Czynnik NF†κB w Fibroblastach skóry ludzkiej poddanych działaniu

Czynnik NF†κB w Fibroblastach skóry ludzkiej poddanych działaniu

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
#ZYNNIK.&†κ"WFIBROBLASTACHSKÌRYLUDZKIEJ
PODDANYCHDZIAŒANIUKAMPTOTECYNY
.&†κ"FACTORINHUMANSKINFIBROBLASTSTREATEDWITHCAMPTOTHECIN
%WA+ŒOSIÊSKAp3ZMURŒO7OJCIECH-ILTYK!RKADIUSZ3URA˜YÊSKI*OANNA$ONDZIŒO*ERZY0AŒKA
+ATEDRA#HEMII!NALIZYI4ECHNOLOGIIgRODKÌW,ECZNICZYCH
5NIWERSYTET-EDYCZNYW"IAŒYMSTOKU
Streszczenie
Abstract
Mechanizm inhibitorowego działania kamptotecyny na
biosyntezę kolagenu nie jest w pełni wyjaśniony. Z niniejszych badań wynika, iż kamptotecyna (CPT) hamuje biosyntezę kolagenu oraz pobudza aktywność prolidazy, enzymu który odgrywa ważną rolę w biosyntezie kolagenu –
hydrolizuje imidodipeptydy dostarczając wolną L-prolinę
do procesu biosyntezy tego białka. Aktywność prolidazy
i biosyntezę kolagenu regulują receptory β1-integrynowe.
Wykazano, że ekspresja podjednostki β1 receptora integrynowego wzrasta w fibroblastach inkubowanych z CPT,
w porównaniu do komórek kontrolnych. Wykazano także,
że CPT pobudza ekspresję czynnika NF-κB (odpowiadającego za hamowanie ekspresji genów kolagenu) w sposób
zależny od użytego stężenia i od czasu inkubacji. Różnica
pomiędzy wzrostem aktywności prolidazy, a obniżeniem
biosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniu CPT może wynikać zatem z przewagi inhibitorowego
działania NF-κB na ekspresję genów kolagenu nad pobudzającym działaniem MAP-kinaz na aktywność prolidazy. Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działania
kamptotecyny na biosyntezę kolagenu może posłużyć
jako model badawczy do poszukiwania nowych leków
stosowanych w terapii zwłóknienia narządów.
Although, camptothecin (CPT) is considered as a potential anticancer agent acting through inhibition of topoisomerase I, the mechanism of its effect on collagen metabolism is not known. The present study was undertaken
to evaluate the mechanism of CPT - induced deregulation
of collagen metabolism in cultured human skin fibroblast.
It has been found that CPT strongly induced inhibition of
collagen biosynthesis. The mechanism of this phenomenon was found to be independent of prolidase activity,
an enzyme that plays an important role in enhancement of
collagen biosynthesis at post-translational level. In fact,
the enzyme activity was found to be stimulated by CPT.
Increase in the enzyme activity was accompanied by increase in the expression of β1 integrin receptor and some
β1 integrin-dependent signaling proteins, Sos, MAPK and
transcription factor NF-κB. Since at least in some cell
types activation of β1 integrin induces NF-κB and this
transcription factor is involved in inhibition of collagen
gene transcription, therefore the mechanism of CPT-dependent inhibition of collagen biosynthesis may be related
to β1 integrin-dependent stimulation of NF-κB. The data
suggest that CPT induces inhibition of collagen biosynthesis in cultured human skin fibroblasts by stimulation of
NF-κB signaling.
Słowa kluczowe: kamptotecyna, kolagen, fibroblasty,
NFκB
Key words: camptothecin, collagen, fibroblasts, NFκB
Wstęp
Badania nad metabolizmem kolagenu stanowią jeden
z głównych kierunków badań nad chorobami tkanki łącznej.
Pomimo znacznego postępu, jaki dokonał się w wyjaśnieniu
mechanizmów regulujących metabolizm kolagenu, wciąż
brakuje skutecznej terapii zwłóknienia narządów.
