Zastosowanie chromatografii planarnej do rozdziału

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w
Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Rozdział barwników roślinnych techniką cienkowarstwowej chromatografii
adsorpcyjnej
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest teoretyczne i praktyczne zapoznanie studentów z techniką
cienkowarstwowej chromatografii adsorpcyjnej i jej zastosowaniem do rozdzielania
barwników roślinnych.
Wprowadzenie
Chromatografia to fizykochemiczna metoda rozdzielania mieszanin, których składniki
ulegają zróżnicowanemu podziałowi pomiędzy dwie fazy, fazę ruchomą i stacjonarną. Jeżeli
fazą ruchomą jest gaz, to chromatografia nosi nazwę gazowej, gdy ciecz, wówczas nazywana
jest cieczową, w przypadku fazy ruchomej będącej płynem w stanie nadkrytycznym mówi się o
chromatografii nadkrytycznej. Fazą stacjonarną natomiast może być ciało stałe bądź ciecz
osadzona na stałym nośniku.
Faza ruchoma przepływając przez fazę stacjonarną powoduje migrację poszczególnych
składników mieszaniny. Składniki te przemieszczają się z różną szybkością wynikającą z ich
odmiennego powinowactwa do adsorbenta, odmiennego swoistego powinowactwa do ligandu,
z różnic w ich masie cząsteczkowej, z różnic w wypadkowym ładunku, bądź z różnej
rozpuszczalności w określonych warunkach rozdziału. Stąd, w zależności od przewagi
czynników działających różnicująco na rozdzielane substancje można wyróżnić 5 zasadniczych
metod chromatograficznych: chromatografię adsorpcyjną, powinowactwa, sita molekularnego,
jonowymienną i podziałową. Ze względu na technikę prowadzenia rozdziału wyróżniamy
chromatografię kolumnową, w której faza stacjonarna umieszczana jest w kolumnie, lub
chromatografię planarną, w której faza stacjonarna umieszczana jest na płaszczyźnie (bibułowa
i cienkowarstwowa). W chromatografii cienkowarstwowej rozdział mieszaniny
substancji wykonuje się na cienkich warstwach nośnika (stanowiącego fazę stacjonarną lub
będącego nośnikiem fazy ruchomej) osadzonych na płytkach szklanych, plastikowych lub
aluminiowych. W zależności od zastosowanego nośnika, rozdział może mieć charakter
chromatografii adsorpcyjnej (na żelu krzemionkowym, tlenku glinu), podziałowej (na
celulozie, skrobi) lub jonowymiennej (na karboksymetylo-celulozie).
1
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w
Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Chromatografia
adsorpcyjna opiera się na zjawisku adsorpcji, czyli
nagromadzeniu cząsteczek rozdzielanych substancji na powierzchni adsorbenta za pomocą
słabych oddziaływań fizykochemicznych. W czasie przesuwania się fazy ruchomej po
powierzchni adsorbenta (faza stacjonarna), substancje słabo adsorbujące się (o mniejszym
powinowactwie do adsorbenta) przesuną się na większą odległość niż substancje silnie
adsorbowane (o większym powinowactwie do adsorbenta), a opisany proces nosi nazwę
rozwijania chromatogramu. Powinowactwo adsorpcyjne (siłę adsorpcji) zatrzymywanej na
adsorbencie substancji (adsorbatu) uzależnione jest od natury chemicznej i właściwości
adsorbentu, adsorbatu oraz fazy ruchomej. Fazę ruchomą stanowi najczęściej rozpuszczalnik
lub mieszanina rozpuszczalników o różnych stopniach polarności, od węglowodorów po
alkohole i kwasy organiczne. Adsorbentem jest nierozpuszczalna w stosowanym układzie
rozpuszczalników substancja, niereagująca z rozdzielanymi związkami. Adsorbenty można
podzielić na dwie zasadnicze grupy, tj. polarne, np. żel krzemionkowy, tlenek glinowy, i
niepolarne, np. węgiel aktywny, talk.
