Synteza, konformacja i spektroskopia analogów nukleozydów oraz

Synteza, konformacja i spektroskopia analogów nukleozydów oraz

Synteza, konformacja i spektroskopia analogów
nukleozydów oraz ich aktywność antywirusowa
Jarosław T. Kuśmierek1,*
Ryszard Stolarski2
Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, Warszawa
2
Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki Doświadczalnej, Wydział Fizyki, Uniwersytet Warszawski, Warszawa
1
Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej
Akademii Nauk, ul. Pawińskiego 5A, 02-106
Warszawa; tel.: (22) 59 23507, e-mail: jareq@
ibb.waw.pl
*
Artykuł otrzymano 13 lipca 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 28 lipca 2015 r.
Słowa kluczowe: nukleozydy, synteza, konformacja, enzymatyka, własności antywirusowe
STRESZCZENIE
C
hemicznie modyfikowane analogi nukleozydów i nukleotydów, składników kwasów nukleinowych, stanowią przedmiot intensywnych badań fizykochemicznych i
biochemicznych, od czasu opracowania i opublikowania modelu podwójnej helisy DNA
przez Watsona i Cricka w 1953 r. [1]. Budowa chemiczna, w tym tautomeria zasad azotowych oraz konformacja monomerów składowych DNA i RNA, warunkują struktury
przestrzenne, drugo- i trzeciorzędowe, cząsteczek kwasów nukleinowych. Podobnie, parametry strukturalno-dynamiczne pochodnych nukleozydów i nukleotydów warunkują
ich biologiczną aktywność w procesach mutagenezy, kancerogenezy i (potencjalnym)
działaniu przeciwwirusowym i przeciwnowotworowym. W przeglądzie zaprezentowano
interdyscyplinarne podejście w badaniach nukleozydów przez prof. Davida Shugara i
jego zespół, które obejmuje syntezy chemiczne analogów nukleozydów, wyznaczanie
parametrów fizykochemicznych, spektralnych i strukturalnych, m. in. metodami spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i dyfrakcji rentgenowskiej oraz
charakterystykę własności tych analogów w stosunku do wybranych enzymów szlaków
metabolicznych, istotnych z punktu widzenia aktywności przeciwwirusowej. W takim
ujęciu, wieloletni nurt badań stanowi realizację kluczowego paradygmatu biofizyki molekularnej, uwarunkowania funkcjonowania biomolekuł przez ich szeroko rozumianą
strukturę (ang. structure-activity relationship).
WPROWADZENIE
Intensywne badania własności fizykochemicznych, struktury i dynamiki
nukleozydów i nukleotydów, datują się od czasu opracowania i opublikowania pierwszego modelu podwójnej helisy B-DNA przez Watsona i Cricka [1]. Struktura DNA oparta na komplementarnym parowaniu zasad w
dominujących formach tautomerycznych okso-amino okazała się kluczowa
w wyjaśnianiu mechanizmów przekazu informacji genetycznej w procesie
replikacji DNA oraz w procesach ekspresji genów: transkrypcji z DNA na
RNA i translacji mRNA do funkcjonalnych białek. Możliwość pojawienia się
rzadkich tautomerów enolo (hydroksy) i imino stanowiła przesłankę do hipotezy inicjacji mutacji punktowych przez rzadkie formy tautomeryczne [2].
Ta hipoteza na długie lata wytyczyła poszukiwanie rzadkich tautomerów w
naturalnych nukleozydach oraz badania równowag tautomerycznych w ich
chemicznie modyfikowanych analogach o potencjalnych własnościach promutagennych, co stanowiło jeden z głównych nurtów badawczych biofizyki
molekularnej, wyjaśnienie podstaw mutagenezy spontanicznej i chemicznie
indukowanej.
Naturalne kwasy nukleinowe, niezależnie od czterech kanonicznych zasad
DNA, tzn. adeniny (A), tyminy (T, 5-metylouracylu), guaniny (G) i cytozyny
(C), oraz dodatkowo uracylu (U) zamiast tyminy w RNA, charakteryzują się
obecnością pewnej liczby naturalnie modyfikowanych zasad. W DNA należy
wymienić od dawna znaną 5-metylocytozynę oraz egzocyklicznie metylowane N6-metyloadeninę i N4-metylocytozynę. Ostatnio wiele badań poświęconych jest produktom enzymatycznego utlenienia grupy metylowej 5-metylocytozyny w DNA, 5-hydroksymetylo-, 5-formylo- i 5-karboksycytozynie,
jako nowoodkrytym markerom epigenetycznym [3]. Niezwykle bogata jest
paleta naturalnych modyfikacji w różnych typach RNA, szczególnie w tRNA,
gdzie wymienianych jest ponad 100 różnych modyfikacji nukleozydów [4].