Jednym z czynników hamujących biosyntezę kolagenu
jest kamptotecyna. Mechanizm tego procesu nie jest w pełni poznany. Kamptotecyna jest alkaloidem chinolinowym,
wykazującym właściwości antymitotyczne [1, 2]. Udowodniono, że najwyższą aktywność cytotoksyczną wykazuje ona w stosunku do komórek znajdujących się w fazie
przedpodziałowej cyklu komórkowego [3, 4]. Faza S cyklu
komórkowego u szybko dzielących się komórek takich jak
komórki nowotworowe trwa dłużej niż w przypadku komó-
rek prawidłowych i dlatego komórki rakowe są niszczone
z dużo większą skutecznością niż komórki prawidłowe
[5-7]. Z tego powodu, pochodne tego alkaloidu znalazły zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej [8, 9].
NF-κB to rodzina jądrowych czynników aktywujących
transkrypcję genów, obejmująca grupę regulatorów kontroli
cyklu komórkowego, wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej, procesów zapalnych, apoptozy i onkogenezy. Czynniki te, w zależności od typu bodźca mają zdolność
do dimeryzacji [7, 10-12]. Najdokładniej scharakteryzowanym heterodimerem jest p50/p65 stanowiący produkt genu
NF-κB1 i RelA [13-19]. Rodzina NF-κB odpowiada za aktywację transkrypcji genów w odpowiedzi na sygnał pochodzący ze środowiska pozakomórkowego, wywołany obec-
&ARM0RZEGL.AUK
nością: cytokin (np. TNF-α), mitogenów (np. anti-CD2, antiCD3), bakterii (endotoksyny Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis), wirusów (np. HTLV-1, HBV), leków (np.
cykloheksamid) i innych czynników np. stresu oksydacyjnego
czy związków przeciwnowotworowych [19-25]. Aktywacja
NF-κB zachodzi w ciągu kilku minut po ekspozycji na czynnik
indukujący, zatem nie wymaga syntezy białek de novo. Proces
ten polega na fosforylacji IκB (inhibitora NF-kB) co prowadzi
do ich ubikwitynacji i oddysocjowania od NF-κB. Aktywny
NF-κB ulega translokacji z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie pobudza transkrypcję odpowiednich genów [26-28].
Wpływ kamptotecyny na ekspresję NF-κB nie jest
znany. Wysunięto przypuszczenie, że potencjalnym punktem uchwytu inhibitorowego działania tego alkaloidu
na biosyntezę kolagenu może być czynnik transkrypcyjny NF-κB. Ocenie poddano ekspresję NF-κB, receptora
β1-integrynowego oraz biosyntezę kolagenu w fibroblastach
skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny.
komórek przy użyciu soli tetrazolinowej (MTT). W żywych
komórkach barwnik ten ulega konwersji do purpurowego
formazonu pod wpływem mitochondrialnych dehydrogenaz. W martwych komórkach konwersja ta nie zachodzi.
Komórki w stanie inhibicji kontaktowej inkubowano w pożywce zawierającej równe stężenia badanego związku przez
24 godziny w inkubatorze z CO2 w temp. 37 oC. Następnie
podłoże usunięto, komórki przepłukano 3 x 1 ml PBS, dodano 1 ml PBS oraz 50Ml MTT o stężeniu 5 mg/ml i kontynuowano inkubację przez 4 godziny. Po tym czasie usunięto
medium i dodano do komórek 1 ml 0,1 mol/l kwasu solnego
w absolutnym izopropanolu. Po ok. 10 minutach, w lizacie
komórek mierzono absorbancję przy 570 nm i 630 nm. Od
wartości absorbancji przy 570 nm odjęto wartość absorbancji tła (630nm). Różnicę wartości absorbancji uzyskaną
w hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Posłużyła ona za wartość porównawczą względem komórek inkubowanych w obecności kamptotecyny. Przeżywalność tych
komórek przedstawiono jako procent wartości kontrolnej.
Materiały i metody
MATERIAŁY
L-prolina, kolagenaza bakteryjna typu VII, trypsyna, pożywka DMEM, kamptotecyna - Sigma, USA, płodowa surowica
bydlęca – Gibco, USA, L-5[3H] prolina (28 Ci/mmol), Amersham, U.K. Przeciwciała poliklonalne królicze przeciw NFκB,
β-aktynie, receptorowi β1-integrynowemu, przeciwciała drugorzędowe znakowane fosfatazą, Santa Gruz, USA. Fibroblasty –
American Type Culture Collection, Rockville, USA.
