Zapisz jako PDF

Pracownia Biologii Molekularnej
Część II
Ekspresja i oczyszczanie białek
Spis treści
1 Wstęp
2 Obiekt
3 Namnażanie białka w komórkach bakterii Escherichia Coli
3.1 Pożywki do hodowli
3.2 Rozwój hodowli bakteryjnych
3.3 Ekspresja w systemie T7
4 Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym białek w warunkach denaturujących
4.1 Wiadomości podstawowe
4.2 Rola niektórych odczynników stosowanych w elektroforezie denaturującej
5 Oczyszczanie bialek metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów
metali (IMAC, Immobilised Metal Affinity Chromatography)
5.1 Rola imidazolu
5.2 Wydajność oczyszczania dodatkowo podnoszą:
6 znaczanie zawartości i stężenia białek w próbkach
6.1 Metoda Melanii Bradford
6.2 Metoda spektroskopowa
Wstęp
Celem II części Pracowni Biologii Molekularnej jest zapoznanie się z pełną procedurą uzyskiwania i
oczyszczania białek. Zajęcia są podzielone na trzy etapy:
1. ekspresja białka w bakteriach Escherichia coli,
2. oczyszczanie,
3. ocena czystości i stężenia uzyskanego produktu.
Podstawą zaliczenia Pracowni są wypełnione karty problemowe, sprawdzające wiedzę studentów
niezbędną do wykonania ćwiczeń oraz karta wynikowa podsumowująca wykonane eksperymenty.
Obiekt
Obiektem, który będziemy eksprymować w bakteriach, izolować i oczyszczać jest wybrane białko z
dołączoną 6-ścio histydynową etykietą umożliwiającą oczyszczanie na kolumnie powinowactwa do
jonów niklu.
Namnażanie białka w komórkach bakterii Escherichia Coli
Celem pierwszej części ćwiczenia jest namnożenie białka w komórkach bakteryjnych E. coli.
W tym celu zostaną przygotowane pożywki (płynna LB i stała LB+agar) zawierające
antybiotyk. Hodowane na nich bakterie E. coli zawierają plazmid białka z genem oporności
na ampicylinę.
Pożywki do hodowli
Do płynnej hodowli bakteryjnej zastosowana zostanie pożywka LB Broth (firmy Biocorp) zawierająca
chlorek sodu zapewniający odpowiednie stężenie elektrolitów, ekstrakt drożdżowy i Trypton, które
są źródłem związków chemicznych umożliwiających prawidłowy i stosukowo szybki wzrost kultur
bakteryjnych E. coli.
W przypadku hodowli stałych dodatkowo dodany zostanie agar, wielocukier, który w temperaturze
pokojowej polimeryzuje tworząc żel. Wysterylizowaną pożywkę stałą przechowujemy w lodówce
rozgrzewając przed wylaniem na szalki.
Zarówno do hodowli płynnej jak i stałej zostanie dodana ampicylina umożliwiająca wybiórczy wzrost
bakterii zawierających gen oporności na ten antybiotyk. Dzięki temu następuje zahamowanie
wzrostu bakterii niezawierających genu oporności, a tym samym plazmidu białka.
Przygotowane pożywki będą sterylizowane przez asystenta parą wodną w autoklawie.
Rozwój hodowli bakteryjnych
Wzrost bakterii zawierających plazmid wybranego białka będzie następował w trzech etapach:
1. Hodowla na pożywce
2. Hodowla nocna w pożywce płynnej
3. Hodowla dzienna w pożywce
Kontrola wzrostu bakterii w pożywce płynnej w 3-cim etapie pracy będzie się odbywać poprzez
pomiar absorpcji hodowli w kuwecie przy długości fali 600 nm
Ekspresja w systemie T7
Wektory ekspresyjne zawierające gen wybranego białka są wprowadzane do bakterii w procesie
transformacji. Umieszczenie dodatkowo genu oporności na antybiotyk umożliwia wyselekcjonowanie
bakterii zawierających transformowany plazmid.
Istnieje kilka typów systemów ekspresyjnych, a wśród nich system T7, w którym wektor ekspresyjny
pRSET został zastosowany w celu ekspresji wybranego białka w E. coli.
System ekspresji T7 uruchamiany jest przez dodanie do pożywki induktora — izopropylo-β-D-1tiogalaktopiranozydu (IPTG) w momencie gdy bakterie osiągną odpowiednią fazę wzrostu (log).
