Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji

Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2010 • Volume 46 • Number 2 • 125-130
Praca oryginalna • Original Article
Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych
frakcji fosfolipidów w surowicy krwi
Validation of the method of determination of phospholipid
fraction fatty acids in blood serum
1
Jolanta Bugajska, 1Joanna Berska, 2Diana Hodorowicz-Zaniewska, 1Krystyna Sztefko
Zakład Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii i
I Katedra Chirurgii Ogólnej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
1
2
Streszczenie
Cel: Określenie parametrów walidacyjnych metody oznaczania poszczególnych kwasów tłuszczowych (średniołańcuchowych,
długołańcuchowych, mono- i wielonienasyconych oraz kwasów o konformacji trans) frakcji fosfolipidów surowicy krwi.
Metoda: Estry metylowe kwasów tłuszczowych uzyskane przez zmydlanie w środowisku zasadowym fosfolipidów wyekstrahowanych z surowicy krwi oznaczono ilościowo na chromatografie gazowym z kapilarną kolumną HP-88 wyposażonym w
detektor płomieniowo-jonizacyjny.
Wyniki: Wyznaczono granicę pomiaru (limit of detection, LOD) i granicę oznaczalności (limit of quantification, LOQ) oraz
współczynniki zmienności (CV) wewnątrz serii i między seriami dla każdego kwasu tłuszczowego oraz obliczono odzysk dla
próbek surowicy obciążonych 1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3-fosfocholiną. Wartości LOD zawierają się w granicach 0,8 – 16,2
mol/l, LOQ w granicach 2,5 – 49,2 mol/l. Współczynniki korelacji (r2) pomiędzy stężeniem kwasu a polem powierzchni piku
mieszczą się w zakresie pomiędzy 0,9993 – 0,9999. Współczynniki zmienności wewnątrz serii były poniżej 10% (z wyjątkiem
kwasów C12, C18:1 trans, C20 + C18:3 (n-6) i C20:2) natomiast między seriami poniżej 20% (z wyjątkiem kwasów C12, C18:2
trans i C24). Średni odzysk był w zakresie 96,9 – 115,3%.
Wniosek: Otrzymane parametry walidacyjne wykazały, że metoda nadaje się do ilościowego oznaczania indywidualnych kwasów tłuszczowych nasyconych, mono- i wielonienasyconych oraz kwasów o konformacji trans frakcji fosfolipidów w surowicy
krwi.
Summary
Aim: Specifying the validation parameters of the method of determination of the individual fatty acids (medium and long-chain,
mono- and polyunsaturated, of cis and trans configuration) of phospholipid fraction of blood serum.
Method: Methyl esters of fatty acids liberated by alkali hydrolysis from phospholipids extracted from blood serum have been
determined on gas chromatograph with capillary column HP-88 and flame-ionization detector.
Results: Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ), as well as variation coefficients (CV) within series and
among series have been determined for each fatty acid. Also recovery was determined by loading serum samples with 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. The values of LOD were within the range of 0.8-16.2 mol/l, those of LOQ between 2.5
and 49.2 µmol/l. The correlation coefficients (r2) between the concentration of fatty acid and area under the peak were in the
range of 0.9993-0.9999. For most fatty acids (with exception of C12, C18:1 trans, C20+C18:3 (n-6) and C20:2 acids) CV within
series was below 10%, and CV among series below 20% (with exception of acids C12, C18:2 trans and C24). Mean recovery
was between 96.9 and 115.3%.
Conclusion: The validation parameters obtained have shown that the method is suitable for the quantitative determination of
the individual saturated and unsaturated, mono and polyunsaturated, cis and trans fatty acids of phospholipid fraction of blood
serum.