METODY
Przygotowanie hodowli fibroblastów.
Fibroblasty skóry ludzkiej hodowano w DMEM z dodatkiem 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/l
glutaminy, 50 Mg/ml penicyliny, 50 Mg/ml streptomycyny
w temperaturze 37 oC, w atmosferze 5 % CO2. Fibroblasty przenoszono z butelek „Costar” do 6 oczkowych płytek „Costar” stosując bufor fosforanowy z dodatkiem
0,05 % trypsyny i 0,02 % EDTA. Komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1x105 komórek na oczko
w 1 ml pożywki hodowlanej. Pożywkę hodowlaną wymieniano na świeżą, co 48 godzin. Fibroblasty osiągały stan inhibicji kontaktowej w 6 dniu wzrostu. W większości przypadków komórki takie użyto do dalszych doświadczeń. Do badań używano komórek pomiędzy 8 i 14 pasażem. Fibroblasty
w stanie inhibicji kontaktowej płukano trzykrotnie 0,15 mol/l
NaCl, zawieszano w 0,15 mol/l NaCl i wirowano przy obrotach 200 x g, a supernatant odrzucono. Następnie, odwirowane komórki zawieszono w 0,3 ml 0,05 mol/l buforu Tris-HCl
o pH 7,8 i poddano działaniu ultradźwięków trzykrotnie po
10 sekund w temp. 0 oC. Próby wirowano przy 16.000 x g w
temp. 0oC przez 30 minut. W uzyskanym supernatancie oznaczono białko i użyto do dalszych doświadczeń.
Test cytotoksyczności
Pomiar cytotoksyczności przeprowadzono według metody opisanej przez Carmichael’a [29]. Oceniono żywotność
Oznaczanie zawartości białka
Białko zawarte w supernatancie homogenatów komórkowych oznaczano metodą Lowry i wsp. [30].
Elektroforetyczny rozdział białek na żelu poliakrylamidowym z SDS
Badane próby zawierające 20 Mg białka rozpuszczono
w buforze 0,125 mol/l Tris-HCl o pH 6,8 zawierającym 3 %
SDS, 20 % glicerol i 0,1 % błękit bromofenolowy. Próbki
poddano rozdziałowi elektroforetycznemu na żelu poliakryloamidowym złożonym z 10 % żelu zagęszczającego
(zawierającego 0,4 % SDS, 1,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH
8,8) i 6 % żelu rozdzielającego (zawierającego 0,4 % SDS,
0,5 mol/l bufor Tris-HCl o pH 6,8) w buforze elektrodowym
zawierającym 1,92 mol/l glicyny, 0,25 mol/l Tris i 1 % SDS.
Doświadczenie prowadzono przy natężeniu prądu 100 mA
na żel przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Analiza białek metodą „Western immunoblot”
Po rozdziale elektroforetycznym żele zrównoważono
5 minutową inkubacją w 20 % (v/v) metanolowym roztworze, który zawierał 25 mmol/l Tris i 0,2 mol/l glicyny. Białka
zostały przetransferowane na nitrocelulozę o porach 0,2 Mm
z użyciem zestawu LKB 2117 Multiphor II, pod wpływem
napięcia 100 mA w ciągu 1 godziny, zgodnie z metodą opisaną w podręczniku dołączonym do aparatu. Niespecyficzne
wiązania nitrocelulozy zablokowano poddając ją działaniu
5 % roztworu beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wolno mieszając. Następnie
nitrocelulozę inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem
przeciw NF-κB lub polikolnalnym przeciwciałem przeciw
receptorowi β1-integrynowemu lub poliklonalnalnym przeciwciałem przeciw β-aktynie w 5 % roztworze mleka beztłuszczowego w TBS-T o stężeniu 1:3000 przez 24 godziny
w temperaturze pokojowej. Po inkubacji nitrocelulozę płukano w roztworze TBS-T (1x15 minut, 2x10 minut) wolno mieszając. W celu wykrycia analizowanych białek dodano drugie
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
[dpm x 10 / mg białka]
Analiza statystyczn
25
Wyniki poddano analizie statystycznej. Obliczono średnie arytmetyczne z poszczególnych
pomiarów i odchylenia standardowe oraz dokonano analizy statystycznej przy użyciu testu „t” –
studenta. Za istotne statystycznie przyjęto różnice
pomiędzy średnimi przy poziomie ufności p<0,05.
