Brak skuteczności przeciwzakrzepowej in vivo po

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego
w Warszawie
Wydział Nauk o Zwierzętach SGGW w Warszawie
Karol Franciszek Kramkowski
Agnieszka Sylwia Leszczyńska
Tytuł pracy:
Brak skuteczności przeciwzakrzepowej in vivo
po krótkoterminowym podawaniu
azotanów u myszy i szczura,
w badaniu porównawczym z azotynami.
Title:
Lack of antithrombotic effects of short-time nitrate treatment in
vivo in rats and mice when compared to nitrite.
Praca wykonana pod kierunkiem: dr n. med. Agnieszki Zakrzeskiej
Tytuł naukowy, imię i nazwisko promotora: dr n. med. Agnieszka Zakrzeska
Nazwa katedry, w której promotor jest zatrudniony: Zakład Biotechnologii, Wyższa Szkoła
Medyczna w Białymstoku
Warszawa, 2016
1
2
3
4
Streszczenie
Tytuł pracy: Brak skuteczności przeciwzakrzepowej in vivo po krótkoterminowym podawaniu
azotanów u myszy i szczura, w badaniu porównawczym z azotynami.
Krótka suplementacja NO3- powoduje u człowieka hipotensję i hamuje agregację płytek
w mechaniźmie NO-zależnym. W niniejszej pracy oceniono czy krótkotrwała suplementacja NO3(0,17 mmol/kg 3 dni p.o. 2xd.) wywołuje efekty przeciwzakrzepowe u szczura i myszy.
NO3- nie modyfikuje formowania zakrzepu u szczurów z nadciśnieniem 2K1C (zakrzepica
indukowana elektrycznie) ani u myszy (zakrzepica wywołana laserowo w metodzie konfokalnej
mikroskopii przyżyciowej), podczas gdy NO2- powoduje znaczny efekt przeciwzakrzepowy. Z kolei
NO2- u szuczurów zmniejsza masę zakrzepu (0,50±0,08mg vs VEH 0,96±0,09mg; p<0,01), hamuje
ex vivo agregację płytek i wytwarzanie TxB2 i wydłuża PT przy znacznym wzroście stężenia NOHb
i NO2- we krwi. W odróżnieniu, NO3- powoduje jedynie nieznaczne zwiększenie stężenia azotynów
w osoczu. Również u myszy nie zaobserwowano efektu działania NO3-, podczas gdy NO2- zmniejsza
kumulację płytek w obaszarze laserowego uszkodzenia śródbłonka.
Mimo, że NO2- powoduje efekty przeciwzakrzepowe in vivo, konwersja NO3- do NO2u szczura i myszy po 3-dniowym stosowaniu była zbyt niska, by wywołać zależne od NO efekty
przeciwpłytkowe i przeciwzakrzepowe.
Słowa kluczowe – azotany, azotyny, szczur, mysz, zakrzepica, płytki krwi
Summary
Title: Lack of antithrombotic effects of short-time nitrate treatment in vivo in rats and mice
when compared to nitrite.
Short-term supplementation of nitrate inhibits platelet aggregation via NO-dependent
mechanism in human. This study evaluated the efficacy of short-term supplementation with NO3 (0.17
mmol/kg 3 days p.o. 2xd.) on antithrombotic effects in rat and mouse.
NO3- does not modify thrombus formation in hypertensive rats 2K1C (electrically induced
thrombosis), or mice (laser induced thrombosis in a method of intravital confocal microscopy), while
NO2- causes a significant antithrombotic effect. In turn, supplementation of NO2- in rats resultes
in reduction of thrombus weight (0,08mg 0.50±0.96 vs VEH±0,09mg ; p< 0,01), inhibits ex vivo
platelet aggregation as well as production of TXB2 and prolongs PT with a significant increase in the
concentration of NOHb and NO2- in the blood. In contrast, NO3- causes only a slight increase in nitrite
concentration in plasma. Moreover, in mice NO3- is found to be inactive, while NO2- reduces
accumulation of platelets in the area of endothelial damage induced by laser.
Although NO2- exerts antithrombotic effect in vivo, the conversion of NO3- to NO2- after 3day supplementation is inssuficient to induce NO-dependent antiplatelet and antithrombotic effects
in rats and mice.
Keywords – nitrates, nitrites, rat, mouse, thrombosis, platelets
5
6
SPIS TREŚCI
STRESZCZENIE……………………………….……………………………………… str. 5
I. WSTĘP………………………………………………………………………….. str. 8
II. MATERIAŁY I METODY……………………………………………………. str. 10
III. WYNIKI……………………………………………………………………….. str. 14
IV. DYSKUSJA……………………………………………………………………. str. 22
V. LITERATURA………………………………………………………………… str. 26
7
I.
WSTĘP
Przez wiele dekad uznawano, że azotyny (NO2-) i azotany (NO3-) są stabilnymi
produktami końcowymi metabilizmu tlenku azotu (NO) wytwarzanego przez specyficzne
syntazy (NOS) (Bryan 2006). Jednakże w ostatnich latach zaproponowano istnienie szlaku
redukcyjnego NO3-–NO2-–NO, który działa jako system rezerwowego wytwarzania NO
(Kapil 2013).
Kompatybilnie z dużym znaczeniem szlaku redukcyjnego wytwarzania NO in vivo,
wykazano, że nawet krótkotrwała (3 dni) suplementacja NaNO3 (0,1 mmol/kg dziennie)
powoduje znaczny wzrost stężenia NO2− w osoczu zdrowych ludzi, czemu towarzyszy
obniżenie ciśnienienia skurczowego krwi (Larsen 2006). Analogicznie, krótkotrwała (3 dni)
suplementacja dietetyczna, w postaci podawania soku z buraków zdrowym ochotnikom, nie
tylko istotnie obniżyła skurczowe i rozkurczowe ciśnienie krwi, ale też poprawiła fukncję
śródbłonka i istotnie ograniczyła agregację płytek krwi indukowaną ex vivo kolagenem i ADP
(Webb 2008). Wywołane przez azotany zmiany ciśnienienia krwi i agregacji płytek
korelowały jednocześnie ze wzrostem stężenia azotynów w osoczu. Co więcej Kapil i wsp.
(2006) wykazali, że nieorganiczne azotany podawane w pojedynczej dawce (12 mmol lub 24
mmol) lub w postaci jednej porcji soku z buraków (zawierającej 5,5 mmol azotanu), obniżają
ciśnienie krwi. Efekt ten jest związany z dawkozależnym zwiększeniem stężenia azotynów
w osoczu, jak też ze zwiększeniem stężenia cyklicznego GMP (cGMP), co potwierdza,
że którkoterminowy efekt działania azotanów u człowieka jest zależny od szlaku NO-cGMP
(Kapil 2010). Oczywiście, nie tylko krótkotrwałe, ale i długotrwałe zażywanie
nieorganicznych suplementów, będących źródłami NO przynosi korzystne efekty w układzie
sercowo-naczyniowym człowieka (Zand 2011).