Aczkolwiek naturalne modyfikacje kwasów nukleinowych pełnią niezwykle
ważną rolę w procesach życiowych, przedmiotem niniejszego artykułu będą
głównie modyfikacje nienaturalne, tworzone przez ingerencję ludzką.
W chemicznie uzyskiwanych pochodnych nukleozydów można formalnie
wyróżnić modyfikacje zasady heterocyklicznej, modyfikacje części cukrowej
oraz modyfikacje polegające na wytworzeniu dodatkowego wiązania między
zasadą o cukrem. Wszystkie trzy wymienione typy były badane w zespołach
284www.postepybiochemii.pl
kierowanych przez prof. Davida Shugara w kontekście
badań strukturalnych jak również poszukiwań środków
przeciwwirusowych i przeciwnowotworowych.
Jednym z przykładów z początku lat 60. ubiegłego
stulecia były prace Davida Shugara z Włodzimierzem
Szerem dotyczące syntezy i badania struktury polinukleotydów ze zmodyfikowaną zasadą azotową. Niektóre z
tych prac, jak wydaje się z perspektywy ponad pół wieku,
miały charakter wręcz pionierski i były szeroko cytowane, jak np. opublikowana w 1961 roku w Acta Biochimica Polonica praca [5] dotycząca kwasu poli(N3-metylo)
urydylowego. W okresie kiedy struktura DNA zwana
była jeszcze częstokroć „the Watson-Crick hypothesis”,
Juliusz Marmur, jeden z liderów w niezbyt wówczas jeszcze zróżnicowanej dziedzinie kwasów nukleinowych,
pisał w prestiżowym wydawnictwie Progress in Nucleic
Acid Research (1963, 1: str. 253): „The strongest evidence to
date of the involvement of hydrogen bonds in maintaining helix
stability comes from the experiments on synthetic polynucleotides by Szer and Shugar (1961). They found that, in contrast
to polyU, poly methyl U (N-methyl U) exhibits no secondary structure nor will the latter polymer form any complexes
with polyA. Thus, by blocking the formation of one hydrogen
bond in one of the aromatic rings, interstrand hydrogen bond
interactions are prevented. Other than the possibility that the
introduction of the methyl group causes structural distortions
due to steric hindrance, it is difficult to explain Szer and Shugar’s results in terms except by hydrogen bonding”.
Część prac dotyczyła roli podstawników w pozycji 5
pierścienia pirymidynowego w stabilizacji struktury polinukleotydów. Doprowadziły one do wniosku, że grupa metylowa w pozycji C5 uracylu lub cytozyny, która
nie może mieć żadnego wpływu na wiązania wodorowe
tworzone przez te zasady, wzmacnia w istotny sposób
strukturę drugorzędową i własności kompleksotwórcze
polinukletydów pirymidynowych z ich komplementarnymi partnerami [6-8]. Odkrycia te przyczyniły się do
ustalenia istotnego, a dopiero kiełkującego poglądu: o ile
wiązania wodorowe stanowią podstawowy mechanizm
rozpoznawczy tworzenia się par zasad, to stabilność
dupleksu zależy w decydującej mierze od oddziaływań
warstwowych, będących z kolei pochodną oddziaływań
hydrofobowych. Jednakże, zmiana podstawnika w pozycji C5 z grupy metylowej na bardziej hydrofobową, ale
jednocześnie większą grupę etylową, dramatycznie obniża stabilność struktur tworzonych przez poli(5-etyloU)
[9] i poli(5-etyloC) [10]. Wskazuje to na istotną rolę czynników sterycznych w stabilności polinukleotydów i ich
kompleksów.