Słowa kluczowe:kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, chromatografia gazowa
Key words:fatty acids, phospholipids, gas chromatography
125
Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w surowicy krwi
Wstęp
Analiza składu kwasów tłuszczowych w materiale biologicznym (surowica, tkanki) wymaga zastosowania odpowiednich
metod ekstrakcji i oczyszczania frakcji lipidowych. Najczęściej stosowaną metodą do ilościowej ekstrakcji składników
lipidowych z surowicy krwi jest metoda Folcha i wsp. [7]. Aby
zapobiec utlenianiu kwasów tłuszczowych w czasie ekstrakcji stosuje się antyutleniacze takie jak butylohydroksytoluen
lub 2,6-di-tert-butyl-p-cresol albo każdy etap przygotowania
wstępnego próbek wykonuje się w atmosferze azotu [4,18].
Rozdział lipidów w ekstraktach z materiałów biologicznych
można przeprowadzić za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub chromatografii cieczowej z użyciem kolumienek z aminopropylową fazą stałą [10,15]. Rozdział lipidów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) jest
metodą czasochłonną i powoduje utlenienie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) z powodu długotrwałej ekspozycji na powietrze. Bardziej polecany jest rozdział
na aminopropylowej fazie stałej, co pozwala na uzyskanie
dokładniejszych wyników oraz na skrócenie czasu analizy.
W celu oznaczenia stężeń poszczególnych kwasów tłuszczowych we frakcjach lipidowych, materiał uzyskany z płytek
chromatograficznych lub rozdzielone na kolumienkach próbki poddaje się zmydlaniu i estryfikacji. Ilościowo uzyskane
w ten sposób estry metylowe kwasów tłuszczowych oznacza się za pomocą chromatografii gazowej (GC) najczęściej
z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) [14,3] lub
detektorem masowym (MS) [11,17]. W dotychczas publikowanych pracach przedstawiających metody oznaczania
kwasów tłuszczowych pochodzących z poszczególnych klas
lipidowych, brak jest danych o możliwości równoczesnego
oznaczenia stężenia kwasów o konformacji cis oraz trans.
Opisywane są metody pozwalające na ilościowe oznaczanie
albo kwasów tłuszczowych o konformacji cis [1,11] albo kwasów o konformacji trans [12,2]. W większości prac wartości
stężeń kwasów średniołańcuchowych, długołańcuchowych,
mono- i wielonienasyconych oraz kwasów tłuszczowych o
konformacji trans podawane są jako procent całkowitych
kwasów tłuszczowych danej frakcji lipidowej, a nie jako bezwzględne stężenia [16,5]. Skład procentowy w odróżnieniu
od bezwzględnego stężenia nie odzwierciedla jednak prawdziwych różnic zawartości kwasów tłuszczowych w różnych
próbkach lub różnych materiałach biologicznych. W tym
świetle określenie parametrów liniowości i powtarzalności
metody ilościowego oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych frakcji lipidowych surowicy krwi wydaje się celowe.
Materiały i metody
Odczynniki
Trifluorek boru w metanolu (14 % BF3), heksan, chloroform
i metanol (Sigma-Aldrich, Niemcy), NaCl (Merck, Niemcy),
izopropanol (J.T.Baker, Holandia), eter dietylowy (Chempur,
Polska), kwas octowy (Fluka, Niemcy), bezwodny siarczan
sodu (Chempur, Polska), wodorotlenek potasu (POCH, Polska). Wszystkie zastosowane odczynniki było o czystości
126
wymaganej w chromatografii. Wzorce kwasów tłuszczowych
w roztworze metanol:chloroform (5:1) (Sigma-Aldrich, Niemcy): kwas laurynowy C12, kwas mirystynowy C14, kwas
palmitynowy C16, kwas palmitooleinowy C16:1 n-7, kwas
stearynowy C18, kwas elaidynowy C18:1 n-9 trans, kwas
oleinowy C18:1 n-9 cis, kwas linolowy C18:2 n-6 trans, kwas
linolowy C18:2 n-6 cis, kwas arachidowy C20, kwas alfa-linolenowy C18:3 n-3, kwas 11,14 eikozadienowy 20:2 n-6 cis,
kwas arachidonowy C20:4 n-6, kwas timnodonowy C20:5
n-3, kwas behenowy C22, kwas cerwonowy C22:6 n-3, kwas
lignocerynowy C24, kwas cerotynowy C26. Jako standard
wewnętrzny zastosowano 1,2-dipentadekanoilo-sn-glicero3-fosfocholinę o stężeniu 8,5 mmol/l (Sigma-Aldrich, Niemcy), a dla oceny odzysku użyto 1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3fosfocholinę (Sigma-Aldrich, Niemcy).
