LAMP - Novazym

Nr 4/2014
Amplifikacja in vitro
wybranych odcinków
DNA i RNA metodą
Loop-mediated
isothermal AMPlification
(LAMP)
Opracowanie:
Adam Burzyński
Novazym Polska
Marta Jankowska
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
strona
Strona
2
SPIS TREŚCI
WSTĘP......................................................................................................................................................................................................................... 3
LAMP (ang. Loop-mediated isothermal AMPlification) .................................................................................................................... 3
Historia ................................................................................................................................................................................................................. 3
Publikacje naukowe na temat LAMP ....................................................................................................................................................... 4
Zakres wykorzystywania LAMP ................................................................................................................................................................ 4
WIRUSY ................................................................................................................................................................................................................. 4
BAKTERIE ............................................................................................................................................................................................................ 5
GRZYBY ................................................................................................................................................................................................................. 6
PIERWOTNIAKI................................................................................................................................................................................................. 7
GMO ........................................................................................................................................................................................................................ 7
LAMP – Zasada działania reakcji .................................................................................................................................................................... 8
Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów) .................................................................................................................................. 8
Warunki reakcji LAMP ................................................................................................................................................................................ 10
Projektowanie starterów do LAMP ...................................................................................................................................................... 11
Zasady projektowania starterów do LAMP ....................................................................................................................................... 11
Parametry starterów ................................................................................................................................................................................... 12
Programy do projektowania starterów .............................................................................................................................................. 13
Detekcja i wizualizacja produktów LAMP ............................................................................................................................................... 13
Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP („LAMPlikons”)....................................................................... 13
Metody detekcji .............................................................................................................................................................................................. 13
1.
Elektroforeza w żelu agarozowym ...................................................................................................................................... 13
2.
Analiza turbidymetryczna ....................................................................................................................................................... 14
3.
Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym ...................................................................................................... 15
4.
Analiza fluorymetryczna .......................................................................................................................................................... 15
5.
Fluorescencja w czasie rzeczywistym ................................................................................................................................ 16
Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP .......................................................................................................................... 17
Badanie SNP technika LAMP ......................................................................................................................................................................... 18
Multiplex LAMP (ang. Detection of Amplification by Release of Quenching, DARQ) .............................................................. 19
Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermalnej amplifikacji DNA firmy OptiGene® ................................. 21
Genie® II – zintegrowana elastyczna platforma ............................................................................................................................ 21
Genie® III – mała zintegrowana elastyczna platforma do reakcji LAMP ........................................................................... 22
Enzymy stosowane w reakcji izotermalnej amplifikacji DNA .................................................................................................. 23
1.
GspSSD® Polimeraza.................................................................................................................................................................. 23
2.
GspSSD® 2.0 Polimeraza .......................................................................................................................................................... 23
3.
GspF Polimeraza DNA................................................................................................................................................................. 23
4.
Tin Polimeraza DNA .................................................................................................................................................................... 23
5.
GspM Polimeraza DNA ............................................................................................................................................................... 23
6.
GspM 2.0 Polimeraza DNA ........................................................................................................................................................ 24
7.
GspM 3.0 Polimeraza DNA ........................................................................................................................................................ 24
8.
BstI Polimeraza DNA .................................................................................................................................................................. 24
9.
Odwrotna Transkryptaza do RT-LAMP ............................................................................................................................. 24
Master Mix-y do reakcji LAMP zawierające zoptymalizowany skład niezbędnych do reakcji odczynników,
poza matrycą DNA i starterami .............................................................................................................................................................. 24
1.