20
-3
3
Wbudowywanie 5[ H]-proliny
Cytotoksyczność
[% wartości kontrolnej]
skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej w
pożywce przez 24 godziny z dodatkiem 5[3H]120
proliny (5 MCi/ml, 28 Ci/mmol). Komórki dwukrotnie przemyto 1 ml DPBS z 10 mmol/l pro100
liny, następnie zawieszono je w 1,5 ml DPBS
z 10 mmol/l proliny. Zawiesinę komórek poddano homogenizacji ultradźwiękami (3 x 20 s w
80
temp. 0 oC). Białka zawarte w homogenatach
wytrącono przez dodanie 1,5 ml 20% TCA z 20
60
mmol/l proliną. Po 5 minutach wytrącone białka odwirowano (1000 x g w temp. 4oC przez 10
40
minut), supernatant odrzucono, a osad rozpuszczono w 0,6 ml 0,2 mol/l NaOH. Pobierano po 2
próby po 0,2 ml lizatu. Każdą próbę zobojętnia20
no przez dodanie 0,16 ml 0,15 mol/l HCl i 0,1 ml
1 mol/l Tris-HCl o pH 7,2, a następnie dodano
0
20 Ml 62,5 mmol/l N-etylomaleimidu (NEM), 10
0
0,1
15
50
Ml CaCl2 oraz 10 Ml DPBS z kolagenazą o stężeniu
1 mg/ml (próba badana) lub bez kolagenazy
½
Kamptotecyna [ μM]
(próba kontrolna). Próby inkubowano przez 90
Ryc. 1. Ocena przeżywalności fibroblastów skóry ludzkiej poddanych minut w temperaturze 37 oC. Następnie dodano
działaniu kamptotecyny (CPT). Komórki inkubowano przez 24 godziny 0,5 ml zimnego 10% TCA i chłodzono przez 5
w pożywce z dodatkiem różnych stężeń CPT. Przedstawiono wartości minut w temperaturze 0 oC. Po 5 minutach próśrednie ± S.D.
by odwirowano, a supernatant przeniesiono do
fiolek scyntylacyjnych z 4 ml płynu scyntylacyjnego. Ilość powstałego kolagenu wyrażono
w dpm 5[3H]-proliny wbudowanej do białek
35
podatnych na działanie kolagenazy bakteryjnej,
w przeliczeniu na Mg białka.
30
15
10
5
Wyniki
0
W celu oceny wpływu kamptotecyny na
przeżywalność fibroblastów skóry ludzkiej,
wykonano test cytotoksyczności metodą CarKamptotecyna [½μM]
michael’a z zastosowaniem soli tetrazolinowej.
Ryc. 2. Biosynteza kolagenu w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej Przeżywalność fibroblastów inkubowanych
w stanie inhibicji kontaktowej inkubowanych przez 24 godziny w po- przez 24 godziny z różnymi stężeniami kampżywce z dodatkiem 0,1, 15, 50 M M CPT. Przedstawiono wartości średnie totecyny (0,1, 15, 50 MM) przedstawia Ryc. 1.
± S.D.
Stwierdzono, że badane stężenia kamptotecyny
nie wpływają w istotnym stopniu na przeżywalprzeciwciało przeciw króliczej Fc IgG, znakowane fosfatazą alka- ność fibroblastów. Z tego względu do dalszych doświadczeń
liczną w stężeniu 1:5000 w TBS-T i poddano inkubacji przez 30 użyto kamptotecyny w stężeniach 0,1, 15, 50 MM. Następnie
minut, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę delikatnie płuka- wykonano pomiar biosyntezy kolagenu. Badania prowadzono TBS-T (5x10 minut) i poddano działaniu odczynnika Sigma– no w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji
kontaktowej. Fibroblasty inkubowano przez 24 godziny
Fast BCIP/NBT aby wybarwić immunoreaktywne białko.
w podłożu zawierającym różne stężenia kamptotecyny.
