komórkowych S.cerevisiae i trawienie chromatyny nukleazą z micrococcus i DNazą I.......................................................................................30 Usuwanie komponentów białkowych z preparatu chromatyny i uzyskanie oczyszczonego DNA.........................................................................................33 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym mająca na celu sprawdzenie jakości preparatu............................................................................................................34 Analiza produktów trawienia DNazy I i nukleazy z Micrococcus....................35 Trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI......................................................35 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym preparatów gotowych do przeniesienia na membranę......................................................................................................36 Przenoszenie DNA z żelu agarozowego na membranę.....................................36 Znakowanie sondy do hybrydyzacji..................................................................37 Hybrydyzacja typu Southern.............................................................................38 Autoradiografia..................................................................................................39 5. Wyniki.........................................................................................................................40 Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji............................40 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu.........................................................45 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w fazie stacjonarnej............................................................................46 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu.........................................................47 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w fazie stacjonarnej............................................................................48 Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1..........................51 Ustalenie miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie kontrolnym (MHY501α)...................................................................................53 Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie pip2.........56 Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach adr1 i oaf1 w warunkach represji i derepresji genu CTA1...................................................58 Próba porównania położenia miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach MHY501α, adr1, oaf1 i pip2 w warunkach derepresji genu CTA1..................................................................................................................60 Analiza miejsc nadwrażliwych na DNazę I w szczepie kontrolnym (MHY501α) i szczepie oaf1 w warunkach indukcji genu CTA1............................................61 6. Dyskusja.....................................................................................................................63 Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji..............63 Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1............69 7. Podsumowanie...........................................................................................................72 8. Literatura...................................................................................................................73 1. Streszczenie Gen CTA1 kodujący katalazę A występującą w peroksysomach drożdży Saccharomyces cerevisiae podlega trójpoziomowej regulacji ekspresji zależnej od dostępnego źródła węgla. Ważną rolę w regulacji genu CTA1, a także innych genów peroksysomalnych, odgrywają czynniki transkrypcyjne Oaf1p i Pip2p. Ich rola w indukcji genów peroksysomalnych nie została jednak jednoznacznie wyjaśniona. W derepresji, a prawdopodobnie także w indukcji genu CTA1 bierze również udział czynnik transkrypcyjny Adr1p, regulujący transkrypcję wielu genów podlegających, podobnie jak gen CTA1, represji glukozowej. Badano wpływ wymienionych czynników transkrypcyjnych na ekspresję genu CTA1 śledząc poziom indukcji genu CTA1 przy użyciu wprowadzonej do komórek S.cerevisiae konstrukcji będącej fuzją obszaru promotora genu CTA1 z genem reporterowym, a także analizując strukturę nukleosomową rejonu promotora badanego genu w warunkach represji, derepresji i indukcji. Przeprowadzone badania sugerują, iż istotną rolę w procesie indukcji genu CTA1 pełni czynnik transkrypcyjny Oaf1p, natomiast czynniki transkrypcyjne Pip2p i Adr1p wydają się nie pełnić istotnej roli w indukcji genu CTA1. Uzyskane wyniki wskazują na subtelną reorganizację struktury chromatyny zachodzącą podczas indukcji w rejonie promotora genu CTA1. Nie zaobserwowano natomiast istotnych zmian struktury chromatyny w procesie derepresji genu CTA1. Jak dotąd nie udało się jednoznacznie określić wpływu poszczególnych czynników transkrypcyjnych na strukturę chromatyny rejonu promotora badanego genu. 1 2. Wstęp W każdym organizmie żywym informacja genetyczna zawarta jest w kwasie deoksyrybonukleinowym (DNA). We wszystkich organizmach jest odpowiedzialna za rozmaite procesy życiowe, ponadto w organizmach wielokomórkowych odpowiada ona także za proces rozwojowy, prowadzący do ukształtowania dojrzałego organizmu z zygoty powstałej w wyniku zapłodnienia. Organizmy żyjące dzieli się na prokarionty i eukarionty. Jedną z najważniejszych cech różniących te dwie grupy jest rozmieszczenie DNA w komórce. U prokariontów DNA znajduje się w cytoplazmie, w przeciwieństwie do eukariontów, których materiał genetyczny znajduje się w jądrze komórkowym. Warto tutaj wspomnieć, że komórka eukariotyczna jest tworem wysoce uporządkowanym. Występuje w niej wiele wyspecjalizowanych struktur zbudowanych z błon lipidowych, których funkcje są ściśle zdefiniowane. Można do nich zaliczyć m.in. jądro komórkowe przechowujące materiał genetyczny, siateczkę śródplazmatyczną będącą m.in. miejscem syntezy białek, aparat Golgiego odpowiedzialny za transport i sekrecję odpowiednich białek i peroksysomy, w których przede wszystkim zachodzą procesy związane z detoksykacją komórki. Funkcje jądra komórkowego nie ograniczają się do fizycznej izolacji materiału genetycznego. Jest to miejsce, w którym przebiega transkrypcja oraz różne procesy prowadzące do powstania ostatecznej cząsteczki mRNA transportowanej następnie do cytoplazmy, gdzie zachodzi translacja. Fakt, że istnieje bariera oddzielająca materiał genetyczny wprowadza dodatkowy etap umożliwiający regulację wyrażania informacji genetycznej. 2 DNA w jądrze komórki eukariotycznej występuje w skondensowanej formie związany z silnie konserwowanymi ewolucyjnie białkami histonowymi, tworząc chromatynę. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom, zbudowany z oktameru histonowego składającego się z histonów H2A, H2B, H3 i H4 oraz fragmentu DNA o długości 146pz [1, 2]. Taki kompleks DNA i białek histonowych kondensując dalej tworzy tzw. włókno 30nm będące kolejnym stopniem upakowania materiału genetycznego. Włókna 30nm uważa się za najczęściej występującą formę chromatyny w jądrze niedzielącej się komórki. Warto przy tym wspomnieć, że w procesie kondensowania chromatyny bierze udział również histon H1, który wiąże się z DNA łączącym poszczególne nukleosomy [3]. W dzielących się komórkach dalsza kondensacja chromatyny ostatecznie prowadzi do powstania chromosomów metafazowych będących najsilniej skondensowaną formą materiału genetycznego. Histony H2A, H2B, H3 i H4 wchodzące w skład rdzenia nukleosomu mają identyczny schemat budowy charakteryzujący się silnie zasadową częścią rdzeniową tych białek oraz ogonami nie przyjmującymi konkretnych struktur przestrzennych. Domena rdzeniowa histonów, ze względu na swoje właściwości fizyczne, bardzo efektywnie oddziałuje z DNA umożliwiając wspomnianą wcześniej jego kondensację [4]. Część ogonowa histonów ulega różnym modyfikacjom posttranslacyjnym: acetylacji [5], fosforylacji [6], metylacji [7] i ubikwitynylacji [8, 9]. Uważa się, że enzymy modyfikujące reszty aminokwasowe tego rejonu mają ułatwiony dostęp dzięki brakowi zwartych i zdefiniowanych struktur przestrzennych. Modyfikacje posttranslacyjne ogonów histonowych pełnią istotną rolę w regulacji stopnia kondensacji chromatyny. Acetylacja powoduje obniżenie ładunku pozytywnego histonów i osłabia oddziaływanie DNA z tymi białkami, a w konsekwencji powoduje 3 rozluźnienie struktury chromatyny [10]. Jednak modyfikacje te nie służą jedynie regulacji struktury chromatyny. Hipoteza kodu histonowego zakłada, że pewne kombinacje modyfikacji posttranslacyjnych mogą powodować selektywną indukcję lub represję niektórych obszarów genoforu [11]. Niewątpliwie formowanie chromatyny służy kondensacji DNA, ale jej funkcje, jak wcześniej wspomniano, nie ograniczają się jedynie do fizycznego zmniejszenia długości nici DNA. Dzięki badaniom prowadzonym w ciągu ostatnich kilkunastu lat okazało się, że chromatyna pełni także funkcje regulujące transkrypcję genów, ponadto bierze ona udział w wielu procesach komórkowych związanych z DNA, takich jak naprawa czy rekombinacja [12]. Często spotykany w ostatnich latach termin „epigenetyka” definiuje się jako „dziedziczne zmiany ekspresji genów niezależne od sekwencji nukleotydowej DNA” [13]. Mechanizmy epigenetycznej regulacji transkrypcji genów uważa się zatem za niezależne w sposób bezpośredni od sekwencji nukleotydowej DNA. Głównymi mechanizmami takiej regulacji transkrypcji genów jest metylacja DNA i posttranslacyjne modyfikacje ogonów histonów powodujące reorganizację struktury chromatyny [14]. Obszary DNA, które uległy metylacji są zwykle nieaktywne transkrypcyjnie [13], znajduje to potwierdzenie również w przypadku wyciszenia transkrypcji genów w jednej z kopii chromosomów X u samic ssaków [15]. Metylacja DNA i modyfikacje ogonów histonów są ze sobą powiązane w słabo jak dotąd poznany sposób. Istnieje jednak kilka przykładów wskazujących na związek tych zjawisk. Jednym z nich jest Neurospora crassa. W organizmie tym stwierdzono, iż do metylacji DNA konieczna jest metylacja określonych reszt aminokwasowych w obrębie ogonów histonowych [16]. Istnieje również głęboki związek między metylacją DNA i 4 deacetylacją histonów. Badania wykazały, że metylacja DNA jest znacznikiem rozpoznawanym przez deacetylazy histonów, które przeprowadzają deacetylację ogonów histonów znajdujących się w nukleosomach w danym rejonie [17]. Powoduje to kondensację DNA i ogólną represję transkrypcji genów. Natomiast regulacja transkrypcji genów w drodze reorganizacji struktury chromatyny opiera się, najogólniej rzecz biorąc, na przesuwaniu nukleosomów i modulowaniu dostępności określonych sekwencji promotorowych dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii transkrypcyjnej. W tym przypadku, podobnie jak w przypadku metylacji, stwierdzono głęboki związek z modyfikacjami posttranslacyjnymi ogonów histonowych. Okazało się bowiem, że rekrutacja kompleksów reorganizujących strukturę chromatyny, takich jak Swi/Snf, uzależniona jest od acetylacji ogonów histonowych przeprowadzonej przez acetylazy histonowe [18, 19]. Wszystkie przedstawione przykłady wskazują na to, że mechanizmy epigenetycznej regulacji transkrypcji genów mają silne powiązania. Znanych jest wiele genów, których aktywność transkrypcji regulowana jest przez zmianę rozmieszczenia nukleosomów w rejonie promotorowym. Pod tym względem dokładnie poznano m.in. geny z grupy GAL (białka umożliwiające wykorzystanie galaktozy) [20, 21] i PHO (fosfataza kwaśna oraz białka regulatorowe) [22], gen ADH2 (dehydrogenaza alkoholowa II) [23, 24, 25] i gen TOP1 (topoizomeraza I) [26]. Wszystkie te badania zostały przeprowadzone na drożdżach piekarniczych Saccharomyces cerevisiae. Jest to najprostszy dobrze poznany organizm eukariotyczny, a łatwość manipulacji genetycznych i znajomość pełnej sekwencji nukleotydowej jego genomu czyni go bardzo atrakcyjnym organizmem modelowym do różnych badań. Ponadto posiada on wiele wspólnych cech z wyższymi organizmami eukariotycznymi. Można wśród nich wymienić m.in. ogólne zasady organizacji 5 struktury chromatyny, modyfikacje posttranslacyjne histonów i obecność kompleksów zmieniających strukturę chromatyny w sposób zależny od ATP [27]. Warto jednak pamiętać o szczególnych cechach S.cerevisiae. Genom S.cerevisiae jest niezwykle mały i prawie w całości aktywny transkrypcyjnie, podczas gdy w genomach wyższych organizmów eukariotycznych jedynie niewielka jego część ulega transkrypcyji [28]. Niektóre obszary metabolizmu komórkowego również są nieco odmienne w S.cerevisiae. Przykładem tego może być β-oksydacja, która zachodzi wyłącznie w peroksysomach [29]. To organellum pełni więc istotną rolę w degradacji kwasów tłuszczowych w komórkach drożdżowych, a dzięki temu S.cerevisiae staje się atrakcyjnym organizmem do prowadzenia badań nad tymi procesami. Podobnie jak w przypadku genów z grupy GAL i genu ADH2, geny peroksysomalne są regulowane przez warunki środowiska zewnętrznego. Zarówno dla genów z grupy GAL i genu ADH2, jak i dla genów peroksysomalnch jest nim źródło węgla. Geny z grupy GAL ulegają transkrypcji, gdy w środowisku znajduje się galaktoza [20], natomiast gen ADH2 