Wiele modyfikacji zasad jest wynikiem uszkodzeń
DNA przez substancje mutagenne i kancerogenne. Wspomnieć tu należy prowadzone przez Janion, Shugara i
współpracowników szeroko zakrojone badania nad mutagennym działaniem hydroksyloaminy, zarówno badania biologiczne w fagach i bakteriach [11] jak i badania
strukturalne nad tautomerią modyfikowanych przez hydroksyloaminę zasad [12]. Innym przykładem są badania
nad tautomerią izoguaniny (2-oksoadeniny, 2-hydroksyadeniny), produktu działania reaktywnych form tlenu na
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
adeninę w DNA [13] oraz związane z tym badania wpływu sąsiadów izoguaniny w matrycy DNA na wbudowywanie komplementarnych zasad przez polimerazę DNA
[14].
Przedstawione powyżej przykłady modyfikacji zasad
w nukleozydach wykorzystywane do badań nad strukturą kwasów nukleinowych czy też nad podstawami
molekularnymi mutagenezy oczywiście nie wyczerpują
ogromu pracy prowadzonej w tym kierunku zarówno w
zespołach prof. Davida Shugara jak i w innych laboratoriach na świecie. Zagadnienia te są przedmiotem równoległych opracowań zamieszczonych w tym zeszycie
Postępów Biochemii. Natomiast w tym artykule chcemy
skoncentrować się na przedstawieniu zagadnień struktury i dynamiki nukleozydów jako kluczowych czynników
warunkujących ich oddziaływanie z enzymami, a w konsekwencji potencjalne własności antywirusowe.
Badanie konformacji monomerów składowych kwasów nukleinowych wynikały przede wszystkim z ich decydującego wpływu na struktury przestrzenne, drugo- i
trzeciorzędowe, cząsteczek DNA i RNA. Wyznaczenie
struktury przestrzennej nukleozydu (nukleotydu) wymagało scharakteryzowania konformacji wokół wiązania glikozydowego między cukrem i zasadą z podaniem
wartości kąta c, konformacji pięcioczłonowego pierścienia furanozowego z podaniem kąt pseudorotacji P i
maksymalnego pofałdowanie pierścienia umax w modelu
pseudorotacyjnym [15], konformacji grupy egzocyklicznej 5’CH2OH (5’CH2OPO3-) z podaniem kąta g oraz konformacji reszty fosforanowej: kąt b w nukleozydo-5’-fosforanach lub kąt e w nukleozydo-3’-fosforanach. Na podstawie struktur krystalicznych ponad 170 naturalnych i
modyfikowanych nukleozydów i nukleotydów analizowano korelacje między konformacjami poszczególnych
fragmentów cząsteczek [16]. Ze względu na „giętkość”
konformacyjną nukleozydów w roztworze, wyrażaną dynamicznymi równowagami kilku form dla rotacji wokół
poszczególnych wiązań pojedynczych, metoda dyfrakcji
promieniowania rentgenowskiego okazywała się z reguły niewystarczająca dla pełnej charakterystyki strukturalnej w roztworze. Informacja o sztywnych, pojedynczych
strukturach w krysztale wymagała wzbogacenia o wartości populacji konformerów w równowadze dynamicznej, uzyskiwane na podstawie pomiarów magnetycznego
rezonansu jądrowego NMR. Wyznaczane z widm NMR
wartości wicynalnych stałych sprzężenia między różnymi jądrami (1H, 13C, 31P) są średnimi ważonymi z wartości
dla tych konformerów, między którymi zachodzi wymiana konformacyjna. Wartości tych stałych określa się
z relacji Karplusa [17-20], a wagi są równe poszukiwanym populacjom. Analogicznie, mierzone na widmach
NMR wartości przesunięć chemicznych są w warunkach
równowagi konformacyjnej średnimi ważonymi z odpowiednich wartości dla konformerów, między którymi
zachodzi wymiana. Stąd, kluczowe znaczenie dla analizy
strukturalnej techniką NMR miało zaprojektowanie i synteza odpowiednich pochodnych o zafiksowanych konformacjach.
285
Parametry fizykochemiczne oraz strukturalno-dynamiczne pochodnych nukleozydów i nukleotydów warunkują ich biologiczną aktywność w procesach mutagenezy, kancerogenezy oraz w potencjalnym działaniu
przeciwwirusowym i przeciwnowotworowym. Z jednej
strony, modyfikacje chemiczne miały na celu uzyskanie
silnych i selektywnych inhibitorów określonych typów
enzymów o kluczowej roli dla funkcjonowania wirusów
czy komórek nowotworowych, a z drugiej strony poszukiwano pochodnych o pożądanych własnościach spektralnych do śledzenia reakcji enzymatycznych. Chodzi tu
przede wszystkim o analogi charakteryzujące się dobrymi wydajnościami kwantowymi fluorescencji, biorąc pod
uwagę niezwykle niski poziom fluorescencji naturalnych
nukleozydów [21].