Zdecydowana większość danych literaturowych sugeruje, że korzystne efekty
działania azotanów u człowieka, niezależnie czy po krótko- czy długoterminowym
stosowaniu (Zand 2011; Mills 2016), wynikają z istnienia jelitowo-śliniankowego szlaku
azotany-azotyny-NO. Od dawna bowiem donoszono, że wchłonięte azotany są aktywnie
przenoszone z krwi do gruczołów śliniankowych i kumulują się w ślinie (Tannenbaum 1976;
Spiegelhalder 1976; Kortboyer 1994; Qin 2012). Bakterie kolonizujące jamę ustną redukują
azotany do azotynów (Tannenbaum 1974; Ishiwata 1975; Duncan 1995; Doel 2005; Kapil
2006), które następnie są ponownie połykane i wchłaniane w jelitach, co skutkuje
zwiększeniem stężenia azotynów w osoczu (Lundberg 2004; Webb 2008; Kapil 2010; Qin
8
2012). Jak opisali to w pracy poglądowej Lundberg i Weitzberg (2010), konwersja azotanyazotyny u jamie ustnej człowieka jest prowadzona przez specyficzne enzymy redukujące
bakterii komensalnych, podczas gdy redukcja azotyny-NO jest katalizowana przez witaminę
C, polifenole czy enzymy cytochromu P450. Co więcej, wykazano że cały szereg
wystęujących u ssaków struktur, redukuje azotyny do NO, włączając w to hemoglobinę (Hb)
(Huang 2005; Larsen 2011; Kahn 2013), mioglobinę (Mb) (Hendgen-Cotta, 2014),
neuroglobinę (Ngb) (Jayaraman 2011), oksydoreduktazę ksantynową (XOR), (CantuMedellin 2013 a, b; Kramkowski 2016), oksydazę aldehydową (AO) (Li 2009), oksydazę
sulfidową (SO) (Wang 2010), elementy mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów
(ETC) oraz NOS (Sparacino-Watkins 2014). Procesy te ulegają szczególnemu nasileniu przy
niskich ciśnieniach parcjalnych tlenu i przy obniżeniu pH (Cantu-Medellin 2013 a, b).
Podsumowując, dane literaturowe wskazują na istnienie dwóch ważnych szlaków
wytwarzania NO: pierwszy z endogennej L-argininy, angażujący NOS i drugi, angażujący
redukcję azotanów do azotynów, który wydaje się być szczególnie aktywny w kontekście
dysfunkcji śródbłonka lub hipoksji lub niskiego pH.
Wiele doniesień sugeruje, że korzystne efekty farmakologiczne azotanów dotyczą,
poza człowiekiem, również szczura i myszy (Bouaziz-Keteta 2014; Jiang 2014; Carlström
2015; Roberts 2015). Jednakże niejasne pozostaje, czy szlak redukcyjny azotany-azotyny-NO
jest tak samo efektywny u gryzoni laboratoryjnych, jak u człowieka oraz czy NO-zależne
efekty widoczne będą już po 3 dniach stosowania, tak jak ma to miejsce u człowieka (Larsen
2006). Aby wyjaśnić ten problem, wykonano w ramach niniejszej pracy badania
porównawcze azotanów i azotynów, pod kątem przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych
efektów działania azotanów oraz oceniono konwersję azotanów do azotynów u szczurów po
3 dniach stosowania. Dodatkowo zbadano przeciwzakrzepowe efekty 3-dniowego stosowania
azotanów, w porównaniu z azotynami, u myszy.
9
II.
MATERIAŁY I METODY
Zwierzęta
Pochodzenie
Samce szczura pochodzącego z hodowli niekrewniaczej stada Wistar zakupiono
w Charles River Laboratory i aklimatyzowano w zwierzętarni Jagiellońskiego Centrum
Terapii Eksperymentalnych (JCET) Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Myszy
transgeniczne z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) szczepu C57Bl/6-Tg(CAGEGFP)1Osb/J
(Okabe
1997)
pozyskano
z
Centrum
Medycyny
Doświadczalnej
w Białymstoku.
Warunki dobrostanu
Zwierzęta wykorzystane w badaniach utrzymywane były podczas hodowli
i eksperymentu w warunkach, w których zachowano wszelkie wymogi niezbędne
do spełnienia dobrostanu. Zwierzęta utrzymywane były w kategorii SPF (Specyfic Pathogen
Free) w indywidualnie wentylowanych klatkach IVC, zapewniających utrzymanie wysokiego
reżimu higienicznego. Zwierzęta były rozgrupowane w klatkach po 4-5 osobników i miały
stały dostęp do sterylizowanej wody wodociągowej oraz karmy bytowej. W pomieszczeniach
panowały optymalne warunki, takie jak: stała temperatura (22±2ºC), wilgotność powietrza
(35-60%), nadciśnienie utrzymywane dzięki systemom klimatyzacyjnym, dzień świetlny
12/12 godzin, 15-krotna wymiana powietrza na godzinę (nieprzekraczająca 0,3m/s). Warunki
bytowania zwierząt urozmaicane były materiałami do budowy gniazd, domkami
stanowiącymi schronienie oraz papierowymi rolkami służącymi do zabawy, schronienia
i zgryzania. Wszystkie te elementy umożliwiają utworzenie odpowiedniego mikrośrodowiska
do celów rozrodczych, odpoczynku i rozładowania stresu.
Zasada 3R
Obecnie w nurt badań eksperymentalnych wpisuje się konieczność zastosowania
zasady 3R (replecment, reduction, refinment) czyli zastąpienia badań na zwierzętach
modelami in vitro albo innymi metodami alternatywnymi; zmniejszenia liczby zwierząt
w doświadczeniu, oraz udoskonalenia metody badań tak, żeby ograniczyć poziomu stresu
i bólu. Prezentowane w niniejszej pracy wyniki badań, uzyskano w oparciu o modele
eksperymentalne in vivo, które nie można w żaden sposób zastąpić badaniami in vitro.
10
Podobnie, niemożliwe jest udoskonalenie prezentowanych metod eksperymentalnych,
ponieważ zostały one wystandaryzowane tak, aby do minimum zredukować poziomu stresu
i bólu u zwierząt badanych, szczególnie ze względu na fakt, że pojawienie się wymienionych
oznak dyskomfortu u zwierząt w sposób istotny wpłynęłoby na wyniki badań. W przypadku
zasady zmniejszenia liczby użytych zwierząt, użyta przez nas metoda mikroskopii konfokalnej
umożliwiła zredukowanie do minimum liczby myszy. Eksperyment konfokalny (opis poniżej)
polega na indukowaniu laserem zakrzepów w naczyniu krwionośnym. Dzięki metodzie laserowej
można wykonać 3-4 indukcje zakrzepicy na 3-4 naczyniach krwionośnych, co w konsekwencji daje
możliwość uzyskania od 9-16 wyników od jednej myszy.