jest aktywowany przez etanol lub brak glukozy [23]. W obu przypadkach regulacja jest dwupoziomowa (represja i derepresja). Sytuacja staje się bardziej skomplikowana w przypadku genów peroksysomalnych [30]. Kiedy w środowisku jest dostatecznie wysokie stężenie glukozy, która jest dla S.cerevisiae najdogodniejszym źródłem węgla, geny peroksysomalne ulegają represji [31]. Wynika to z faktu, iż w warunkach optymalnych komórka nie przeprowadza biogenezy peroksysomów. Derepresja tych genów jest powodowana obecnością związków niefermentowalnych, takich jak etanol. W stanie derepresji geny te ulegają transkrypcji, ale na bardzo niskim poziomie. Dopiero w środowisku bogatym w kwasy tłuszczowe geny peroksysomalne ulegają pełnej indukcji [32]. Można zatem stwierdzić, że jest to 6 regulacja trójpoziomowa. Geny peroksysomalne można podzielić na dwie grupy: geny kodujące białka odpowiedzialne za proliferację peroksysomów i geny kodujące enzymy katalizujące reakcje chemiczne zachodzące w peroksysomach. W przypadku S.cerevisiae do pierwszej grupy zalicza się około 20 genów PEX [33]. Fakt, iż mutacje genów ortologicznych u człowieka powodują choroby genetyczne, takie jak syndrom Zellwegera [34], wyraźnie wskazuje na to, że są to geny kodujące białka odgrywające istotne role w podstawowym metabolizmie komórki. Do drugiej grupy zalicza się takie geny jak CTA1 (katalaza A) [35], POX1 (oksydaza acyloCoA), ECI1 (izomeraza enoiloCoA), FOX2 (kompleks β-oksydacji) i FOX3 (tiolaza 3-oksoacyloCoA) [36]. Obok enzymów degradujących kwasy tłuszczowe, w peroksysomach występują także enzymy przeprowadzające detoksykację komórki. Wśród nich szczególnie istotną rolę wydaje się pełnić katalaza A kodowana przez gen CTA1, która jest odpowiedzialna za utylizację cząsteczki H2O2 powstającej m.in. w procesie rozkładu kwasów tłuszczowych w peroksysomach. Transkrypcja genu CTA1 jest regulowana nie tylko przez źródło węgla, ale także przez tlen oraz hem [37]. Zarówno hodowla S.cerevisiae w warunkach beztlenowych, jak i brak hemu powodują znaczne obniżenie poziomu mRNA genu katalazy A. Podobny sposób regulacji dotyczy także innych genów, ale w przypadku genu CTA1 obecność hemu nie znosi zahamowania transkrypcji spowodowanego hodowlą w warunkach beztlenowych. Jest to cecha wyróżniająca gen CTA1 spośród innych genów regulowanych przez tlen i hem. Poziom ekspresji genu CTA1 nie zmienia się także pomimo zmiany poziomu Hap1p, czynnika transkrypcyjnego zależnego od hemu [38]. Jest to zaskakujące, ponieważ w rejonie promotorowym genu CTA1 7 stwierdzono obecność sekwencji wykazującej duży stopień podobieństwa do sekwencji wiążącej Hap1p i można było się spodziewać wpływu tego białka na poziom ekspresji genu CTA1 [35]. Wydaje się więc prawdopodobne, że istnieje niepoznany jeszcze mechanizm regulujący transkrypcję genu CTA1 przy udziale tlenu i hemu. Jak wcześniej wspomniano, regulacja transkrypcji genu CTA1 zależna od dostępnego źródła węgla jest trójpoziomowa, a jej mechanizm jest dużo lepiej poznany w porównaniu z mechanizmem regulacji przy udziale tlenu i hemu. Zidentyfikowane zostały sekwencje nukleotydowe w rejonie promotora genu CTA1, z którymi wiążą się odpowiednie białka regulujące transkrypcję tego genu, m.in. Oaf1p, Pip2p i Adr1p. Funkcje niektórych z tych białek nie zostały jednak jednoznacznie określone. Sekwencja nukelotydowa ORE Fragment sekwencji promotora genu CTA1 CGGNNNTNA(N.....9 Konsensus Tab. 2-1 CGGCTTTAACAAATATAAACTCCG - 12)CCG Porównanie sekwencji ORE występującej w rejonie od -209 do -185 promotora genu CTA1 z konsensusem tej sekwencji. Zaadaptowano z [39]. Charakterystyczną sekwencją nukleotydową występującą w rejonie promotorów genów regulowanych przez kwasy tłuszczowe jest ORE (oleate response element) [39]. Sekwencja ta odpowiedzialna jest za wiązanie białek aktywujących transkrypcję wielu genów peroksysomalych, w tym także genu CTA1. W przypadku tego genu, sekwencja ORE występuje w rejonie od -209 do -185 (numerem 1 oznaczono początek sekwencji nukleotydowej kodującej Cta1p) [35]. Tuż obok znajduje się inna istotna sekwencja nukleotydowa biorąca udział w regulacji transkrypcji genu CTA1. Jest to sekwencja UAS1 (upstream activating sequence type 1) 8 występująca w rejonie od -184 do -156 [40]. Jest ona miejscem wiązania białka odpowiedzialnego za derepresję genu CTA1 [32]. Stosunkowo dobrze poznana została rola czynników transkrypcyjnych Oaf1p, Pip2p i Adr1p w regulacji transkrypcji genu CTA1. Pip2p zostało opisane również jako Oaf2p [41]. Porównanie Oaf1p i Pip2p wykazało około 40% homologię sekwencji aminokwasowych, szczególnie wysoką w części N-końcowej tych białek, gdzie znajdują się motywy „palców cynkowych” (Zn2Cys6) odpowiedzialne za wiązanie tych białek z sekwencją ORE [42, 43, 44]. Białka te wydają się wiązać z sekwencją ORE jako heterodimer Oaf1p-Pip2p [43, 45, 46], jednak istnieją badania sugerujące możliwość wiązania się homodimeru (Oaf1p)2 z sekwencją ORE przy braku Pip2p [39, 45]. Niedobór Pip2p może być spowodowany różnicą w ekspresji genów kodujących te białka. W przeciwieństwie do genu OAF1 wyrażanego konstytutywnie, transkrypcja genu PIP2 jest aktywowana przez kwasy tłuszczowe, a w rejonie promotorowym genu PIP2 występuje sekwencja ORE [45]. Niektóre prace sugerują jednak konieczność występowania heterodimeru Oaf1p-Pip2p do indukcji genu CTA1 [43, 45, 46], tak więc mechanizm aktywacji transkrypcji tego genu wymaga dalszych badań. Adr1p jest czynnikiem transkrypcyjnym aktywującym transkrypcję genów związanych z wykorzystywaniem niefermentowalnych źródeł węgla, takich jak etanol, glicerol czy kwasy tłuszczowe, kiedy stężenie glukozy w pożywce jest zbyt niskie [31]. Pod jego kontrolą jest wiele genów kodujących enzymy związane z metabolizmem niefermentowalnych źródeł węgla, w tym gen CTA1 [41]. Adr1p wiąże się z sekwencją UAS1 występującą w rejonie od -184 do -156 genu CTA1 i pełni istotną rolę w derepresji tego genu [32]. Niektóre prace sugerują także udział tego białka w indukcji genu CTA1 [32, 47]. Istnieje jednak praca, która stwierdza brak oddziaływania między 9 Adr1p i sekwencją ORE [32]. Wydają się więc niezbędne dalsze badania mające na celu wyjaśnienie mechanizmu ewentualnej indukcji genu CTA1 przez Adr1p§. ORE -209 CTA 1 UAS1 -185 -184 -156 In du kcja +1 Der epr esja ? Oa f1p P ip2p Adr1p lu b Oa f1p Ryc. 2-1 Oa f1p Schemat rejonu promotora genu CTA1. Zaznaczono istotne sekwencje nukleotydowe biorące udział w regulacji tego genu oraz oddziałujące z nimi białka. Regulacja genów związanych z wykorzystaniem niefermentowalnych źródeł węgla może również być kontrolowana na wyższym poziomie. W procesie tym biorą udział takie białka jak Snf1p i Glc7p [47, 48]. Snf1p jest kinazą białkową działającą wydajnie w warunkach niskiego stężenia glukozy w komórce. Aktywna forma Snf1p fosforyluje wcześniej wspomniany czynnik transkrypcyjny Adr1p i umożliwia jego działanie jako aktywatora transkrypcji genów związanych z wykorzystywaniem niefermentowalnych źródeł węgla. Glc7p zaś jest fosfatazą białkową aktywną w warunkach wysokiego stężenia glukozy w komórce i działając na Adr1p uniemożliwia § W ostatnim czasie stwierdzono, że ekspresja genu PIP2 jest zależna od Adr1p [66]. W sugerowanej przez niektórych autorów indukcji genu CTA1 przez Adr1p może więc pośredniczyć gen PIP2. Nie poznano jednak ewentualnego mechanizmu indukcji genu CTA1 przez Adr1p. 10 jego działanie jako czynnika transkrypcyjnego [48]. Można stwierdzić, że Adr1p pełni rolę swoistego „przełącznika” odpowiednich genów, w tym genu CTA1, włączającego lub wyłączającego transkrypcję w zależności od stężenia glukozy w środowisku zewnętrznym. Istnieje inny, równie ważny mechanizm regulacji transkrypcji genów, który najprawdopodobniej jest zaangażowany także w regulację transkrypcji genu CTA1. Jest nim reorganizacja struktury chromatyny. Czasowe wyłączenie syntezy histonu H4 w specjalnie skonstruowanym szczepie S.cerevisiae spowodowało aktywację transkrypcji ok. 15% genów zawartych w genomie [49]. Jako przyczynę tego zjawiska podano niemożność formowania poprawnej struktury chromatyny spowodowaną brakiem histonu H4, a w konsekwencji ogólne rozluźnienie chromatyny. W ten sposób białka inicjujące transkrypcję genów uzyskują łatwiejszy dostęp do istotnych w tym procesie sekwencji nukleotydowych. Wśród genów, w których nastąpiła aktywacja transkrypcji znajduje się również gen CTA1. Może to świadczyć o tym, że istnieje związek struktury chromatyny i regulacji transkrypcji genu CTA1. Jednak rozluźnienie struktury chromatyny może powodować również zmiany poziomu ekspresji innych genów, których produkty wpływają na transkrypcję genu CTA1, tak więc może to być jedynie efekt pośredni. Dzięki stosunkowo dobrze poznanym wpływom czynników transkrypcyjnych oraz prawdopodobnemu udziałowi struktury chromatyny w regulacji ekspresji genu CTA1, gen ten wydaje się atrakcyjnym modelem do badań nad wpływem struktury chromatyny na ekspresję genów. Pełne poznanie mechanizmów regulacji transkrypcji genów w komórkach S.cerevisiae powinno ułatwić także zrozumienie podobnych procesów w innych organizmach. Dzięki temu możliwe będzie dokładne poznanie 11 mechanizmów rozwoju organizmu, przyczyn wielu chorób, metod ich leczenia i innych zagadnień związanych z wyrażaniem informacji genetycznej. 12 3. Założenia i cel pracy Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 regulowana jest w zależności od dostępnego źródła węgla. Mechanizm ten został dość dobrze poznany, jednak rola niektórych czynników transkrypcyjnych biorących udział w regulacji transkrypcji genu CTA1 nie została jednoznacznie wyjaśniona. Nie została także poznana kinetyka indukcji genu CTA1. Prawdopodobna natomiast jest regulacja aktywności transkrypcji genu CTA1 przez reorganizację struktury chromatyny. Jednak do tej pory nie zostały przeprowadzone badania mające na celu stwierdzenie udziału tego mechanizmu w regulacji transkrypcji genu CTA1. Celem tej pracy było: • Ustalenie wpływu nieobecności czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p na regulację aktywności transkrypcyjnej genu CTA1. • Zbadanie kinetyki indukcji genu CTA1. • Wykazanie udziału reorganizacji struktury chromatyny w regulacji aktywności transkrypcyjnej genu CTA1 oraz wpływu czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p na reorganizację struktury chromatyny. 13 4. Materiały i metody Informacje ogólne Jeżeli nie zaznaczono inaczej, stosowano odczynniki cz.d.a. z firm: Sigma, POCh i Merck. Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane do doświadczeń Symbol szczepu Symbol usuniętej ORF Nazwa usuniętego genu MHY501α Genotyp MATα; his3-∆200; leu2-3; 112 ura3-52 trp1-1 BY4742 MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0 Y10355 oaf1 YAL051w OAF1 BY4739; MATα; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0; YAL051w::kanMX4 Y11660 pip2 YOR363c PIP2 BY4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0; YOR363c::kanMX4 Y13575 adr1 YDR216w ADR1 BY4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0; YDR216w::kanMX4 Wszystkie wyżej wymienione szczepy pochodzą z EUROSCARF (European Saccharomyces cerevisiae archive for functional analysis) z wyjątkiem szczepu MHY501α, który został opisany w [50]. 14 Pojemność stosowanych kolb Erlenmeyera i objętość hodowli Pojemność kolby Objętość hodowli 100ml 25ml 250ml 50ml lub 75ml 2000ml 500ml 15 Badanie aktywności promotora genu CTA1 za pomocą genu reporterowego Badanie aktywności promotora genu CTA1 prowadzono przy użyciu wprowadzonej do komórek S.cervisiae konstrukcji będącej fuzją natywnego obszaru promotora genu CTA1 z genem kodującym β-galaktozydazę. Po sporządzeniu ekstraktu z odpowiednich hodowli S.cerevisiae oznaczano zawartość białka oraz aktywność β-galaktozydazy niżej opisanymi metodami. Obliczona w sposób niżej opisany aktywność właściwa β-galaktozydazy jest pośrednią miarą aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1. Konstrukcja genu reporterowego oraz wektory Doświadczenie prowadzono przy użyciu genu reporterowego będącego fuzją obszaru promotorowego genu CTA1 z S.cerevisiae (sekwencja nukleotydowa od -819 do +3, numerem 1 oznaczono początek sekwencji nukleotydowej kodującej Cta1p) i sekwencji genu lacZ z Escherichia coli kodującej β-galaktozydazę. Ten gen fuzyjny został wprowadzony na wektor episomalny i integracyjny. Wektor episomalny, pochodna plazmidu YEp357 [51], niesie ori 2µ i dzięki temu występuje w komórce w wielu kopiach. Wektor integracyjny zaś występuje w komórce w jednej kopii i jest pochodną plazmidu YIp357, który integruje z genomem w locus URA3 [51]. Oba plazmidy niosą marker uracylowy przydatny w selekcji transformantów drożdżowych, ponadto oba plazmidy są bifunkcyjne, funkcjonują zarówno w komórkach S.cerevisiae 16 jak i E.coli. Plazmidy te zostały zaprojektowane, wykonane i udostępnione przez dr. M. Skonecznego z Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Plazmid episomalny i integracyjny nazwano odpowiednio p149 i p150. Otrzymywanie DNA plazmidowego z bakterii Plazmidy udostępnione przez dr. M. Skonecznego znajdowały się w komórkach E.coli XL-1 Blue MRF’ (∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]). Plazmidowy DNA został wyizolowany metodą lizy alkalicznej [52]. Dodatkowo do buforu, w którym zawieszano bakterie, dodano RNazęA (Sigma) do końcowego stężenia 0,5mg/ml. W celu identyfikacji otrzymanych plazmidów część wyizolowanego preparatu poddano trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI/BamHI i ApaI/BamHI (Fermentas), a następnie przeprowadzono elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym. Uzyskano fragmenty DNA zgodne z oczekiwanymi na podstawie map restrykcyjnych tych plazmidów (elektroforetogramów nie przedstawiono). Plazmid integracyjny został poddany trawieniu endonukleazą restrykcyjną ApaI (Fermentas), której jedyne miejsce rozpoznawane znajduje się w obrębie genu URA3. W ten sposób plazmid integracyjny został przygotowany do transformacji i integracji z genomem S.cerevisiae w locus genu URA3. 