Najczęściej stosowanym adsorbentem jest żel krzemionkowy, wysokoporowaty,
amorficzny kwas krzemowy, którego aktywność uwarunkowana jest obecnością na jego
powierzchni grup hydroksylowych. Grupy te mogą tworzyć wiązania wodorowe z polarnymi
grupami rozdzielanych substancji. Termiczna aktywacja żelu (110°C) przed rozdziałem ma na
celu usunięcie z jego powierzchni wody blokującej grupy hydroksylowe. Na adsorbencie
polarnym zachodzi silna adsorpcja substancji o charakterze polarnym, a bardzo słaba substancji
niepolarnych, w myśl zasady: im substancja bardziej polarna tym silniej adsorbuje się na
powierzchni polarnego adsorbenta z niepolarnego rozpuszczalnika. Stąd droga migracji
substancji bardziej polarnej jest mniejsza w stosunku do substancji mniej polarnej, słabiej
adsorbowanej. Stopień adsorpcji rośnie wraz ze wzrostem liczby polarnych grup funkcyjnych
oraz ilością podwójnych wiązań występujących w cząsteczce adsorbatu. Grupy funkcyjne ze
względu na wzrastającą siłę oddziaływania z polarnym adsorbentem można uszeregować w
następującej kolejności: -Cl < -H < -OCH3 < -COOR < -C = O < -CHO < -NH 2 < -OH < CONH2 < -COOH. Na powinowactwo adsorpcyjne ma również wpływ polarność fazy
ruchomej. Stosowane w chromatografii adsorpcyjnej rozpuszczalniki zostały ułożone zgodnie z
wzrastająca zdolnością do wymywania zaadsorbowanych substancji, w tzw. szereg
eluotropowy (od najmniej do najbardziej polarnych): eter naftowy < cykloheksan < eter
etylowy < chloroform < aceton < benzen < metanol < woda < kwasy i zasady. Im większa siła
elucyjna rozpuszczalnika, tym silniej wypiera on z powierzchni adsorbenta zaadsorbowane
substancje. Tak więc, przepływ rozpuszczalnika powoduje przemieszczanie się rozdzielanych
2
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w
Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
substancji, tym szybsze, im słabsza jest adsorpcja danej substancji i większa siła elucyjna
rozpuszczalnika.
Prędkość wędrówki poszczególnych składników, czyli odległość, na jaką przesunęły się
one od miejsca startu w określonym czasie, wyraża się tzw. współczynnikiem przesunięcia (Rf):
Rf =
przesunięcie badanej substancji
przesunięcie czoła rozpuszczalnika
Barwniki roślinne to związki nierozpuszczalne w wodzie, natomiast dobrze
rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych. Należą do nich chlorofile, karoteny i
ksantofile (Rys. 2). W zielonych liściach występują wszystkie wymienione barwniki, jednak
chlorofili jest najwięcej i to one maskują barwę karotenoidów. Barwniki występujące w
kwiatach należą do flawonoidów, wśród których szczególną rolę odgrywają antocyjany o
różnym natężeniu barwy czerwonej, niebieskiej i fioletowej. Ze względu na charakter budowy
(brak lub obecność polarnych grup funkcyjnych) i długość łańcuchów węglowych w
cząsteczce, barwniki roślinne różnią się znacznie polarnością.
Chlorofile są to związki magnezoporfirynowe zbudowane z 4 pierścieni pirolowych
połączonych mostkami metinowymi z centralnie umieszczonym atomem magnezu. Z resztą
propionylową występującą przy atomie węgla 7 związany jest estrowo fitol (C 20H39OH),
alkohol nienasycony pochodny izopentenolu. Chlorofil b różni się tym od chlorofilu a, że
grupa metylowa przy atomie 3 węgla jest zastąpiona grupą aldehydową.
Karotenoidy,
do
których
należą
karoteny
i
ksantofile,
są
pochodnymi
izopentenylowymi. W liściach głównym składnikiem karotenowym jest β-karoten, którego
cząsteczka na obu końcach zawiera pierścienie β-jononu. Karoteny α i β różnią się położeniem
wiązań podwójnych w pierścieniu jononu. Ksantofile są to utlenione pochodne karotenów,
zawierające w pierścieniach jononu grupy hydroksylowe, karbonylowe lub karboksylowe.
Odznaczają się one jaśniejszym od karotenów, żółtym zabarwieniem. Najpowszechniej
występującym ksantofilem jest luteina.
W warunkach ćwiczenia, wymienione barwniki zostaną wyekstrahowane z roślin za
pomocą rozpuszczalnika organicznego jakim jest aceton, następnie zostaną naniesione w
postaci mieszaniny na płytkę chromatograficzną pokrytą warstwą żelu krzemionkowego i
rozdzielone w kamerze zawierającej układ rozpuszczalników - eter naftowy:aceton. Do
rozdziału barwników zostanie wykorzystana technika wstępująca rozwijania chromatogramu,
w której rozpuszczalnik podsiąka od dołu żelu do góry dzięki działaniu sił kapilarnych.
3
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w
Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Rys. 2. Wzory strukturalne podstawowych barwników roślinnych: chlorofili (A) oraz
karotenoidów (B)
W trakcie rozwijania chromatogramu, poszczególne związki barwne przemieszczają się z
różną prędkością i układają w następującej kolejności od góry płytki: karoteny o barwie
pomarańczowożółtej, feofityna (chlorofil, w którym Mg zastąpiony jest przez 2H) o barwie
oliwkowobrunatnej, chlorofil a o barwie niebieskozielonej, chlorofil b o barwie żółtozielonej
4
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w
Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
oraz najbardziej polarne z rozdzielanych barwników ksantofile - luteina, wiolaksantyna i
neoksantyna o barwie żółtej.
Odczynniki
1. 96% etanol skażony acetonem
2. Żel krzemionkowy typu 60 G (60 - rozmiar porów 6 nm, G - 11 % domieszka gipsu)
3. Aceton
4.
