ĆWICZENIE I Temat : Podstawowe wiadomości z techniki

ĆWICZENIE I Temat : Podstawowe wiadomości z techniki

ĆWICZENIE I
Temat : Podstawowe wiadomości z techniki mikrobiologicznej.
•
Zapoznanie z przepisami BHP.
Przedmiotem badań mikrobiologii rolniczej są mikroorganizmy zasiedlające glebę,
powierzchnie roślin, komposty, obornik i inne nawozy organiczne. Badania te mają na celu
charakterystykę ilościową i jakościową mikroorganizmów oraz określenie ich roli i
aktywności w środowisku.
1. Podłoża hodowlane (typy i przykłady); substancje zestalające (agar – agar,
żelatyna).
Hodowle drobnoustrojów prowadzi się na pożywkach lub podłożach hodowlanych. Pożywką
nazywamy zestaw składników pokarmowych odpowiednio dobranych pod względem
ilościowym i jakościowym niezbędnych do hodowli drobnoustrojów.
Skład pożywki musi być tak dobrany, by gwarantował optymalne warunki wzrostu i
rozwoju badanych mikroorganizmów.
W związku z tym, podłoże musi posiadać:
•
•
•
•
odpowiedni zestaw związków chemicznych
optymalny odczyn
ciśnienie osmotyczne
musi być jałowe
Istnieje wiele kryteriów podziału pożywek. Najczęściej podstawą podziału jest:
•
•
•
•
skład chemiczny pożywek
wymagania pokarmowe drobnoustrojów
cel stosowania
konsystencja pożywek
Ze względu na charakter chemiczny składników wyróżnia się pożywki:
•
•
•
naturalne
syntetyczne
półsyntetyczne
W zależności od wymagań pokarmowych drobnoustrojów pożywki dzieli się na:
•
•
proste
złożone
Zależnie od celu, jakiemu mają służyć, pożywki dzieli się na:
•
•
ogólne
selektywne (wybiórcze)
Pod względem konsystencji pożywki dzieli się na:
•
•
•
płynne
półpłynne
stałe
Krótka charakterystyka poszczególnych typów pożywek
•
•
•
Naturalne – przygotowywane są z produktów pochodzenia naturalnego np. mleka,
bulionu, wyciągów roślinnych lub glebowych.
Syntetyczne – mają ściśle zdefiniowany skład chemiczny zarówno pod względem
ilościowym, jak i jakościowym. Stosowane są między innymi w badaniach
diagnostycznych.
Półsyntetyczne – wykonywane są ze składników naturalnych i syntetycznych
związków chemicznych.
•
Proste – stosowane dla prototrofów, czyli drobnoustrojów, którym wystarcza w
podłożu prosty związek organiczny, wykorzystywany do budowy wszystkich
niezbędnych składników komórki.
•
Złożone – służą do hodowli auksotrofów tj. drobnoustrojów, które nie są w stanie
syntetyzować niektórych składników komórki np. pewnych aminokwasów czy
witamin i związki te należy im dostarczać w pożywce.
•
Ogólne - na których rosną różne grupy fizjologiczne drobnoustrojów np. bulion
mięsny. Jest to podłoże płynne. Przygotowuje się je z wyciągu z mięsa do którego
dodaje się 1-2% peptonu i 0,5% NaCl.
Wybiórcze - w celu wyizolowania jednej grupy fizjologicznej mikroorganizmów,
oznaczającej się określonymi wymaganiami pokarmowymi np.
•
a. Podłoże wg Martina do hodowli grzybów. Wybiórczość podłoża powodowana jast
przez róż bengalski, streptomycynę i niskie pH.
b. Podłoże wg Bunta i Roviry z dodatkiem wyciągu glebowego stosowana jest do
izolacji i liczenia mikroorganizmów glebowych.