Wszystkie procedury zostały zaaprobowane przez Lokalną Komisję Etyczną do spraw
Doświadczeń na Zwierzętach i prowadzone były według wytycznych, zgodnych z przepisami
prawa międzynarodowego, włączając w to Dyrektywę Unii Europejskiej 2010/63/EU oraz
zasady Guidelines for the Care and the Use of Animals in Biomedical Research (Giles 1987).
Indukcja nadciśnienia naczyniowo-nerkowego
Szczury znieczulano pentobarbitalem (40 mg/kg, ip.). Nadciśnienie naczyniowonerkowe typu two-kidney one-clip (2K1C) indukowano przez standaryzowane niepełne
podwiązanie lewej tętnicy nerkowej (Huang 1981). Po sześciu tygodniach rozwoju
nadciśnienia, średnie ciśnienie krwi (MBP) u operowanych szczurów mierzono metodą tail
cuff (Panlab, Harvard Apparatus, UE) (Zatz 1990). Wszystkie szczury ze zwiększonym
ciśnieniem krwi (SBP/DBP>140/90 mmHg) przypisano do grupy zwierząt nadciśnieniowych.
Jako kontrola wobec szczurów 2K1C, służyły szczury pozornie operowane (SO). Zwierzęta
te przechodziły taką samą operację jak szczury 2K1C, lecz nie podwiązywano im tętnicy
nerkowej. Szczury 2K1C podzielono na dwie grupy: przeznaczoną do indukcji zakrzepicy
tętniczej oraz do eksperymentów in vitro.
Szczurzy model zakrzepicy tętniczej in vivo
Szczury 2K1C znieczulano pentobarbitalem (40 mg/kg, i.p.) i układano na grzbiecie
na termostatowanym (37°C) stoliku operacyjnym. Zakrzepicę tętniczą indukowano poprzez
stymulację elektryczną prawej tętnicy szyjnej wspólnej, jak opisano wcześniej (Kramkowski
2012). W skrócie, anoda, którą stanowił zagięty w kształt litery “L” drut ze stali nierdzewnej,
11
umieszczano pod tętnicą i podłączano do źródła prądu stałego. Katodę umieszczano
podskórnie w okolicy pachwiny. Następnie tętnicę stymulowano przez 10 minut prądem
o stałym natężeniu 1mA. W 55 minucie od rozpoczęcia stymulacji, fragment tętnicy
zawierający uformowany już zakrzep wycinano, następnie rozcinano wzdłużnie i wyjmowano
cały zakrzep. Następnie zakrzep suszono na powietrzu w temperaturze pokojowej, a po 24
godzinach ważono.
Agregacja płytek
Stymulowana kolagenem agregacja płytek w pełnej krwi cytrynianowej badana była
metodą impedancyjną, jak opisano wcześniej (Kramkowski 2012) w aparacie Whole Blood
Lumi-Aggregometer (Chrono-log, USA). W skrócie, próbki krwi pobierano od szczurów
2K1C z zakrzepicą, którym podawano azotany lub azotyny. Próbki zbierano na 3,13%
cytrynian sodu w stosunku objętościowym 10:1. Kolagen (5 µg/ml) dodawano po 15
minutach inkubacji w temperaturze 37°C z 0,9% NaCl (vol/vol=1:1). Zmiany w rezystancji
w próbce mierzono przez 6 minut, a maksymalne wychylenie krzywej agregacji w szóstej
minucie traktowano jako wynik, który podawano w postaci odsetka odpowiedzi w próbkach
kontrolnych.
Dynamiczna generacja thromboksanu B2 (TxB2)
Próbki krwi cytrynianowej od szczurów 2K1C z zakrzepicą rozcieńczano 0,9% NaCl
w stosunku objętościowym 1:1, a następnie mieszano w kuwetach agregacyjnych
z szybkoscią 1000 obr./min w temperaturzez 37°C. W czasie 0, 20, 40, 60 minut z mieszaniny
odbierano małe próbki i mieszano je z zimnym roztworem kwasu acetylosalicylowego
(stężenie końcowe 500 µM) w stosunku objętościowym 1:1. Stężenia TxB2 w próbkach
oznaczano metodą ELISA, zgodnie z instrukcjami producenta zestawu odczynników.
Pomiar stężeń azotynów, azotanów w osoczu i nitrozyl-hemoglobiny i we krwi
Stężenia azotanów i azotynów w osoczu oznaczano korzystając z aparatu ENO-20,
wykorzystującego metodę chromatografii wysokosprawnej (HPLC). Z kolei stężenia NOHb
we krwi oznaczano metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR).
12
Pomiar prametrów krzepnięcia i fibrynolizy osocza oraz parametrów morfologicznych krwi
Czas protrombinowy (PT), czas po częściowej aktywacji tromboplastyną (aPTT), czas
trombinowy (TT), wskaźnik protrombinowy (wskaźnik QUICK), stężenie fibrynogenu (Fg)
metodą
Claussa
oznaczano
zgodnie
ze
wskazaniami
producentów
odczynników
wykorzystując aparat Coag-Chrom 3003 (Bio-ksel, Poland).
Z kolei, w celu szczegółowej oceny procesu tworzenia fibryny, wykorzystano metodę
opisaną wcześniej (He 2001) w modyfikacji własnej (Buczko 2003). W skrócie, fibryna
tworzona była w próbkach osocza pozyskanego z krwi cytrynianowej dzięki rekalcynacji
prowadzonej bezpośrednio w dołkach mikropłytki za pomocą CaCl2 (36 mM)
rozpuszczonego w buforze Tris (66 mM Tris, 130 mM NaCl, pH 7.4) w temperaturze 37°C.
Przyrosty gęstości optycznej w dołkach (w miarę wytwarzania fibryny) mierzono za pomocą
czytnika mikropłytek (Biotec EL808, USA) w 1- minutowych interwałach przez 9 minut,
a wyniki przedstawiono jako pole powierchni pod krzywą (AUC). Analiza typu point-to-point
wykonywana była po przeliczeniu wyników jako odsetka wartości wyjściowej gęstości
optycznej.
Parametry morfologiczne krwi oceniano za pomocą aparatu Animal Blood Counter
(ABC Vet, Horiba, Germany) we krwi zebranej z prawej komory serca szczurów.