ANALOGI NUKLEOZYDÓW I
BADANIA STRUKTURALNE
W nukleozydach (nukleotydach) tworzących kwasy
nukleinowe DNA i RNA reszty cukrowe to, odpowiednio,
pięcioczłonowe pierścienie 1-b-D-2’-deoxyrybofuranozy
i 1-b-D-rybofuranozy. Nukleozydy ze zmodyfikowaną
częścią cukrową stanowiły od dawna przedmiot intensywnych badań zarówno biofizycznych jak i biochemicznych ze względu na potencjalne lub/i klinicznie testowane własności antywirusowe, antynowotworowe i antybakteryjne (antybiotyki) oraz oddziaływanie z różnymi
enzymami jako substraty lub inhibitory. Porównawcza,
w stosunku do naturalnych monomerów składowych
kwasów nukleinowych, analiza konformacji pierścienia
cukrowego objęła a-nukleozydy, arabinonukleozydy,
ksylonukleozydy i lyksonukleozydy oraz ich pochodne,
metylowane na hydroksylach cukrowych.
Znaczna część prac chemicznych realizowanych w zespole prof. Shugara dotyczyła syntezy nukleozydów alkilowanych w części cukrowej. Naturalnie występujące
w RNA 2’-O-metylonukleozydy, a także ich 3’-izomery
były dostępne w reakcji odpowiednich nukleozydów z
dwuazometanem [22]. Katalizowana jonami cyny reakcja
dwuazometanu była jednak ograniczona do podstawienia 2’,3’-cis systemu grup hydroksylowych rybozy. Występowała potrzeba uzyskania nukleozydów i nukleotydów podstawionych grupami metylowymi i etylowymi
również w innych pozycjach części cukrowej, jak również
O’-alkilowanych analogów nukleozydów zawierających
inny cukier niż ryboza. Badania Kuśmierka, Shugara i
współpracowników doprowadziły do odkrycia, że w silnie alkalicznych roztworach wodnych grupy hydroksylowe rybozy w cytydynie ulegają alkilowaniu przez siarczany dwualkilowe, podczas gdy reszta cytozynowa pozostaje praktycznie nieaktywna. Zastosowanie różnego
rodzaju alkalistabilnych grup chroniących w cytydynie
(np. 2’,3’-O-izopropylideno, 5’-O-tritylo), alkilowanie 5’CMP oraz następnie dezaminacja pochodnych cytydynowych pozwoliły na uzyskanie różnych O’-metylowanych
i O’-etylowanych pochodnych cytydyny i urydyny oraz
5’-CMP i 5’-UMP. [23,24]. Opracowana metoda alkilowania okazała się także skuteczna w uzyskaniu O’-alkilowanych pochodnych 1-β-D-arabinofuranozylocytozyny
[25], a także O’-alkilowanych rybo-, arabino- i ksylofuranozydów adeniny [26-28].
Podstawową metodą wyznaczania konformacji cukrów
była analiza wicynalnych stałych sprzężenia proton-proton z widm 1H NMR, które na podstawie relacji Karplusa
[17,29] dostarczały wartości kątów dwuściennych wokół
wiązań w pierścieniu, a stąd kąty pseudorotacji i populacje form N i S w dwustanowej równowadze dynamicznej
N ↔ S. Dodatkowe informacje o ustalonych strukturach
uzyskiwano metodą dyfrakcji rentgenowskiej [16], a z obliczeń energii w przybliżeniu klasycznego pola siłowego
force field, patrz np. [30], można było oszacować energie
konformerów i wysokości barier przejścia między nimi.