Podłoża:
•
•
•
płynne – powinny być klarowne, a wszystkie składniki muszą być całkowicie
rozpuszczone (do 0,5 % agaru).
półpłynne – zestalone małą ilością substancji żelującej (0,5-1,5 % agaru).
stałe – zestalone większą ilością substancji żelującej(1,5-2 % agaru, ok 15%
żelatyny). Można w próbówkach po sterylizacji zestalić w postaci tzw. słupka lub
przez ułożenie przed zastygnięciem w położeniu pochyłym w postaci tzw. skosu
agarowego.
Substancje zestalające – są to substancje, które pozwalają na zestalenie pożywek. Do
Agar – jest wysuszoną, hydrofilną, koloidalną substancją
wyekstrahowaną z glonów znanych jako agarofity. Składa się
on z dwóch polisacharydów - agarozy i agaropektyny w
zmiennych proporcjach zależnych od strefy pochodzenia
glonów. Temperatura upłynnienia podłoża z agarem wynosi
około 100ºC, a temperatura zestalania około 45ºC. Poniżej tej
temperatury podłoże z agarem zastyga tworząc trwałą galaretę.
Nie stanowi substancji odżywczej tylko czynnik zestalający
podłoże. W handlu dostępny jest w postaci włókien lub
proszku.
najczęściej używanych substancji zestalających należy agar i żelatyna.
Agar odżywczy sporządza się z bulionu z dodatkiem 1,5 – 2% agaru.
Żelatyna – jest substancją białkową. Otrzymuje się ją w wyniku hydrolizy kolagenu czyli
białka występującego w tkance łącznej zwierząt. Temperatura upłynnienia podłoża z żelatyną
wynosi około 25ºC, a temperatura zestalania około 20ºC. Wykorzystywana jest przez
drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych.
Żelatynę odżywczą sporządza się z bulionu dodając około 15% żelatyny.
2. Naczynia i urządzenia do hodowli drobnoustrojów: płytki Petriego, probówki
bakteriologiczne, kolby, pipety, cieplarki, suszarki.
Płytki Petriego – są to dwie szklane szalki;
górna ma nieco większą średnicę i niższy
brzeg niż dolna, wskutek czego szalki
zachodzą na siebie i można je swobodnie
zamykać i otwierać. Służą do zakładania
hodowli, liczenia, badań diagnostycznych i
morfologicznych drobnoustrojów. Mają
zastosowanie wyłącznie przy użyciu podłoży
stałych.
Po zestaleniu pożywek agarowych wydziela
się z nich woda kondensacyjna, która może
rozmyć kolonie wyrosłe na płytkach Petriego,
dlatego należy płytki z pożywkami
zestalonymi agarem inkubować zawsze
odwrócone dnem do góry.
a). probówka
chemiczna,
Probówki
bakteriologiczne – bez
kołnierzyka o różnych
wymiarach. Stosowane
do hodowli i
przechowywania
drobnoustrojów oraz do
wykonywania
rozcieńczeń np. gleby,
mleka. Mają
zastosowanie przy użyciu
podłoży płynnych i
stałych (słupki i skosy).
Zamyka się je korkami z
waty, tworzywa
sztucznego lub
gumowego.
b). probówka
mikrobiologiczna
a). skos, b). słupek
Probówki
Probówki chemiczne - stosowane do analiz chemicznych i biochemicznych w mikrobiologii.
Posiadają kołnierzyk ułatwiający przelewanie.
W mikrobiologii
wykorzystywane
są kolby różnego typu i
wielkości. Najczęściej są
stosowane kolby
stożkowe, kuliste lub
płaskodenne. Służą do
sporządzania pożywek,
roztworów oraz do
hodowli drobnoustrojów
na pożywkach płynnych.
Zamyka się je korkami z
waty, lub tworzywa
gumowego.
Kolby -stożkowa i
kulista płaskodenna
Pipety (kalibrowane i automatyczne) – służą do posiewów
hodowli płynnej oraz do przygotowywania rozcieńczeń .
Pipety pasterowskie – do nanoszenia materiału na szkiełka
lub do posiewów wgłębnych w probówkach.