Przyżyciowe obrazowanie kumulacji płytek po laserowym uszkodzeniu śródbłonka u myszy
Myszy GFP znieczulano mieszaniną ketaminy (120mg/kg) i ksylazyny (12,5mg/kg)
(0,25ml i.p.). Po wykonaniu laparotomii, wypreparowywano żyłę krezkową z jamy brzusznej
i wraz z jelitami rozpinano na plastikowym stożku. Żyła była przez cały czas polewana
ogrzanym do 37°C 0,9% roztworem NaCl buforowanym fosroranami (PBS), w celu
utrzymania właściwego pH oraz temperatury wyizolowanych tkanek. Po umieszczeniu tak
przygotowanej myszy pod obiektywem mikroskopu konfokalnego, śródbłonek żyły
krezkowej uszkadzany był za pomocą lasera argonowego (λ=514 nm) (Intelligent Imaging
Innovations GmbH, Germany) wbudowanego w tor optyczny mikroskopu. Intensywność
świecenia oraz czas naświetlania laserem były ściśle wystandaryzowane i w każdym
eksperymencie miały stałą wartość (Falati 2002; Hayashi 2008; Kramkowski 2012). Zmiany
13
fluorescencji
mierzono
automatycznie
za
pomocą
oprogramowania
Slidebook5.0.
Intensywność fluorescencji GFP normalizowana była względem wartości wyjściowej,
dodatkowo, do obliczeń statystycznych wyliczano pola powierzchni po krzywymi zmian
fluorescencji w czasie.
Podawanie NaNO2 i NaNO3
Szczury i myszy otrzymywały azotany i azotyny (0,17 mmol/kg) dwa razy dziennie
przez 3 dni za pomocą sondy dożołądkowej; ostatnia dawka podawana była 20 minut przed
znieczuleniem. Rozpuszczalnikiem, a zarazem kontrolą (VEH) była sterylizowana woda
wodociągowa (2 ml/kg). Dawki azotanów i azotynów dobrane były w oparciu o wcześniejsze
badania własne, które pokazały, że azotyn w dawce 0,17 mmol/kg jest silną substancją
przeciwzakrzepową, lecz o zaniedbywalnym efekcie hemodynamicznym (Kramkowski 2016).
Odczynniki i leki
Użyto następujących odczynników: azotyn sodu (NaNO2), azotan sodu (NaNO3),
chlorek wapnia (CaCl2), chlorek sodu (NaCl), bufor Tris (Sigma–Aldrich, Niemcy);
pentobarbital (Morbital; Biovet, Polska); sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS;
Biomed,Polska); kolagen Chrono-log (USA); gotowe do użycia zestawy odczynników
do oznaczania morfologii krwi do aparatu HoribaABX (Niemcy); odczynniki laboratoryjne
do rutynowych oznaczań PT, aPTT i stężeń Fg w osoczu szczurzym (HemosIL
Instrumentation Laboratory, USA); zestawy ELISA: rat PAI-1 i tissue tPA ELISA kits
(Hyphen BioMed, Francja), TxB2 ELISA kit (ENZO Life Science, Francja). Pozostałe
substancje zakupiono w Sigma (Gillingham, Dorset, UK).
Analiza statystyczna
Wykorzystano test analizy wariancji (ANOVA) z korektą Bonferroniego, do analiz
korelacji wykorzystano test Pearsona. Wyniki przedstawiano jako średnia±SEM. Wartość
p<0.05 traktowano jako wskaźnik istotności statystycznej.
14
III.
WYNIKI
Wpływ azotanów i azotynów na masę zakrzepu u szczurów
Podawanie azotanów w dawce 0,17 mmol/kg dwa razy dziennie przez 3 dni (p.o.) nie
wpłnęło na masę zakrzepu (0,83±0,06 mg vs VEH 0,96±0,09 mg, n=11, ns), podczas gdy
równomolowa dawka azotynów istotnie zmniejszała masę zakrzepu (0,50±0,08 mg vs VEH
0,96±0,09 mg, n=9, p<0,01) (Ryc. 1).
Rycina 1. Efekt przeciwzakrzepowy azotanów w porównaniu do azotynów u szczurów
hipertensyjnych (2K1C) po dożołądkowym podaniu dwa razy dziennie przez 3 dni (0,17
mmol/kg [2 ml/kg]); **p<0,01 vs VEH.
15
Wpływ azotanów i azotynów na funkcję płytek krwi ex vivo
Analogicznie jak powyżej, podawanie azotanów nie wpłynęło na indukowaną
kolagenem agregację płytek we krwi pełnej ex vivo (87,50±7,14% vs VEH 100±4,46%, ns),
podczas gdy azotyny zahamowały agregację płytek (70,54±7,14% vs VEH, p<0,05) (Ryc. 2a).
Co więcej, azotyny nie wpływały na dynamiczną generację TxB2 przez płytki w badaniu
na pełnej krwi, podczas gdy azotyny istotnie hamowały ten proces (p<0,05 vs VEH)
(Ryc. 2b).
Rycina 2. Efekt przeciwpłytkowy azotanów w porównaniu do azotynów ex vivo na
a: agregację płytek stymulowaną kolagenem we krwi pełnej; b: dynamiczną generację TxB2
u szczurów hipertensyjnych (2K1C) po dożołądkowym podaniu dwa razy dziennie przez
3 dni (0,17 mmol/kg [2 ml/kg]); *p<0,05 vs VEH.
16
Wpływ azotanów na stężenia azotanów i azotynów w osoczu oraz NOHb we krwi
Zgodnie z oczekiwaniami, stężenie azotanów w osoczu było znacznie podwyższone
u szczurów, które otrzymywały tą substancję (114,45±6,86 µM vs. VEH 13,70±2,41 µM,
p<0,05), podczas gdy stężenie NOHb we krwi było zwiększone jedynie w sposób
umiarkowany (328±6,0 jednostek/mg vs. VEH, 231,9±36 jednostek/mg, ns). W grupie
otrzymującej azotyny (Ryc. 3), osoczowe stężenia azotynów były znacznie podwyższone
(43,71±6,44 µM vs. VEH 0,61±0,11 µM, p<0,001), podobnie jak i stężenia NOHb we krwi
(27100±5514 jednostek/mgvs VEH 231,9±36 jednostek/mg, p<0,001). Stężenia NOHb we
krwi korelowały z masą zakrzepu oraz ze stężeniami azotynów w osoczu (Ryc. 4a,b).
Rycina 3. Wpływ azotynów i azotanów na: a: stężenie azotynów; b: stężenie NOHb
u hipertensyjnych szczurów (2K1C) po dożołądkowym podaniu dwa razy dziennie przez
3 dni (0.17 mmol/kg [2 ml/kg]); ***p<0.001 vs VEH.
17
Rycina 4. Korelacje pomiędzy a: masą zakrzepu a stężeniem NOHb, *p<0.05. b: stężeniem
NOHb a stężeniem azotynów; **p<0,001.