Układ rozwijający - eter naftowy:aceton (7:3)
Wykonanie
1. Przygotowanie płytek chromatograficznych (jednocześnie cała grupa). 12 suchych
płytek szklanych (po jednej na parę + 4 dodatkowe) o wymiarach 2,3 × 7,5 cm odtłuścić
etanolem (1). Do małej zlewki odważyć 4,5 g żelu krzemionkowego (2), dodać 12 ml wody
destylowanej i dokładnie wymieszać bagietką (porcja na 12 płytek). Z otrzymanej jednorodnej
zawiesiny żelu każda para pobiera pipetą 1 ml, nanosi na odtłuszczoną płytkę i rozprowadza
równomiernie po jej powierzchni za pomocą bagietki, a następnie przechylając delikatnie
płytkę na boki. Powyższe czynności wykonać szybko, gdyż żel prędko krzepnie ze względu
na zawartość gipsu. Sporządzoną płytkę chromatograficzną pozostawić na 15 minut na
równej powierzchni stołu laboratoryjnego (powierzchnia żelu zmatowieje), po czym
aktywować przez 15 minut w suszarce w temp. 110°C (aktywacja polega na usunięciu wody
zaadsorbowanej na powierzchni żelu). Dodatkowe 4 płytki (na salę) wykorzystać dla
przećwiczenia prawidłowego nakraplania.
2. Przygotowanie wyciągu z liści (w zespołach 4-osobowych). Odważyć 1 g liści
pietruszki, rozetrzeć w moździerzu, dodać 3 ml acetonu (3) i znowu rozcierać tak szybko, aby
nie wyparował rozpuszczalnik. Zawartość moździerza przesączyć przez mały zwitek watki,
umieszczony w lejku, do suchej kalibrowanej probówki. Probówkę szczelnie owinąć
parafilmem.
3. Nanoszenie ekstraktu barwników na płytki z adsorbentem (parami). Ekstrakt
barwników (60µl) nanosić na płytkę chromatograficzną bardzo małymi kroplami w postaci
pasma przyjmując, że linia startu jest oddalona 1 cm od krawędzi dolnej płytki i 0,5 cm od
krawędzi bocznych. Preparat nanosić mikropipetą w trzech porcjach (3 x 20µl), za każdym
5
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w
Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
razem kolejną porcję ekstraktu nanieść dopiero po wyschnięciu poprzedniej. Uważać, aby
podczas nakraplania ekstraktu nie naruszyć warstwy żelu końcówką mikropipety !!!
4. Rozwijanie chromatogramu (parami). Po wyschnięciu naniesionego ekstraktu, płytkę
wstawić pionowo do kamery zawierającej 4,5 ml mieszaniny rozpuszczalników (4) i przykryć
pokrywą. Linia naniesionych barwników musi znajdować się powyżej poziomu mieszaniny
rozpuszczalników, w przeciwnym razie barwniki będą przechodziły do roztworu. Zwrócić
uwagę, aby płytka w kamerze była ustawiona w pozycji możliwie dokładnie pionowej, i nie
opierała się o ściany komory jedną z krawędzi bocznych, gdyż powoduje to nierównomierne
wznoszenie się układu rozwijającego. Rozwijanie chromatogramu trwa ok. 20-30 minut. Płytkę
wyjąć z kamery w momencie, kiedy czoło rozpuszczalnika dojdzie na odległość 0,5 cm od
górnego końca płytki, i suszyć w temperaturze pokojowej pod wyciągiem przez kilka minut.
Opracowanie wyników
W sprawozdaniu należy przedstawić schemat ułożenia pasm barwników na rozwiniętym
chromatogramie oraz podać ich zabarwienie.
Przykładowe pytania
1. W jaki sposób i w jakim celu przeprowadza się aktywację żelu krzemionkowego przed
rozdziałem?
2.
Wyjaśnij jaki wpływ na powinowactwo adsorpcyjne rozdzielanych na żelu
krzemionkowym substancji ma polarność fazy ruchomej, a jaki adsorbatu?
3.
Co to jest współczynnik Rf?
4. Podaj krótką charakterystykę barwników występujących w zielonych liściach.
5.
Które z barwników roślinnych, w warunkach rozdziału wykonywanego na ćwiczeniach,
charakteryzują
się
najsłabszym
powinowactwem
adsorpcyjnym
do
żelu
krzemionkowego? Uzasadnij.
Literatura
1.
2.
3.
4.
Sherma J., Lippstone G. S. (1964). Chromatography of chloroplast pigments on
preformed thin layers. J. Chrom. A 41, 220-227
Kacprzak F., Klimek B., Kwapińska H. (1969) Chromatografia barwników.
Wydawnictwa naukowo-techniczne. Warszawa.
Strain H. H., Sherma J. (1969). Modifications of solution chromatography illustrated
with chloroplast pigments. J. Chem. Educ. 46, 476-483.
Witkiewicz Z. (2000). Podstawy chromatografii. Wydawnictwo Naukowo-Techniczne.
Warszawa.
6