Wynik doświadczenia przedstawia Ryc. 2. Dodatek kampPomiar biosyntezy kolagenu
totecyny do pożywki hodowlanej w stężeniu 0,1, 15, 50 MM
Pomiar biosyntezy kolagenu wykonano według me- spowodował obniżenie biosyntezy kolagenu w hodowlach fitody opisanej przez Peterkofsky i wsp. [31]. Fibroblasty broblastów skóry ludzkiej odpowiednio o 30%, 47%, 73% w
0
0,1
15
50
&ARM0RZEGL.AUK
A.
NF-κB
B.
β-aktyna
0
0.1
15
Kamptotecyna [μM]
50
Ryc. 3. (A) Ocena ekspresji czynnika NF-κB w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry
ludzkiej inkubowanych w obecności różnych stężeń kamptotecyny (B) ekspresja β-aktyny
w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w obecności różnych
stężeń kamptotecyny.
A.
NF-κB
B.
β-aktyna
0
20
60
240
Czas [min]
Ryc. 4. Ekspresja NF-κB (A) i β-aktyny (B) w zależności od czasu inkubacji w ekstrakcie komórkowym fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych w pożywce hodowlanej z dodatkiem
50 mM kamptotecyny.
integrynowego w homogenacie fibroblastów skóry
ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny. Badanie
przeprowadzono
metodą
„Western-immunoblot”.
Jednocześnie przeprowadzono analizę β-aktyny metodą „Western-immunoblot”
w celu stwierdzenia kontroli
ilości nanoszonego białka.
Wykazano większą zdolność do wiązania przeciwciał przeciwko podjednostce
β1 receptora integrynowego
homogenatów komórek inkubowanych z CPT w porównaniu do homogenatów
komórek kontrolnych (Ryc.
5). Wskazuje to, iż kamptotecyna pobudza ekspresję
receptora β1-integrynowego
w hodowli fibroblastów
skóry ludzkiej.
Dyskusja
receptor
β1 - integrynowy
Pomimo
znacznego
postępu jaki dokonał się
w wyjaśnieniu mechanizmów regulujących metaboB.
β-aktyna
lizm kolagenu, wciąż brakuje
skutecznej terapii zaburzeń
0
0.1
15
50
kolagenu z tkanki łącznej.
Kamptotecyna [μM]
Kolagen jest najobficiej
Ryc. 5. (A) Ekspresja receptora β1-integrynowego w fibroblastach kontrolnych oraz inkubo- występującym
białkiem
wanych z CPT w różnych stężeniach. (B) Ekspresja β-aktyny w fibroblastach kontrolnych macierzy pozakomórkowej
oraz inkubowanych z CPT w różnych stężeniach.
ssaków. Odpowiada on za
utrzymanie
prawidłowej
porównaniu do biosyntezy kolagenu zachodzącej w komór- struktury i integralności tkanki łącznej, odgrywa też ważna
kach rosnących w pożywce hodowlanej bez CPT (kontrola). rolę w interakcji z receptorami integrynowymi powierzchZaobserwowano hamowanie biosyntezy kolagenu proporcjo- ni komórek, regulujących wiele procesów fizjologicznych
nalne do użytych stężeń alkaloidu. Uzyskane wyniki wskazu- i patologicznych: reorganizację cytoszkieletu, transport joją, że CPT jest inhibitorem biosyntezy kolagenu w hodowli nów, metabolizm lipidów, aktywację kinaz, ekspresję genów, regulację cyklu komórkowego, procesy różnicowania
fibroblastów skóry ludzkiej w stanie inhibicji kontaktowej.
Jednym z czynników odpowiedzialnych za hamowa- i wzrostu komórek nowotworowych jak również inwazyjnie biosyntezy tego białka jest NF-κB. Oceniono ekspresję ność komórek nowotworowych. Z tego względu wszelkie
NF-κB w hodowli fibroblastów inkubowanych w obecności zmiany w procesach biosyntezy i degradacji kolagenu mają
różnych stężeń kamptotecyny. Wynik tego doświadczenia potencjalny wpływ na metabolizm komórkowy [32].