Isothermal Master Mix (ISO-001) ........................................................................................................................................ 24
2.
Isothermal Master Mix (ISO-001t) ....................................................................................................................................... 25
3.
Isothermal Master Mix (ISO-004) ........................................................................................................................................ 25
Zalety i wady techniki LAMP.................................................................................................................................................................... 25
Podsumowanie..................................................................................................................................................................................................... 26
Bibliografia............................................................................................................................................................................................................. 26
WSTĘP
LAMP (ang. Loop-mediated isothermal AMPlification)
 Nowatorska metoda amplifikacji kwasów nukleinowych, która pozwala na szybką
identyfikację patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych.
 Metoda polega na syntezie nowych nici DNA na matrycy (DNA lub RNA) w kolejnych
cyklach reakcji oraz zastępowaniu (wymianie) łańcuchów DNA przez łańcuchy nowo
zsyntetyzowane.
 Polimeraza wykorzystywana w reakcji posiada aktywność syntezy nici DNA w kierunku
5’ → 3’ oraz wymiany nici i nie posiada aktywności egzonuklotydowej.
 Powstałe amplifikowane produkty posiadają strukturę składającą się z na przemian
odwróconych powtórzeń sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu DNA.
 Produkt LAMP jest mieszaniną łańcuchów DNA, tworzących struktury typu łodyga-pętla
i różniących się wielkością.
 Uzyskany produkt posiada wysoką specyficzność do matrycy poprzez zastosowanie 2
par starterów komplementarnych do 6 niezależnych miejsc na matrycy w początkowym
etapie reakcji oraz 4 niezależnych miejsc w kolejnych etapach LAMP.
 Amplifikacja przebiega w warunkach izotermicznych.
Historia
1998 Opracowanie techniki LAMP przez japońską firmę Eiken Chemical Co., Ltd.
2000 Pierwsza publikacja naukowa nt. LAMP (Loop-mediated isothermal amplification of DNA,
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T).
2002 Pojawienie się na rynku komercyjnych zestawów do prowadzenia reakcji LAMP.
2006 Pojawienie się zestawów do wykrywania patogenów w żywności i w środowisku
(Cryptosporidium, Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, itd.).
2009 Założenie w UK firmy OptiGene Ltd.
2011 Umowa licencyjna pomiędzy OptiGene Ltd. i Eiken Chemical Co., Ltd. zezwalająca
OptiGene na rozwijanie i sprzedaż urządzeń i produktów do prowadzenia LAMP.
2011 Wprowadzenie na rynek przez OptiGene Ltd. w pełni zintegrowanej platformy Genie® II
do prowadzenia reakcji LAMP w czasie rzeczywistym.
2012 Umowa pomiędzy Novazym Polska s.c., a OptiGene Ltd. o wyłączność dystrybucji na
terenie Polski.
strona
Strona
2014 Wprowadzenie nowego enzymu do reakcji LAMP polimerazy GspSSD 2.0, intensywny
rozwój Reverse Transcription Loop-mediated amplification (RT-LAMP).
3
2013 Szybki wzrost ilości publikacji naukowych na temat LAMP. Opracowanie pierwszych
komercyjnych zestawów do identyfikacji patogenów bakteryjnych i wirusowych w
Novazym Polska.
Publikacje naukowe na temat LAMP
Wykorzystywanie reakcji LAMP (liczba publikacji na przestrzeni lat, na podstawie PubMED).
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Rysunek 1. Liczba publikacji w latach 2000-2011.
Obecnie jest ponad 600 publikacji, (w 2012: 16 publikacji).
Zakres wykorzystywania LAMP
Wykrywanie obecności patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych.
Technika jest wykorzystywana w badaniach weterynaryjnych, środowiskowych, rolnictwie,
badaniach żywności czy diagnostyce laboratoryjnej.
Techniką LAMP zamplifikowano ponad 200 genów.
Szeroki zakres zastosowań z przykładami:
WIRUSY
Influenza A Detection of human influenza A viruses by Loop-mediated Isothermal AMPlification.
Poon LL, Leung CS, Chan KH, Lee JH, Yuen KY, Guan Y, Peiris JS. J Clin Microbiol. 2005 Jan;
43(1):427-30
Herpes simplex Rapid diagnosis of herpes simplex virus infection by a loop-mediated isothermal
amplification method. Enomoto Y, Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, Miyake F, Usui C, Suga S,
Suzuki K, Kawana T, Nishiyama Y, Asano Y. Clin Microbiol. 2005 Feb; 43(2):951-5
Ebola virus Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated
isothermal amplification. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, Feldmann H,
Kawaoka Y, Yasuda J. J Virol Methods. 2007 Apr; 141(1):78-83. Epub 2006 Dec 27
strona
Strona
Epidemic diarrhea virus Development of reverse transcription loop-mediated isothermal
amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus. Ren X, Li P. Virus Genes. 2011
Apr; 42(2):229-35. Epub 2011 Feb 1
4
Porcine parvovirus Detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal amplification.
Chen CM, Cui SJ. J Virol Methods 2009 Feb; 155(2):122-5. Epub 2008 Nov 20
Porcine circovirus type 2 Specific, simple and rapid detection of porcine circovirus type 2 using
the loop-mediated isothermal amplification method. Zhao K, Shi W, Han F, Xu Y, Zhu L, Zou Y, Wu
X, Zhu H, Tan F, Tao S, Tang X. Virol J. 2011 Mar 18; 8:126
Human papillomavirus Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses
by loop-mediated isothermal amplification Saetiew C, Limpaiboon T, Jearanaikoon P, Daduang S,
Pientong C, Kerdsin A, Daduang J. J Virol Methods. 2011 Dec; 178(1-2):22-30
Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loopmediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye.Luo L, Nie K, Yang MJ, Wang M,
Li J, Zhang C, Liu HT, Ma XJ. J ClinMicrobiol. 2011 Oct; 49(10):3545-50
Colorimetric detection of HPV6 and HPV16 by loop mediated isothermal amplification.Lu CB, Luo
L, Yang MJ, Nie K, Wang M, Ma XJ. Bing Du XueBao. 2011 Jan; 27(1):64-70
Loop-mediated isothermal amplification method for detection of human papillomavirus type 6, 11,
16 and 18 Hagiwara M, Sasaki H, Matsuo K, Honda M, Kawase M, Nakagawa H. J Med Virol. 2007
May; 79(5):605-15
BAKTERIE
Mycobacterium tuberculosis Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of
Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum sample Iwamoto
T, Sonobe T, Hayashi K. J ClinMicrobiol. 2003 Jun; 41(6):2616-22
Use of visual loop-mediated isotheral amplification of rimM sequence for rapid detection of
Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis Zhu RY, Zhang KX, Zhao MQ, Liu YH, Xu YY,
Ju CM, Li B, Chen JD. J Microbiol Methods. 2009 Sep; 78(3):339-43. Epub 2009 Jul 17. Erratum in:
J Microbiol Methods. 2009 Nov; 79(2):250
Streptococcus pneumoniae Loop-mediated isothermal amplification method targeting the lytA
gene for detection of Streptococcus pneumoniae Seki M, Yamashita Y, Torigoe H, Tsuda H, Sato S,
Maeno M. J Clin Microbiol. 2005 Apr; 43(4):1581-6
Clostridium difficile Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium
difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification Kato H, Yokoyama T, Kato H,
Arakawa Y. J Clin Microbiol 2005 Dec; 43(12):6108-12
Campylobacter jejuni Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification
assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli Yamazaki W,
Taguchi M, Ishibashi M, Kitazato M, Nukina M, Misawa N, Inoue K. J Med Microbiol. 2008 Apr;
57(Pt 4):444-51
strona
Strona
Salmonella A loop-mediated isothermal amplification method targets the phoP gene for the
detection of Salmonella in food samples Li X, Zhang S, Zhang H, Zhang L, Tao H, Yu J, Zheng W, Liu
C, Lü D, Xiang R, Liu Y. Int J Food Microbiol. 2009 Aug 15; 133(3):252-8. Epub 2009 Jun 1
5
Clostridium botulinum Rapid and simple detection of Clostridium botulinum types A and B by
loop-mediated isothermal amplification Sakuma T, Kurosaki Y, Fujinami Y, Takizawa T, Yasuda J. J
ApplMicrobiol. 2009 Apr; 106(4):1252-9. Epub 2009 Jan 30
The rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification
(LAMP) Ueda S, Kuwabara Y. Biocontrol Sci. 2009 Jun; 14(2):73-6
Rapid, sensitive, and specific detection of the O4 group of Salmonella enterica by loop-mediated
isothermal amplification Okamura M, Ohba Y, Kikuchi S, Takehara K, Ikedo M, Kojima T,
Nakamura M. Avian Dis. 2009 Jun; 53(2):216-21
Escherichia coli O157 Development and application of a loop-mediated isothermal amplification
method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples.Zhao X, Li Y, Wang L,
You L, Xu Z, Li L, He X, Liu Y, Wang J, Yang L. Mol Biol Rep. 2010 Jun; 37(5):2183-8. Epub 2009
Aug 15
Staphylococcus aureus Loop-mediated isothermal amplification assays for identification of
antiseptic and methicillin-resistant Staphylococcus aureus Hanaki K, Sekiguchi J, Shimada K, Sato
A, Watari H, Kojima T, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae T. J Microbiol Methods. 2011 Feb; 84(2):2514. Epub 2010 Dec 16
Listeria monocytogenes Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loopmediated isothermal amplification Tang MJ, Zhou S, Zhang XY, Pu JH, Ge QL, Tang XJ, Gao YS. Curr
Microbiol 2011 Dec; 63(6):511-6. Epub 2011 Sep 21
Clostridium perfringens Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples
by using molecular methods Kaneko I, Miyamoto K, Mimura K, Yumine N, Utsunomiya H, Akimoto
S, McClane BA. Appl Environ Microbiol. 2011 Nov; 77(21):7526-32. Epub 2011 Sep 2
Vibrio cholerae Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a
loop-mediated isothermal amplification Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K.
BMC Microbiol 2008 Jun 12; 8:94
A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect toxigenic
Vibrio cholerae in rectal swab samples Okada K, Chantaroj S, Taniguchi T, Suzuki Y, Roobthaisong
A, Puiprom O, Honda T, Sawanpanyalert P. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010 Feb; 66(2):135-9.
Epub 2009 Oct 7
Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid
diagnosis of Vibrio cholerae Ke XM, Chen YY, Gao LL, DU ZP, Feng XM, Liao RY, Chen ZY, Cao YC,
Chen Q. Nan Fang Yi Ke Da XueXueBao. 2009 Oct; 29(10):2059-63
GRZYBY
strona
Strona
Candida Efficient identification of clinically relevant Candida yeast species by use of an assay
combining panfungal loop-mediatedisothermal DNA amplification with hybridization to speciesspecific oligonucleotide probes Inácio J, Flores O, Spencer-Martins I. J. Clin Microbiol. 2008 Feb;
46(2):713-20, Epub 2007 Dec 12
6
Paracoccidiodes brasiliensis Detection of gp43 of Paracoccidioides brasiliensis by the loopmediated isothermal amplification (LAMP) method Endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama
K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K. FEMS MicrobiolLett. 2004 May 1;
234(1):93-7
Pneumocystis pneumonia Development of a loop-mediated isothermal amplification method for
diagnosing Pneumocystis pneumonia Uemura N, Makimura K, Onozaki M, Otsuka Y, Shibuya Y,
Yazaki H, Kikuchi Y, Abe S, Kudoh S. J. Med Microbiol. 2008 Jan; 57(Pt 1):50-7
PIERWOTNIAKI
Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loopmediated isothermal amplification (LAMP) method Zhang H, Thekisoe OM, Aboge GO, Kyan H,
Yamagishi J, Inoue N, Nishikawa Y, Zakimi S, Xuan X. ExpParasitol. 2009 May; 122(1):47-50,
Epub 2009 Feb 1
Wuchereria bancrofti Development of loop-mediated isothermal amplification method for
detecting Wuchereriabancrofti DNA in human blood and vector mosquitoes Takagi H, Itoh M, Kasai
S, Yahathugoda TC, Weerasooriya MV, Kimura E. Parasitol Int. 2011 Dec; 60(4):493-7. Epub
2011 Sep 10
Plasmodium falciparum Development of a reverse transcription – loop-mediated isothermal
amplification (RT-LAMP) for clinical detection of Plasmodium falciparum gametocytes Buates S,
Bantuchai S, Sattabongkot J, Han ET, Tsuboi T, Udomsangpetch R, Sirichaisinthop J, Tan-ariya P.
Parasitol Int. 2010 Sep; 59(3):414-20, Epub 2010 Jun 10
GMO
Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target DNA
sequences Lee D, La Mura M, Allnutt TR, Powell W. BMC Biotechnol. 2009 Feb 2; 9:7
strona
Strona
7
Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediated
isothermal amplification Liu M, Luo Y, Tao R, He R, Jiang K, Wang B, Wang L. Biosci Biotechnol
Biochem 2009 Nov; 73(11):2365-9. Epub 2009 Nov 7
LAMP – Zasada działania reakcji
Kolejne cykle wydłużania i zastępowania nici prowadzone są przy użyciu odpowiedniej
polimerazy oraz 2 lub 3 par starterów rozpoznających odpowiednio 6 lub 8 miejsc matrycy.
Startery wewnętrzne to FIP (ang. Forward Inner Primer) oraz BIP (ang. Backward Inner Primer),
sekwencje ich są komplementarne do dwóch różnych odległych miejsc w sekwencji matrycy
(nici sensownej i antysensownej).
Startery zewnętrzne F3 (ang. Forward Primer) i B3 (ang. Backward Primer) komplementarne są
do zewnętrznych końców matrycy. Startery zewnętrzne są krótsze od starterów wewnętrznych i
ich końcowe stężenie w reakcji jest niższe, dlatego wolniej hybrydyzują do matrycy inicjując
reakcję zastępowania nici (ang. Strand Displacement).
Dodatkowo dla wzmocnienia reakcji można zastosować startery zapętlające LoopF (ang. Loop
Forward Primer) i LoopR (ang. Loop Backward Primer). Zastosowanie tej trzeciej pary starterów
zwiększa ilość „punktów startowych” do reakcji LAMP, tym samym zwiększając wydajność oraz
czułość reakcji.
Zastosowana polimeraza DNA posiada aktywność zastępowania nici DNA (ang. Strand
Displacement Activity), dzięki czemu nie potrzebna jest dodatkowa denaturacja matrycy i reakcję
można prowadzić w warunkach izotermicznych (w stałej temperaturze).
Kluczową cechą LAMP jest utworzenie w pierwszym etapie reakcji sztucznej matrycy (ssDNA)
o strukturze typu łodyga-pętla (ang. Stem-Loop), przez tzw. self-priming końców matrycy.
Matryca w następnych etapach jest amplifikowana, co prowadzi do powstania mieszaniny
dwuniciowego DNA o strukturach podobnych do kalafiora.
Proces można podzielić na etapy:
1. Tworzenie materiału startowego do LAMP.
2. Cykliczna amplifikacja.
3. Elongacja i recyklizacja.
Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów)
strona
Strona
8
Gdy dsDNA osiągnie stan równowagi (65°C) wówczas pierwszy ze starterów wewnętrznych
może przyłączyć się do komplementarnej sekwencji matrycy inicjując syntezę nowej nici DNA.
Polimeraza DNA o aktywności zastępującej wydłuża starter w kierunku 5’ → 3’.
Następnie starter zewnętrzny F3 hybrydyzuje do miejsca F3c matrycy i następuje jego
wydłużanie.
Zachodzi wydłużanie startera F3 w kierunku 5’ → 3’ oraz odsunięcie nici oflankowanej
starterem FIP.
Nowo powstały dsDNA (powyżej) uwolniony ssDNA (poniżej).
Uwolniona nić ssDNA oflankowana starterem FIP tworzy na końcu 5’ strukturę pętli z powodu
komplementarności sekwencji F1c z końca 5’ do sekwencji F1 wewnątrz sekwencji. Nić ta jest
matrycą dla kolejnego startera wewnętrznego BIP, po czym następuje wydłużenie i powstanie
nowej nici, zaś struktura pętli powraca do formy liniowej. Następnie starter B3 przyłącza się na
zewnątrz od BIP i zachodzi wydłużanie nowej nici i uwolnienie ssDNA.
strona
Strona
9
Uwolniona nić ssDNA tworzy strukturę pętli na obydwu końcach (struktura przypominająca
hantlę, ang. Dumbell-like Structure). Tak powstała struktura stanowi matrycę dla rozpoczęcia
kolejnego etapu reakcji: cyklicznej amplifikacji.
STRUKTURA STARTOWA DLA REAKCJI LAMPRozpoczyna się etap cyklicznej amplifikacji,
starter FIP przyłącza się do ssDNA i zaczyna się synteza nowej kolejnej nici w kierunku 5’ → 3’,
uwalniając wcześniej zsyntetyzowaną nić. Następnie na końcu 3’ regionu B1 zachodzi
wydłużenie nici i uwolnienie nici oflankowanej starterem FIP (9). Uwolniona nić tworzy
strukturę hantli z pętlami na obydwu końcach (11). Powstała nić jest odwróceniem nici z etapu
(8). Podobnie jak w etapach (8) do (11) następuje self-priming matrycy (11), dodatkowo starter
BIP hybrydyzuje do regionu B2c i zachodzi wydłużanie starterów i zastępowanie i uwalnianie
kolejnej nici DNA. W trakcie reakcji wydłużania starterów, self-priming matrycy oraz
zastępowania nici powstają produkty składające się z na przemian odwróconych powtórzeń
sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu.
Animacja reakcji LAMP: http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html