Materiały
Kolumienki ekstrakcyjne z aminopropylową fazą stałą – SepPak NH2, 500mg (Waters, USA)
Ekstrakcja lipidów z surowicy
Do ekstrakcji lipidów z surowicy zastosowano metodę Folcha
i wsp. [7]. 10 ml mieszaniny chloroform-metanol (2:1, v/v) i
40 µl standardu wewnętrznego dodawano do 1 ml surowicy, mieszano 15 min. Następnie dodawano 5 ml 10% NaCl,
ponownie mieszano i wirowano. Fazę organiczną zbierano,
osuszano bezwodnym Na2SO4 i odparowywano w atmosferze azotu w temperaturze 370C.
Rozdział frakcji lipidowych na kolumienkach Sep-Pak NH2
Suchą pozostałość rozpuszczano w 200 µl chloroformu
i nakładano na kolumienkę z aminopropylową fazą stałą
Sep-Pak NH2. Kolumienki aktywowano poprzez trzykrotne
przemycie 2 ml heksanu. Estry cholesterolu, monoglicerydy,
diglicerydy i triglicerydy eluowano z kolumienki 4 ml mieszaniny chloroform-izopropanol (2:1, v/v), następnie wymywano
kwasy tłuszczowe 6 ml 2% kwasu octowego w eterze. Ostatnim etapem było eluowanie fosfolipidów 4 ml metanolu.
Zmydlanie fosfolipidów
Próbki zawierające frakcję fosfolipidów odparowywano w
atmosferze azotu w temp 370C. Do suchej pozostałości dodawano 1 ml 2M KOH w metanolu i przeprowadzano zmydlanie w szczelnie zamkniętych probówkach przez 20 minut
w atmosferze azotu w temperaturze 700C.
Otrzymywanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych
Do każdej próbki zawierającej kwasy tłuszczowe pochodzące z frakcji fosfolipidów dodawano 1 ml 14 % BF3 w metanolu. Metylację prowadzano w temperaturze 1000C w szczelnie
zamkniętych probówkach w atmosferze azotu przez 60 min, a
następnie próbki doprowadzano do temperatury pokojowej.
Końcowe przygotowanie próbek do rozdziału na chromatografie gazowym
Do wszystkich probówek zawierających estry metylowe kwasów tłuszczowych dodawano 2 ml heksanu i 2 ml 10% NaCl
i wytrząsano przez 15 minut. Zbierano warstwę organiczną
i procedurę powtarzano. Zebrane warstwy organiczne odparowywano do sucha w atmosferze azotu w temperaturze
37°C, a następnie rozpuszczano w 100 µl heksanu.
J. Bugajska i inni
Warunki rozdziału estrów metylowych na chromatografie gazowym.
Oznaczenia estrów metylowych kwasów tłuszczowych
wykonano przy użyciu chromatografu gazowego (Agilent
Technologies 6890 N Network GC Systems), wyposażonego w detektor płomieniowo jonizacyjny (FID) oraz dozownik
7683B. Do rozdziału zastosowano kolumnę HP-88 (100 m,
0,250mm, 0,20 µm).
Warunki rozdziału (zgodnie z zaleceniami producenta kolumny): objętość próbki nakładanej na kolumnę: 1 µl w
trybie split (stosunek 1:5), temperatura dozownika: 2500C,
temperatura detektora: 2800C. Temperatura kolumny utrzymywana była według następującego schematu: temperatura
początkowa: 1200C przez 1 minutę, wzrost o 100C/min do
temperatury 1750C utrzymywanej przez 10 minut, wzrost o
50C/min do temperatury 2100C utrzymywanej przez 5 minut,
wzrost o 50C/min do temperatury 2300C utrzymywanej przez
7,5 minuty. Całkowity czas rozdziału jednej próbki wynosił 40
minut. Jako gaz nośny stosowano hel o przepływie 2 ml/min.