Badania zespołu Czuwary-Ładykowskiej wskazujące, że
przedstawia Ryc. 3. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnika NF-κB zależny od użytego stężenia kamptotecyny. kamptotecyna silnie hamuje biosyntezę kolagenu, nie wyW celu potwierdzenia poprawności wykonania doświadcze- jaśniły jednak mechanizmu inhibitorowego działania CPT.
nia wykonano jednocześnie analizę „Western-immunoblot” Ten przeciwnowotworowy związek zwany „fazowo specyβ-aktyny. Zaobserwowano wzrost ekspresji czynnika NF- ficznym” może modulować cykl komórkowy, wpływając
κB w hodowli fibroblastów w zależności od czasu inkuba- na replikację DNA (fazę S), a dokładniej na stabilizowanie
cji z kamptotecyną. Najwyższą ekspresję zaobserwowano kompleksu DNA – topoizomeraza I (enzym biorący udział
po 4 godzinach inkubacji (Ryc. 4) W regulacji aktywności w replikacji, zmniejszający naprężenia nici DNA) i hamoNF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej ważną funkcję peł- wanie przesuwania się widełek replikacyjnych. Zjawisko to
ni podjednostka β1 receptora integrynowego powierzchni zatrzymuje cykl w fazie S, co może prowadzić do licznych
komórki. Z tego powodu oceniono ekspresję receptora β1- mutacji, a w efekcie do śmierci komórki [35].
A.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Z przeprowadzonych doświadczeń wynika, iż kamptotecyna hamuje biosyntezę kolagenu proporcjonalnie do użytych stężeń. Związek ten jednocześnie pobudza aktywność
prolidazy (dane nie prezentowane). Rozbieżność między
zwiększoną aktywnością prolidazy a zahamowaniem biosyntezy kolagenu nasunęła przypuszczenie, że hamowanie
biosyntezy kolagenu może wynikać z indukcji innych mechanizmów. Z badań tych, wynikło również, że w regulację
aktywności prolidazy i biosyntezy kolagenu zaangażowane
są receptory β1-integrynowe [32].
Ligandem receptorów β1-integrynowych jest kolagen.
Interakcja kolagenu z receptorem integrynowym inicjuje
kaskadę wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego. Pobudzony receptor β1-integrynowy wywołuje autofosforylację
kinazy białkowej FAK, która następnie oddziaływuje z białkami adaptorowymi Grb i Src, poprzez białka Shc i Shr. Ta interreakcja pozwala na aktywację kaskady białek Sos, Ras, Raf,
a następnie kinaz MAP: ERK1 i ERK2, które indukują czynniki
transkrypcyjne, regulujące ekspresję wielu genów biorących
udział w regulacji wzrostu komórek i ich różnicowaniu [33].
Oceniono ekspresję receptora β1-integrynowego w homogenacie fibroblastów skóry ludzkiej poddanych działaniu
kamptotecyny. Badanie przeprowadzono metodą „Westernimmunoblot”. Badanie wykazało większą zdolność do wiązania przeciwciał przeciwko podjednostce β1 receptora integrynowego homogenatów komórek inkubowanych z CPT
w porównaniu do komórek kontrolnych. Wskazuje to, iż
kamptotecyna pobudza ekspresję receptora β1-integrynowego
w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej.
Przeprowadzone badania wykazały, że kamptotecyna
pobudza ekspresję zarówno receptora β1-integrynowego
jak i czynnika NF-κB. Ekspresja czynnika jądrowego
NF-κB wzrasta proporcjonalnie do użytych stężeń CPT i czasu inkubacji, w porównaniu do komórek kontrolnych. NFκB indukuje transkrypcję genów w odpowiedzi na sygnał z
zewnątrz komórki wywoływany przez cytokiny (np. TNFα),
mitogeny, bakterie, wirusy, leki (np. cykloheksamid), światło UV, stres oksydacyjny, związki przeciwnowotworowe
[17, 19, 20, 22]. W niektórych typach komórek zwiększona
ekspresja NF-κB może zachodzić pod wpływem sygnału generowanego przez receptor β1-integrynowy [34].