Przed wyjałowieniem część ustnikową pipety zatyka się
zacikiem, co zabezpiecza materiał pobierany pipetą przed
zakażeniem z zewnątrz a szczególnie przed przedostaniem się
drobnoustrojów do ust.
Pipety automatyczne
Szkiełka przedmiotowe i
nakrywkowe – służą do
przygotowywania preparatów
mikroskopowych. Szkiełka Lindnera
z wgłębieniem przeznaczone są do
obserwacji preparatów
przyżyciowych w wiszącej kropli.
Szkiełka
mikroskopowe
a). przedmiotowe
b). nakrywkowe
Cieplarki – są to mniejsze lub
większe szafy z półkami,
zaopatrzone w urządzenia
ogrzewające i termostatowe
odpowiednio izolowane termicznie.
Stałość temperatury zapewnia
termostat. Służą do hodowli
drobnoustrojów na pożywkach
płynnych i stałych. Różne gatunki
drobnoustrojów wymagają różnych
temperatur do prawidłowego
wzrostu i rozwoju.
Suszarka – szafka wyposażona w
izolację cieplną oraz grzałki
elektryczne i termoregulator,
służąca do sterylizacji szkła
laboratoryjnego (kolb, probówek,
pipet, płytek Petriego) w temp.
około 180OC przez około 3
godziny. Czyste, suche szkło
laboratoryjne przygotowuje się do
jałowienia owijając je w papier,
folię aluminiową lub umieszcza się
w specjalnych pojemnikach
metalowych (tubusach). W
metalowych tubusach muszą być
pootwierane otwory aby był
zapewniony swobodny obieg
powietrza.
Cieplarka
Uwagi na temat jałowienia w suszarkach
•
•
•
•
Szkło wstawiamy do zimnej suszarki.
Po skończeniu sterylizacji nie wyjmujemy szkła od razu.
Szkło musi być odpowiednio zapakowane.
Nie sterylizujemy podłoży biologicznych.
3. Podstawowe zabiegi stosowane w mikrobiologii:
a). sterylizacja pożywek (metoda termiczna, filtracja).
Sterylizacja (wyjaławianie) – zabieg prowadzący do zabicia lub usunięcia drobnoustrojów.
Sterylizacja termiczna polega na zastosowaniu odpowiedniej temperatury.
Wyróżniamy sterylizację termiczną:
•
•
na sucho (nie stosuje się do jałowienia podłoży) – wyżarzanie, opalanie i
wyjaławianie w suszarkach.
na mokro – autoklawowanie, pasteryzacja i tyndalizacja
Pożywki najczęściej jałowi się na mokro, w gorącej parze wodnej, w aparatach zwanych
autoklawami.
Autoklaw – jest to kocioł o podwójnych ścianach i
podwójnym dnie, zaopatrzony w manometry,
termometr oraz zawór bezpieczeństwa i zawór
odpowietrzający. W górnej części znajduje się pokrywa
mocowana specjalnymi śrubami. Czynnikiem
jałowiącym jest przegrzana para wodna pod
zwiększonym ciśnieniem. Sterylizacja odbywa się przy
ciśnieniu (1 atmosfery) w temp. 121OC – w ciągu 20 –
30 minut. Autoklaw jest najczęściej stosowanym
aparatem do jałowienia, oprócz pożywek można w nim
jałowić sprzęt, który w suszarce przy znacznie wyższej
temperaturze może ulec zniszczeniu.
Autoklaw
Nie wszystkie jednak pożywki można jałowić pod zwiększonym ciśnieniem w autoklawach.
Pożywki zwierające cukry, żelatynę, a także roztwory witamin i inne substancje ulegające
rozkładowi pod wpływem wysokiej temperatury wyjaławia się w bieżącej parze wodnej w
temp. do 100OC. Proces ten nazywa się pasteryzacją.