IPTG, po dostaniu się do środka komórek bakterii, wiąże się do represora laktozowego, powodując
jego inaktywację. Powoduje to uruchomienie produkcji polimerazy RNA z faga T7, a następnie
eksprymowanego białka.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym białek w warunkach
denaturujących
Wiadomości podstawowe
Do oceniania masy i zawartości zanieczyszczeń w próbce białek lub kwasów nukleinowych stosuje
się techniki elektroforetyczne wykorzystujące właściwość rozdzielania naładowanych składników
mieszanin pod wpływem pola elektrycznego w specjalnie przygotowanych żelach
poliakryloamidowych lub agarozowych. Żele pełnią rolę sita molekularnego przez które, dzięki
przyłożonemu polu elektrycznemu cząsteczki migrują z szybkością zależną od ich wielkości, kształtu
i ładunku.
W zależności od konkretnego problemu można zastosować różne rodzaje elektroforezy, w tym
elektroforezę denaturująca (SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel elektrophoresis). Dodajemy wtedy
do próbki białka siarczan dodecylu sodu (SDS) — silny detergent anionowy, który rozbija cząsteczki
białka na podjednostki, opłaszcza je, nadając formę liniową i silny ujemny ładunek, niezależny od
ładunku cząsteczki w stanie natywnym. Szybkość migracji w żelu w obecności SDS zależy głównie od
wielkości cząsteczki białka.
Pod wpływem przyłożonego napięcia w granicach 100 — 300 V cząsteczki mieszaniny ulegają
rozdziałowi, po którym są lokalizowane poprzez barwienie (np. solami srebra, kumasyną, bromkiem
etydyny) i identyfikowane przy użyciu odpowiedniej metody detekcji.
Celem ćwiczenia jest wykonanie denaturującej elektroforezy białkowej (SDS-PAGE) z zastosowaniem
żeli poliakryloamidowych tworzonych dzięki polimeryzacji monomerów akryloamidowych w długie
łańcuchy, które następnie są łączone kowalencyjnie przez N,N’-metyleno-bisakrylamid. Proces ten
zachodzi w obecności nadsiarczanu amonu (APS) i tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
Uwaga! Przy przygotowywaniu żeli należy zachować szczególna ostrożność ponieważ akryloamidy
używane do ich przygotowania są neurotoksyczne. Należy pracować w rękawiczkach, pod
wyciągiem, uważając aby nie rozlać mieszaniny akryloamidu z N,N’-metyleno-bisakrylamidem.
Unikać kontaktu ze skórą i błonami śluzowymi.
Wielkość porów zależy od stężenia akryloamidu. Przyjęto konwencję w której żele są nazywane w
zależności od stężenia procentowego całkowitej ilości akryloamidu i bis-akryloamidu [%T].
Stęzenie procentowe wskazuje jaka jest względna wielkość porów. Wielkość porów zmniejsza się
wraz ze zwiększaniem stężenia akryloamidów.
W ćwiczeniu zastosujemy nieciągły gradient stężenia żelu, mianowicie układ będzie składał się z
dwóch żeli — 4%-ego ściągającego (żel górny, który koncentruje nakładaną próbkę w cienkie pasmo)
i 12%-ego separującego (żel dolny, w którym następuje rozdział białek w zależności od ich masy).
Rola niektórych odczynników stosowanych w elektroforezie denaturującej
W typowej elektroforezie denaturującej znajdują zastosowanie następujące odczynniki:
bufory o określonym pH, utrzymujące ładunek cząsteczek białka i umożliwiające ich stała
migrację w kierunku elektrody, aż do zakończenia elektroforezy,
siarczan dodecylu sodu (SDS) — detergent anionowy o ujemnym ładunku w szerokim zakresie
pH rozbijajacy białka złożone na podjednostki i nadający mu silny ładunek ujemny,
2-merkaptoetanol lub ditiotreitol (DTT) — silne reduktory rozrywające wiązania
dwusiarczkowe,
glicerol — zagęszczajscy próbki, co zapobiega ich dyfuzji w czasie nakładania do studzienek,
błekit bromofenolowy — zabarwiający próbkę białka,
kumazyna (Coomassie Brilliant Blue R250, CBB) — barwnik stosowany do zabarwiania żelu po
zakończeniu elektroforezy,
żel ściągający 4.0 % i separujący 12.0%.
