Analiza otoczenia katalitycznego optymalnego dla reakcji

Analiza otoczenia katalitycznego optymalnego dla reakcji

Słowa kluczowe: kinazy węglowodanowe, reakcja fosforylacji,
statyczne i dynamiczne pola katalityczne, kataliza enzymatyczna
Edyta DYGUDA1, Borys SZEFCZYK2, W. Andrzej SOKALSKI2
Analiza otoczenia katalitycznego optymalnego dla reakcji
fosforylacji katalizowanej przez kinazę tiazolową
Kinazy to enzymy katalizujące jedną z najpowszechniejszych w układach biologicznych reakcję
fosforylacji, polegającą na przeniesieniu grupy fosforanowej z cząsteczki donora (zwykle
adenozynotrifosforanu, ATP) na akceptor. Celem niniejszej pracy jest teoretyczna analiza
mechanizmu reakcji fosforylacji katalizowanej przez kinazę tiazolową – reprezentanta kinaz
węglowodanowych. Modele centrum aktywnego enzymu i reagentów stworzono metodami
modelowania molekularnego. Analiza potencjałów elektrostatycznych i pola elektrycznego
generowanego przez stan przejściowy i substraty reakcji dała w rezultacie różnicowe mapy własności
elektrostatycznych – statyczne i dynamiczne pola katalityczne, interpretowane jako otoczenie
molekularne optymalne dla reakcji. Porównanie pól katalitycznych z rzeczywistym układem
obdarzonych ładunkiem reszt aminokwasowych centrum aktywnego pozwoliło zweryfikować wpływ
wspomnianych reszt na efektywność katalizy. Zastosowana metoda różnicowej stabilizacji stanu
przejściowego stanowi obiecujący sposób projektowania katalizatorów wyłącznie na podstawie
znajomości struktury substratów i stanu przejściowego zadanej reakcji chemicznej.
1. WSTĘP
Z uwagi na ogromne znaczenie katalizatorów, zarówno biologicznych dla
funkcjonowania żywych organizmów, jak i chemicznych w przemyśle, idea
teoretycznego projektowania związków specyficznie katalizujących daną reakcję
cieszy się dużym zainteresowaniem. Optymalną sytuację stanowiłaby możliwość
konstruowania otoczenia molekularnego, najbardziej sprzyjającego danej reakcji,
wyłącznie na podstawie jej mechanizmu. Takie podejście do zagadnienia
projektowania katalizatorów jest podstawą techniki statycznych i dynamicznych pól
katalitycznych [5, 6]. Niniejsza praca prezentuje przykład zastosowania pól
katalitycznych, stworzonych w ramach metody różnicowej stabilizacji stanu
__________
1
2
Koło Naukowe “Gambrinus”, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska
Instytut Chemii Fizycznej i Teoretycznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska
przejściowego [5], do określenia optymalnego otoczenia molekularnego procesu
przeniesienia grupy fosforanowej. Badana reakcja katalizowana jest przez kinazę
tiazolową [1].
Kinazy katalizują reakcje przeniesienia grupy fosforanowej (zazwyczaj z ATP) na
szereg cząsteczek o różnorodnym charakterze chemicznym: alkoholi, cukrów, białek,
a nawet lipidów [2]. Mimo licznych prac teoretycznych i eksperymentalnych,
mechanizmy ich funkcjonowania nadal są przedmiotem dyskusji. Jednocześnie
większość teoretycznych badań dotyczy kinaz białkowych, podczas gdy inne kinazy,
w tym kinazy węglowodanowe z rodziny rybokinazy, analizowane były jak dotąd
głównie na drodze eksperymentalnej. Z wymienionych powodów kinaza 4-metylo-5β-hydroksyetylotiazolu (kinaza tiazolowa, ThiK) – reprezentująca wspomnianą
rodzinę kinaz cukrowych – wybrana została jako obiekt niniejszej pracy.