17 Transformacja S.cerevisiae i selekcja transformantów W celu wprowadzenia plazmidów p149 i p150 do wszystkich wyżej wymienionych szczepów S.cerevisiae, zastosowano metodę wysokowydajnej transformacji drożdży [53]. S.cerevisiae szczepiono na pożywkę YPD2% (1% ekstrakt drożdżowy, 1% pepton, 2% glukoza) i inkubowano w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc. Po sprawdzeniu gęstości hodowli (liczenie komórek w komorze Bürkera), przeszczepiano odpowiednią objętość hodowli w ten sposób, aby w nowej pożywce YPD2% (obj. 50ml) gęstość hodowli wynosiła 5·106komórek/ml. Prowadzono hodowlę w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) do momentu uzyskania gęstości hodowli 2·107komórek/ml. Hodowlę wirowano następnie przy 3000g przez 5min., płukano wodą i zawieszano w 1,0ml 100mM octanu litu. Po wirowaniu w mikrowirówce i usunięciu supernatantu zawieszano osad komórek w 100mM octanu litu tak, aby objętość końcowa wynosiła 500µl. Do 50µl w ten sposób przygotowanych komórek S.cerevisiae dodawano 350µl buforu do transformacji (240µl PEG3350 (50% w/v), 36µl 1M octanu litu, 15µl ssDNA (10mg/ml), 59µl wody) oraz ok. 1µg DNA plazmidowego. Po dokładnym wymieszaniu mieszaninę inkubowano w 300C przez 30min., a następnie poddawano szokowi cieplnemu w 420C przez 30min. Poprzez wirowanie w mikrowirówce usuwano bufor do transformacji, a osad komórek zawieszano w 300µl wody. Całość zawiesiny komórek wysiewano na szalkę z pożywką ω02% (0,67% YNB (zestaw soli mineralnych i witamin, ang. Yeast Nitrogen Base without Aminoacids, Difco), 2% glukoza) zawierającą odpowiednie uzupełnienia aminokwasów (10-50µg/ml), ale bez uracylu, ponieważ selekcja transformantów opierała się na zniesieniu wymagania uracylu do wzrostu. 18 Pożywki użyte do regulacji aktywności genu CTA1 Represja Derepresja Indukcja ω010% ω0EtOH ω0Kw.Ol. 0,67% YNB 10% glukoza 0,67% YNB 0,5% glukoza 2% etanol 0,67% YNB 0,5% kwas olejowy Hodowla S.cerevisiae Dzień 1 Odpowiedni szczep drożdży S.cerevisiae szczepiono na pożywkę ω02% (obj. 50ml) i hodowano w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc do osiągnięcia wartości OD600=2,5-3,0 (fazy stacjonarnej). Dzień 2 Z hodowli założonej w dniu poprzednim szczepiono do pożywek ω010% (obj. 50ml) i ω0EtOH (dwie hodowle o obj. 75ml), odpowiednio po 100-400µl i 1,0-6,0ml hodowli. Zaszczepione pożywki umieszczano w takich samych warunkach. Hodowle prowadzono przez noc. Dzień 3 Hodowle z poprzedniego dnia prowadzono do momentu osiągnięcia wartości OD600=1,5 (logarytmiczna faza wzrostu) i OD600=2,5 (faza stacjonarna). Po osiągnięciu planowanych wartości OD600, z hodowli prowadzonych w pożywce ω010% sporządzano 19 ekstrakt (w sposób niżej opisany), natomiast dwie identyczne hodowle prowadzone w pożywce ω0EtOH o objętości 75ml w pożywce mieszano ze sobą uzyskując w ten sposób 150ml hodowli. Po rozdzieleniu hodowli na 6 porcji po 25ml, poddawano je wirowaniu (5000g, 2min.), następnie po usunięciu pożywki w sterylnych warunkach przenoszono komórki do pożywki ω0Kw.Ol w porcjach po 25ml. Z jednej z sześciu tak przeszczepionych hodowli sporządzano ekstrakt natychmiast po przeszczepieniu, a pozostałe pięć hodowli umieszczano w 300C i prowadzono hodowlę z wytrząsaniem (250obr./min.) przez 3, 6, 9, 12 i 24 godziny. Po hodowli prowadzonej przez określony czas sporządzano ekstrakt. Hodowle mające na celu indukcję genu CTA1 przeszczepiano po osiągnięciu planowanej wartości OD600 w pożywce ω0EtOH, ponieważ komórki S.cerevisiae nie dzielą się w pożywce ω0Kw.Ol. Opisana procedura oraz schemat hodowli S.cerevisiae (Ryc. 4-1) dotyczą pełnego doświadczenia mającego na celu zbadanie zarówno procesu indukcji, jak i procesu derepresji genu CTA1. W dalszej części pracy zostaną jednak przedstawione wyłącznie wyniki dotyczące procesu indukcji badanego genu. 20 Zaraz po ω02% przeszczep. 50ml ω0Kw.Ol. 6 x 25ml ekstrakt Ekstrakt po ω0EtOH 2 x 75ml hodowli do OD600=1,5 przez 3, 6, 9,12 i 24h Zaraz po przeszczep. ω0EtOH 2 x 75ml ω0Kw.Ol. 6 x 25ml ekstrakt do fazy stac. Ekstrakt po hodowli przez 3, 6, 9,12 i 24h ω010% 50ml ω010% 50ml do OD600=1,5 do fazy stacjonarnej Ekstrakt Ryc. 4-1 Ekstrakt Schemat hodowli S.cerevisiae prowadzonych w celu sporządzania ekstraktów drożdżowych, w których następnie oznaczano aktywność promotora genu CTA1 mierząc aktywność β-galaktozydazy. Linią przerywaną zaznaczono część doświadczenia, której wyniki zostaną przedstawione w dalszej części pracy. 21 Sporządzenie ekstraktów Hodowlę poddawano wirowaniu przy 5000g przez 2min., w 40C. Osad komórek uzyskany w wyniku wirowania zawieszano w 25ml sterylnej wody w celu usunięcia resztek pożywki. Komórki następnie poddawano wirowaniu jak wcześniej, a uzyskany osad komórek zawieszano w 400µl (dla hodowli o obj. 25ml) lub 800µl (dla hodowli o obj. 50ml) 50mM buforu potasowo-fosforanowego (50mM KPi pH7,0). Do zawiesiny dodawano równą objętość szklanych kulek (∅0,45-0,50mm), a następnie zamrażano w -200C. Na tym etapie przechowywano uzyskane komórki od kilku dni do miesiąca. Po rozmrożeniu w temperaturze pokojowej komórki rozbijano przez sześciominutowe wytrząsanie na mikrowstrząsarce typu vortex w temperaturze 40C. W celu usunięcia nierozbitych komórek i reszt ścian komórkowych, uzyskany homogenat poddawano wirowaniu przy 10000g przez 5min. w 40C. Otrzymaną w supernatancie frakcję cytoplazmatyczną wykorzystywano bezpośrednio do oznaczeń stężenia białka oraz aktywności β-galaktozydazy. Stosowane podczas sporządzania ekstraktów szklane kulki płukano przed użyciem w stężonym kwasie solnym. Po ok. 4 godzinach przemywano wodą doprowadzając do pH7, a następnie suszono przez 3 godziny w 1800C. 22 Oznaczenie poziomu aktywności promotora genu CTA1 A. Oznaczanie stężenia białka w otrzymanym ekstrakcie Oznaczanie przeprowadzano metodą Bradford [54], zgodnie z niniejszym schematem. Do oznaczeń używano odczynnika Bradford z firmy Sigma. Próba kontrolna 1ml H2O 1ml odczynnika Bradford Próba oznaczana 990µl H2O + 10µl ekstraktu rozcieńczonego 2x lub 5x w 50mM KPi 1ml odczynnika Bradford Po dodaniu odczynnika Bradford próby pozostawiano na 10min., a następnie oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali 595nm. Rozcieńczenia ekstraktu dobierano tak, aby odczyt spektrofotometryczny mieścił się w przedziale 0,2-0,7. Każdy ekstrakt oznaczano w dwóch powtórzeniach, a stężenie białka w ekstrakcie obliczano na podstawie uśrednionych wartości z dwóch pomiarów. Podstawę obliczeń stężenia białka stanowiła krzywa wzorcowa wykonana przy użyciu roztworu albuminy o stężeniu 1mg/ml. Roztwór ten rozcieńczano wodą tak, aby uzyskać stężenia albuminy 1,67µg/ml, 3,33µg/ml, 5,0µg/ml, 10µg/ml, 15µg/ml i 20µg/ml. Wszystkie wymienione roztwory albuminy oznaczano w dwóch powtórzeniach i odczyty uśredniano, podobnie jak w przypadku oznaczenia stężenia białka w próbach. Dla każdej nowej butelki odczynnika Bradford sporządzano nową krzywą wzorcową. 23 B. Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy prowadzono wg [55] przy użyciu o-nitrofenylogalaktopiranozydu (ONPG). Związek ten rozkładany jest przez β-galaktozydazę na galaktozę i barwny o-nitrofenol. Do 800µl buforu Z (60mM NaH2PO4, 40mM Na2HPO4, 10mM KCl, 1mM MgSO4, pH7,0) dodawano 50µl ekstraktu odpowiednio rozcieńczonego w 50mM KPi. W próbie kontrolnej zamiast ekstraktu dodawano 50mM KPi. Przygotowaną próbkę inkubowano w 300C przez 5min. Następnie dodawano 160µl 0,4% ONPG (substrat do reakcji, rozpuszczony w 50mM Tris-HCl, pH8) i inkubowano w takich samych warunkach, mierząc czas inkubacji, do uzyskania widocznego gołym okiem jasno żółtego zabarwienia. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 400µl 1M węglanu sodu i umieszczano w lodzie. Oznaczanie zawartości o-nitrofenolu prowadzono spektrofotometrycznie przy długości fali 420nm. Oznaczenie aktywności β-galaktozydazy dla każdego ekstraktu prowadzono w dwóch powtórzeniach. Następnie wyniki pomiaru spektrofotometrycznego uśredniano w celu prowadzenia dalszych obliczeń. Czas trwania reakcji wahał się od 3 do 46min., natomiast rozcieńczenia ekstraktów od 1 do 500 razy. Różnice zarówno w czasie reakcji, jak i w rozcieńczeniu ekstraktu wynikają z poziomu aktywności β-galaktozydazy w poszczególnych ekstraktach. Reakcja ta jest liniowa w czasie i w stosunku do rozcieńczeń ekstraktu [56]. 24 C. Obliczanie aktywności właściwej β-galaktozydazy Aktywność właściwą β-galaktozydazy obliczano stosując następujący wzór matematyczny: x= A⋅u ε ⋅l⋅p⋅v⋅t gdzie: x aktywność właściwa β-galaktozydazy [µmol·mg-1·min-1] A wartość absorbancji przy długości fali 420nm u całkowita objętość, w której prowadzono reakcję. W stosowanym układzie doświadczalnym wartość ta wynosiła 1,41 [ml] ε współczynnik absorbancji o-nitrofenolu przy długości fali 420nm. Wartość współczynnika wynosi 0,0045 [µM-1·cm-1] l grubość kuwety. W doświadczeniu używano kuwet o grubości 1 [cm] p stężenie białka w ekstrakcie [mg/ml] v objętość nierozcieńczonego ekstraktu dodana do reakcji [ml] t czas trwania reakcji [min.] 25 Na podstawie otrzymanych wyników dla każdego szczepu, w logarytmicznej fazie wzrostu oraz w fazie stacjonarnej, obliczano względny poziom indukcji promotora genu CTA1, wyrażany następującym wzorem: Akt.Kw.Ol. xh Akt.EtOH (Kw.Ol. 0h) gdzie: Akt.Kw.Ol. xh aktywność β-galaktozydazy po x godzinach hodowli w warunkach indukcji (gdzie x = 3, 6, 9, 12 lub 24 godziny) Akt.EtOH (Kw.Ol. 0h) aktywność β-galaktozydazy w warunkach derepresji (wartości uzyskane dla ekstraktów sporządzanych z komórek tuż po ich przeniesieniu do pożywki ω0Kw.Ol.) D. Analiza statystyczna W celu sprawdzenia istotności statystycznej różnic poziomu indukcji genu CTA1 między szczepem kontrolnym i szczepami badanymi przeprowadzono test sprawdzający równość wariancji oraz dwustronny test t Studenta różnic między średnimi przy różnych wariancjach. W obu testach za próg istotności statystycznej przyjęto wartość p=0,055. 26 Badanie struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1 Przy badaniu struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1 stosowano metodę pośredniego znakowania końców [57, 58, 59]. Wyizolowane jądra komórkowe poddawano trawieniu nukleazą z Micrococcus i DNazą I o różnych stężeniach. Po zakończeniu reakcji odbiałczano DNA i przecinano wyczerpująco odpowiednio dobraną endonukleazą restrykcyjną. Wybrano endonukleazę restrykcyjną, która nie ma miejsca cięcia w obszarze, którego strukturę chromatyny analizowano, ale tnącą DNA w pobliżu tego obszaru. W przypadku genu CTA1 dogodną endonukleazą restrykcyjną jest MboI, która ma miejsce cięcia zarówno po stronie 5', jak i 3' obszaru promotorowego CTA1. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym DNA poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym, przenosi na filtr i po denaturacji hybrydyzuje z krótką, wyznakowaną radioaktywnie sondą o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji zlokalizowanej blisko miejsca działania użytej endonukleazy restrykcyjnej. Z sondą hybrydyzują odcinki DNA o różnej długości, jednak jeden ich koniec jest zawsze ten sam, powstały w wyniku trawienia endonukleazy restrykcyjnej. Natomiast drugi koniec powstaje w wyniku trawienia nukleazą z Micrococcus lub DNazą I. Miejscem działania nukleazy z Micrococcus jest DNA znajdujący się między nukleosomami, nie chroniony przez oktamery histonowe. Zatem długości hybrydyzujących odcinków określają odległość miejsc wrażliwych na użytą nukleazę od miejsca cięcia MboI, a co za tym idzie, rozmieszczenie nukleosomów w badanym rejonie chromatyny. W przypadku działania DNazą I można zidentyfikować tzw. miejsca nadwrażliwe. Są one jednak często w innym miejscu niż miejsca wrażliwe na nukleazę z Micrococcus. Substratem dla DNazy I są miejsca na nici DNA o zmienionej strukturze przestrzennej. DNaza I 27 atakuje miejsca te nawet wtedy, gdy znajdują się one na nukleosomach. Interesujący jest również fakt, iż miejsca te są charakterystyczne dla obszarów promotorowych i często odpowiadają miejscom wiązania czynników transkrypcyjnych [60, 61]. Pożywki użyte w części doświadczenia dotyczącej ustalania struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1 Hodowlę mającą na celu odświeżenie i namnożenie komórek S.cerevisiae prowadzono w pożywce pełnej YPD2%, następnie hodowle przeszczepiano na pożywki zapewniające regulację aktywności promotora genu CTA1. Represja Derepresja Indukcja YPD10% YPDE YPO 1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 10% glukoza 1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 0,5% glukoza 2% etanol 1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 0,5% kwas olejowy Hodowla S.cerevisiae Dzień 1 Odpowiedni szczep drożdży S.cerevisiae szczepiono na pożywkę YPD2% (obj. 25ml) i hodowano w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc do osiągnięcia wartości OD600=9,0-10,0 (fazy stacjonarnej). 