18
Wpływ azotanów i azotynów na wytwarzanie fibryny
Podawanie azotanów nie wpłynęło na wytwarzanie fibryny, podczas gdy azotyny
zmniejszały ten parametr (p<0,05 vs VEH w analizie point-to-point względem krzywej VEH)
oraz zmniejszyły pole powierzchni pod krzywą (88,71±17,44 jednostek2 vs. VEH
171,94±15,79 jednostek2, p<0,01) (Ryc. 5a,b).
Rycina 5. Działanie ex vivo azotanów i azotynów na a: generację fibryny; b: pole powierzchni
pod krzywą (AUC) u szczurów hipertensyjnych (2K1C) (po dożołądkowym podaniu dwa razy
dziennie przez 3 dni (0,17 mmol/kg [2 ml/kg]); *p<0,05, **p<0,01 vs VEH.
19
Wpływ azotanów i azotynów na kumulację płytek krwi in vivo: obrazowanie przyżyciowe
Azotany nie wpływały na kumulację płytek w obszarze laserowego uszkodzenia
śródbłonka naczyniowego u myszy GFP (90,26±24,45 jednostek2 vs VEH, 95,76±19,66
jednostek2, ns), podczas gdy azotyny zmniejszały pole powierzchni pod krzywą zmian
kumulacji płytek w czasie (49,03±6,31 jednostek2 vs. VEH 95,76±19,66 jednostek2, p<0,05)
(Ryc. 6a,b).
Rycina 6.
Zarejestrowane przyżyciowo działanie azotanów i azotynów na A: kinetykę
akumulacji płytek krwi w miejscu uszkodzenia śródbłonka laserem u myszy GFP, B: pole
powierzchni pod krzywą (AUC) (po dożołądkowym podaniu dwa razy dziennie przez 3 dni
(0,17 mmol/kg [2 ml/kg]); *p<0,05 vs VEH.
.
20
Wpływ azotanów i azotynów na parametry krzepnięcia, fibrynolizy i morfologię krwi
Jak pokazuje Tabela 1, stosowanie azotynów nieznacznie wydłużyło PT, lecz nie
wpłynęło na żadne inne oceniane parametry, takie jak aPTT, TT, stężenie Fg, QUICK.
Zarówno azotany jak i azotyny nie wpłynęły na parametry morfologicznie krwi w istotny
klinicznie sposób (Tabela 2).
Tabela1. Parametry krzepnięcia szczura.
VEH (2K1C)
3 dni NaNO2 0,17
mmol/kg
3 dni NaNO3 0,17
mmol/kg
PT [sec.]
18,1±0,2
19,5±0,6*
18,6±0,4
aPTT [sec.]
19,1±0,4
18,7±0,6
18,5±0,7
Fg [ng/ml]
2,5±0,1
2,5±0,1
2,4±0,04
QUICK
58,6±2,0
55,0±4,1
57,5±2,6
PT – czas protrombinowy; TT – czas protrombinowy; aPTT – czas częściowej
tromboplastyny po aktywacji; Fg – stężenie fibrynogenu; QUICK – procentowy wskaźnik
czasu protrombinowego (indeks Quick’a); * p<0.05 vs. VEH.
21
Tabela 2. Morfologia krwi szczura.
VEH (2K1C)
NaNO2
3 dni 0,17 mmol/kg
NaNO3
3 dni 0,17 mmol/kg
6
3,33±0,18
2,70±0,19
3,00±0,35
RBC [10 /µl]
6
7,51±0,2
7,10±0,27
7,10±0,10
HGB [g/dl]
13,59±0,35
13,25±0,4
13,23±0,27
HCT [%]
41,58±1,07
40,00±1,52
40,68±1,55
MCV [fl]
55,42±0,31
56,33±0,71
57,5±0,50*
MCH [pg per cell]
18,13±0,15
18,68±0,28
18,68±0,25
MCHC [g/dl]
32,68±0,15
33,17±0,63
32,60±0,45
623±24
650±31
669±52
WBC [10 /µl]
3
PLT [10 /µl]
WBC – krwinki białe; RBC – krwinki czerwone; HGB – hemoglobina; HCT – hematokryt;
MCV – średnia objętości krwinki czerwonej; MCH – średnia masa hemoglobiny w krwince
czerwonej; MCHC – średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach; PLT – płytki krwi.
22
IV.
DYSKUSJA
W prezentowanej pracy po raz pierwszy wykazano brak przeciwzakrzepowego
działania niskiej dawki azotanu (0,17 mmol / kg , p.o., 2 razy dziennie przez 3-dni) u szczura
i myszy. Natomiast azotyn podawany w dawce równomolowej wykazał istotne statystycznie
zmniejszenie masy zakrzepu, zahamowanie stymulowanej kolagenem agregacji płytek krwi
ex vivo, oraz zahamowanie wytwarzania TXB2 we krwi pełnej. Dodatkowo azotyn skrócił
czas PT i zahamował powstawanie fibryny. Ponieważ całkowity potencjał krzepnięcia zależny
jest w dużym stopniu od ekspresji fosfolipidów eksponowanych na powierzchni
zaktywowanych płytek krwi, wnioskujemy, że przeciwzakrzepowe działanie azotynu oparte
jest bardziej na mechanizmie zależnym od hamowania aktywności płytek krwi, a nie
na
bezpośrednim
zahamowaniu
aktywności
osoczowych
czynników
krzepnięcia.
W badaniach naszych zaobserwowaliśmy istotną korelację pomiędzy masą zakrzepu
i stężeniem azotynów a stężeniem NOHb we krwi badanych szczurów. Parametry te wskazują
na istotny udział NO w przeciwzakrzepowym działaniu azotynu. Podobne efekty, wskazujące
na słuszność wyciągniętych przez nas wniosków, zaobserwowaliśmy w badaniach
na myszach, w których azotany wykazały brak efektu przeciwzakrzepowego, natomiast
azotyny istotnie zmniejszyły proces kumulacji płytek krwi w miejscu uszkodzenia śródbłonka
laserem.