Oprócz struktur kompleksów ThiK
z substratami,
znane są wyniki
ukierunkowanej mutagenezy [1]: mutacja
reszty
cysteiny
sąsiadującej
z fosforylowaną grupą hydroksylową do
asparaginianu
9-krotnie
zwiększa
Rys. 1. Schemat reakcji katalizowanej przez
aktywność
katalityczną
enzymu.
Zarówno
kinazę tiazolową ThiK.
kinazy
białkowe,
jak
i
pozostałe
kinazy
Fig. 1. Scheme of ThiK catalyzed reaction
węglowodanowe, mają w analogicznej
pozycji resztę asparaginianu, któremu przypisuje się rolę zasady katalitycznej
zwiększającej nukleofilowość atomu tlenu grupy hydroksylowej. Kwestia optymalnej
dla efektów katalitycznych liczby jonów magnezu i samego mechanizmu reakcji
również nie została rozstrzygnięta. Stąd celem niniejszego projektu jest określenie
optymalnego dla reakcji fosforylacji otoczenia katalitycznego i porównanie jego
charakterystyki z geometrią centrum aktywnego, co w przyszłości umożliwiłoby
analizę mechanizmu katalizy badanego procesu, a w szególności roli wybranych reszt
aminokwasowych.
2. METODY OBLICZENIOWE
Projekt został w całości wykonany teoretycznymi metodami modelowania
molekularnego (mechanika molekularna i kwantowa) z wykorzystaniem zarówno
standardowych pakietów (InsightII, Gaussian03), jak i oprogramowania
opracowanego w Zakładzie Modelowania Molekularnego Instytutu Chemii Fizycznej
i Teoretycznej.
Analizy otoczenia katalitycznego dokonano w ramach metody różnicowej
stabilizacji stanu przejściowego [5]. Zgodnie z jej założeniami, aktywność
katalityczna (inhibicyjna) danego katalizatora, rozumiana jako stosunek szybkości
reakcji katalizowanej, kC w porównaniu do procesu nie podlegającego katalizie
(zachodzącego w fazie gazowej - kG), wynika z różnicy standardowych entalpii
swobodnych aktywacji charakteryzujących oba porównywane przypadki Ze względu
na zaniedbywalny zazwyczaj udział efektów entropowych i wkładów oscylacyjnych,
entalpię swobodną aktywacji można przybliżyć poprzez barierę energetyczną reakcji,
co jest z kolei równoważne różnicy energii oddziaływania otoczenia, C (np. enzymu)
ze stanem przejściowym (TC) i kompleksem substratów reakcji (SC):
− RTln
kC
= ∆G C0 − ∆G G0 ≅ BC − BG ≡ ∆ = ∆ETC,C − ∆E SC,C
kG
(1)
Tak wyrażona aktywność katalityczna opisuje stopień, w jakim stan przejściowy
procesu stabilizowany jest przez środowisko w porównaniu do substratów
i analogicznej reakcji w fazie gazowej. Zatem preferencyjna stabilizacja stanu
przejściowego w odniesieniu do substratów, charakteryzowana przez ujemną wartość
∆, odpowiada obniżeniu bariery aktywacji i w rezultacie prowadzi do efektu
katalitycznego. Zakładając następnie dominującą rolę oddziaływań elektrostatycznych
[7] oraz wprowadzając opis otoczenia molekularnego jako zbioru ładunków
punktowych, qc, aktywność katalityczną ∆ można przybliżyć poprzez różnicę energii
oddziaływania wspomnianych ładunków oraz potencjałów elektrostatycznych
generowanych przez stan przejściowy i substraty reakcji:
∆ ≈ ¦ q c (VTC − VSC )
(2)
c∈C
Ponieważ różnica VTC-VSC wyraża wpływ jednostkowego dodatniego ładunku na
obniżenie bariery energetycznej reakcji, porównanie potencjałów elektrostatycznych
wytwarzanych przez stan przejściowy i substraty pozwala wyrazić potencjalny wpływ
środowiska w postaci różnicowych map – statycznych pól katalitycznych [5]:
∆s = V TS − V SC
(3)
Analogicznie, porównanie pól elektrycznych wokół stanu przejściowego
i substratów, interpretowane jako wpływ sprzężonego ze współrzędną reakcji ruchu
jednostkowego dodatniego ładunku na wysokość bariery aktywacji, prowadzi do
wektorowych, dynamicznych pól katalitycznych [6]:
− grad∆d = E TS − E SC
Podsumowując,
różnicowe
mapy
potencjałów
(4)
elektrostatycznych
i
pól
elektrycznych wokół nałożonych struktur stanu przejściowego i substratów pozwalają
określić optymalne dla katalizy rozmieszczenie ładunków prowadzące do
maksymalnego obniżenia bariery aktywacji.