28 Dzień 2 Niewielką objętość hodowli (300µl-900µl) założonej poprzedniego dnia szczepiono do trzech kolb z pożywką YPD10% (represja) i sześciu kolb z pożywką YPDE (derepresja i indukcja) o objętości 500ml. Pożywki te uzupełniano streptomycyną i ampicyliną (odpowiednio 40µg/ml i 30µg/ml). Zaszczepione pożywki umieszczano w takich samych warunkach i prowadzono hodowle przez noc. Dzień 3 Hodowlę z poprzedniego dnia prowadzono do momentu osiągnięcia OD600=2,5 (logarytmiczna faza wzrostu). Po osiągnięciu planowanej wartości OD600 hodowle z trzech kolb z jednakową pożywką łączono, a następnie prowadzono izolację jąder komórkowych (represja i derepresja) lub przenoszono do pożywki YPO (indukcja). W tym przypadku poddawano hodowlę wirowaniu przy 3000g przez 5min. w temperaturze pokojowej. Następnie osad komórek przenoszono sterylnie do trzech kolb z pożywką YPO (obj. 500ml). Hodowlę prowadzono w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc. Dzień 4 (dotyczy tylko hodowli prowadzonej w warunkach indukcji genu CTA1) Po trwającej 24 godziny hodowli w pożywce YPO rozpoczynano izolację jąder komórkowych. Hodowlę mającą na celu indukcję genu CTA1 przeszczepiano po osiągnięciu planowanej wartości OD600 w pożywce YPDE, ponieważ komórki S.cerevisiae nie dzielą się w pożywce YPO. 29 Wartości OD600 wskazujące na osiągnięcie przez hodowlę odpowiedniej fazy wzrostu różnią się w zależności od stosowanej pożywki. Przy hodowli prowadzonej w pożywce minimalnej ω0 (stosowana w części dotyczącej oznaczenia aktywności właściwej β-galaktozydazy) wartość OD600=2,5 odpowiada najczęściej fazie stacjonarnej, w pożywce pełnej YPD wartość ta jednak odpowiada logarytmicznej fazie wzrostu. Izolacja jąder komórkowych S.cerevisiae i trawienie chromatyny nukleazą z Micrococcus i DNazą I Izolację jąder przeprowadzano metodą wirowania w gradiencie gęstości fikolu lizatu sferoplastów otrzymanych w wyniku traktowania komórek drożdży zymoliazą [22]. Hodowlę o odpowiedniej wartości OD600 poddawano wirowaniu przy 3000g przez 5min. w temperaturze pokojowej. Osad komórek zawieszano w równej objętości wody* i wirowano w takich samych warunkach. Następnie osad zawieszano w 60ml roztworu 1* (20mM EDTA pH7,4, 0,7M β-merkaptoetanol) i umieszczano w 300C. Po inkubacji trwającej 30min. wirowano zawiesinę komórek przy 3000g przez 5min. w temperaturze pokojowej. Po zawieszeniu osadu komórek w 50ml 1M sorbitolu*, wirowano jak wcześniej. Uzyskany osad komórek zawieszano w 20ml roztworu 2* (1M sorbitol, 5mM β-merkaptoetanol) i przenoszono do kolbki o pojemności 100ml, którą umieszczano w * Symbolem tym oznaczono roztwory, do których dodawano glukozę do stężenia 5% (w/v) w przypadku otrzymywania jąder komórkowych z hodowli prowadzonych w pożywce YPD10%. Dodatek ten służył utrzymaniu stanu represji glukozowej. 30 inkubatorze z wytrząsaniem (300C, 200obr./min.). Następnie dodawano 10-20mg zymoliazy 100T z Arthrobacter luteus (Seikagaku) zawieszonej w 1ml 50mM KPi pH7,5 i prowadzono inkubację przez ok. 35min. Stopień strawienia ściany komórkowej S.cerevisiae oceniano na podstawie obserwacji w mikroskopie świetlnym wykorzystując właściwości sferoplastów (komórek pozbawionych ściany komórkowej), które rozpadają się w wodzie na skutek ciśnienia osmotycznego. Po pobraniu niewielkiej objętości z zawiesiny komórek umieszczano ją w wodzie oraz 1M sorbitolu i porównywano obraz obu zawiesin. Po stwierdzeniu braku sferoplastów w wodzie przystępowano do dalszego etapu procedury. W zależności od stopnia strawienia ściany komórkowej, czas trawienia zymoliazą 100T przedłużano do półtorej godziny prowadząc obserwację mikroskopową co 15min. Procedurę otrzymania jąder komórkowych z S.cerevisiae po uzyskaniu sferoplastów prowadzono w 40C. Sferoplasty wirowano przy 3600g przez 10min., uzyskany osad zawieszano w 15ml 1M sorbitolu*. Zawiesinę poddawano wirowaniu w takich samych warunkach, uzyskując osad sferoplastów gotowych do lizy. Sferoplasty zawieszano w 100ml roztworu do lizy* (18% ficoll 400 (Pharmacia Fine Chemicals), 20mM KPi pH6,8, 0,25mM EGTA, 0,25mM EDTA, 1mM MgCl2, 1mM PMSF) i homogenizowano ręcznie w lodzie przy pomocy homogenizatora typu Pottera-Elvehjema. Homogenat poddawano wirowaniu przy 2500g przez 5min., następnie supernatant przenoszono do nowych probówek i wirowano przy 30000g przez 25min (15749obr./min. w wirówce Beckman J-30I Avanti z rotorem JA30.50Ti). Połowę uzyskanego w ten sposób osadu jąder S. cerevisiae zawieszano w 15ml buforu do DNazyI* (15mM Tris pH7,4, 75mM NaCl, 3mM MgCl2, 0,05mM CaCl2, 1mM β-merkaptoetanol), a drugą połowę w 15ml buforu do nuklezay z Micrococcus* (15mM 31 Tris pH8,0, 50mM NaCl, 1,4mM CaCl2, 0,2mM EGTA, 0,2mM EDTA, 5mM β-merkaptoetanol). Zawiesinę jąder wirowano przy 2500g przez 5min. Osad jąder zawieszano ponownie w 15ml odpowiedniego buforu i wirowano w takich samych warunkach. Uzyskany w ten sposób osad jąder zawieszano w 2ml odpowiedniego buforu. Następnie w celu ustalenia zawartości DNA w otrzymanych preparatach wprowadzano po 5µl zawiesiny jąder do 2ml roztworu do pomiaru stężenia DNA (1% SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, pH7,5). Zawartość DNA w preparatach ustalano spektrofotometrycznie przy długości fali 260nm. W przypadku uzyskania odczytów większych niż A260=240 dla nierozcieńczonych preparatów (A260=0,6 dla preparatu 400 razy rozcieńczonego przy pomiarze) rozcieńczano je odpowiednim buforem do wartości A260=240, natomiast przy odczytach większych niż A260=24 dla nierozcieńczonych preparatów (A260=0,06 dla preparatu 400 razy rozcieńczonego przy pomiarze) rozcieńczano je odpowiednim buforem do wartości A260=24 (procedura ustalona empirycznie przez dr Joannę Trzcińską-Danielewicz). Rozcieńczone preparaty dzielono na 6 porcji i poddawano trawieniu DNazą I (Calbiochem, stężenie końcowe 0,01-2,0U/ml z roztworu 2,2U/µl w wodzie) i nukleazą z Micrococcus (Sigma, stężenie końcowe 0,00033-2,43U/ml z roztworu 0,2U/µl w 50mM Tris-HCl pH8,0, 0,05mM CaCl2, 20% glicerol) w 370C przez 20min. Reakcję zatrzymywano przez dodanie buforu STOP 5x (12,5mM Tris pH7,5, 0,375M NaCl, 37,5mM EDTA, 0,75% SDS) do końcowego stężenia 1x. Do preparatów dodawano proteinazę K (Sigma) do stężenia końcowego 5,0-10µg/ml i inkubowano przez noc w 370C. 32 W stosowanej metodzie bardzo trudno było przewidzieć zawartość DNA w uzyskanym preparacie na podstawie pomiarów wartości A260 oraz wynikających z nich obliczeń, ponieważ zaobserwowano brak zależności liniowej między wartością A260 a zawartością DNA w preparacie. Na podstawie licznych doświadczeń stwierdzono, że przyjęty sposób postępowania zapewnia poprawną ocenę zawartości DNA w preparacie i dlatego stosowano go w celu uzyskania odpowiedniego stężenia DNA. Ponadto dzielono preparaty na 6 porcji, które następnie poddawano działaniu DNazy I lub nukleazy z Micrococcus o różnym stężeniu. Umożliwiało to późniejszy wybór preparatów o odpowiednim stopniu strawienia, które poddawano dalszej analizie. Usuwanie komponentów białkowych z preparatu chromatyny i uzyskanie oczyszczonego DNA Do preparatów po trawieniu proteinazą K dodawano równą objętości fenolu nasyconego 1M Tris-HCl pH8,0. Po energicznym wstrząsaniu wirowano w mikrowirówce w temperaturze pokojowej. Zbierano fazę wodną do nowej probówki. Czynność powtarzano dwukrotnie. Następnie dodawano równą objętości chloroformu i wstrząsano energicznie. Preparat poddawano wirowaniu w mikrowirówce w temperaturze pokojowej, a do zebranej fazy wodnej dodawano RNazę A do końcowego stężenia 50-100µg/ml i inkubowano w 370C przez 2 godziny. Po inkubacji przeprowadzano ekstrakcję DNA dwukrotnie fenolem i chloroformem, w taki sam sposób jak opisano wcześniej. Po ekstrakcji chloroformem dodawano równą objętość izopropanolu i wytrącano DNA w -200C w ciągu 30min. Preparat wirowano przy 33 14500obr./min. w 40C w celu uzyskania osadu wytrąconego DNA. Osad płukano w 200µl 70% etanolu. Po wirowaniu i usunięciu 70% etanolu, osad DNA osuszano przez 15min. DNA rozpuszczano w 100µl wody. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym mająca na celu sprawdzenie jakości preparatu Przygotowywano żel agarozowy o stężeniu 2% w buforze TAE (40mM Tris-octan, 1mM EDTA, pH7,2). Elektroforezie poddawano 5µl każdego preparatu DNA wraz z barwnikiem OrangeG. Elektroforezę w żelu agarozowym o długości 10cm prowadzono przy napięciu 80V przez ok. półtorej godziny do momentu dotarcia barwnika naniesionego wraz z preparatem do końca żelu. Następnie żel przenoszono do roztworu bromku etydyny (0,5µg/ml) na 15min. w celu zabarwienia DNA, który obserwowano na transiluminatorze UV. Fotografię żelu agarozowego wykonywano aparatem fotograficznym Polaroid DS34 z filmem Studio B/W o czułości ISO3000 tej samej firmy (czas ekspozycji 1s, wartość przesłony 4,5). Na podstawie elektroforetogramu wybierano preparaty do dalszej analizy. Odrzucano zarówno preparaty o zbyt niskim, jak i zbyt wysokim stopniu strawienia. 34 Analiza produktów trawienia DNazy I i nukleazy z Micrococcus DNaza I MNaza 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Numer ścieżki elektroforetogramu Nazwa enzymu w próbce (U/ml) 1 0,025 2 0,05 3 4 DNaza I 0,1 0,2 5 0,4 6 0,8 7 0,00033 8 9 10 11 12 Ryc. 4-2 Stężenie enzymu 0,001 Nukleaza z Micrococcus (MNaza) 0,003 0,009 0,027 0,081 Elektroforetogram preparatu DNA uzyskanego ze szczepu pip2 hodowanego w pożywce YPDE, następnie poddanego trawieniu DNazą I i MNazą o różnych stężeniach. Do dalszej analizy wybrano preparaty ze ścieżek 3, 4 i 5 (po trawieniu DNazą I) oraz 8, 9 i 10 (po trawieniu MNazą). Elektroforezie poddawano 1/20 obj. każdej próbki. Trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI Całość wybranego preparatu poddawano trawieniu endonukleazą restrykcyjną MboI (Fermentas) w 370C przez noc. Dodawano 4µl endonukleazy restrykcyjnej MboI (10U/µl) w celu przeprowadzenia wyczerpującego trawienia. Reakcję zatrzymywano, zgodnie z zaleceniami producenta, przez umieszczenie preparatu w 650C na 20min. Następnie wytrącano DNA 96% etanolem w -200C w ciągu 30min. W celu uzyskania osadu DNA, preparat poddawano wirowaniu przy 14500obr./min. w 40C. Osad płukano 35 w 200µl 70% etanolu. Po wirowaniu i usunięciu 70% etanolu, osad DNA osuszano przez 15min. Następnie rozpuszczano DNA w 100µl wody. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym preparatów gotowych do przeniesienia na membranę Przygotowywano żel agarozowy o stężeniu 2% w buforze TAE. Elektroforezie poddawano 15-25µl preparatu DNA wraz z 3-5µl barwnika OrangeG. Do skrajnych kieszonek nanoszono 2µl wskaźnika wielkości (DNA bakteriofaga φX174 poddany trawieniu endonukleazą restrykcyną HaeIII, Fermentas) wraz z 20µl roztworu barwników (60% glicerol, 0,09% błękit bromofenolowy, 0,09% cyjanol ksylenu, 60mM EDTA, Fermentas). Barwniki te migrowały z ruchliwością odpowiadającą odcinkom DNA o długości 300pz i 4000pz. Elektroforezę w żelu o długości ok. 16cm prowadzono przy napięciu 20V przez 18-20 godzin do momentu dotarcia błękitu bromofenolowego do końca żelu. Następnie żel przenoszono do roztworu bromku etydyny na 15min. w celu zabarwienia DNA, który obserwowano na transiluminatorze UV. Fotografię żelu agarozowego wykonywano w sposób opisany wcześniej. Przenoszenie DNA z żelu agarozowego na membranę DNA z żelu agarozowego przenoszono na membranę metodą elektrotransferu. Z żelu odcinano skrajne ścieżki, 1,0-1,5cm części dolnej, a także fragment żelu 36 znajdujący się powyżej studzienek. Następnie wycinano membranę nylonową (Zeta-probe, Amersham) odpowiadającą wymiarom przyciętego żelu agarozowego oraz dwa kawałki bibuły Whatman 3 nieco większe niż żel agarozowy. Wyciętą membranę, bibuły i gąbki z aparatu do elektrotransferu nawilżano w buforze 0,5x TBE (45mM Tris-boran, 1mM EDTA, pH8,0) i usuwano wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie układano poszczególne elementy w następującej kolejności: [katoda] - gąbka - bibuła żel agarozowy (wierzchnią stroną do bibuły) - membrana - bibuła - gąbka - [anoda]. Przy układaniu poszczególnych elementów obficie polewano je buforem 0,5x TBE i rolowano bagietką usuwając w ten sposób pęcherzyki powietrza. Przygotowaną „kanapkę” następnie umieszczano w aparacie do elektrotransferu wypełnionym buforem 0,5x TBE. Procedurę elektrotransferu przeprowadzano przy napięciu 10V przez 18 godzin w 40C. Następnie w celu utrwalenia membrany z DNA umieszczano ją stroną DNA do góry na bibule Whatman 3 nasączonej 0,4M roztworem wodorotlenku sodu. Po 10min. płukano membranę dwukrotnie buforem SSC 2x (0,3M NaCl, 0,03M cytrynian sodu, pH7,0). Wilgotną membranę zawijano w folię spożywczą i przechowywano w -200C. Znakowanie sondy do hybrydyzacji Sondy do hybrydyzacji znakowano radioaktywnie metodą losowych starterów stosując Megaprime DNA Labelling System (Amersham) i fragment Klenowa polimerazy I DNA, zgodnie z instrukcją producenta. Ilość matrycowego DNA sondy, którą poddawano znakowaniu oceniano przeprowadzając elektroforezę w żelu 37 agarozowym. Umieszczano ok. 25ng matrycowego DNA sondy (ilość odpowiadająca dobrze widocznemu prążkowi na elektroforetogramie) wraz z 5µl starterów w probówce typu Eppendorf i przeprowadzano denaturację matrycowego DNA w 1000C w ciągu 5min. Następnie przygotowywano mieszaninę składników pozwalających na znakowanie sondy, dodając po 4µl