W świetle danych literaturowych wazodylatacyjny efekt azotynów został dogłębnie
zbadany, natomiast wpływ tego związku na aktywność płytek krwi pozostaje nadal
nierozstrzygnięty. Zaobserwowano bowiem, że wysokie dawki azotynu (500 mM)
zahamowały indukowaną ADP agregację płytek krwi oraz spowodowały wzrost stężenia
cGMP (Laustiola 1991), co wskazuje na istotną rolę NO jako mediatora efektu
przeciwpłytkowego za pośrednictwem aktywacji cyklazy guanylanowej. Ważną rolę
azotynów w działaniu hamującym aktywność płytek krwi opisano również u ludzi (Webb
2008). W grupie osób badanych zaobserwowano istotny wzrost stężenia azotynów we krwi
po spożyciu posiłku bogatego w azotany, któremu towarzyszyło obniżenie ciśnienia krwi oraz
zahamowanie indukowanej ADP i kolagenem agregacji płytek krwi. W badaniach
prezentowanych w niniejszej pracy wykazano, że azotyny zahamowały aktywność płytek
krwi ex vivo, na co wskazują wyniki indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi we krwi
pełnej oraz dynamicznej generacji tromboksanu. Z uwagi na fakt ścisłej zależności pomiędzy
płytkami krwi a zakrzepicą tętniczą (Kramkowski 2010; Pruolle 2014), wyniki naszych badań
i badań innych autorów wskazują że działanie azotynów na proces zakrzepowy jest w istotny
23
sposób mediowane poprzez zahamowanie aktywności płytek krwi. Wnioski te potwierdzają
wyniki badań na myszach z użyciem przyżyciowej mikroskopii konfokalnej, w których
zaobserwowaliśmy istotnie zmniejszoną kumulację płytek krwi w miejscu uszkodzenia
śródbłonka laserem u myszy narażanych na azotyny. W modelu tym azotany nie wpłynęły
na aktywność płytek krwi.
Reasumując, opisane w pracy wyniki badań wskazują na istotny przeciwzakrzepowy
efekt azotynu, zależny od uwalnianego przez nie NO, zaobserwowany po trzydniowym
podawaniu związku badanym gryzoniom. Natomiast, w przeciwieństwie do ludzi,
zaobserwowany u szczurów i myszy brak przeciwzakrzepowego działania azotanu, związany
jest z nieefektywną i niewystarczalną konwersją azotanów do azotynów, i w konsekwencji
niemożliwością wywołania zależnego od NO przeciwpłytkowego efektu (Larsen 2006).
Z kolei, podobnie jak u ludzi, przeciwpłytkowe działanie azotynu jest istotnie zależne od NO
(Lasrsen 2006; Webb 2008). Przedstawione powyżej obserwacje dotyczące aktywności
biologicznej azotynu, odnajdują odzwierciedlenie w badaniach prezentowanych w niniejszej
pracy,
szczególnie
gdy
rozpatrzymy
wyniki
wskazujące
na
korelacje
pomiędzy
przeciwzakrzepową aktywnością azotynów a stężeniem NOHb we krwi. W tym miejscu
należy podkreślić, że nie uchwyciliśmy ważnego z punktu widzenia farmakologii
przeciwpłytkowego i przeciwzakrzepowego efektu azotanu, który mógłby wykazać różnice
pomiędzy metabolizowaniem azotanów i azotynów u myszy i szczura w przełożeniu na efekty
opisane u człowieka.
U ludzi okres półtrwania nieorganicznego azotanu po podaniu doustnym jest
zaskakująco długi bowiem trwa od 5 do 8 godzin. W organizmie człowieka azotany ulegają
stałej konwersji do azotynów, w związku z czym wzrost stężenia jednego związku we krwi
jest równoważny ze wzrostem drugiego (Larsen 2011). Efekt ten jest związany
z wchłanianiem przez gruczoły śliniankowe azotanów i ich redukcję do azotynów pod
wpływem mikroflory bakteryjnej zasiedlającej jamę ustną człowieka (Lundberg 2010).
W badaniach prezentowanych w niniejszej pracy zarówno azotan sodu jak i azotyn
sodu podawany był zwierzętom bezpośrednio sondą dożoładkową. Jak wspomniano, u ludzi
azotany po dostaniu się do krwiobiegu wychwytywane są przez ślinianki, a następnie
redukowane enzymatycznie przez mikroflorę bakteryjną jamy ustnej do azotynów.
U szczurów również zidentyfikowano bakterie nitryfikacyjne, których liczebność wzrasta w
kierunku tylnej części języka (Li 1997). Badania przeprowadzone przez Hyde I wsp. (2014)
wykazały, że u szczurów suplementowanych wysokimi dawkami (1 g/litr w wodzie pitnej)
24
azotanów przez 7 dni pojawił się znaczny spadek ciśnienia krwi oraz wystąpiły zmiany flory
bakteryjnej
kolonizującej
język
na
korzyść
bakterii
nitryfikacyjnych,
w
tym
H. parainfluenzae, Granulicatella i Aggregatibacter. Dieta wysokoazotanowa indukuje
zmiany mikrobiomu jamy ustnej w kierunku skutecznej redukcji azotanów do azotynów i do
NO (Hyde 2014). Opisane wyniki badań prezentowanych w danych literaturowych są zgodne
z wynikami badań naszego zespołu (Kramkowski 2013), w których zaobserwowano istotny
spadek masy zakrzepu u szczurów którym podawano azotany w dawce 0.17 mmol/kg przez
10 dni do 65% w stosunku do zwierząt kontrolnych, p<0.05. W przypadku badań
prezentowanych
w
niniejszej
pracy
nie
uzyskano
zależnego
od
NO
efektu
przeciwzakrzepowego u szczurów suplementowanych azotanami w równomolowej dawce
(0.17 mmol/kg), prawdopodobnie z uwagi na zbyt krótki, bo zaledwie 3-dniowy okres
podawania tego związku z wodą do picia, w trakcie którego mikroflora bakteryjna u myszy
i szczura nie uległa modyfikacji ilościowej w kierunku bakterii zdolnych do redukowania
azotanów do azotynów.
Badania naukowe dotyczące analizy efektów długoterminowej suplementacji
azotanami wykazały,
że u szczurów z chirurgicznie podwiązanymi przewodami
śliniankowymi w modelu eksperymentalnym (BPSDL) narażanie azotanami istotnie
zredukowało wywoływane stresem uszkodzenia błony śluzowej żołądka (Jin 2013).
W modelu BPSDL podwiązanie przewodów śliniankowych skutkowało całkowitym
zahamowaniem sekrecji azotanów przez ślinianki, dając w rezultacie istotny spadek stężenia
azotanów (60%), azotynów (66%) i NO (62%) w żołądku. Jednotygodniowa suplementacja
azotanami w wodzie do picia dała w rezultacie wzrost stężenia azotanów i azotynów
mierzonych w soku żołądkowych zwierząt na czczo. Podobne efekty zaobserwowano
w stężeniach NO w warstwach luminalnych, które wzrosło aż o 1000%. Na uwagę zasługuje
fakt, że protekcyjny efekt azotanów na wywoływane stresem uszkodzenia błony śluzowej
żołądka u szczurów wymaga sprawnej wydzielniczej funkcji ślinianek. Istotna jest również
długoterminowa ekspozycja na azotany, podczas której rozwija się mikroflora bakteryjna
redukująca azotany do azotynów. Niestety warunki te nie są spełniane u zwierząt
laboratoryjnych karmionych standardową dietą.