Temperatura: 60-70°C (~63°C) – warunki izotermiczne.
Objętość reakcji: 25 l.
Enzym: polimeraza DNA GspSSD, 8 U/reakcję.
Startery:
 wewnętrzne (FIP, BIP): 0,8 M
 zewnętrzne (F3, B3): 0,2 M
 zapętlające (LF, LB): 0,4 M
Trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dNTPs): 1,4 mM każdego.
strona
Strona




10
Warunki reakcji LAMP


Matryca: 0,5-5 l/reakcję.
Czas reakcji: do 1 godziny.
Projektowanie starterów do LAMP
Odpowiednie zaprojektowanie starterów jest kluczowym etapem poprawnego przeprowadzenia
reakcji LAMP.
FIP
Starter wewnętrzny Forward, zawiera na końcu 3’ region F2 komplementarny do F2c
matrycy oraz na końcu 5’ region F1c.
BIP
Starter wewnętrzny Reverse, zawiera na końcu 3’ region B2 komplementarny do B2c
matrycy oraz na końcu 5’ region B1c.
F3
Starter zewnętrzny Forward, zawiera w swojej sekwencji region F3 matrycy
komplementarny do F3c.
B3
Starter zewnętrzny Reverse, zawiera w swojej sekwencji region B3 matrycy
komplementarny do B3c.
Loop F Starter zapętlający Forward, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli
pomiędzy regionami F2 i F1 na końcu 5’ nici ssDNA o strukturze przypominającej
hantlę.
Loop B Starter zapętlający Reverse, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli
pomiędzy regionami B2 i B1 na końcu 5’ nici ssDNA o strukturze przypominającej
hantlę.
Rysunek 2. Sekwencje starterów wykorzystywane w reakcji LAMP.
strona
Strona
Odpowiednie i poprawne zaprojektowanie starterów wymaga postępowania krok po kroku
zgodnie z poniższymi wskazówkami:
 Określenie wymagań (celu) badań:
 Matryca: wybór odpowiednich szczepów / rodzajów mikroorganizmów, których
geny mają być amplifikowane (pozytywny wynik reakcji).
 Określenie odpowiednich szczepów / rodzajów mikroorganizmów, których geny
nie mogą być amplifikowane (negatywny wynik reakcji).
 Zebranie dostępnych sekwencji genów dla wszystkich szczepów / rodzajów
mikroorganizmów, które mają dawać pozytywny i negatywny wynik reakcji.
11
Zasady projektowania starterów do LAMP