Przepływ gazów przez detektor FID: wodór 40ml/min, powietrze 450 ml/min i gaz dopełniający (Hel) 30ml/min. Zbieranie
oraz opracowywanie danych przeprowadzono za pomocą
programu Chemstation firmy Agilent Technologies.
Identyfikacja kwasów tłuszczowych oraz obliczanie ich stężenia
Kwasy tłuszczowe identyfikowano na podstawie czasów
retencji. Porównywano czasy retencji poszczególnych kwasów tłuszczowych próbki z czasami retencji kwasów wchodzących w skład mieszaniny kalibracyjnej. Analizę ilościową
przeprowadzono w oparciu o zależność pomiędzy sygnałem
z detektora, którego miarą jest powierzchnia piku a stężeniem mierzonej substancji. Zastosowano metodę wzorca
wewnętrznego. Standard wewnętrzny (IS) dodawano zarówno do mieszaniny wzorcowej jak i do każdej analizowanej
próbki przed rozpoczęciem procesu ekstrakcji.
Kalibracja metody, ustalenie zakresu liniowości
Dla każdego kwasu tłuszczowego użytego do przygotowania
mieszaniny kalibracyjnej ustalono zakres liniowości i współczynnik korelacji (r2) pomiędzy stężeniem kwasu a polem
powierzchni piku. Zastosowano serię roztworów wzorcowych o różnych stężeniach. Rozdział kwasów tłuszczowych
w mieszaninie wzorcowej wykonano trzykrotnie dla każdego
stężenia, a krzywe kalibracyjne ustalono w oparciu o wartości średnie.
Ustalenie granicy pomiaru (LOD) i granicy oznaczalności
(LOQ) dla każdego kwasu tłuszczowego
Granicę pomiaru (LOD) wyznaczono z krzywej kalibracyjnej dla
każdego kwasu tłuszczowego na podstawie wzoru: LOD=3,3
x syx /α, gdzie: syx – odchylenie standardowe, α - współczynnik
kierunkowy prostej (tangens kąta nachylenia). Granicę oznaczalności (LOQ) według wzoru: LOQ= 10 x syx /α
Określenie powtarzalności metody
Powtarzalność wewnątrz serii określono w oparciu o 21-krotne oznaczenie jednej próbki przeprowadzone w tych samych
warunkach pomiarowych, natomiast powtarzalność między
seriami określono w oparciu o 21 niezależnie przygotowanych próbek oznaczonych w ciągu 14 dni. Obliczono CV wewnątrz serii i między seriami.
Ocena odzysku
Próbki surowicy obciążano 1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3-fosfocholiną w ilości odpowiadającej różnej zawartości kwasu
palmitynowego: 203,5µmol/l, 407µmol/l, 814µmol/l. Każde
obciążenie wykonano trzykrotnie.
Ocena swoistości oznaczenia
W celu wyznaczenia swoistości oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidowej, w trzech niezależnych próbkach surowicy oznaczono stężenia kwasów tłuszczowych
metodą GC-FID oraz na chromatografie gazowym Agilent
Technologies serii 6890 sprzężonym z kwadrupolowym
spektrometrem mas typu Agilent Network 5973 na kolumnie
HP5 50mx0,32mmx0,25µm.
Obliczenia statystyczne
Do oceny statystycznej wykorzystano średnie arytmetyczne,
odchylenie standardowe i współczynniki zmienności. Stężenia kwasów tłuszczowych podano w µmol/l.
Wyniki
Przykład rozdziału chromatograficznego mieszaniny kalibracyjnej przedstawiono na ryc. 1. Uzyskano wyraźnie rozdzielone piki dla oznaczanych kwasów tłuszczowych z wyjątkiem
dwóch składników mieszaniny, a mianowicie kwasu C20 i
kwasu C18:3 (n-6), które w ustalonych warunkach nie rozdzielały się i występowały w postaci jednego piku.