Podsumowując, potwierdziliśmy, że azotyny wykazują znaczne NO-zależne efekty
przeciwzakrzepowe in vivo nie tylko u człowieka, ale u szczura i myszy. Jednakże konwersja
azotanów do azotynów u szczura i myszy po krótkim, 3-dniowym stosowaniu jest
niewystarczająca do wywołania przez azotyny NO-zależnego efektu przeciwzakrzepowego
25
u tych zwierząt. Wynika to najprawdopodobniej z mniej efektywnego krążenia jelitowośliniankowego i niedostatecznego rozwoju flory mikrobiologicznej u szczurów i myszy
– w porównaniu do człowieka, u którego wykazano NO-zależne efekty krótkotrwałego
stosowania azotanów (Kapil 2013).
Źródła finansowania
Niniejsza praca finansowana była ze środków Unii Europejskiej: European Regional
Development Fund under the Innovative Economy Programme (grant koordynowany przez
JCET-UJ, No. POIG.01.01.02-00-069/09), Narodowe Centrum Badań i Rozwoju grant
METENDOPHA (grant nr. STRATEGMED1/233226/11/NCBR/2015) oraz z grantów
statutowych Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku (nr 123-26924F i 153-26600F).
26
Literatura
Bouaziz-Ketata H, Salah GB, Salah HB, Marrekchi R, Jamoussi K, Boudawara T, Fakhfekh
F, Zeghal N (2014) Nitrate-induced biochemical and histopathological changes in the liver of
rats: ameliorative effect of Hyparrhenia hirta. Biomed Environ Sci 27:695-706
Bryan NS (2006) Nitrite in nitric oxide biology: cause or consequence? A systems-based
review. Free Radic Biol Med 41:691-701
Buczko W, Mogielnicki A, Kramkowski K, Chabielska E (2003) Aspirin and the fibrinolytic
response. Thromb Res 110:331-334
Cantu-Medellin N, Kelley EE (2013a) Xanthine oxidoreductase-catalyzed reactive species
generation: A process in critical need of reevaluation. Redox Biol 1:353-358
Cantu-Medellin N, Kelley EE (2013b) Xanthine oxidoreductase-catalyzed reduction of nitrite
to nitric oxide: insights regarding where, when and how. Nitric Oxide 34:19-26
Carlström M, Liu M, Yang T, Zollbrecht C, Huang L, Peleli M, Borniquel S, Kishikawa H,
Hezel M, Persson AE, Weitzberg E, Lundberg JO (2015) Cross-talk Between Nitrate-NitriteNO and NO Synthase Pathways in Control of Vascular NO Homeostasis. Antioxid Redox
Signal 23:295-306
Doel JJ, Benjamin N, Hector MP, Rogers M, Allaker RP (2005) Evaluation of bacterial nitrate
reduction in the human oral cavity. Eur J Oral Sci 113:14-19
Duncan C, Dougall H, Johnston P, Green S, Brogan R, Leifert C, Smith L, Golden M,
Benjamin N (1995) Chemical generation of nitricoxide in the mouth from the enterosalivary
circulation of dietary nitrate. Nat Med 1:546-551
Falati S, Gross P, Merrill-Skoloff G, Furie BC, Furie B (2002)Real-time in vivo imaging of
platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med
8:1175-1181
Giles AR (1987) Guidelines for the use of animals in biomedical research. Thromb Haemost
58:1078-1084
27
Hayashi T, Mogami H, Murakami Y, Nakamura T, Kanayama N, Konno H, Urano T (2008)
Real-time analysis of platelet aggregation and procoagulant activity during thrombus
formation in vivo. Pflugers Arch 456:1239-1251
He S, Antovic A, Blombäck M (2001) A simple and rapid laboratory method for
determination of haemostasis potential in plasma. II. Modifications for use in routine
laboratories and research work. Thromb Res 103:355-361
Hendgen-Cotta UB, Kelm M, Rassaf T (2014) Myoglobin functions in the heart. Free Radic
Biol Med 73C:252-259
Huang WC, Ploth DW, Bell PD, Work J, Navar LG (1981) Bilateral renal function responses
to converting enzyme inhibitor (SQ 20,881) in two-kidney, one clip Goldblatt hypertensive
rats. Hypertension 3:285-293
Huang Z, Shiva S, Kim-Shapiro DB, Patel RP, Ringwood LA, Irby CE, Huang KT, Ho C,
Hogg N, Schechter AN, Gladwin MT (2005) Enzymatic function of hemoglobin as a nitrite
reductase that produces NO under allosteric control. J Clin Invest 115:2099-2107
Hyde ER, Luk B, Cron S, Kusic L, McCue T, Bauch T, Kaplan H, Tribble G, Petrosino JF,
Bryan NS (2014) Characterization of the rat oral microbiome and the effects of dietary nitrate.
Free Radic Biol Med 77:249-257
Ishiwata H, Tanimura A, Ishidate M (1975) Studies on in vivo formation of nitroso
compounds (III). Food Hyg Saf Sci 16:89-92
Jayaraman T, Tejero J, Chen BB, Blood AB, Frizzell S, Shapiro C, Tiso M, Hood BL, Wang
X, Zhao X, Conrads TP, Mallampalli RK, Gladwin MT (2011) 14-3-3 binding and
phosphorylation of neuroglobin during hypoxia modulate six-to-five heme pocket
coordination and rate of nitrite reduction to nitric oxide. J Biol Chem 286:42679-42689
Jiang H, Torregrossa AC, Potts A, Pierini D, Aranke M, Garg HK, Bryan NS (2014) Dietary
nitrite improves insulin signaling through GLUT4 translocation. Free Radic Biol Med 67:5157
Jin L, Qin L, Xia D, Liu X, Fan Z, Zhang C, Gu L, He J, Ambudkar IS, Deng D, Wang S
(2013) Active secretion and protective effect of salivary nitrate against stress in human
volunteers and rats. Free Radic Biol Med 57:61-67
28
Kahn MJ, Maley JH, Lasker GF, Kadowitz PJ (2013) Updated role of nitric oxide in disorders
of erythrocyte function. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets 13:83-87
Kapil V, Haydar SM, Pearl V, Lundberg JO, Weitzberg E, Ahluwalia A (2013) Physiological
role for nitrate-reducing oral bacteria in blood pressure control. Free Radic Biol Med 55:93100
Kapil V, Milsom AB, Okorie M, Maleki-Toyserkani S, Akram F, Rehman F, Arghandawi S,
Pearl V, Benjamin N, Loukogeorgakis S, Macallister R, Hobbs AJ, Webb AJ, Ahluwalia A
(2010) Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitritederived NO. Hypertension 56:274-281
Kortboyer JM, Colbers EPH, Vaessen HAMG, Groen K, Zeilmaker MJ, Slob W, Speilers
GJA, Meulenbelt J (1994) A pilot-study to investigate nitrate and nitrite kinetics in healthy
volunteers with normal and artificially increased gastric pH after sodium nitrate ingestion. In:
International Workshop on Health Aspects of Nitrate and Its Metabolites (Particularly
Nitrite). Bilthoven: Council of Europe Press 1994:269-284.