W niniejszej pracy modele centrum aktywnego uzyskane w wyniku optymalizacji
struktur krystalograficznych [1] metodami mechaniki molekularnej zostały
wykorzystane jako punkt wyjścia do kwantowochemicznej optymalizacji geometrii
substratów (HF/STO-3G) oraz wyznaczenia własności elektrostatycznych reagentów.
Rozmiar badanych układów został ograniczony do cząsteczki metylotrifosforanu
i etanolu, reprezentujących odpowiednio ATP i fosforylowany substrat. Ponadto
wykorzystano przybliżony stan przejściowy analogicznej reakcji, katalizowanej przez
kinazę białkową A, PKA [4].
Po przestrzennym nałożeniu struktur stanu przejściowego i substratów, porównano
potencjał elektrostatyczny i pole elektryczne na wspólnej dla obu geometrii
powierzchni van der Waalsa. W prezentowanych poniżej dwuwymiarowych
reprezentacjach pól katalitycznych dla płaszczyzn przechodzących przez
zrywane/tworzone wiązania, znak różnicowych wartości (oraz zwrot wektorów) został
odwrócony dla wyrażenia komplementarnej charakterystyki środowiska. Rozmiar
znaków „plus” i „minus” oraz strzałek jest proporcjonalny do różnicowych wartości
potencjału
elektrostatycznego
i pól elektrycznych.
3. WYNIKI
Statyczne i dynamiczne pola katalityczne dla dwóch wzajemnie prostopadłych
płaszczyzn przedstawiono na Rys. 2 [3]. Porównanie optymalnego otoczenia
katalitycznego z rzeczywistym otoczeniem molekularnym oferowanym przez enzym
ujawnia szereg cech wspólnych, wyrażających się we wzajemnym rozmieszczeniu
obdarzonych ładunkiem składników wnęki katalitycznej ThiK. Wspomniana
zgodność dotyczy szczególnie położenia dodatnio naładowanego łańcucha bocznego
Arg121 oraz jonu magnezu oddziałującego z grupami α i β-fosforanowymi. Mniej
oczywista obecność drugiego jonu magnezu wynikać może z jego ekranowania przez
ujemnie naładowane łańcuchy boczne dwóch reszt: Asp94 i Glu126. Analiza
statycznych pól katalitycznych wykazuje ponadto sprzyjającą katalizie obecność
ujemnego
ładunku
w pozycji zajmowanej przez Cys198. Polarny, tiolowy łańcuch boczny cysteiny
w większości przypadków występuje w formie niezjonizowanej i w związku z tym nie
jest obdarzony ładunkiem. Jednocześnie wyraźnie zwiększona aktywność katalityczna
enzymu ma miejsce po wymianie tej grupy na ujemnie naładowany asparaginian.
Zatem, w badanym przypadku, metoda pól katalitycznych zdaje się dostarczać
argumentów dla wyjaśnienia eksperymentalnych wyników ukierunkowanej
Rys. 2. Statyczne i dynamiczne pola katalityczne oraz geometria miejsca wiązania reagentów.
Fig. 2. Static and dynamic catalytic fields compared to corresponding active site geometries.
mutagenezy.