Aparat Koch – jest to kocioł metalowy, znacznie lżejszy od autoklawu, o uproszczonej
budowie, przykryty luźną pokrywą. Czynnikiem jałowiącym jest bieżąca para wodna o
temp. do 100OC. Czas sterylizacji nie przekracza zwykle 30 minut.
W bieżącej parze wodnej o temp. do 100OC giną wegetatywne formy drobnoustrojów,
natomiast nie zostają zniszczone formy przetrwalne drobnoustrojów odporne na wysoką
temperaturę. Dla uzyskania pełnej jałowości materiału stosujemy metodę trzykrotnego
ogrzewania w temp.100OC w ciągu 30 minut co 24 godziny. W między czasie materiał
przenosi się do inkubacji w cieplarce w celu umożliwienia wykiełkowania przetrwalników.
Zabieg ten nosi nazwę tyndalizacji.
Wyjaławianie przez filtrację – metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod
wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne bądź chemiczne (surowica, roztwory
mocznika i niektórych cukrów). Metoda filtracji polega głównie na mechanicznym
zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od średnicy drobnoustrojów.
Istnieje wiele rodzajów takich filtrów, różniących się materiałem z którego są wykonane oraz
konstrukcją np.:
•
•
•
•
•
Berkefelda – wykonany z ziemi okrzemkowej.
Chamberlanda – z nieglazurowanej porcelany.
Seitsa – azbestowe.
Schotta – ze spiekanego szkła
membranowe (molekularne) – przygotowywane z żelatyny, pergaminu,
poliwęglanów, błon zwierzęcych itp.
Filtry są przed użyciem sterylizowane wraz z zestawem naczyń, używanych w procesie
sączenia. Proces sączenia odbywa się w ten sposób, że filtr łączy się z naczyniem, z którego
usuwa się powietrze za pomocą pompy wodnej. Ciśnienie atmosfery przeciska płyn przez
ścianki filtrów, a drobnousrtoje większe od porów zostają zatrzymane.
b). Sterylizacja szkła bakteriologicznego (metoda termiczna)
•
•
na sucho – wyjaławianie w suszarkach.
na mokro – autoklawowanie
c). Dezynfekcja
Metoda chemiczna – polega na stosowaniu związków chemicznych do zabijania
drobnoustrojów (dezynfekcja).
Do dezynfekcji stosuje się zasady (węglan sodu), kwasy (kwas siarkowy), środki utleniające
(chloramina, chlor), sole metali ciężkich (sublimat – chlorek rtęci), alkohole (etylowy),
formalinę, krezol, i amonowe zasady czwartorzędowe itd.
d). Posiew materiału mikrobiologicznego ezą i pipetą (jałowienie ez i igieł)
Posiew – wprowadzenie badanego materiału (np. zawiesiny drobnoustrojów, zawiesiny
wodnej gleby, cząsteczek gleby) na podłoże hodowlane lub do pożywki.
Przesiew – przeniesienie drobnoustrojów z podłoża na podłoże.
Pobieranie materiału wykonuje się za pomocą ezy, pipety itp.
Eza – oczko wykonane ze specjalnego
rodzaju drutu i osadzone w oprawce
metalowej, służy do wykonywania
posiewów, przesiewów i sporządzania
preparatów mikroskopowych.
Igła – prosty drucik w oprawce metalowej,
służy do wykonywania posiewów wgłębnych
i sporządzania preparatów mykologicznych
(grzybowych).
W zależności od konsystencji materiału posiewnego i podłoża, które należy zaszczepić,
dobiera się odpowiedni sposób przeszczepiania wg. poniższego schematu
•
•
•
Z pożywki płynnej - na pożywkę płynną (pipetą, ezą)
Z pożywki płynnej - na skos (pipetą, ezą)
Z pożywki płynnej - na płytkę (*metoda powierzchniowa - pipetą, ezą, **metoda
wgłębna - pipetą)
•
•
•
Z pożywki stałej - na pożywkę płynną (ezą)
Z pożywki stałej - na skos (ezą)
Z pożywki stałej - na płytkę (ezą)
*Metoda powierzchniowa – niewielką ilość rozcieńczonego materiału nanosi się pipetą na
zestaloną pożywkę i rozprowadza szklaną głaszczką po całej powierzchni.