W niniejszej pracy wykazano, że ekspresja podjednostki receptora β1 integrynowego powierzchni komórki wzrasta w fibroblastach skóry ludzkiej inkubowanych z CPT,
w porównaniu do komórek kontrolnych. Stymulacja tego
receptora indukuje NF-κB, który odpowiada za hamowanie
ekspresji genów kolagenu oraz pobudza kinazę MAP regulującą aktywność prolidazy. NF-κB i MAPK oddziaływają
między sobą na zasadzie konkurencji [32]. Zahamowanie
genów kolagenu przez NF-κB uniemożliwia biosyntezę tego
białka. Zatem nasilenie aktywności prolidazy pobudzającej
biosyntezę kolagenu na etapie posttranslacyjnym, a obniżeniem biosyntezy kolagenu, w fibroblastach poddanych działaniu CPT nie równoważy inhibitorowego działania NF-κB
na ekspresję genów kolagenu.
Przedstawiony mechanizm inhibitorowego działania
kamptotecyny poprzez receptory β1-integrynowe i NF-κB
na biosyntezę kolagenu może służyć jako model badawczy
do poszukiwania nowych leków stosowanych w terapii chorób związanych z zaburzeniami metabolizmu kolagenu.
Piśmiennictwo
1. Kruszewski S. Zastosowanie zjawisk fotoluminescencji
w badaniach farmaceutycznych oraz w terapii i diagnostyce przeciwnowotworowej. Zakład Fizyki Medycznej; CM UMK, Wiadomości Akademickie Nr 19.
2. Wink M, van Wyk B. Rośliny lecznicze świata. Ilustrowany przewodnik naukowy. Briza Publications
2004, 76.
3. Kruszewski S, Burke T. Właściwości analogów kamptotecyny – obiecujących inhibitorów topoizomerazy I,
oznaczonych metodą spektroskopii fluorescencyjnej.
Polish J Med Phys & Eng. 2002; 8(3): 183-192.
4. Wall M i wsp. Plant antitumor agents. The isolation and
structure of camptothecin, a novel alkaloidal leukemia
and tumor inhibitor from Camptotheca acuminate. J Am
Chem Soc. 1996; 88: 3888-90.
5. Kohn K, Pommier Y. Molecular and Biological Determinants of the Cytotoxic Actions of Camptothecins.
Ann NY Acad Sci. 2000; 922: 11-26.
6. Liu L i wsp. Mechanism of Action of Camptothecin.
Ann NY Acad Sci. 2000; 922: 1-10.
7. Yamamoto Y, Gaynor R. I-κB kinases: key regulators
of the NF-κB pathway. Trends Biochem Sci 2004; 29:
72-79.
8. Omyła - Staszewska J, Deptała A. Inhibitory topoizomerazy I – unikalna grupa leków przeciwnowotworowych. Współcz Onkol 2003. 7; 1: 45-53.
9. Pommier Y. Eucaryotic DNA topoisomerase I: Genome
gatekeeper and its intruders camptothecins. Semin Oncol. 1996; 23: 3-12.
10. Karin M, Ben - Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquination: the control of NF-κB activity. Ann Rev Immunol. 2000; 18: 621-663.
11. Li Z i wsp. Genetic dissection of antigen receptor induced – NF-κB activation. Mol Immunol 2004; 41:
701-714.
12. McKay L, Cidlowski J. Molecular control of immune/
inflammatory responses: interactions between NF-κB
and steroid receptor – signaling pathway. Endocrinol
Rev 1999; 20: 435-459.
13. Boland MP i wsp. Danarubicin activates NF-κB and
induces NF-κB – dependent gene expression in HL60 promyelocytic and Jurkat T lymphoma cells. J Biol
Chem 1997; 272: 12952-12957.
14. Chen F i wsp. New insights into the role of Nuclear Factor-κB in Cell Growth Regulation. Am J Pathol
2001; 159: 387-393.
15. Ghosh S i wsp. NF-κB and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Ann Rev
Immunol 1998; 16: 225-260.
16. Ji GZ i wsp. Role of transforming growth factor-β1smad signal transduction pathway in patients with hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2006; Jan
28; 12(4): 644-648.