nieznakowanych dCTP, dGTP i dTTP, 5µl buforu do reakcji, 2U fragmentu Klenowa i 5µl [α-32P]dATP (3000Ci/mmol, Amersham) doprowadzając objętość wodą do 50µl. Reakcję znakowania prowadzono w 370C przez 10min., następnie zatrzymywano przez dodanie 5µl roztworu 0,2M EDTA, 10mg/ml tRNA z E.coli i wytrącano DNA dodając 100µl 96% EtOH, a następnie umieszczając w -200C na 30 min. Preparat poddawano wirowaniu w mikrowirówce (14500obr./min., temp. pokojowa, 10min.). Przed użyciem sondę rozpuszczano w 500µl buforu do hybrydyzacji (patrz niżej) i denaturowano przez podgrzanie do 1000C na 5 min. Używano sondy o sekwencji nukleotydowej całkowicie zgodnej z rejonem od +68 do +366 sekwencji nukleotydowej genu CTA1 (długość sondy wynosi 298pz, numerem 1 oznaczono pierwszy nukleotyd, który ulega translacji). Matrycowy DNA sondy został namnożony metodą PCR przez dr Joannę Trzcińską-Danielewicz. Hybrydyzacja typu Southern Do pojemnika do hybrydyzacji (zakręcane, grubościenne szklane fiolki o pojemności 200ml) wkładano membranę zwiniętą stroną DNA do wewnątrz, a następnie wlewano ok. 15ml buforu do hybrydyzacji o składzie 0,5M bufor sodowo-fosforanowy 38 (NaPi), 7% SDS, 1mM EDTA, pH7,5 i prowadzono prehybrydyzację w 650C przez 1-3 godziny. Następnie do pojemnika wprowadzano całość zdenaturowanej sondy i prowadzono hybrydyzację przez 12-18 godzin w takich samych warunkach. Po hybrydyzacji, dokładnie zlewano bufor do hybrydyzacji wraz z niezwiązaną sondą, a następnie membranę płukano w 650C: • dwa razy po 10min. w 0,2M NaPi, 1% SDS, pH7,5 • dwa razy po 10min. w 0,1M NaPi, 1% SDS, pH7,5 • dwa razy po 5min. w 0,04M NaPi, 0,1% SDS, pH7,5. W zależności od wielkości i liczby filtrów za każdym razem używano od 50 do 150ml roztworu do płukania. Po przeprowadzonych płukaniach sprawdzano sygnał membrany przy użyciu licznika Geigera-Müllera. Autoradiografia Membranę po hybrydyzacji umieszczano w kasecie wraz z filmem rentgenowskim i prowadzono ekspozycję w -700C przez 1-7 dni. Stosowano filmy XS-1N (Foton) oraz BioMax MS (Kodak). W przypadku silnego sygnału (powyżej 50cps) nie stosowano ekranów wzmacniających, natomiast do membran ze słabym sygnałem (poniżej 10cps) używano filmu BioMax MS wraz z ekranem wzmacniającym o tej samej nazwie. W przypadku nieco silniejszego sygnału stosowano ekran wzmacniający Cronex Lightning-Plus (Dupont) wraz z filmem XS-1N. Filmy wywoływano standardową metodą, a następnie fotografowano cyfrowym aparatem fotograficznym Olympus C-200. 39 5. Wyniki 1. Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji Analizę aktywności transkrypcyjnej genu CTA1 prowadzono wykorzystując układ reporterowy będący fuzją promotora genu CTA1 i bakteryjnego genu lacZ kodującego β-galaktozydazę. Konstrukcja została wprowadzona, zarówno do szczepu kontrolnego (BY4742, dzikiego pod względem badanych czynników transkrypcyjnych), jak i do szczepów adr1, oaf1 i pip2, na dwóch plazmidach: episomalnym (występującym w komórce w kilkudziesięciu kopiach) i integracyjnym (występującym w komórce w jednej kopii). Hodowle będące w stanie derepresji genu CTA1 w logarytmicznej fazie wzrostu oraz w fazie stacjonarnej przeszczepiano do pożywki z kwasem olejowym, który indukuje transkrypcję m.in. genu CTA1. Z części hodowli przygotowywano ekstrakt natychmiast po przeszczepieniu (ekstrakt ten reprezentował wyjściowy poziom aktywności promotora genu CTA1 w stanie derepresji), natomiast resztę hodowli w pożywce z kwasem olejowym prowadzono przez 3, 6, 9, 12 i 24 godziny, a następnie sporządzano ekstrakt. Przygotowane ekstrakty wykorzystywano do oznaczenia aktywności właściwej β-galaktozydazy, która jest pośrednią miarą aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1. Pomiaru dokonywano dla ekstraktów przygotowanych z każdego szczepu transformowanego odpowiednim plazmidem, w obu fazach wzrostu, w stanie derepresji genu CTA1 i po upływie odpowiedniego czasu hodowli w warunkach indukcji tego genu. 40 Każdy ekstrakt oznaczano w dwóch powtórzeniach i wyliczano średnią. Dla każdego szczepu eksperyment powtarzano co najmniej trzy razy. Z nieznanych powodów wartości aktywności właściwej β-galaktozydazy w powtórzeniach doświadczenia wykonanych dla jednego szczepu znacznie się różniły. Podobne zjawisko zaobserwowali także inni badacze [38, 41]. Ponieważ obliczanie wartości średnich z tak rozbieżnych wyników nie byłoby poprawne, wyniki dotyczące aktywności właściwej β-galaktozydazy po odpowiednim czasie indukcji genu CTA1 przeliczano w stosunku do aktywności w warunkach derepresji, a otrzymaną wartość określano jako względny poziom indukcji (Tab. 5-P). Z niewyjaśnionych również powodów, niektóre wyniki pomiarów odbiegały znacznie od ogólnej tendencji indukcji lub spójnych powtórzeń doświadczenia dotyczącego jednego szczepu. W takim przypadku odrzucano ten punkt jako niewiarygodny i nie brano pod uwagę przy wyliczaniu średniej. Razem z wykresami pokazującymi względny poziom indukcji w funkcji czasu hodowli w pożywce z kwasem olejowym, podano także tabele zawierające dane liczbowe z poszczególnych powtórzeń doświadczenia, na podstawie których obliczano wartości średnie względnego poziomu indukcji oraz wartości odchylenia standardowego przedstawione na wykresach (wartości odchylenia standardowego podano również w tabelach). 41 Bezwzględne wartości aktywności właściwej β-galatozydazy uzyskane w dwóch doświadczeniach Czas hodowli z kw. olej. [godziny] Aktywność właściwa β-galatozydazy [µmol·mg-1·min-1] Symbole 0 A 0,06 0,04 3 X3 1,22 0,62 6 X6 4,97 1,70 9 X9 4,91 2,05 12 X12 6,43 4,31 24 X24 11,70 6,17 Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Względny poziom indukcji Czas hodowli z kw. olej. [godziny] Symbole 0 A/A 1 1 3 X3/A 20 17 6 X6/A 80 46 9 X9/A 79 56 12 X12/A 104 118 24 X24/A 189 168 Tab. 5-P Względny poziom indukcji Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Przykład opracowania wyników przedstawionych w postaci bezwzględnych wartości aktywności β-galatozydazy. Wyniki te wydają się dość rozbieżne, jednak po przeliczeniu na względny poziom indukcji stają się porównywalne. Przedstawione w przykładzie wartości pochodzą z wyników uzyskanych dla szczepu oaf1 z plazmidem integracyjnym z hodowli w logarytmicznej fazie wzrostu. 42 Legenda Wykresy: BY4742 (szczep kontrolny) adr1 oaf1 pip2 Przedstawiono wykresy z połączonymi linią prostą punktami, odpowiadającymi wyliczonym wartościom aktywności właściwej β-galaktozydazy. Nie musi to dokładnie odzwierciedlać rzeczywistego przebiegu procesu, zwłaszcza pomiędzy punktami przedstawiającymi wartości względnego poziomu indukcji po 12 i 24 godzinach hodowli. Takie wykresy są jednak bardziej czytelne niż wykresy słupkowe. Pionowymi liniami oznaczono wartości odchylenia standardowego w danym punkcie. Wartości odchyleń standardowych umieszczono w tabelach z danymi liczbowymi. Tabele z danymi liczbowymi: W poszczególnych kolumnach tabeli umieszczono wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w niezależnych eksperymentach, dotyczące jednego szczepu transformowanego odpowiednim plazmidem. Kursywą zaznaczono wartości pominięte przy obliczaniu wartości średnich z powodu znacznego odstępstwa od ogólnej tendencji indukcji genu CTA1 i spójnych powtórzeń eksperymentu dotyczącego jednego szczepu. 43 b/p - brak pomiaru b/d - brak danych spowodowany niemożnością obliczenia wartości odchylenia standardowego wynikającą ze zbyt małej liczby przeprowadzonych pomiarów * - symbolem tym oznaczono istotną statystycznie różnicę między poziomem indukcji w szczepie pozbawionym jednego z trzech badanych czynników transkrypcyjnych w stosunku do wyniku pomiaru szczepu kontrolnego, na podstawie przeprowadzonego dwustronnego testu t Studenta różnicy między średnimi przy różnych wariancjach (poziom istotności p=0,055). Symbol ten umieszczono zarówno w tabelach z danymi liczbowymi, jak i przy odpowiednich punktach na wykresach. 44 Numer doświadczenia BY4742 1 2 3 Odchylenie 4 5 standardowe 6 3h 1 21 26 15 35 127 6 6h 1 136 115 37 115 317 10 9h 5 223 277 76 287 237 27 12h 18 265 493 52 303 550 121 24h 77 815 1059 20 566 776 175 Szczep adr1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 4 3h 16 30 25 42 9 6h 96 50 103 268 24 9h* b/p 100 191 149 37 12h b/p b/p b/p 299 b/d 24h* 237 211 272 278 27 Szczep oaf1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowle w logarytmicznej fazie wzrostu 3 3h 15 29 9 8 6h* 62 58 30 14 9h* 63 128 34 14 12h* 77 97 52 18 24h* 227 209 91 9 1200 1000 Względny poziom indukcji Szczep 800 600 * 400 200 * * * * * * * * 01 0 3 6 9 12 15 18 Czas hodowli z kwasem olejowym [godziny] Szczep pip2 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 3h 63 33 31 15 6h 72 184 101 47 9h* 143 136 108 15 12h* 232 164 215 29 24h* 289 421 492 84 Tab. 5-1 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z wartościami odchylenia standardowego Ryc. 5-1 Przebieg indukcji promotora genu CTA1 pod wpływem kwasu olejowego 21 24 27 Odchylenie Numer doświadczenia BY4742 1 2 3 4 5 standardowe 6 3h 4 65 23 34 33 63 17 6h 11 296 141 115 25 223 71 9h 31 468 138 182 160 452 147 12h 73 494 304 176 188 512 145 24h 148 530 395 274 167 550 112 Szczep adr1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 4 3h 41 55 26 67 15 6h 73 197 21 109 52 9h b/p 171 50 138 17 12h b/p b/p b/p 120 b/d 24h* 102 172 65 169 45 Szczep oaf1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w fazie stacjonarnej 3 3h 57 45 28 12 6h* 177 67 63 2 9h 121 126 88 17 12h* 756 96 73 11 24h* 211 88 75 6 600 500 Względny poziom indukcji Szczep 400 300 200 100 * * * * * * 01 0 3 6 9 12 15 18 Czas hodowli z kwasem olejowym [godziny] Szczep pip2 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 3h 31 69 48 16 6h 55 161 95 44 9h 67 223 133 33 12h* 89 205 109 10 24h* 102 206 110 4 Tab. 5-2 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z wartościami odchylenia standardowego Ryc. 5-2 Przebieg indukcji promotora genu CTA1 pod wpływem kwasu olejowego 21 24 27 Numer doświadczenia BY4742 1 2 Odchylenie 3 standardowe 4 3h 72 52 7 69 9 6h 129 228 13 223 45 9h 378 143 49 304 98 12h 414 232 75 394 81 24h 459 294 148 340 69 Szczep adr1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 4 3h 49 38 44 52 5 6h 121 98 80 142 24 9h 150 204 193 377 87 12h 214 158 286 335 68 24h 345 b/p b/p 493 74 Szczep oaf1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu 3 3h* 20 35 17 8 6h 80 b/p 46 17 9h 79 306 56 12 12h* 104 372 118 7 24h* 189 264 168 10 600 500 Względny poziom indukcji Szczep 400 300 200 * * 100 * 01 0 3 6 9 12 15 18 Czas hodowli z kwasem olejowym [godziny] Szczep pip2 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 3h 59 58 54 2 6h 128 112 128 8 9h 181 159 169 9 12h 216 238 294 33 24h 292 265 332 28 Tab. 5-3 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z wartościami odchylenia standardowego Ryc. 5-3 Przebieg indukcji promotora genu CTA1 pod wpływem kwasu olejowego 21 24 27 1 2 3 standardowe 4 3h 32 71 24 22 4 6h 60 169 20 83 11 11 9h 105 119 92 43 12h 122 129 102 50 11 24h 167 165 124 77 20 Szczep adr1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 4 3h 48 34 41 34 6 6h 62 60 81 76 9 9h 75 76 111 60 18 12h 70 b/p 101 78 13 24h 95 b/p 125 66 24 Szczep oaf1 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w fazie stacjonarnej 3 3h 28 46 21 4 6h 86 145 72 7 9h 91 271 125 17 12h 112 134 123 9 24h 107 199 131 39 300 250 Względny poziom indukcji BY4742 Odchylenie Numer doświadczenia Szczep 200 150 100 50 01 0 3 6 9 12 15 18 Czas hodowli z kwasem olejowym [godziny] Szczep pip2 Odchylenie standardowe Numer doświadczenia 1 2 3 3h 73 38 53 14 6h 217 106 b/p b/d 9h 223 129 189 39 12h 208 118 135 39 24h 235 227 148 39 Tab. 5-4 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z wartościami odchylenia standardowego Ryc. 5-4 Przebieg indukcji promotora genu CTA1 pod wpływem kwasu olejowego 21 24 27 Indukcja genu CTA1 w komórkach S.cerevisiae znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu pokazuje tendencję wzrostową przez 24 godziny po przeniesieniu do pożywki z kwasem olejowym, niezależnie od plazmidu, którym transformowano komórki drożdży (Ryc. 5-1 i Ryc. 5-3). Wyjątkiem jest szczep kontrolny z plazmidem integracyjnym i szczep adr1 z plazmidem episomalnym, w których po 12 godzinach hodowli nie obserwuje się wzrostu poziomu indukcji genu CTA1. Odmienną sytuację można zaobserwować w drożdżach znajdujących się w fazie stacjonarnej, w których, z wyjątkiem szczepu kontrolnego z plazmidem episomalnym, wzrost poziomu indukcji genu CTA1 trwa jedynie 9 godzin (Ryc. 5-2 i Ryc. 5-4). Przez następne 15 godzin hodowli w warunkach indukcji aktywność transkrypcyjna promotora genu nie wzrasta w sposób znaczący. W hodowlach znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu wszystkie szczepy pozbawione jednego z trzech badanych czynników transkrypcyjnych wykazują obniżoną zdolność indukcji genu CTA1 w porównaniu do szczepu kontrolnego. Szczególnie niski poziom indukcji można zaobserwować w szczepie oaf1 transformowanym plazmidem episomalnym (Ryc. 5-1), dla którego już po 6 godzinach hodowli w pożywce z kwasem olejowym można zauważyć istotne statystycznie obniżenie stopnia indukcji. Przebieg indukcji genu CTA1 w komórkach S.cerevisiae transformowanych plazmidem episomalnym znajdujących się w fazie stacjonarnej (Ryc. 5-2) wyraźnie różni się od wyników uzyskanych dla hodowli drożdży znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu (Ryc. 5-1). W fazie stacjonarnej wszystkie trzy szczepy pozbawione jednego z trzech czynników transkrypcyjnych wykazują obniżoną w równym stopniu zdolność indukcji genu CTA1, a szczep oaf1 nie wyróżnia się w żaden 49 sposób na tle dwóch pozostałych badanych szczepów drożdży. Niespodziewane wyniki uzyskano w hodowlach S.cerevisiae transformowanych plazmidem integracyjnym, przeniesionych do pożywki z kwasem olejowym w fazie stacjonarnej (Ryc. 5-4). Nie zaobserwowano znaczącej różnicy między szczepem kontrolnym i szczepami badanymi (adr1 i oaf1), zaś szczep z usuniętym genem czynnika transkrypcyjnego Pip2p wykazywał wyższy stopień indukcji genu CTA1 przez cały czas trwania hodowli w pożywce z kwasem olejowym. Różnica ta nie była jednak istotna statystycznie. Warto zaznaczyć, iż nawet w szczepach wykazujących obniżony w stosunku do szczepu kontrolnego poziom indukcji genu CTA1, w wyniku przeniesienia drożdży do warunków indukcji aktywność promotora tego genu zwiększała się od 100 do 200 razy. 50 2. Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1 Analizę struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1 prowadzono w drożdżach hodowanych do wczesnej logarytmicznej fazy wzrostu w trzech warunkach: represji, derepresji i indukcji. Następnie izolowano jądra komórkowe i analizowano strukturę chromatyny stosując metodę pośredniego znakowania końców. Podobnie jak w omawianej wcześniej analizie aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1 przeprowadzonej przy pomocy genu reporeterowego, strukturę chromatyny badano w szczepach adr1, oaf1 i pip2, a także w szczepie kontrolnym MHY501α (dzikim pod względem badanych czynników transkrypcyjnych). Odcinki DNA powstałe w wyniku trawienia chromatyny poddawano elektroforezie w żelu agarozowym, następnie po przeniesieniu DNA na membranę przeprowadzano hybrydyzację typu Southern z odpowiednią sondą znakowaną radioaktywnie i poddawano autoradiografii. Porównując prążki widoczne na autoradiogramie można uzyskać informacje o rozmieszczeniu nukleosomów i miejscach wrażliwych na działanie DNazy I w badanym rejonie, a także o zmianach ich położenia w zależności od warunków w których prowadzono hodowlę i w zależności od badanego szczepu. Jednak pełny obraz zmian zachodzących w strukturze chromatyny w rejonie promotora genu CTA1 można uzyskać dopiero po przeprowadzeniu elektroforezy preparatów ze wszystkich badanych szczepów we wszystkich warunkach hodowli (represji, derepresji i indukcji) na jednym żelu agarozowym. Jest to istotne, ponieważ tylko w ten sposób można dokonać rozdziału fragmentów DNA z równą ruchliwością umożliwiającą porównanie wykrytych sondą fragmentów DNA na jednym filmie 51 rentgenowskim. Umożliwia to jednoznaczne stwierdzenie wzajemnego położenia wykrytych fragmentów DNA. Do chwili obecnej nie przeprowadzono elektroforezy wszystkich preparatów na jednym żelu agarozowym, tak więc zostaną przedstawione jedynie cząstkowe wyniki porównań niektórych szczepów i warunków hodowli. Legenda Czarne strzałki wskazują prążki wykrywane we wszystkich ścieżkach autoradiogramu, natomiast czerwone strzałki wskazują prążki pojawiające się lub znikające w niektórych ścieżkach. Różowe strzałki wskazują prążek o długości 1906pz powstający w wyniku trawienia endonukleazą restrykcyjną MboI. 52 A. Ustalenie miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie kontrolnym (MHY501α) MHY501α W celu EtOH Glc Kw. olej. reorganizacji zbadania struktury możliwości chromatyny w udziału regulacji aktywności promotora genu CTA1, ustalono miejsca wrażliwe na nukleazę z Micrococcus w szczepie kontrolnym. Na autoradiogramie można zauważyć zarówno fragmenty DNA wykrywane we wszystkich trzech ścieżkach (A3, A8, A9 i A10), jak i wykrywane A1 jedynie w niektórych warunkach hodowli. Prążek A2 A2 nie jest widoczny w preparacie izolowanym z hodowli A3 w pożywce z kwasem olejowym, podobnie jak prążki A4 A5 A6 A7 A8 A5 i A7. Odwrotna sytuacja przedstawia się dla prążka A6. Jest on widoczny w warunkach indukcji, jednak nie jest wykrywany ani w warunkach represji, ani derepresji. Podobną tendencję można zauważyć dla prążka A4. A9 A10 Na podstawie prezentowanego autoradiogramu, a także opierając się na analogicznych danych uzyskanych przy zastosowaniu innej sondy do hybrydyzacji, nie przedstawionych w niniejszej pracy, Trzcińska-Danielewicz i wsp. ustalili pozycje miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus, a także miejsc nadwrażliwych na DNazę I w rejonie promotora genu CTA1 (Ryc. 5-5) [62]. 53 -700 -645 -669 DNazaI -490 -365 -195 -145 -226 -80 1 Glc -515 MNaza EtOH -125 - 990 -708 - 790 Kw. olej. -156 -546 Sonda 5’ RMS1 5’ AUG -1794 Ryc. 5-5 50 Sonda 3’ CTA1 MboI UGA -1541 -310 MboI 3’ AUG +1 +366 Schemat rejonu promotora genu CTA1 wraz z zaznaczonymi miejscami nadwrażliwymi na DNazę I oraz wrażliwymi na nukleazę z Micrococcus (MNaza). Zaznaczono także położenie sekwencji nukleotydowych sond molekularnych, którymi wykrywano fragmenty DNA w stosowanej metodzie pośredniego znakowania końców. Numerem +1 oznaczono pierwszy nukleotyd, który ulega translacji. Zaadaptowano z [62]. Najwyraźniejszy prążek wykrywany we wszystkich trzech ścieżkach (prążek A1) jest fragmentem DNA o długości 1906pz, który powstaje w wyniku trawienia endonukleazą restrykcyjną MboI. Fragmenty te są największe wśród wykrywanych sondą molekularną, ponieważ nie uległy trawieniu nukleazą z Micrococcus lub DNazą I. Fragment DNA o długości 1906pz jest więc wykrywany we wszystkich przeprowadzanych eksperymentach niezależnie od badanego szczepu S.cerevisiae i warunków hodowli, z której zostały wyizolowane jądra komórkowe. Brak na autoradiogramach prążków większych niż 1906pz świadczy natomiast o tym, że trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI było wyczerpujące. Jest to warunek konieczny do uzyskania wiarygodnych wyników przy zastosowaniu metody 54 pośredniego znakowania końców. Wszystkie fragmenty DNA migrujące podczas elektroforezy szybciej niż wspomniany fragment o długości 1906pz powstają w wyniku trawienia z jednej strony nukleazą z Micrococcus lub DNazą I, z drugiej zaś strony endonukleazą restrykcyjną MboI. Dzięki analizie struktury chromatyny w badanych szczepach S.cerevisiae i ewentualnych jej zmian w stosunku do szczepu kontrolnego będzie możliwe potwierdzenie lub wykluczenie udziału poszczególnych czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p w reorganizacji struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1. 55 B. Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie pip2 pip2 Podobnie jak w przypadku szczepu EtOH Glc Kw. olej. kontrolnego, w szczepie pip2 również można zauważyć prążki wykrywane we wszystkich ścieżkach, jak i te pojawiające się jedynie w niektórych ścieżkach. Do prążków wykrywanych we wszystkich ścieżkach można zaliczyć prążki B1 (identyczny z prążkiem A1), B2, B4-B6, B10-B14, B16-B18. Prążek B3 nie jest B1 B2 wykrywany w preparacie wyizolowanym z hodowli prowadzonej w pożywce z kwasem olejowym, podobnie B3 B4 jak prążek B8. Natomiast prążki B9 i B15 są B5 B6 wykrywane jedynie w preparacie wyizolowanym z B7 B8 komórek hodowanych w warunkach indukcji genu B9 B10 B11 CTA1. Prążek B7 również najwyraźniej widoczny jest w B12 prepracie wyizolowanym z hodowli w pożywce z B13 kwasem olejowym, jednak w przypadku tego prążka jest B14 B15 on widoczny, choć słabiej, także w preparatach B16 wyizolowanych z hodowli w stanie represji i derepresji B17 genu CTA1. Po analizie autoradiogramów (również nie B18 przedstawionych w niniejszej pracy) ustalono niektóre miejsca działania nukleazy z Micrococcus w rejonie 56 promotora genu CTA1. Pozycja -220 (prążek B13) i +70 (prążek B17) są miejscami działania nukleazy z Micrococcus we wszystkich badanych warunkach. Pozycja -150 (prążek B15) jest natomiast miejscem działania nukleazy z Micrococcus występującym jedynie w warunkach indukcji genu CTA1. Obserwacje te odpowiadają obrazowi ze szczepu kontrolnego (Ryc. 5-5). Ustalone pozycje miejsc działania nukleazy z Micrococcus są obarczone stosunkowo dużym błędem. Można jednak stwierdzić, że w rejonie promotora genu CTA1 zachodzą zmiany w strukturze chromatyny w szczepie pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Pip2p podobne do obserwowanych w szczepie kontrolnym. 57 C. Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach adr1 i oaf1 w warunkach represji i derepresji genu CTA1 adr1 oaf1 EtOH Glc EtOH Glc Jak wynika z autoradiogramów przedstawionych w punktach A i B, układ wykrywanych fragmentów DNA w preparatach wyizolowanych z warunków represji i derepresji jest C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 bardzo podobny. Tak też jest w przypadku porównania szczepów adr1 i oaf1 w warunkach represji i derepresji. Wyraźne różnice pojawiają się jedynie w dwóch miejscach. Są to prążki C6 i C8 wykrywane tylko w szczepie oaf1 w warunkach represji. Warto także zauważyć, że w szczepie pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Adr1p nie występują żadne zmiany w układzie wykrywanych C12 C13 C14 prążków między komórkami hodowanymi w warunkach represji i derepresji. Pod tym względem szczep ten różni się od szczepu oaf1, w którym można zauważyć kilka zmian w układzie wykrywanych prążków między komórkami hodowanymi w pożywce z glukozą i w pożywce z etanolem. Prążki C6 i C8 wykrywane jedynie w szczepie oaf1 w warunkach represji mają 58 długość ok. 1000pz i wskazują na zmiany zachodzące w pobliżu pozycji -650 (licząc od pierwszego nukleotydu ulegającego translcji). Są to dosyć odległe miejsca od rejonu promotora genu CTA1 i wydaje się, że nie mają one dużego znaczenia w regulacji aktywności transkrypcyjnej badanego promotora. 59 D. Próba porównania położenia miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus (MNazę) w szczepach MHY501α, adr1, oaf1 i pip2 w warunkach derepresji genu CTA1 Porównanie autoradiogramów z EtOH MNaza pochodzącymi wszystkich pip2 oaf1 adr1 MHY501α preparatami badanych ze szczepów hodowanych w stanie derepresji genu MNaza CTA1 umożliwiło wstępne zidentyfikowanie prążka obecnego we MboI-MboI wszystkich 1906pz szczepach z wyjątkiem szczepu kontrolnego (prążek D1). Inne prążki zaznaczone kolorem czarnym wydają się występować we wszystkich badanych szczepach. Analiza przeprowadzona w ten D1 sposób obarczona jest dużym błędem D1 spowodowanym rozdzielanych oddzielnych różną ruchliwością fragmentów żelach DNA w agarozowych, a także różną intensywnością sygnału sondy używanej do hybrydyzacji. Pozwala ona jednak na porównanie układów wykrywanych prążków i umożliwia wykrycie prążków pojawiających się tylko w określonym szczepie lub w określonych warunkach hodowli. 60 E. Analiza miejsc nadwrażliwych na DNazę I w szczepie kontrolnym (MHY501α) i szczepie oaf1 w warunkach indukcji genu CTA1 Kw. olej. Oaf1 MHY501α Zmiany w układzie wykrywanych fragmentów DNA są nieliczne. Prążki E3 i E6 są widoczne jedynie w preparacie wyizolowanym ze szczepu pozbawionego czynnika transkrypcyjnego Oaf1p. Jednak inne fragmenty DNA są E1 E2 wykrywane w obu szczepach S.cerevisiae. E3 E4 E5 E6 E7 E8 61 Analiza przedstawionych autoradiogramów sugeruje, że w przypadku genu CTA1 reorganizacja struktury chromatyny nie jest procesem szczególnie ważnym dla indukcji tego genu. Z przedstawionych w punkcie A oraz B autoradiogramów wynika, iż w warunkach represji i derepresji struktura chromatyny rejonu promotora genu CTA1 jest bardzo podobna (potwierdza to także autoradiogram przedstawiony w punkcie C), natomiast drobne, choć wyraźne zmiany zachodzą przy indukcji tego genu. Jak wcześniej wspomniano, pełny obraz dotyczący reorganizacji struktury chromatyny badanego rejonu można poznać jedynie przez przeprowadzenie elektroforezy wszystkich preparatów na jednym żelu agarozowym. Bardzo trudne zatem jest przypisanie poszczególnych prążków wykrytych przez autoradiografię do miejsc działania nukleazy z Micrococcus i DNazy I na podstawie kilku oddzielnych autoradiogramów. Konieczna więc będzie kontynuacja badań w celu jednoznacznego wyjaśnienia roli czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p w procesie reorganizacji chromatyny rejonu promotora genu CTA1. Jednak opierając się na przedstawionych wynikach można stwierdzić, że w rejonie promotora genu CTA1 zachodzi subtelna reorganizacja struktury chromatyny przy udziale badanych czynników transkrypcyjnych i ma ona związek m.in. z indukcją genu CTA1. 62 6. Dyskusja 1. Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji Metoda wykorzystująca pomiary aktywności β-galaktozydazy jest metodą pośrednią i może służyć jedynie do ustalenia przybliżonego poziomu aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1. Przeprowadzenie jednak eksperymentu w kilku niezależnych od siebie powtórzeniach i uzyskanie w nich istotnych statystycznie różnic w stosunku do szczepu kontrolnego (BY4742) pozwala na formułowanie wniosków dotyczących udziału czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p oraz ich roli w indukcji badanego genu. Kinetyka indukcji genu CTA1 szczepów transformowanych plazmidem episomalnym znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu jest liniowa. Tendencję tę można zauważyć zarówno w szczepie kontrolnym, jak i w szczepach oaf1 i pip2. Jedynie w szczepie adr1 nie obserwuje się wzrostu poziomu indukcji genu CTA1 między 12 i 24 godziną hodowli w pożywce z kwasem olejowym. Te same szczepy wykazują nieco inną kinetykę indukcji genu CTA1, kiedy w chwili przenoszenia do warunków indukcji znajdują się w fazie stacjonarnej. W tym przypadku poziom indukcji genu CTA1 wzrasta liniowo tylko do 9 godziny hodowli. Osiągnięty poziom indukcji utrzymuje się aż do 24 godziny hodowli. Wyjątkiem tutaj jest szczep kontrolny, w którym poziom indukcji genu CTA1 wzrasta przez cały czas trwania hodowli w warunkach indukcji. Obserwowany przyrost względnego poziomu indukcji z upływem 63 czasu staje się jednak mniejszy. Podobną kinetykę indukcji zaobserwowano już wcześniej [38]. W tym przypadku również, pomimo znacznie niższej wartości względnego poziomu indukcji (wynoszącej ok. 70), wzrost względnego poziomu indukcji był liniowy przez 24 godziny hodowli. Wartości te mogą się różnić z powodu odmiennego układu doświadczalnego, jednak obserwowane zjawiska mają bardzo podobną charakterystykę w postaci liniowego wzrostu aktywności genu CTA1. Indukcja genu CTA1 w szczepach transformowanych plazmidem integracyjnym przedstawia się podobnie. W logarytmicznej fazie wzrostu, poza szczepem kontrolnym nie wykazującym wzrostu poziomu indukcji między 12 i 24 godziną hodowli, można uznać, że poziom indukcji wzrasta liniowo przez cały czas trwania hodowli. Natomiast w fazie stacjonarnej w żadnym z badanych szczepów nie obserwuje się wyraźnych zmian w poziomie indukcji genu CTA1 po 9 godzinie trwania hodowli w warunkach indukcji. Zahamowanie wzrostu poziomu indukcji genu CTA1 w hodowlach będących w chwili przenoszenia do warunków indukcji w fazie stacjonarnej może wynikać z ogólnej represji transkrypcji. W komórkach znajdujących się w tej fazie wzrostu obserwuje się zahamowanie istotnych procesów komórkowych takich jak transkrypcja [63] i translacja [64, 65]. Możliwe jest więc zahamowanie syntezy białek odgrywających ważną rolę m.in. w procesie indukcji genu CTA1, a także β-galaktozydazy będącej kluczowym białkiem w stosowanej metodzie. W przypadku zahamowania syntezy β-galaktozydazy nie jest możliwe śledzenie rzeczywistej aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1. W szczepie oaf1 transformowanym zarówno plazmidem episomalnym, jak i plazmidem integracyjnym, w logarytmicznej fazie wzrostu hodowli można zauważyć, iż 64 poziom indukcji genu CTA1 jest wyraźnie niższy w porównaniu do szczepu kontrolnego, natomiast szczep pip2 transformowany zarówno plazmidem episomalnym, jak i plazmidem integracyjnym wykazuje podobny do szczepu kontrolnego poziom indukcji badanego genu. Wyniki te sugerują, iż konieczny jest udział czynnika transkrypcyjnego Oaf1p do pełnej indukcji genu CTA1. Wysoce prawdopodobne jest więc formowanie homodimeru (Oaf1p)2 w szczepie pip2, w którym poziom indukcji jest porównywalny do szczepu kontrolnego. Obserwacje te są zgodne z wcześniej wysuwanymi hipotezami [39, 45]. Jednak na podstawie przedstawionych wyników nie jest możliwe stwierdzenie, czy formowanie homodimeru (Oaf1p)2 jest zjawiskiem występującym powszechnie w indukcji genu CTA1. Istnieje bowiem możliwość, iż homodimer (Oaf1p)2 tworzy się jedynie w warunkach niedoboru Pip2p. Warto również zauważyć, że pomimo obniżonego poziomu indukcji genu CTA1 w szczepie oaf1, aktywność promotora tego genu wzrasta 100-200 razy po trwającej 24 godziny hodowli w pożywce z kwasem olejowym. Wartość ta wynosi 25-50% w porównaniu do względnego poziomu indukcji obserwowanego w szczepie kontrolnym. Być może w warunkach braku Oaf1p tworzy się homodimer (Pip2p)2, który jednak dużo słabiej indukuje gen CTA1 w porównaniu do homodimeru (Oaf1p)2 lub heterodimeru Oaf1p-Pip2p tworzącego się w szczepie kontrolnym. W jednej z przeprowadzonych wcześniej prac [39] zaobserwowano wartość względnego poziomu indukcji genu CTA1 wynoszącą ok. 4 w szczepie kontrolnym oraz ok. 2 w szczepie pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Oaf1p (obliczenia własne wg danych z [39]). Wartości te są dużo mniejsze od zaobserwowanych w niniejszej pracy, jednak stosunek względnego poziomu indukcji w szczepie kontrolnym do wartości w szczepie pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Oaf1p wynosi ok. 2 (4/2). 65 Wartość tę można uznać za porównywalną z obserwowaną w niniejszej pracy (ok. 4 (400/100) w hodowlach, w których zanotowano istotne statystycznie różnice), jeżeli weźmie się pod uwagę znaczne różnice w stosowanym układzie doświadczalnym [39]. Znaczne różnice w wartościach względnego poziomu indukcji uzyskane w niniejszej pracy w porównaniu do wcześniejszych prac mogą wynikać nie tylko z odmiennego układu doświadczalnego (szczepy, plazmidy, metody badania), ale także niekompletnej derepresji genu CTA1. W celu uzyskania warunków derepresji różne zespoły badawcze prowadzą hodowlę S.cerevisiae stosując pożywki o stężeniu glukozy wynoszącym 0% [39], 0,1% [38], 0,3% [42] lub 0,5% [46] uzupełnione zwykle etanolem lub glicerolem do końcowego stężenia wynoszącego 2%. W pożywce o stężeniu glukozy wynoszącej 0% komórki S.cerevisiae dzielą się bardzo rzadko, ponadto często powoduje ona wcześniejsze przejście komórek do fazy stacjonarnej (wyników nie przedstawiono). Stosowanie pożywki z 0,5% glukozą mogło jednak opóźnić rozpoczęcie procesu derepresji. Może ona zatem, przy stosowaniu pożywki o zbyt wysokim stężeniu glukozy, zachodzić dopiero po przeniesieniu komórek drożdży do pożywki z kwasem olejowym. W takiej sytuacji obserwowany wzrost poziomu aktywności promotora genu CTA1 jest wynikiem zarówno derepresji, jak i indukcji tego genu. Pomimo dużego podobieństwa stosowanych w badanich metod, istnieją także odmienne wyniki [56] od uzyskanych w niniejszej pracy. W wymienionej pracy szczepy adr1 i pip2 w logarytmicznej fazie wzrostu charakteryzują się wyższą wartością względnego poziomu indukcji genu CTA1 w porównaniu do szczepu kontrolnego. Wyniki te wydają się jednak mało wiarygodne, ponieważ oparte są na jednym przeprowadzonym doświadczeniu. Natomiast we wspomnianej pracy, podobnie jak w 66 niniejszej, zaobserwowano niższą wartość względnego poziomu indukcji w hodowlach przeszczepianych w fazie stacjonarnej. Czynnik transkrypcyjny Adr1p wydaje się nie mieć wpływu na indukcję genu CTA1 w hodowlach znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu. Poziom indukcji badanego genu obserwowany w szczepie adr1 transformowanym zarówno plazmidem episomalnym, jak i plazmidem integracyjnym nie odbiega zasadniczo od poziomu indukcji obserwowanego w szczepie kontrolnym. Interesujący jest jednak związek ekspresji genu PIP2 i Adr1p [66], ponieważ wysoce prawdopodobny jest wpływ Adr1p na liczbę cząsteczek Pip2p w komórce. Jeżeli jednak za indukację genu CTA1 odpowiedzialny jest homodimer (Oaf1p)2, ani brak Pip2p, ani brak Adr1p nie powinien mieć wpływu na poziom indukcji genu CTA1. Uzyskane w doświadczeniu wyniki wraz z prawdopodobnym wpływem Adr1p na ekspresję genu PIP2 przemawiają za przyjęciem takiej hipotezy, która jest także zgodna z wcześniej wysuwanymi hiptezami [39, 45]. Stosowany w doświadczeniu plazmid episomalny, jak wcześniej wspomniano, występuje w komórce w kilkudziesięciu kopiach. Brak wyraźnych różnic w wynikach uzyskanych w przeprowadzonych doświadczeniach przy użyciu identycznych szczepów transformowanych plazmidem episomalnym i integracyjnym wskazują więc na dużą liczbę cząsteczek czynników transkrypcyjnych biorących udział w indukcji genu CTA1 w komórce. Kiedy w komórce jest mała liczba cząsteczek czynników transkrypcyjnych, w plazmidzie integracyjnym występującym w jednej kopii w komórce wysycenie sekwencji nukleotydowej promotora genu trwa krócej w porównaniu do plazmidu episomalnego. Jeśli jednak w komórce jest duży nadmiar liczby cząsteczek czynników transkrypcyjncyh, w obu plazmidach wysycenie sekwencji nukleotydowej promotora 67 genu CTA1 powinno w przybliżeniu zajmować tyle samo czasu. Uzyskane wyniki, jak wcześniej wspomniano, sugerują więc występowanie dużego nadmiaru liczby cząsteczek cznników transkrypcyjnych biorących udział w indukcji genu CTA1. Obserwacja ta również sugeruje, iż istotnym czynnikiem transkrypcyjnym w omawianym procesie jest Oaf1p, którego gen wyrażany jest konstytutywnie [45]. Jeśli czynnik transkrypcyjny Pip2p byłby białkiem koniecznym do indukcji genu CTA1, wysycenie sekwencji nukleotydowej promotora w plazmidzie episomalnym nastąpiłoby dużo później w porównaniu do plazmidu integracyjnego, ponieważ gen PIP2 indukowany jest w podobny sposób jak gen CTA1 [45, 66]. Z ostatniej pracy wynika również, iż ekspresja genu PIP2 jest zależna od czynnika transkrypcyjnego Adr1p [66], którego gen podlega, podobnie jak gen CTA1 i PIP2, represji glukozowej [68]. Skutki syntezy cząsteczek Pip2p wcześniej byłyby obserwowane w komórkach z plazmidem integracyjnym. Brak różnic w kinetyce indukcji genu CTA1 wskazuje zatem na główną rolę czynnika transkrypcyjnego Oaf1p w omawianym procesie. 68 2. Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1 Obecnie szeroko wykorzystywaną metodą analizy struktury chromatyny jest metoda oparta na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) pozwalająca na ustalenie pozycji nukleosomów z dokładnością do jednego nukleotydu [67]. Wystarczającą jednak dokładność do wstępnego zbadania struktury chromatyny w celu potwierdzenia lub wykluczenia udziału czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p w procesie reorganizacji struktury chromatyny zachodzącym w rejonie promotora genu CTA1 zapewnia stosowana w niniejszej pracy metoda pośredniego znakowania końców [57, 58, 59]. Z wcześniej wykonanej w Zakładzie Biologii Molekularnej pracy wiadomo, że w rejonie promotora genu CTA1 zachodzi reorganizacja struktury chromatyny zależna od dostępnego źródła węgla [62]. Uzyskane w niniejszej pracy wyniki potwierdzają tę obserwację. Czynnik transkrypcyjny Adr1p jest dobrze poznanym czynnikiem transkrypcyjnym pod względem reorganizacji struktury chromatyny. Adr1p wiąże się z sekwencją UAS1 w rejonie promotora genu ADH2 i powoduje destabilizację nukleosomu uniemożliwiającego dostępu białkom biorącym udział w procesie transkrypcji do sekwencji TATA-box znajdującej się w rejonie promotora tego genu [23]. Analogiczne działanie Adr1p w rejonie promotora genu CTA1 wydaje się prawdopodobne, ponieważ sekwencja UAS1 występuje również w rejonie promotora genu CTA1 [40]. Brak wyraźnych różnic w układzie wykrywanych prążków w stanie 69 represji i derepresji zarówno w szczepie kontrolnym, jak i w szczepie oaf1 i pip2 (w których funkcjonuje gen ADR1) może jednak świadczyć o tym, że w procesie derepresji nie zachodzi reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1. Brak różnicy w układzie wykrywanych prążków w stanie represji i derepresji w szczepie pozbawionym Adr1p również potwierdza tę hipotezę. Podobnie jak w szczepie kontrolnym, w szczepie pip2 wyraźne zmiany struktury nukleosomowej rejonu promotora zachodzą w warunkach indukcji genu CTA1. Zmiany te, na podstawie przeprowadzonej wstępnej analizy, wydają się odpowiadać zmianom obserwowanym w szczepie kontrolnym. Istnieje więc możliwość, iż czynnik transkrypcyjny Pip2p nie bierze czynnego udziału w reorganizacji struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1. Zarówno w świetle analizy aktywności promotora genu CTA1 przeprowadzonej przy użyciu genu reporterowego, jak i na podstawie wcześniejszych prac [39, 45] najbardziej interesującym czynnikiem transkrypcyjnym wydaje się Oaf1p. Niestety do chwili obecnej udało się jedynie przeprowadzić analizę struktury chromatyny w warunkach represji i derepresji, a więc wtedy, kiedy Oaf1p raczej nie powinien oddziaływać z promotorem genu CTA1. Podobnie jak w szczepie kontrolnym i szczepie pip2, nie zaobserwowano wyraźnych zmian w strukturze chromatyny. Możliwe, że przeprowadzenie analizy preparatu wyizolowanego ze szczepu oaf1 hodowanego w warunkach indukcji genu CTA1 przyniesie interesujące wyniki dotyczące udziału tego czynnika transkrypcyjnego w badanym procesie. Koniec sekwencji nukleotydowej genu RMS1 występującego obok genu CTA1 oddalony jest od pierwszego nukleotydu ulegającego translacji w genie CTA1 jedynie o 310pz (Ryc. 5-5). Część obszaru regulatorowego genu CTA1 może więc leżeć w rejonie 70 sekwencji kodującej genu RMS1. Uzasadniona jest zatem obawa, iż zmiany ekspresji genu RMS1 mogłyby wpływać na strukturę chromatyny, która następnie może mieć wpływ na aktywność promotora genu CTA1. Gen RMS1 jest jednak wyrażany konstytutywnie, a rozluźnienie struktury chromatyny spowodowane brakiem histonu H4 nie wpływa na jego aktywność transkrypcyjną [49]. Zmiany struktury chromatyny zachodzące w rejonie promotora genu CTA1 są więc z dużym prawdopodobieństwem związane ze zmianami aktywności promotora genu CTA1. Obserwowane w czasie indukcji genu CTA1 zmiany struktury chromatyny w obrębie genu RMS1 mogą być jedynie spowodowane przesunięciem nukleosomu w rejonie promotora genu CTA1. Może to wymuszać przesunięcia kolejnych nukleosomów, m.in. w obrębie genu RMS1. 