Szczególnie dużo uwagi poświęcono syntezie, analizie konformacyjnej w roztworze i krysztale [31-38] oraz
właściwościom antymetabolicznym [39-43] arabinonukleozydów purynowych i pirymidynowych, ze względu
na stwierdzone, szerokie spektrum działania antywirusowego i antynowotworowego araC oraz araA [44]. Analiza widm 1H NMR araC, 3’-O-metylo-araC i 3’-O-metylo-araU w środowisku alkalicznym pokazała, że jonizacja
grupy 2’-hydroksylowej prowadzi do nietypowej, jednoczesnej zmiany konformacji pierścienia cukru i grupy egzocyklicznej, do ponad 90% populacji formy N (C2’endo) i
gauche-gauche [45]. Efekt ten świadczył o utworzeniu wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego z grupą
5’OH jako donorem i grupą O2’(-) jako akceptorem protonu. Analogiczne wiązanie wodorowe zaobserwowano w
3’-O-metylo-lyksoC i 3’-O-metylo-lyksoU, a w mniejszym
stopniu w wyjściowych związkach, lyksoC i lyksoU, ze
względu na konkurencyjną jonizację grupy 3’OH [46].
Wysoka aktywność wobec wirusa opryszczki (ang. Herpes Simplex Virus) i antynowotworowe działanie ksyloA
stymulowały przeprowadzenie badań konformacji tego
związku i jego pochodnych w roztworze [28,47,48]. W
przeciwieństwie do pochodnych ara i lykso, w ksyloA nie
tworzy się analogiczne wewnątrzcząsteczkowe wiązanie
wodorowe między grupą 5’OH i zjonizowanym hydroksylem O3’(-) [48].
Analiza konformacyjna a-nukleozydów, przeprowadzona porównawczo w stosunku do odpowiedników b,
umożliwiła bezpośredni wgląd w rolę konfiguracji (anomerycznej) przy C1’ na własności reszty cukrowej [49].
Ponadto, a-nukleozydy funkcjonują jako monomery w
żywych komórkach (np. a-adenozyna), selektywnie hamują wzrost leukemicznych komórek myszy (a anomery
pochodnych 2’-deoxy-5-fluoro-2-tio- urydyny i cytydyny) oraz wykazują własności substratów (np. kinaza tymidynowa) czy inhibitorów (np. polimeraza DNA E. coli)
w różnych systemach enzymatycznych (patrz odnośniki
cytowane w [49]).
Analiza konformacji wokół wiązania glikozydowego w roztworze była wyjątkowo trudna, ze względu na
konieczność określenia trzech parametrów: wartości kątów glikozydowych c dla form syn i anti oraz populacji
obu form w równowadze dynamicznej, przy pomiarze
jedynie dwóch wicynalnych stałych sprzężenia między
protonem H1’ i węglami w pierścieniach zasady, C6 i C2
286www.postepybiochemii.pl
w nukleozydach pirymidynowych oraz C4 i C8 w purynowych. Pojawiły się również trudności z odpowiednią
parametryzacją relacji Karplusa dla wicynalnych stałych
sprzężenia proton-węgiel [19]. Zagadnienie próbowano
rozwiązać stosując bardziej ilościowe podejście, polegające na wyznaczaniu odległości proton-proton na podstawie pomiarów jądrowego efektu Overhausera (NOE, ang.
nuclear Overhauser effect) [50,51]. Wyniki wskazywały na
preferencję formy syn. Alternatywnym podejściem (jakościowym) była analiza przesunięć chemicznych protonów
i atomów węgla w cząsteczkach cukrów z wykorzystaniem pochodnych z dużymi podstawnikami w pozycji C8
zasady purynowej i C6 zasady pirymidynowej, które w
różnym stopniu wzmacniały formę syn. Te z kolei wyniki, wskazywały na preferencję formy anti dla naturalnych
nukleozydów/nukleotydów.
Analizę „problemu syn-anti” w nukleozydach i nukleotydach purynowych oraz wyjaśnienie sprzeczności
w wynikach uzyskiwanych różnymi metodami przeprowadzono w grupie prof. Shugara stosując dwa nowatorskie podejścia w ilościowej analizie przesunięć chemicznych H1’, H2’, H3’, C2’, C3’. Syntetyzowano nukleozydy
(nukleotydy) podstawione na C8 atomami lub grupami
o wzrastającym promieniu van der Waalsa, tzn. w różnym zakresie wymuszające formę syn, od grupy CH3 poprzez podstawniki halogenowe (Cl, Br) i aminowe (NH2
NHCH3 N(CH3)2) do a-hydroksyizopropylu i tert-butylu,
i zbadano wpływ tych podstawników na wartości przesunięć chemicznych wymienionych jąder w cukrze [52-57].