**Metoda wgłębna – rozcieńczony materiał badany wprowadza się do płytki Petriego, a
następnie zalewa płynnym, wystudzonym (ok. 50oC) podłożem. Całość miesza się ruchami
kolistymi i pozostawia do zastygnięcia.
Wyżarzanie – to sterylizacja przez rozgrzanie do czerwoności w płomieniu palnika, a
następnie 3 krotne przesunięcie w płomieniu palnika oprawki wyżarzanego narzędzia – ezy
lub igły.
Opalanie – polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia np. z brzegami naczyń
zawierających pożywki, wlotami probówek. Głaszczkę opala się zanurzając w alkoholu i
zapalając w płomieniu palnika.
a) igła, b) eza
Przeszczepianie etapy
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
w przypadku hodowli płynnej dokładnie mieszamy materiał
wyżarzamy ezę lub opalamy pipetę trzymając ją w jednej ręce
probówkę z badanym materiałem bierzemy w drugą rękę
otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymającej ezę (pipetę)
opalamy wlot probówki (probówki podczas przeszczepiania trzymamy możliwie jak
najbardziej przechyloną, co zapobiega zakażeniu hodowli z powietrza)
studzimy ezę o wewnętrzną ściankę probówki a następnie pobieramy materiał
opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu
bierzemy probówkę z pożywką które będziemy szczepili
otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymającej ezę (pipetę)
opalamy wlot probówki
wprowadzamy ezę (pipetę) do probówki
szczepimy opłukując ezę pożywce (w przypadku skosu rysujemy wężyk na
powierzchni podłoża zaczynając od dołu ku górze), natomiast z pipety pozwalamy
swobodnie wypłynąć materiałowi (nie wydmuchujemy !)
opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu
wyżarzamy ezę i odstawiamy do statywu; pipetę odkładamy do pojemnika ze
środkiem dezynfekyjącym
Celem posiewu może być:
•
•
•
Odświeżenie hodowli drobnoustrojów w celu utrzymania ich żywotności i
aktywności.
Izolacja czystych kultur z badanego materiału.
Diagnostyka wyizolowanych szczepów w celu określenia ich przynależności do
gatunku, rodzaju lub określonej grupy drobnoustrojów.
Posiewy diagnostyczne służą do badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych.
Po wykonaniu posiewu, płytki umieszcza się w cieplarkach i inkubuje w optymalnej
temperaturze (np. 28oC) przez określony czas dostosowany do wymagań drobnoustrojów.
Część praktyczna
Ćwiczenie wysiewu ezą i pipetą płynów doświadczalnych (woda z barwnikiem i bez
barwnika).
Posiew redukcyjny – demonstracja.
Posiew redukcyjny – zmniejsza liczbę drobnoustrojów wysiewanych na jednostkę
powierzchni podłoża zestalonego i ma na celu uzyskanie kolonii z jednej komórki
macierzystej (czysta kultura).
Kolonią – nazywamy zespół komórek widoczny gołym okiem powstały z jednej komórki
macierzystej.
Spośród kolonii rosnących na płytce wybieramy jedną do posiewu redukcyjnego. Pobierany
jałowo materiał rozprowadzamy ezą na powierzchni płytki z podłożem agarowym gęstymi
zygzakowatymi ruchami, rozcieramy materiał na 1/2 powierzchni płytki, obracamy płytką o
90o i znów ruchami zygzakowatymi, zahaczając o posianą poprzednio powierzchnię
rozcieramy na 1/2 powierzchni płytki, czynność jeszcze raz powtarzamy.
Część praktyczna
Należy obejrzeć płytkę z wykonanym posiewem redukcyjnym bakterii - wykonać i opisać
rysunek.