W tabeli I podano wartości LOD, LOQ, CV wewnątrz serii i
między seriami dla każdego kwasu tłuszczowego. Dla każdego kwasu uzyskano zakresy liniowości do 1000µmol/l,
ale dla celów obecnej pracy wykorzystano zakres liniowości
odpowiadający stężeniom, które występują w fosfolipidach
surowicy krwi. Wartości LOD zawierają się w granicach 0,8
– 16,2µmol/l natomiast LOQ w granicach 2,5 – 49,2µmol/l.
Współczynniki korelacji (r2) pomiędzy stężeniem kwasu a
polem powierzchni piku zawierają się pomiędzy 0,9993 –
0,9999.
Współczynniki zmienności wewnątrz serii były poniżej 10%
dla większości oznaczanych kwasów tłuszczowych. Dla
kwasów C12, C18:1 trans, C20 + C18:3 (n-6) i C20:2 wartości CV były wyższe niż 10%. Największą zmienność oznaczeń miedzy seriami stwierdzono dla kwasów C12, C18:2
trans i C24.
Średni odzysk dla próbek surowicy obciążonych 1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3-fosfocholiną otrzymano w zakresie 96,9
– 115,3%.
Wyniki oznaczenia kwasów tłuszczowych z użyciem GC/MS
jak również z użyciem GC-FID podano jako udział procentowy każdego kwasu. Obliczono różnicę pomiędzy uzyskanymi wynikami (tabela II). Największe różnice stwierdzono
dla kwasów tłuszczowych występujących we frakcji fosfolipidów w najmniejszej ilości (poniżej 1,5%), takich jak: C16:1,
C20:5, C22, C24. Dla kwasów o udziale procentowym powyżej 5% różnice były w granicach od 2,61 do 14,8%.
127
Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w surowicy krwi
Rycina. 1
Chromatogram kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w mieszaninie kalibracyjnej
Tabela I
Krzywe kalibracyjne, LOD i LOQ, współczynniki zmienności wewnątrz serii i między seriami dla poszczególnych
kwasów tłuszczowych
Kwas tłuszczowy
LOD
[mmol/l]
LOQ
[mmol/l]
CV wewnątrz serii
[%]
CV między seriami
[%]
C12
2,2
6,5
3,2
33,3
C14
2,7
8,2
9,2
12,4
C16
16,2
49,2
0,3
5,9
C16:1
2,6
7,9
1,8
8,1
C18:0
7,2
21,9
1,3
6,1
C18:1 trans
2,5
7,7
13,8
19,2
C18:1 cis
7,5
22,7
1,2
5,7
23,5
C18:2 trans
2,2
6,5
11,9
C18:2 cis
7,7
23,4
0,4
7,5
C20 + C18:3 (n-6)
2,2
6,8
19,0
19,6
C18:3 (n–3)
0,9
2,8
5,6
19,7
C20:2
1,1
3,2
4,2
11,8
C22
2,9
8,9
4,1
9,3
C20:4
12,5
37,9
0,4
6,8
C20:5
5,1
15,4
3,2
10,3
C24
1,3
4,0
5,4
23,7
C26
0,8
2,5
C22:6
12,5
37,7
Dyskusja
Walidacja metody wymaga wyznaczenia zakresu liniowości,
granicy wykrywalności, granicy oznaczalności oraz określenia powtarzalności, dokładności i swoistości metody [8,9,6].