4. WNIOSKI
Niniejsza praca stanowi przykład zastosowania metody pól katalitycznych do
wyznaczenia otoczenia molekularnego wykazującego optymalny efekt katalityczny
względem reakcji przeniesienia grupy fosforanowej. Porównanie wyników –
różnicowych map własności elektrostatycznych – z topologią centrum aktywnego
enzymu katalizującego analizowaną reakcję wykazuje szereg podobieństw
wzajemnego rozkładu ładunków i podkreśla komplementarność środowiska
katalitycznego oferowanego przez kinazę tiazolową względem przeprowadzanej przez
nią reakcji. Ostatni wniosek pozostaje w zgodzie z coraz częściej postulowaną tezą
[7], przypisującą źródło katalitycznej aktywności enzymów preferencyjnej,
elektrostatycznej stabilizacji stanu przejściowego w porównaniu do substratów. W
przypadku kinazy tiazolowej największy udział w różnicowej stabilizacji ma Arg121 i
oba jony magnezu. Z kolei wyniki eksperymentalne potwierdzają optymalną dla
katalizy obecność ujemnie naładowanej grupy w pozycji Cys198.
Przedstawione obserwacje podkreślają możliwość wykorzystania metodologii pól
katalitycznych do projektowania nowych bądź optymalizacji już istniejących
katalizatorów. Inne potencjalne zastosowania, oprócz analizy istotności
poszczególnych komponentów miejsc aktywnych enzymów, obejmują wspomaganie
prac eksperymentalnych poprzez wskazanie reszt, których modyfikacja może mieć
największy wpływ na szybkość katalizowanej reakcji, a także wybór pomiędzy
możliwymi stanami protonacji reszt aminokwasowych bądź reagentów.
LITERATURA
[1] CAMPOBASSO, N.; MATHEWS I. I.; BEGLEY, T. P.; EALICK, S. E. Crystal Structure of
4-Methyl-5-β-hydroxyethylthoiazole Kinase from Bacillus subtilis at 1.5 Å Resolution. Biochemistry
2000, 39, 7868–7877.
[2] CHEEK, S.; ZHANG, H.; GRISHIN, N. V. Sequence and Structure Classification of Kinases.
J. Mol. Biol. 2002, 320, 855–881.
[3] DYGUDA, E.; SZEFCZYK, B.; SOKALSKI, W. A. The Mechanism of Phosphoryl Transfer
Reaction and the Role of Active Site Residues on the Basis of Ribokinase-like Kinases.
Int. J. Mol. Sci. 2004, 5 141–153.
[4] RAKOWSKI F.; GROCHOWSKI P.; LESYNG B. SCC DFT-TB Energy calculations of the
phosphoryl transfer reaction in the PKA active site. Cell. Mol. Biol. Lett. 2003, 8, 603–604.
[5] SOKALSKI, W. A. The physical nature of catalytic activity due to the molecular environment in
terms of intermolecular interaction theory: derivation of simplified models. J. Mol. Catalysis 1985, 30,
395–410.
[6] SOKALSKI, W. A. Nonempirical modeling of the static and dynamic properties of the optimum
environment for chemical reactions. J. Mol. Struct. 1986, 138, 77–87.
[7] WARSHEL, A. Electrostatic Origin of the Catalytic Power of Enzymes and the Role of Preorganized
Active Sites. J. Biol. Chem. 1998, 273, 27035–27038.
THIAZOLE KINASE: ANALYSIS OF CATALYTIC ENVIRONMENT IN THE
PHOSPHORYL TRANSFER REACTION.
4-Methyl-5-β-hydroxyethylthiazole kinase (Thz kinase) belongs to the ribokinase-like carbohydrate
kinases. Although they differ substantially in structural terms and exhibit a broad substrate specificity,
some family-wide conserved features can be distinguished suggesting a common mode of action. Due to
the experimental data availability, Thz kinase was chosen as a representative model and the mechanism
proposed in X-ray crystal structure paper served as a basis for calculations. In particular, the possible role
of several active site residues (Arg121 and Cys198 among others) and of the two magnesium ions was
examined. Static and dynamic catalytic fields for the reaction were generated revealing the most
favourable environment for the preferential transition state stabilization and enabling the comparison with
actual geometry of active site cavity.