17. Lisowska K, Witkowski J. Viral Strategies in Modulation of NF-κB. Activity Arch Immun Ther Exp, 2003,
51, 367-375.
18. Pahl HL. Activators and target genes of Rel /NF-κB
transcription factors. Oncogene 1999; 18: 6853-6858.
&ARM0RZEGL.AUK
19. Wang CY i wsp. NF-κB antiapoptosis: induction of
TRAF1 and TRAF2 and cIAP1 and cIAP2 to suppress
caspase-8 activation. Science 1998; 281: 1680-1685.
20. Starska K, Łukomski M. Regulacja Cyklu Komórkowego, Procesu Apoptozy, Wydzielania Cytokin i Cząsteczek
Adhezyjnych w Limfocytach T i innych Komórkach
Krwi Obwodowej oraz w Komórkach Nowotworowych
w Mechanizmie Aktywacji toll-like receptors (TLRs) i
Rodziny Cząsteczek Transkrypcyjnego Czynnika Jądrowego NF-κB. Post Biol Kom 2006; 33, (4): 621-634.
21. Baeuerle PA, Baltimore D. NF-κB: Ten years after. Cell
1996; 87: 13-18.
22. Gilmore TD i wsp. Rel/ NF-κB/I-κB proteins and cancer. Oncogene 1996; 13: 1367-1374.
23. Carson J i wsp. Pharmacogenomic Identification of Targets for Adjuvant Therapy with the Topoisomerase Poison Camptothecin. Cancer Res 2004; 64: 2096-2104.
24. Piret B, Piette J. Topoisomerase poisons activate the
transcription factor NF-κB in ACH-2 and CEM cells.
Nucleic Acids Research 1996; 24: 4242-4248.
25. Qiao L i wsp. Constitutive activation of NF-κB in human
hepatocellular carcinoma: evidence of a cytoprotective
role. Hum Gene Ther 2006 Mar; 17(3): 280-290.
26. Ruland J, Mak TW. From antigen to activation: specific
signal transduction pathways linking antigen receptors
to NF-κB. Semin Immunol 2003; 15: 177-183.
27. Rutkowski R i wsp. Właściwości biologiczne czynnika
transkrypcji jądrowej NF-κB. Alergia Astma Immunologia, 2005; 10(3): 125-131.
28. Deptala A i wsp. Simple assay of activation of nuclear
factor – κB by laser scanning cytometry (LSC). Cytometry 1998; 33: 376-381.
29. Carmichael J i wsp. Evaluation of a tetrazolium-based
semiautomated colorimetric assay: assessment of radiosensitivity. Cancer Res 1987; 47(4): 943-6.
30. Lowry I i wsp. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275.
31. Oyamada I i wsp. Scorbutic and fasted guinea pig sera
contain an insulin-like growth factor I-reversible inhibitor of proteoglycan and collagen synthesis in chick
embryo chondrocytes and adult human skin fibroblasts.
Arch. Biochem. Biophys. 1990; 276(1): 85-93.
32. Miltyk W i wsp. Prolidase independent mechanism of
camptothecin – induced inhibition of collagen biosynthesis in cultured human skin fibroblasts. J. Biochem.
2007; 141(2): 287-292.
33. Ciesielska E. Inhibitory topoizomerazy I – nowa klasa
leków przeciwnowotworowych. Post Biol Kom 1998;
25(4): 613-632.
34. Pałka J. Farmakoterapia nowotworów. Inhibitory angiogenezy. Farmacja Regionu Północno-Wschodniego.
2006; 1(49): 25.
35. Friedland JC i wsp. α6β4-integrin activates Rac – dependent p21-activated kinase 1 to drive NF-κB – dependent
resistance to apoptosis in 3D mammary acini. J Cell Sci
2007; 120 (Pt 20): 3700-12.
data otrzymania pracy: 29.04.2010 r.
data akceptacji do druku: 01.07.2010 r.
Adres do korespondencji:
Wojciech Miltyk
Samodzielna Pracownia Analizy Leków
Katedra Chemii, Analizy i Technologii Środków Leczniczych
Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
15-089 Białystok, ul. Jana Kilińskiego 1
tel. +48 85 748 57 06, e-mail: [email protected]