Dopasowanie i określenie regionów konserwatywnych w genomie szczepów / rodzajów
mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane – czułość LAMP.
 Określenie regionów unikalnych (specyficznych) w genomie szczepów / rodzajów
mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (regiony niewystępujące
w genomach mikroorganizmów – negatywny wynik reakcji) – specyficzność LAMP.
 Wykorzystanie dostępnych programów komputerowych do projektowania starterów.
W przypadku, gdy zaprojektowane startery nie dają satysfakcjonującego rezultatu (brak
produktu, obecność niespecyficznych sekwencji, itd.) należy ponownie zaprojektować startery.
Parametry starterów
Odległość pomiędzy regionami starterów
 Odległość pomiędzy końcami regionu F2 i B2 (region amplifikowany przez LAMP)
powinna wynosić 120-180 pz, natomiast zarówno pomiędzy F2 i F3 oraz B2 i B3
powinna wynosić 0-20 pz.
 Odległość dla regionów tworzących strukturę pętli (pomiędzy 5' końcem F2 i 5' końcem
F1 oraz 5' końcem B2 i 3' końcem B1) powinna wynosić 40-60 pz.
 Odległość pomiędzy regionami F2 i F3 oraz B2 i B3 powinna wynosić 0-60 pz.
5’ F3
F2
F1c
<40~60>pz
<0~60>pz
3’
B1c
B2
B3 5’
<40~60>pz
<120~160>pz
<0~60>pz
Temperatura topnienia (Tm)
 Około 60-65°C dla regionów bogatych w pary GC i ok. 55-60°C dla regionów bogatych w
pary AT.
 Tm dla każdego regionu powinna wynosić odpowiednio: ok. 65°C (64-66°C) dla F1c i
B1c, ok. 60°C (59-61°C) dla F2, B2, F3, i B3 oraz ok. 65°C (64-66°C) dla starterów LoopF i
LoopB.
strona
Strona
Zawartość par GC
 Powinna wynosić 50-60 %, w przypadku matryc bogatych w pary GC, oraz 40-50 %, dla
matryc bogatych w pary AT.
12
Stabilność końców
 Końce starterów stanowią początkowy punkt dla syntezy DNA i tym samym muszą być
odpowiednio stabilne. Końce 3’ regionów F2/B2, F3/B3, i LF/LB oraz koniec 5’ regionów
F1c/B1c powinny być zaprojektowane tak, by energia swobodna wynosiła 4 kcal/mol
lub mniej (dla 6 pz końca). Koniec 5’ regionu F1c po amplifikacji łączy się z końcem 3’
regionu F1, dlatego stabilność w tym przypadku jest bardzo istotna (zmiana energii
swobodnej (ΔG) jest różnicą pomiędzy energią swobodną produktu i energią swobodną
materiału początkowego).
 Im niższa wartość ΔG, tym z większym prawdopodobieństwem startery hybrydyzują do
matrycy.
Tworzenie struktur dwurzędowych
 Ważne jest, szczególnie dla wewnętrznych, aby startery nie tworzyły struktur
drugorzędowych typu primer-dimer. Końce 3’ starterów nie mogą być komplementarne
względem siebie.
Inne

Jeżeli w sekwencji występują miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, z
wyjątkiem regionów dla starterów, mogą być one użyte dla potwierdzenia
zamplifikowanego produktu.
Programy do projektowania starterów
Primer Explorer V4
 Automatyczne oprogramowanie stworzone przez Fujitsu Ltd. i Eiken Chemical Co., Ltd.
 Wersja V4.
 Pracuje w środowisku Windows, Internet Explorer 5+.
 Dostępne na stronie internetowej http://primerexplorer.jp/e/
LAMP Designer (OptiGene Ltd.)
 Automatyczne oprogramowanie stworzone przez OptiGene Ltd.
 Posiada wbudowany algorytm wyszukiwania najlepszych sekwencji starterowych.
 Startery przeszukiwane są pod kątem tworzenia struktur drugorzędowych, dimerów,
homologii właściwości fizycznych zgodnie z zadanymi warunkami.
 Sekwencje matrycowe mogą być pobierane z baz danych (przy pomocy numeru dostępu,
ang. accession number), z pliku w formacie tekstowym oraz wklejane bezpośrednio w
okienko programu.
 Pracuje w środowisku Windows.
 Wersja demo dostępna na stronie internetowej
http://www.optigene.co.uk/products/lamp_designer.htm
Detekcja i wizualizacja produktów LAMP
Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP („LAMPlikons”)
Tabela 1. Porównanie produktów reakcji LAMP i PCR.
Struktura
Rozmiar
Kształt
Liczba kopii genu
Stężenie
LAMP
pętla-łodyga dsDNA
różny
przypominający kalafior
wiele kopii/1 amplikon
400-800 µg/ml
PCR
dsDNA
jednakowy
liniowy
1 kopia/1 amplikon
1012 kopii/reakcję, 4-40 µg/ml
Elektroforeza w żelu agarozowym



Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi T et al.).
Produkty reakcji wybarwiane bromkiem etydyny i rozdzielane w 2 % żelu agarozowym.
Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji).
strona
Strona
1.
13
Metody detekcji




Produkt na żelu widoczny w postaci „smearu”.
Wynik tylko jakościowy.
Wizualizacja w świetle UV.
Pozwala obserwować produkt reakcji LAMP po trawieniu restrykcyjnym.
A
B
Rysunek 3A. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy HBV techniką
LAMP (amplifikacja w temp. 60°C przez 60 min).
Linia 1: Marker masy DNA, Linia 2-4: Amplifikowane produkty z matrycy HBV, Linia 5: Kontrola
ujemna, Linia 6: Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau3AI).
Rysunek 3B. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy PSA mRNA
(amplifikacja w temp. 65°C przez 60 min).
Linia 1: Marker masy DNA, Linia 2: Kontrola ujemna, Linia 3-4: Amplifikowane produkty z
matrycy PSA mRNA, Linia 5-6: Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau3AI).
Analiza turbidymetryczna





Po raz pierwszy dla LAMP w 2001 roku (Mori et al.).
Powstający w trakcie reakcji produkt uboczny, pirofosforan magnezu, pozwala na ocenę
wyniku poprzez analizę zmętnienia.
Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji).
Produkt reakcji widoczny „gołym okiem”.
Wynik jakościowy.
W trakcie reakcji przyłączania kolejnych nukleotydów do wydłużanego łańcucha DNA
podczas polimeryzacji uwalniany jest z dNTP – ów pirofosforan. Duża ilość powstającego
piroforsforanu reaguje z jonami magnezu obecnymi w buforze reakcyjnym – powstaje biały
osad (zgodnie z równaniem poniżej):
/
P2O74- + 2Mg2+ = Mg2P2O7↓
Zmętnienie w probówce widoczne jest, kiedy stężenie pirofosforanu magnezu przekracza
0,5 mM. Do powstania pirofosforanu magnezu w stężeniu powyżej 0,5 mM potrzeba
wytworzenia 4 µg DNA w 25 µl objętości reakcji. W reakcji LAMP uzyskuje się 10 µg
DNA / 25 µl, dla porównania w reakcji PCR otrzymuje się ok. 0,2 µg DNA / 25 µl, a stężenie
pirofosforanu magnezu wynosi wówczas 0,02 mM, co nie pozwala na zaobserwowanie
białego osadu. Dodatkowo warunki termiczne (podgrzewanie) w reakcji PCR powodują, że
jony pirofosforanowe są hydrolizowane do jonów fosforanowych.
14
(DNA)n-1 + dNTP = (DNA)n + P2O74-
strona
Strona
2.
Rysunek 4. Analiza turbidymetryczna produktów reakcji LAMP. Probówka
1: K(-), Probówka 2: amplikon LAMP.
3.
Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym






Po raz pierwszy dla LAMP w 2003 roku (Mori et al.).
Pomiar w czasie rzeczywistym (ang. real-time) pozwala wyeliminować etap szacowania
ilości produktu po zakończeniu reakcji.
Pomiar podobny do analizy spektrofotometrycznej.
Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji.
Analiza turbidymetryczna jest pomiarem pośrednim ilości DNA, gdyż opiera się na
pomiarze stężenia produktu ubocznego reakcji – pirofosforanu magnezu.
Określana jest zależność pomiędzy ilością powstającego pirofosforanu magnezu, a ilością
powstającego DNA.
Rysunek 5. Pomiar zmętnienia produktów reakcji LAMP w czasie rzeczywistym.
Analiza fluorymetryczna



Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi T. et al.).
Detekcja produktu przez fluorescencję.
Detektorami są cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości po
związaniu się z dwuniciowym DNA, takie jak: bromek etydyny, SYBR Green I, kalceina,
itd.
Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji).
Analiza jakościowa.
Wizualizacja w świetle UV, ale produkt reakcji można obserwować „gołym okiem”.
15



strona
Strona
4.
R
y
s
u
n
e
k
6
A
.
W
i
A
B
z
u
Rysunek 6A wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: kalceina).
Jony pirofosforanowe usuwają jony manganu z kalceiny, a fluorescencja wzrasta, im więcej
kalceiny łączy się z uwolnionymi z dNTPs jonami magnezu. Probówka 1-K(-), Probówka 2amplikon LAMP.
Rysunek 6B. Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: bromek etydyny)
– obraz w świetle UV.
Probówka 1-K-, Probówka 2-amplikon LAMP.
Fluorescencja w czasie rzeczywistym



A
Pomiar zachodzi w czasie rzeczywistym, co pozwala wyeliminować etap szacowania
produktu po zakończeniu reakcji.
Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji.
Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie przez pomiar
fluorescencji.
Specyficzność reakcji – analiza temperatury annealingu produktu.
B
Rysunek 7A. Pomiar fluorescencji produktu reakcji LAMP w czasie rzeczywistym.
Rysunek 7B. Krzywa annealingu produktu reakcji LAMP.
16

strona
Strona
5.
Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP
Przed przystąpieniem do obliczania wskaźników wydajności LAMP należy:
1. Określić, które z badanych prób mają dać wynik pozytywny, a które negatywny.
2. Zebrać jak największą liczbę prób, które będą stanowiły odniesienie (tzw. próby
referencyjne) faktycznie dające wynik pozytywny oraz faktycznie dające wynik
negatywny.
3. Zbadać każdą próbę i określić, które w reakcji LAMP dają wynik pozytywny, a które
wynik negatywny.
4. Zebrane dane liczbowe umieścić w tabeli tzw. tablicy 2x2:
P. odniesienia (+)
Test (+) Prawdziwie dodatnie (PD)
Test (-) Fałszywie ujemne (FN)
SUMA
suma (PD+FN)
P. odniesienia (-)
Fałszywie dodatnie (FD)
Prawdziwie ujemne (PN)
suma (FD+PN)
suma (PD+FD)
suma (FN+PN)
SUMA
Wskaźniki:
Czułość – zdolność do wykrycia badanej cechy, stosunek wyników prawdziwie dodatnich do
faktycznie posiadających daną cechę.
Cz = PD / (PD+FN) [%]
Specyficzność – część negatywnych prób odniesienia, która w reakcji dała wynik negatywny,
stosunek wyników prawdziwie ujemnych do faktycznie nieposiadających danej cechy.
Sp = PN / FD+PN [%]
Predykcja dodatnia – iloraz wyników prawdziwie dodatnich oraz sumy wyników prawdziwie
dodatnich i fałszywie dodatnich (czyli wszystkich dodatnich wyników testu).
Pd = PD / (PD+FD) [%]
Predykcja ujemna – iloraz wyników prawdziwie ujemnych oraz sumy wyników prawdziwie
ujemnych i fałszywie ujemnych (czyli wszystkich ujemnych wyników testu).
Pn = PN / (PN+FN) [%]
strona
Strona
17
Wydajność – określa jak często w reakcji otrzymujemy poprawny wynik.
W = (PD+PN) / SUMA [%]
Badanie SNP technika LAMP
Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) jest to
zmienność sekwencji DNA, która polega na zmianie pojedynczego nukleotydu pomiędzy
osobnikami danego gatunku lub drugim, odpowiadającym chromosomem danemu osobnikowi.
Wysoka specyficzność reakcji LAMP powoduje, że tylko docelowa „dzika” sekwencja (ang. Wild
Type allele, WT allele, tj. nie zawierająca SNP) zostanie zamplifikowana spośród sekwencji
homologicznych. Występowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu można potwierdzić
przez brak amplifikowanego produktu w reakcji.
Możliwe to jest dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu starterów do reakcji. Startery FIP i BIP
do reakcji SNP-LAMP projektowane są w taki sposób, że na końcach 5’ zawierają nukleotyd SNP.
Kiedy matrycą w reakcji jest sekwencja bez polimorfizmu, wówczas w trakcie reakcji powstaje
struktura startowa i reakcja jest kontynuowana. W przypadku, gdy matrycą jest zmutowana
sekwencja genu zawierająca polimorfizm (ang. MUT allele), nie otrzymujemy produktu w reakcji.
Rysunek 8. Przebieg reakcji LAMP ukierunkowanej na identyfikację polimorfizmu SNP w
sekwencji.
strona
Strona
18
Animacja reakcji LAMP: http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps_anim.html
Multiplex LAMP (ang. Detection of Amplification by Release of Quenching, DARQ)
Metoda multiplex LAMP polega na znakowaniu starterów reakcji LAMP różnymi barwnikami
fluorescencyjnymi, które umożliwiają detekcję kilku produktów reakcji w jednej probówce.
Możliwość dostosowania do każdej reakcji LAMP.
Nie wymaga projektowania dodatkowych starterów. Koniec 5’ FIP znakuje się barwnikiem
wygaszającym fluorescencję (Iowa Black FQ, Iowa Black RQ). Koniec 3’ Fd posiada znacznik
fluorescencyjny (FAM, HEX, ROX, Cy5, Cy5.5).
Przygotowanie wstępne wymaga ogrzania mieszaniny 50 µM Q-FIP + 50 µM Fd do temperatury
98°C, a następnie powolnego schłodzenia do temperatury pokojowej.
Rysunek 10. Schemat reakcji multiplex LAMP.
strona
Strona
19
Rysunek 9. Zasada znakowania startera FIP i Fd w reakcjach multiplex LAMP.
strona
Strona
20
Rysunek 11. Schemat reakcji multiplex LAMP na przykładzie równoległej amplifikacji
wielu matryc DNA: faga lambda (λ), C. elegans, E. coli, hBRCA1.
Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria do izotermalnej amplifikacji DNA firmy
OptiGene®
Genie® II – zintegrowana elastyczna platforma
Genie® II to zaawansowane narzędzie, które pozwala na prowadzenie izotermalnej reakcji w
czasie rzeczywistym w przenośnej platformie o niskim poborze mocy. System zamknięty
prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanym produktem.
Genie® II jest urządzeniem wyposażonym w dwa niezależne bloki grzejne, każdy mieszczący
8 mikroprobówek (0,2 ml) odpowiednich dla urządzenia. Genie® II posiada funkcję gradientową
oraz umożliwia zaprogramowanie dodatkowego annealingu dla potwierdzenia obecności
amplifikowanego produktu.
Najważniejsze funkcje Genie® II:


Rysunek 12. Genie® II – urządzenie do prowadzenia reakcji LAMP i detekcji produktu w
czasie rzeczywistym.
21



Szybka izotermiczna amplifikacja.
Potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do
analizy krzywej topnienia produktu).
Niskie koszty i łatwość obsługi.
Kompaktowe, przenośne i wytrzymałe urządzenie.
Zasilanie sieciowe lub bateryjne pozwalające na 10-godzinne podtrzymanie pracy
urządzenia.
Łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB.
Obsługa za pomocą komputera lub niezależnie przez ekran dotykowy.
strona
Strona


Genie® III – mała zintegrowana elastyczna platforma do reakcji LAMP
Genie® III to zaawansowane narzędzie, które pozwala na prowadzenie izotermalnej reakcji w
czasie rzeczywistym w przenośnej platformie o niskim poborze mocy. System zamknięty
prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanym produktem.
Genie® II jest urządzeniem wyposażonym w jeden blok grzejny mieszczący 8 mikroprobówek
(0,2 ml Genie® III posiada funkcję gradientową oraz umożliwia zaprogramowanie dodatkowego
annealingu dla potwierdzenia obecności amplifikowanego produktu).
Najważniejsze funkcje Genie® III:
Rysunek 13. Genie® III – urządzenie do prowadzenia reakcji LAMP i detekcji produktu w
czasie rzeczywistym.
22



Wielkość dużego kalkulatora (kompaktowy).
Wysoka jakość układu optycznego.
Potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do
analizy krzywej topnienia produktu).
Wbudowany moduł GPS.
Panel dotykowy.
Łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB.
strona
Strona



Enzymy stosowane w reakcji izotermalnej amplifikacji DNA
GspSSD® Polimeraza







GspSSD® 2.0 Polimeraza





3.
GspF Polimeraza DNA


4.
Enzym przeznaczony do diagnostyki, charakteryzuje się wysoką aktywnością
zastępowania nici.
Posiada wysoką aktywność odwrotnej transkryptazy.
Tin Polimeraza DNA



5.
Nowa zmutowana polimeraza z Geobacillus sp. posiada najwyższą ze wszystkich
enzymów aktywność zastępowania nici.
Pozwala na amplifikację matrycy w czasie o ~30 % krótszym w porównaniu do
Polimerazy GspSSD.
Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności.
Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy.
Posiada wyższą aktywność odwrotnej transkryptazy, która jednak nie pozwala na
amplifikowanie RNA bez dodatkowego uzupełnienia mieszaniny reakcyjnej odwrotną
transkryptazą.
Enzym jako jedyny z enzymów do reakcji LAMP wykazujący termostabilność i
wymagający denaturacji wstępnej do prawidłowej pracy.
Charakteryzuje się niewielką, w stosunku do innych enzymów, aktywnością
zastępowania nici.
Posiada aktywność odwrotnej transkryptazy.
GspM Polimeraza DNA


Charakteryzuje się niewielką, w stosunku do innych enzymów, aktywnością
zastępowania nici.
Podobny do polimerazy BstI.
23
2.
Najczęściej wykorzystywana w reakcji LAMP polimeraza z Geobacillus sp. pozwala na
uzyskanie z niewielkiej ilości matrycy aż 109 kopii DNA w czasie krótszym, niż 30 minut.
Pozwala na amplifikację matrycy w znacznie krótszym czasie w porównaniu do
polimerazy BstI.
Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności.
Ze względu na aktywność zastępowania nici pozwala na prowadzenie reakcji w
warunkach izotermicznych bez konieczności wykorzystywania specjalistycznej
aparatury, jak w przypadku reakcji amplifikacji in vitro metodą PCR.
Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy.
Posiada niewielką aktywność odwrotnej transkryptazy, która jednak nie pozwala na
amplifikowanie RNA bez dodatkowego uzupełnienia mieszaniny reakcyjnej odwrotną
transkryptazą.
Enzym nie jest odporny na denaturację, ale utrzymuje wysoką aktywność w czasie
powyżej 10 godzin w temp. 75°C.
strona
Strona
1.

6.
GspM 2.0 Polimeraza DNA


7.


Charakteryzuje się czterokrotnie wyższą, w stosunku do do GspM, aktywnością
zastępowania nici.
Niewielka aktywność odwrotnej transkryptazy.
Enzym stosowany w turbidymetrii.
BstI Polimeraza DNA


9.
Charakteryzuje się dwukrotnie wyższą, w stosunku do do GspM, aktywnością
zastępowania nici.
Niewielka aktywność odwrotnej transkryptazy.
GspM 3.0 Polimeraza DNA

8.
Brak aktywności odwrotnej transkryptazy.
Pierwszy z enzymów zastosowany do reakcji izotermalnej amplifikacji DNA
charakteryzujący się relatywnie niską, w stosunku do innych enzymów, aktywnością
zastępowania nici.
Nie posiada aktywności odwrotnej transkrypcji.
Odwrotna Transkryptaza do RT-LAMP