71 7. Podsumowanie W niniejszej pracy ustalono kinetykę indukcji genu CTA1 zarówno w szczepie kontrolnym drożdży S.cerevisiae, jak i w szczepach pozbawionych jednego z czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p lub Pip2p. Wzrost wartości względnego poziomu indukcji jest liniowy we wszystkich badanych szczepach i nie zaobserwowano żadnych cech wyróżniających któryś ze szczepów na tle innych. Obserwacje względnego poziomu indukcji sugerują, iż czynnik transkrypcyjny Oaf1p odgrywa ważną rolę w procesie indukcji genu CTA1. Pozostałe z badanych czynników transkrypcyjnych wydają się mieć mniejszy wpływ na proces indukcji tego genu. Reorganizacja struktury chromatyny jest związana z regulacją aktywności transkrypcyjnej genu CTA1. Uzyskane wyniki sugerują, iż ten mechanizm jest wyraźnie związany z indukcją tego genu. W celu zidentyfikowania odpowiedzialnych za ten proces czynników transkrypcyjnych potrzebne są dalsze badania. Przeprowadzenie elektroforezy preparatów ze wszystkich szczepów hodowanych w trzech warunkach regulacji genu CTA1 (represja, derepresja i indukcja) na jednym żelu agarozowym pozwoli porównać pozycje nukleosomów w poszczególnych szczepach z dużą wiarygodnością. W ten sposób przeprowadzona analiza najprawdopodobniej doprowadzi do poznania czynnika transkrypcyjnego związanego z reorganizacją struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1. 72 8. 1. Literatura Kornberg RD Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science 1974 May 24;184(139):868-71 2. Kornberg RD, Thomas JO Chromatin structure; oligomers of the histones. Science 1974 May 24;184(139):865-8 3. Wolffe AP Chromatin: Structure and Function. Academic Press Limited (1995) 4. Arents G, Moudrianakis EN Topography of the histone octamer surface: repeating structural motifs utilized in the docking of nucleosomal DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1993 Nov 15;90(22):10489-93 5. Turner BM, Franchi L, Wallace H Islands of acetylated histone H4 in polytene chromosomes and their relationship to chromatin packaging and transcriptional activity. J Cell Sci 1990 Jun;96 ( Pt 2):335-46 6. Cyert MS, Thorner J Putting it on and taking it off: phosphoprotein phosphatase involvement in cell cycle regulation. Cell 1989 Jun 16;57(6):891-3 7. Bannister AJ, Zegerman P, Partridge JF, Miska EA, Thomas JO, Allshire RC, Kouzarides T Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 2001 Mar 1;410(6824):120-4 8. Goldknopf IL, French MF, Daskal Y, Busch H A reciprocal relationship between contents of free ubiquitin and protein A24, its conjugate with histone 2A, in chromatin fractions obtained by the DNase II, Mg++ procedure. Biochem Biophys Res Commun 1978 Oct 16;84(3):786-93 9. Goldknopf IL, Wilson G, Ballal NR, Busch H Chromatin conjugate protein A24 is cleaved and ubiquitin is lost during chicken erythropoiesis. J Biol Chem 1980 Nov 25;255(22):10555-8 73 10. Hong L, Schroth GP, Matthews HR, Yau P, Bradbury EM Studies of the DNA binding properties of histone H4 amino terminus. Thermal denaturation studies reveal that acetylation markedly reduces the binding constant of the H4 "tail" to DNA. J Biol Chem 1993 Jan 5;268(1):305-14 11. Strahl BD, Allis CD The language of covalent histone modifications. Nature 2000 Jan 6;403(6765):41-5 12. Workman JL, Kingston RE Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annu Rev Biochem 1998;67:545-79 13. Wolffe AP, Matzke MA Epigenetics: regulation through repression. Science 1999 Oct 15;286(5439):481-6 14. Jaenisch R, Bird A Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet 2003 Mar;33 Suppl:245-54 15. Mohandas T, Shapiro LJ, Sparkes RS Reactivation of an inactive human X chromosome: evidence for X inactivation by DNA methylation. Science 1981 Jan 23;211(4480):393-6 16. Tamaru H, Selker EU A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa Nature 2001 Nov 15;414(6861):277-83 17. Irvine RA, Lin IG, Hsieh CL DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Mol Cell Biol 2002 Oct;22(19):6689-96 18. Belotserkovskaya R, Berger SL Interplay between chromatin modifying and remodeling complexes in transcriptional regulation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1999;9(3-4):221-30 19. Hassan AH, Neely KE, Workman JL Histone acetyltransferase complexes stabilize swi/snf binding to promoter nucleosomes. Cell 2001 Mar 23;104(6):817-27 74 20. Lohr D Chromatin structure and regulation of the eukaryotic regulatory gene GAL80. Proc Natl Acad Sci U S A 1993 Nov 15;90(22):10628-32 21. Lohr D, Lopez J GAL4/GAL80-dependent nucleosome disruption/deposition on the upstream regions of the yeast GAL1-10 and GAL80 genes. J Biol Chem 1995 Nov 17;270(46):27671-8 22. Almer A, Hörz W Nuclease hypersensitive regions with adjacent positioned nucleosomes mark the gene boundaries of the PHO5/PHO3 locus in yeast. EMBO J 1986 Oct;5(10):2681-7 23. Verdone L, Camilloni G, Di Mauro E, Caserta M Chromatin remodeling during Saccharomyces cerevisiae ADH2 gene activation. Mol Cell Biol 1996 May;16(5):1978-88 24. Verdone L, Cesari F, Denis CL, Di Mauro E, Caserta M Factors affecting Saccharomyces cerevisiae ADH2 chromatin remodeling and transcription. J Biol Chem 1997 Dec 5;272(49):30828-34 25. Di Mauro E, Kendrew SG, Caserta M Two distinct nucleosome alterations characterize chromatin remodeling at the Saccharomyces cerevisiae ADH2 promoter. J Biol Chem 2000 Mar 17;275(11):7612-8 26. Rubbi L, Camilloni G, Caserta M, Di Mauro E, Venditti S Chromatin structure of the Saccharomyces cerevisiae DNA topoisomerase I promoter in different growth phases. Biochem J 1997 Dec 1;328 ( Pt 2):401-7 27. Perez-Martin J Chromatin and transcription in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev 1999 Jul;23(4):503-23 28. White CL, Suto RK, Luger K Structure of the yeast nucleosome core particle reveals fundamental changes in internucleosome interactions. EMBO J 2001 Sep 17;20(18):5207-18 29. Kunau WH, Dommes V, Schulz H β-oxidation of fatty acids in mitochondria, peroxisomes, and bacteria: a century of continued progress. Prog Lipid Res 1995;34(4):267-342 75 30. Veenhuis M, Mateblowski M, Kunau WH, Harder W Proliferation of microbodies in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 1987 Jun;3(2):77-84 31. Gancedo JM Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev 1998 Jun;62(2):334-61 32. Filipits M, Simon MM, Rapatz W, Hamilton B, Ruis H A Saccharomyces cerevisiae upstream activating sequence mediates induction of peroxisome proliferation by fatty acids. Gene 1993 Sep 30;132(1):49-55 33. Distel B, Erdmann R, Gould SJ, Blobel G, Crane DI, Cregg JM, Dodt G, Fujiki Y, Goodman JM, Just WW, Kiel JA, Kunau WH, Lazarow PB, Mannaerts GP, Moser HW, Osumi T, Rachubinski RA, Roscher A, Subramani S, Tabak HF, Tsukamoto T, Valle D, van der Klei I, van Veldhoven PP, Veenhuis M. A unified nomenclature for peroxisome biogenesis factors. J Cell Biol 1996 Oct;135(1):1-3 34. Brul S, Westerveld A, Strijland A, Wanders RJ, Schram AW, Heymans HS, Schutgens RB, van den Bosch H, Tager JM. Genetic heterogeneity in the cerebrohepatorenal (Zellweger) syndrome and other inherited disorders with a generalized impairment of peroxisomal functions – a study using complementation analysis. J Clin Invest 1988 Jun;81(6):1710-5 35. Cohen G, Rapatz W, Ruis H Sequence of the Saccharomyces cerevisiae CTA1 gene and amino acid sequence of catalase A derived from it. Eur J Biochem 1988 Sep 1;176(1):159-63 36. Gurvitz A, Hamilton B, Ruis H, Hartig A Peroxisomal Degradation of trans-Unsaturated Fatty Acids in the Yeast Saccharomyces cerevisiae J Biol Chem 2001 Jan 12;276(2):895-903 37. Hortner H, Ammerer G, Hartter E, Hamilton B, Rytka J, Bilinski T, Ruis H Regulation of synthesis of catalases and iso-1-cytochrome c in Saccharomyces cerevisiae by glucose, oxygen and heme. Eur J Biochem 1982 Nov;128(1):179-84 76 38. Skoneczny M, Rytka J Oxygen and haem regulate the synthesis of peroxisomal proteins: catalase A, acyl-CoA oxidase and Pex1p in the yeast Saccharomyces cerevisiae; the regulation of these proteins by oxygen is not mediated by haem. Biochem J 2000 Aug 15;350 Pt 1:313-9 39. Karpichev IV, Small GM Global regulatory functions of Oaf1p and Pip2p (Oaf2p), transcription factors that regulate genes encoding peroxisomal proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 1998 Nov;18(11):6560-70 40. Cheng C, Kacherovsky N, Dombek KM, Camier S, Thukral SK, Rhim E, Young ET Identification of potential target genes for Adr1p through characterization of essential nucleotides in UAS1. Mol Cell Biol 1994 Jun;14(6):3842-52 41. Simon M, Adam G, Rapatz W, Spevak W, Ruis H The Saccharomyces cerevisiae ADR1 gene is a positive regulator of transcription of genes encoding peroxisomal proteins. Mol Cell Biol 1991 Feb;11(2):699-704 42. Rottensteiner H, Kal AJ, Filipits M, Binder M, Hamilton B, Tabak HF, Ruis H Pip2p: a transcriptional regulator of peroxisome proliferation in the yeast Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 1996 Jun 17;15(12):2924-34 43. Karpichev IV, Luo Y, Marians RC, Small GM A complex containing two transcription factors regulates peroxisome proliferation and the coordinate induction of β-oxidation enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 1997 Jan;17(1):69-80 44. Luo Y, Karpichev IV, Kohanski RA, Small GM Purification, identification, and properties of a Saccharomyces cerevisiae oleate-activated upstream activating sequence-binding protein that is involved in the activation of POX1. J Biol Chem 1996 May 17;271(20):12068-75 45. Rottensteiner H, Kal AJ, Hamilton B, Ruis H, Tabak HF A heterodimer of the Zn2Cys6 transcription factors Pip2p and Oaf1p controls induction of genes encoding peroxisomal proteins in Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem 1997 Aug 1;247(3):776-83 77 46. Baumgartner U, Hamilton B, Piskacek M, Ruis H, Rottensteiner H Functional analysis of the Zn2Cys6 transcription factors Oaf1p and Pip2p. Different roles in fatty acid induction of beta-oxidation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1999 Aug 6;274(32):22208-16 47. Simon M, Binder M, Adam G, Hartig A, Ruis H Control of peroxisome proliferation in Saccharomyces cerevisiae by ADR1, SNF1 (CAT1, CCR1) and SNF4 (CAT3). Yeast 1992 Apr;8(4):303-9 48. Young ET, Kacherovsky N, Van Riper K Snf1 protein kinase regulates Adr1 binding to chromatin but not transcription activation. J Biol Chem 2002 Oct 11;277(41):38095-103 49. Wyrick JJ, Holstege FC, Jennings EG, Causton HC, Shore D, Grunstein M, Lander ES, Young RA Chromosomal landscape of nucleosome-dependent gene expression and silencing in yeast. Nature 1999 Nov 25;402(6760):418-21 50. Chen P, Johnson P, Sommer T, Jentsch S, Hochstrasser M Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell 1993 Jul 30;74(2):357-69 51. Myers AM, Tzagoloff A, Kinney DM, Lusty CJ Yeast shuttle and integrative vectors with multiple cloning sites suitable for construction of lacZ fusions. Gene 1986;45(3):299-310 52. Sambrook J, Maniatis T, Fritsch EF Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 53. Gietz RD, Woods RA Transformation of yeast by lithium acetate / single-strandedcarrier DNA / polyethylene glycol method. Methods Enzymol 2002;350:87-96 54. Bradford MM A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976 May 7;72:248-54 78 55. Guarente L Yeast promoters and lacZ fusions designed to study expression of cloned genes in yeast. Methods Enzymol 1983;101:181-91 56. Solińska M Analiza aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1 Saccharomyces cerevisiae. Praca magisterska wykonana w Zakładzie Biologii Molekularnej Wydziału Biologii UW (2002) 57. Wu C The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature 1980 Aug 28;286(5776):854-60 58. Wu C Analysis of hypersensitive sites in chromatin. Methods Enzymol 1989;170:269-89 59. Nedospasov SA, Shakhov AN, Georgiev GP Analysis of nucleosome positioning by indirect end-labeling and molecular cloning. Methods Enzymol 1989;170:408-20 60. Keene MA, Corces V, Lowenhaupt K, Elgin SC DNase I hypersensitive sites in Drosophila chromatin occur at the 5' ends of regions of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jan;78(1):143-6 61. Sledziewski A, Young ET Chromatin conformational changes accompany transcriptional activation of a glucose-repressed gene in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Jan;79(2):253-6 62. Trzcińska-Danielewicz J, Bulkowska U, Fronk J Struktura nukleosomowa promotora genu CTA1 Saccharomyces cerevisiae Plakat prezentowany na XXXVI zjeździe Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, Poznań (2000) 63. Choder M A general topoisomerase I-dependent transcriptional repression in the stationary phase in yeast. Genes Dev 1991 Dec;5(12A):2315-26 64. Fuge EK, Braun EL, Werner-Washburne M Protein synthesis in long-term stationary-phase cultures of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 1994 Sep;176(18):5802-13 79 65. Boucherie H Protein synthesis during transition and stationary phases under glucose limitation in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 1985 Jan;161(1):385-92 66. Rottensteiner H, Wabnegger L, Erdmann R, Hamilton B, Ruis H, Hartig A, Gurvitz A Saccharomyces cerevisiae PIP2 mediating oleic acid induction and peroxisome proliferation is regulated by Adr1p and Pip2p-Oaf1p. J Biol Chem 2003 May 14 (w chwili opracowywania spisu literatury dostępna była jedynie wersja elektroniczna, PMID: 12748191) 67. Venditti P, Costanzo G, Negri R, Camilloni G ABFI contributes to the chromatin organization of Saccharomyces cerevisiae ARS1 B-domain. Biochim Biophys Acta 1994 Nov 22;1219(3):677-89 68. Blumberg H, Hartshorne TA, Young ET Regulation of expression and activity of the yeast transcription factor ADR1. Mol Cell Biol 1988 May;8(5):1868-76 80