Kramkowski K, Leszczynska A, Mogielnicki A, Chlopicki S, Fedorowicz A, Grochal E,
Mann B, Brzoska T, Urano T, Motterlini R, Buczko W (2012) Antithrombotic properties of
water-soluble carbon monoxide-releasing molecules. Arterioscler Thromb Vasc Biol
32:2149-2157
Kramkowski K, Leszczyńska A, Przyborowski K, Buczko W, Chłopicki S (2013) Different
effects of nitrate and nitrite on hemostasis in rats. Pharmacological Reports 65, suppl, 57-58.
XVIIIth International Congress of the Polish Pharmacological Society, Kazimierz Dolny, 2325 May 2013.
Kramkowski K, Leszczynska A, Przyborowski K, Kaminski T, Rykaczewska U, Sitek B,
Zakrzewska A, Proniewski B, Smolenski RT, Chabielska E, Buczko W, Chlopicki S (2015)
Role of xanthine oxidoreductase in the anti-thrombotic effects of nitrite in rats in vivo.
Platelets 16:1-9
Kramkowski K, Mogielnicki A, Leszczynska A, Buczko W (2010) Angiotensin-(1-9), the
product of angiotensin I conversion in platelets, enhances arterial thrombosis in rats. J Physiol
Pharmacol 61:317-324
29
Larsen FJ, Ekblom B, Sahlin K, Lundberg JO, Weitzberg E (2006) Effects of dietary nitrate
on blood pressure in healthy volunteers. N Engl J Med 355:2792-2793.
Larsen FJ, Schiffer TA, Borniquel S, Sahlin K, Ekblom B, Lundberg JO, Weitzberg E (2011).
Dietary inorganic nitrate improves mitochondrial efficiency in humans. Cell Metab 13:149159
Laustiola KE, Vuorinen P, Pörsti I, Metsä-Ketelä T, Manninen V, Vapaatalo H(1991)
Exogenous GTP enhances the effects of sodium nitrite on cyclic GMP accumulation, vascular
smooth muscle relaxation and platelet aggregation. Pharmacol Toxicol 68:60–63
Li H, Duncan C, Townend J, Killham K, Smith LM, Johnston P, Dykhuizen R, Kelly D,
Golden M, Benjamin N, Leifert C (1197) Nitrate-reducing bacteria on rat tongues. Appl
Environ Microbiol 63:924-930
Li H, Kundu TK, Zweier JL (2009) Characterization of the magnitude and mechanism of
aldehyde oxidase-mediated nitric oxide production from nitrite. J Biol Chem 284:33850–
33858
Lundberg JO, Govoni M (2004) Inorganic nitrate is a possible source for systemic generation
of nitric oxide. Free Radic Biol Med 37:395-400
Lundberg JO, Weitzberg E (2010) NO-synthase independent NO generation in mammals.
Biochem Biophys Res Commun 396:39-45. Review.
Mills CE, Khatri J, Maskell P, Odongerel C, Webb AJ (2016) It is rocket science - why
dietary nitrate is hard to Beet! part II: further mechanisms and therapeutic potential of the
nitrate-nitrite-NO pathway. Br J Clin Pharmacol. doi: 10.1111/bcp.12918
Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y (1997) ‘Green mice’ as a
source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407:313-319
Proulle V, Furie RA, Merrill-Skoloff G, Furie BC, Furie B (2014) Platelets are required for
enhanced activation of the endothelium and fibrinogen in a mouse thrombosis model of APS.
Blood 124:611-622
Qin L, Liu X, Sun Q, Fan Z, Xia D, Ding G, Ong HL, Adams D, Gahl WA, Zheng C, Qi S,
Jin L, Zhang C, Gu L, He J, Deng D, Ambudkar IS, Wang S (2012) Sialin(SLC17A5)
30
functions as a nitrate transporter in the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA
109:13434-13239
Roberts LD, Ashmore T, Kotwica AO, Murfitt SA, Fernandez BO, Feelisch M, Murray AJ,
Griffin JL (2015) Inorganic nitrate promotes the browning of white adipose tissue through the
nitrate-nitrite-nitric oxide pathway. Diabetes 64:471-484
Sparacino-Watkins CE, Tejero J, Sun B, Gauthier MC, Thomas J, Ragireddy V, Merchant
BA, Wang J, Azarov I, Basu P, Gladwin MT (2014). Nitrite reductase and nitric-oxide
synthase activity of the mitochondrial molybdopterin enzymes mARC1 and mARC2. J Biol
Chem 289:10345-10358.
Spiegelhalder B, Eisenbrand G, Preussmann R (1976) Influence of dietary nitrate on nitrite
content of human saliva: possible relevance to in vivo formation of N-nitroso compounds.
Food Cosmet Toxicol 14:545-548
Tannenbaum SR, Sinskey AJ, Weisman M, Bishop W (1974) Nitrite in human saliva: its
possible relationship to nitrosamine formation. J Natl Cancer Inst 53:79-84
Tannenbaum SR, Weisman M, Fett D (1976) The effect of nitrate intake on nitrite formation
in human saliva. Food Cosmet Toxicol 14:549-552
Wang J, Krizowski S, Fischer-Schrader K, Niks D, Tejero J, Sparacino-Watkins C, Wang L,
Ragireddy V, Frizzell S, Kelley EE, Zhang Y, Basu P, Hille R, Schwarz G, Gladwin MT
(2010) Novel function of sulfite oxidase as a nitrite reductase that generates nitric oxide. Free
Rad Biol Med 49:S122
Webb AJ, Patel N, Loukogeorgakis S, Okorie M, Aboud Z, Misra S, Rashid R, Miall P,
Deanfield J, Benjamin N, MacAllister R, Hobbs AJ, Ahluwalia A (2008). Acute blood
pressure lowering, vasoprotective, and antiplatelet properties of dietary nitrate via
bioconversion to nitrite. Hypertension 51:784-790
Zand J, Lanza F, Garg HK, Bryan NS (2011) All-natural nitrite and nitrate containing dietary
supplement promotes nitric oxide production and reduces triglycerides in humans. Nutr Res
31:262-269
Zatz R (1990) A low cost tail-cuff method for the estimation of mean arterial pressure in
conscious rats. Lab Anim Sci 40:198–201
31
32
33