Odwrotna transkryptaza o wysokiej termostabilności, dedykowana reakcji LAMP.
Pozwala na zachowanie stało-temperaturowego charakteru procesu reakcji.
Stężenie: 1 U/µl.
Zalecana temperatura do prowadzenia jednoetapowej stałotemperaturowej reakcji
RT-LAMP: 63°C.
Zalecana ilość enzymu do uzupełnienia aktywności w reakcji 1 rxn RT-LAMP:
0,0125-0,25 U.
Master Mix-y do reakcji LAMP zawierające zoptymalizowany skład niezbędnych do
reakcji odczynników, poza matrycą DNA i starterami
1.
Isothermal Master Mix (ISO-001)
Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP zawierająca polimerazę GspSSD, pozwala
na fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II oraz innych urządzeniach
fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy długości fali 488 nM i emisję przy 520 nM.
Może być także wykorzystywana w aparatach do qPCR lub real-time PCR ustawionych na kanał
FAM. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia obecności produktu. Eliminuje to
konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy
turbidymetrycznej oraz pozwala na prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym (ang. closetube system).
Amplifikacja: 30 minut w temp. 65°C.
Annealing: co 0,05°C w przedziale 98°C → 80°C.
strona
Strona


24
Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to:
2.
Isothermal Master Mix (ISO-001t)
Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP zawierająca GspM 3.0 Polimerazę DNA.
Pozwala na turbidymetryczną detekcję produktu (analiza zmętnienia w probówce) na specjalnie
dostosowanych do tego typu urządzeniach, turbidymetrach, lub „gołym okiem”. Umożliwia więc
prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym.

3.
Amplifikacja: 30-40 minut w temp. 65°C.
Isothermal Master Mix (ISO-004)
Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP zawierająca nową polimerazę GspSSD
2.0, pozwala na fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II, III oraz innych
urządzeniach fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy długości fali 488 nM i emisję
przy 520 nM np. aparatach do qPCR z kanałem FAM. Polimerazę GspSSD 2.0 charakteryzuje
najwyższa ze wszystkich enzymów aktywność zastępowania nici, która pozwala na skrócenie o
ok. 30 % czasu reakcji LAMP w stosunku do innych mastermiksów zawierających Polimerazę
GspSSD. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia obecności produktu. Eliminuje
to konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy
turbidymetrycznej oraz umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym.
Zawiera zoptymalizowany skład niezbędnych do reakcji odczynników, poza matrycą DNA i
starterami.
Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to:


Amplifikacja: 20 minut w temp. 65°C.
Annealing: co 0,05°C w przedziale 98°C → 80°C.
Zalety i wady techniki LAMP
Zalety:
 Szybka, krótki czas reakcji (produkt można zaobserwować po 20 min).
 Czuła i specyficzna, dzięki zastosowaniu starterów rozpoznających 6-8 miejsc na
matrycy.
 Izotermalna, możliwość prowadzenia reakcji w stałej temperaturze.
 Prostsze i tańsze urządzenia, niż w real-time PCR, przy porównywalnej czułości.
 Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy.
 Produkt reakcji można zaobserwować gołym okiem.
strona
Strona
Biorąc pod uwagę powyższe zalety i wady, można stwierdzić, że metoda LAMP jest odpowiednia
tam, gdzie mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami, gdzie wyniki potrzebne są w krótkim
25
Wady:
 Trudniejsze i bardziej czasochłonne projektowanie starterów do reakcji w porównaniu
do PCR.
 Ryzyko kontaminacji w systemach otwartych.
 Nie wszystkie badania DNA są specyficzne dla sekwencji.
czasie oraz prowadzone analizy są specyficzne w przypadku sekwencji. Technika nie nadaje się
natomiast do analizy nieznanych sekwencji DNA i RNA.
Podsumowanie













LAMP jest nową, innowacyjną i szybko rozwijającą się techniką amplifikacji kwasów
nukleinowych.
LAMP doskonale nadaje się w sytuacjach, gdy mamy do czynienia z ograniczonymi
zasobami sprzętowymi, a prowadzone analizy wymagają bardzo szybkich wyników.
LAMP umożliwia specyficzną amplifikację matrycy (startery rozpoznają 6-8 różnych
sekwencji matrycy).
Projektowanie starterów dla reakcji LAMP jest bardziej złożone, niż w przypadku PCR,
ale udogodnienie stanowią specjalne oprogramowania do projektowania.
Nie wymaga denaturacji matrycy, zaś całość reakcji przebiega w stałych warunkach
temperaturowych.
Wydajność amplifikacji jest bardzo wysoka, wyższa niż real-time PCR.
LAMP pozwala na znaczne skrócenie czasu analizy (do 1h).
LAMP jest mniej wrażliwy na obecność inhibitorów, nie zawsze wymagana jest izolacja
DNA.
Pozwala na amplifikację RNA bez dodawania odwrotnej transkryptazy.
Produkt uboczny powstający w reakcji LAMP, pirofosforan magnezu, pozwala na
obserwację wyniku w świetle UV i widzialnym (analiza turbidymetryczna).
Możliwy pomiar ilościowy produktu w czasie rzeczywistym.
Umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym, co pozwala uniknąć
zanieczyszczeń w próbie.
Zastosowanie zintegrowanej platformy Genie® II umożliwia prowadzenie reakcji w
czasie rzeczywistym i ilościowe oznaczenie produktu.
Bibliografia
Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, Suzutani T. Tolerance of loop-mediated isothermal
amplification to a culture medium and biological substances. J BiochemBiophys Methods. 2007
Apr 10; 70(3):499-501. Epub 2006 Aug 30
Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification
reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. BiochemBiophys Res
Commun. 2001 Nov 23; 289(1):150-4
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, YonekawaT, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated
isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15; 28(12):E63
strona
Strona
Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification
using loop primers. Mol Cell Probes. 2002 Jun; 16(3):223-9
26
Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying
template DNA. J BiochemBiophys Methods. 2004 May 31; 59(2):145-57
Parida M, Sannarangaiah S, Dash PK, Rao PV, Morita K. Loop mediated isothermal amplification
(LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical
diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008 Nov-Dec; 18(6):407-21
Strony www:
http://www.optigene.co.uk
http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/index.html
http://www.novazym.pl
strona
Strona
27
Novazym Polska S.C.
ul. Rubież 46H, 61-612 Poznań
tel.: (+48) 61 610 39 10; fax: (+48) 61 610 39 11
email: [email protected]; www.novazym.ehost.pl/esklep4