Oczyszczanie bialek metodą chromatografii powinowactwa
do unieruchomionych jonów metali (IMAC, Immobilised
Metal Affinity Chromatography)
Chromatografia powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (tu: niklu) jest jedną z
najprostrzych jednoetapowych metod oczyszczania białek, przy zastosowaniu której, szczególnie w
przypadku białek w formie zdenaturowanej, uzyskuje się próbki o wysokiej czystości.
Jony niklu są stabilizowane i silnie wiązane ze złożem za pomocą mostka zbudowanego z cząsteczek
kwasu nitrylooctowego (NTA). Umożliwia to związanie białka z ogonem histydynowym do niklu i
dalej złoża. Po związaniu bialka wymywa się zanieczyszczenia, które nie związały sięz niklem.
Ostatnim etapem jest wymycie białka za pomocą buforu do elucji zawierającego imidazol, w którym,
pod wpływem konkurencji o miejsce wiązania pomiędzy histydyną a imidazolem, białko odczepia się
od kolumny.
Procedura umożliwia oczyszczenie białka do stanu 95% homogenności w jednym etapie. Kolumna NiNTA jest wypełniona złożem zawierającym Ni-NTA połaczonym z sefarozą. Jest stabilna i łatwa do
przechowywania.
W ćwiczeniu wykorzystamy kolumienki wirownicze umożliwiające oczyszczenie do 150 μg białka z
lizatu komórkowego z wykorzystaniem mikrowirówki.
Procedura oczyszczania białek metodą powinowactwa do unieruchomionych jonów metali składa się
z następujących etapów:
1. Nałożenie białka na kolumnę zawierającą złoże połączone z Ni-NTA.
2. Odseparowanie białka oczyszczonego od zanieczyszczeń niespecyficznie związanych ze złożem,
poprzez przemycie buforem zawierającym imidazol o stężeniu około 20 mM.
3. Wymycie właściwego białka buforem do elucji zawierającym imidazol o stężeniu 250 mM.
Rola imidazolu
Pierścień imidazolowy jest fragmentem histydyny, która wiąże się na kolumnie do unieruchomionego
jonu niklu. Imidazol konkuruje z histydyną i w niewielkim stężeniu powoduje odłączanie
niespecyficznie związanych ze złożem białek. Przy niskim stężeniu imidazolu białko z ogonem
sześciohistydynowym nadal pozostaje przyłączone do kolumny. Dopiero znacznie podwyższone
stężenie imidazolu powoduje odłączenie białka będącego obiektem oczyszczania.
Wydajność oczyszczania dodatkowo podnoszą:
Betamerkaptoetanol zapobiegający tworzeniu mostków siarczkowych pomiędzy białkiem z ogonem
histydynowym a innymi białkami, które chcemy usunąć.
Detergenty (Triton X-100, Tween 20) lub NaCl redukujące niespecyficzne oddziaływania białek ze
złożem oparte na oddziaływaniach hydrofobowych bądź jonowych.
znaczanie zawartości i stężenia białek w próbkach
Metoda Melanii Bradford
Metoda Melanii M. Bradford wykorzystuje fakt przesunięcia maksimum absorpcji roztworu
kumazyny (Coomassie Brillant Blue) z 465 nm do 595 nm po związaniu z białkiem. Cząsteczka
barwnika oddziałuje poprzez grupy SO3ˉ z dodatnio naładowanymi resztami aminokwasowymi. Z
barwnikiem reagują głównie reszty argininy, w mniejszym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny,
tryptofanu i fenyloalaniny. W środowisku kwaśnym kumazyna ma brunatne zabarwienie, które po
reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka
w roztworze.
Metoda spektroskopowa
Spektroskopowe metody oznaczania stężeń białek opierają się na właściwościach absorpcyjnych
naturalnych chromoforów występujących w białkach takich jak tyrozyna, tryptofan i fenyloalanina,
które absorbują promieniowanie ultrafioletowe w zakresie 240 — 340 nm. Znając zawartość tych
aminokwasów w białku możemy wyznaczyć współczynnik ekstynkcji i, korzystając z prawa LambertaBeera, stężenie białek w próbce. Dla krótszych fal (ok. 200 nm) absorbują wiązania peptydowe w
białkach. Znając współczynnik ekstynkcji dla długości fali w tym zakresie możemy również
wyznaczyć stężenie białka. Metoda ta jest jednak znacznie rzadziej stosowana ze względu na często
spotykaną absorpcję buforów w tym zakresie.