Wartości LOD i LOQ są istotne dla oceny bardzo niskich
stężeń kwasów tłuszczowych, a w większości publikacji nie
128
nie oznaczano
3,4
8,1
są one podawane albo podawane są tylko dla kwasów występujących w surowicy w wysokich stężeniach [11]. Często
ocenia się metodę w oparciu tylko o obliczenie współczynników zmienności wewnątrz i zewnątrz serii oraz wielkości odzysku [1,13]. Jedynie Sanchez-Avila i wsp. podają wartości
LOD i LOQ dla wszystkich kwasów tłuszczowych, zarówno
J. Bugajska i inni
Tabela II
Średnie wartości różnicy ± SD [%] między wynikami
oznaczenia kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów
metodą GC/MS i metodą GC-FID
kwas
Różnica ± SD [%]
C15 (IS)
3,16 ± 2,56
C16:1
15,57 ± 10,73
C16
14,49 ± 1,36
C18:2 cis
2,61 ± 1,21
C18:1 cis
5,34 ± 3,67
C18:0
10,93 ± 2,66
C20:4
6,64 ± 1,78
C20:5
24,52 ± 8,26
C20:2
3,62 ± 3,68
C22:6
14,80 ± 2,44
C22
28,12 ± 5,21
C24
22,57 ± 5,23
mono jak i wielonienasyconych oraz konformacji trans, lecz
nie rozróżniają kwasów tłuszczowych pochodzących z poszczególnych frakcji lipidowych surowicy. Metoda opisana
przez nich służy do oznaczania kwasów tłuszczowych zestryfikowanych i wolnych [17].
Uzyskane przez nas współczynniki zmienności (CV, %)
wewnątrz serii dla poszczególnych kwasów tłuszczowych
mieszczą się w granicach zmienności podawanych przez
Horwitz [19] i uzyskanych przez Bondia-Bons i wsp [1]. Ci
ostatni autorzy nie oznaczali jednak kwasu C12, oraz kwasów C18:1 trans i C18:2 trans. Podawane przez nich wartości CV wewnątrz serii były podobne do uzyskanych w stosowanej przez nas metodzie, z wyjątkiem kwasów C14 oraz
C20 + C18:3 (n-6), dla których CV były znacznie wyższe.
Stężenia kwasów o konformacji trans są we frakcji fosfolipidów niskie, dlatego też uzyskane wartości CV wewnątrz serii
oraz między seriami są wysokie i wynoszą dla kwasu C18:1,
n-7 trans + C18:1, n-9 trans odpowiednio 13,8% i 19,2% oraz
dla C18:2 trans (9t,12t C18:2, n-6) 11,9%, 23,5%. King i wsp.
[12] oznaczali w surowicy krwi tylko kwasy trans i uzyskali
następujące wartości CV dla dwóch próbek o różnych stężeniach: dla kwasu C18:1, n-7 trans 4% i 9%, dla kwasu C18:1,
n-9 trans 3% i 21 % oraz dla kwasu C18:2 trans (9t,12t C18:2,
n-6) 13% i 28% [12]. Dla stosowanej przez nas metody
oznaczania kwasów tłuszczowych uzyskano wysokie odzyski, które świadczą o dobrej dokładności.
Porównanie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych we frakcji fosfolipidów oznaczonych metodą GC-FID
oraz metodą GC/MS wykazało różnicę od 2,61 do 28,12%.
Oznaczenia metodą GC/MS wykonane w innym laboratorium potwierdzają swoistość metody. Dopuszczalny całkowity błąd pomiaru dla rzadkich oznaczeń o wieloetapowej
procedurze przygotowania próbek wynosi nawet do 30-35%.
Masood i wsp. porównując oznaczenia kwasów tłuszczowych wykonane na dwóch różnych zestawach chromatograficznych w tym samym laboratorium otrzymali różnice sięga-
jące 15,6% [13].
Przedstawiona metoda umożliwia oznaczanie kwasów tłuszczowych C12, C14, C16, 16:1, C18, C18:1 trans, C18:1 cis,
C18:2 cis, C18:3 n-3, 20:2, C20:4, C20:5, C22, 22:6, C24,
C26 we frakcji fosfolipidów surowicy z akceptowalną precyzją i dokładnością. Natomiast dla kwasu C18:2 trans uzyskane stężenia w surowicy są na granicy wykrywalności metody. Uzyskane w obecnej pracy wartości LOD i LOQ mogą
stanowić punkt odniesienia dla innych metod oznaczania
indywidualnych kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów
surowicy krwi.
Wnioski
Otrzymane parametry walidacyjne wykazały, że metoda nadaje się do ilościowego oznaczania indywidualnych kwasów
tłuszczowych nasyconych, mono- i wielonienasyconych oraz
kwasów o konformacji trans frakcji fosfolipidów w surowicy
krwi.
Piśmiennictwo
1. Bondia-Pons I, Morera-Pons S, Castellote AI I wsp. Determination of phospholipid fatty acids in biological samples by solidphase extraction and fast gas chromatography.J Chromatogr A
2006; 1116: 204-8.
2. Bradbury KE, Skeaff CM, Green TJ I wsp.The serum fatty acids myristic acid and linoleic acid are better predictors of serum
cholesterol concentrations when measured as molecular percentages rather than as absolute concentrations. Am J Clin Nutr
2010; 91: 398-405.
3. Brondz I; Development of fatty acid analysis by high-performance liquid chromatography, gas chromatography, and related
techniques. Anal Chim Acta 2002; 465: 1–37
4. Burdge GC, Wright P, Jones AE i wsp. A method for separation
of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids
and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction.
Br J Nutr 2000; 84: 781-7.
5. Chajès V, Hultén K, Van Kappel AL i wsp. Fatty-acid composition
in serum phospholipids and risk of breast cancer: an incident
case-control study in Sweden. Int J Cancer 1999; 83: 585-90.
6. EURACHEM Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Method, First Internet Version, 1998.
7. Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for the
isolation and purification of total lipides from animal tissues. J
Biol Chem 1957; 226: 497-509.
8. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical
Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Text on Validation of Analytical Procedures, ICH-Q2A,
Geneva 1994.
9. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical
Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Validation of Analytical Procedures: Methodology,
ICH-Q2B, Geneva 1996.
10. Kaluzny MA, Duncan LA, Merritt MV. i wsp.Rapid separation of
lipid classes in high yield and purity using bonded phase columns; J Lipid Res 1985; 26: 135-40.
11. Kangani CO, Kelley DE, Delany JP.; New method for GC/FID
and GC-C-IRMS analysis of plasma free fatty acid concentration and isotopic enrichment. J Chromatogr B Analyt Technol
Biomed Life Sci 2008; 873: 95-101.
12. King IB, Kristal AR, Schaffer S i wsp. Serum trans-fatty acids
are associated with risk of prostate cancer in beta-Carotene and
Retinol Efficacy Trial. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;
14: 988-92.
129
Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w surowicy krwi
13. Masood A, Stark KD, Salem N Jr. A simplified and efficient method for the analysis of fatty acid methyl esters suitable for large
clinical studies. J Lipid Res 2005; 46: 2299-305.
14. Morrison WR , Smith LM. Preparation of fatty acid methyl esters
and dimethylacetals from lipids with boron fluoride—methanol.
J Lipid Res 1964; 5: 600-8.
15. Ruiz-Gutiérrez V, Pérez-Camino MC. Update on solid-phase extraction for the analysis of lipid classes and related compounds.
J Chromatogr A 2000; 885: 321-41.
16. Saadatian-Elahi M, Slimani N, Chajès V i wsp. Plasma phospholipid fatty acid profiles and their association with food intakes: results from a cross-sectional study within the European
Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. Am J Clin
Nutr 2009; 89: 331-46.
17. Sánchez-Avila N, Mata-Granados JM, Ruiz-Jiménez J i wsp.
Fast, sensitive and highly discriminant gas chromatographymass spectrometry method for profiling analysis of fatty acids in
serum. J Chromatogr A 2009; 1216: 6864-72.
130
18. van Dooremalen C, Pel R, Ellers J. Maximized PUFA measurements improve insight in changes in fatty acid composition in
response to temperature. Arch Insect Biochem Physio. 2009;
72: 88-104.
19. William Horwitz; Evaluation of analytical methods used for regulation of foods and drugs Anal. Chem 1982; 54: 67A–76A.
Adres Autorów:
Zakład Biochemii Klinicznej
Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CM UJ
ul. Wielicka 265
30-663 Kraków
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2010.07.01)
(Praca przekazana do opublikowania: 2010.07.09)