Do syntez stosowano różnorodne metody, m.in. fotochemiczne podstawianie izopropanolu w pozycji C8 adeniny [58] dla uzyskania a-hydroksyizopropylopochodnych
adenozyny, 5’AMP i 5’GMP oraz bezpośrednią alkilację
z użyciem wolnych rodników dla uzyskania 8-tert-butylo-5’GMP [57]. Jednocześnie, w wyniku wieloetapowych
reakcji, zsyntetyzowano nukleozydy w formie anti, wymuszanej przez połączenie między C5’ i C8 albo przez
mostek tlenowy albo bezpośrednio, z ustawieniem grupy
5’OH w konfiguracjach R i S, a następnie zbadano wartości przesunięć chemicznych protonów i węgli cukrowych [55,59-61]. Na podstawie przeprowadzonych analiz
przesunięć chemicznych otrzymano liczbowe wartości
populacji konformerów syn i anti [62], zróżnicowane w
zależności od rodzaju nukleozydu/nukleotydu oraz rozpuszczalnika.
Odrębną i szeroko badaną klasą nukleozydów były
analogi zawierające halogenowe pochodne benzimidazoli zamiast zasady azotowej. Zainteresowanie tą klasą
związków wynikało z własności 5,6-dichloro-1-b-D-rybofuranosylo-benzimidazolu (DRB) jako specyficznego i
odwracalnego inhibitora syntezy jądrowego RNA [63,64],
induktora produkcji interferonu w ludzkich fibroblastach
[65] i inhibitora niektórych enzymów wirusa zapalenia
wątroby typu C (HCV, ang. Hepatitis C Virus) [66]. Standardowe badania konformacji metodą 1H NMR objęły
nowo otrzymane analogi ara- i rybo-DRB o konfiguracji
a i b przy C1’, podstawione jednym lub dwoma atomami
chloru w pozycjach C4, C5, C6 i C7 pierścienia benzenu
oraz grupą metylową lub trifluorometylową w pozycji C2
pierścienia imidazolu [67-69]. Zsyntetyzowano również i
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
określono konformację w roztworze analogów 2’-deoxy-DRB z różnymi podstawnikami halogenowymi na benzimidazolu [70]. Kluczową okazała się analiza widm NMR
w celu określenia struktury chemicznej, a w szczególności miejsc przyłączenia podstawników halogenowych,
nowych związków.
Badania całkowicie nowej klasy analogów nukleozydów, tzw. acyklonukleozydów, w których pierścień cukru jest zamieniony na łańcuch acykliczny, zostały zainicjowane w wyniku odkrycia, że acyklovir (ACV, 9-(2-hydroksyetoksymetylo)guanina) jest silnym środkiem
antywirusowym [71], stosowanym klinicznie przeciwko
infekcjom wirusa opryszczki (ang. HSV, Herpes Simplex
Virus) typu 1 i 2. Własności antywirusowe in vitro stwierdzono również dla 9-(1,3-dihydroksy-2-propoksymethyl)
guaniny (DHPG) [72] i wielu innych [73]. W zespole prof.
Davida Shugara po raz pierwszy wyznaczono strukturę
ACV w krysztale [74] oraz zsyntetyzowano szereg nowych pochodnych acyklicznych. Badania strukturalne
dla DHPG, 9-(2-hydroksyetoksymetylo)adeniny (DHP-Ade), 9-(3,4-dihydroksybutyl)guaniny (DHBG), 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymethyl)-butyl]-guaniny (2HM-HBG),
9-(2,3-dihydroksypropyl)-guaniny (HPG), także pozbawionych wiązania C2’-C3’ pochodnych 2’,3’-seco, w tym
2’,3’-secoDRB, 2’,3’-secoCMP i 2’,3’-secoUMP, oraz cyklicznych fosforanów niektórych z nich, były równolegle
prowadzone metodami NMR [75-79] i dyfrakcji rentgenowskiej [80-83] (we współpracy z National Research
Council w Ottawie i Freie Universität w Berlinie). Zgodnie z oczekiwaniami łańcuch acykliczny charakteryzuje
się znaczną „giętkością konformacyjną” z możliwością
przyjmowania ustawień przestrzennych fragmentów
acyklonukleozydów, które są nieosiągalne dla nukleozydów z pełnym pierścieniem cukrowym. W tym kontekście testowana była aktywność acyklonukleozydów jako
substratów lub/i inhibitorów różnych enzymów oraz aktywność przeciwwirusowa [75-84].
ANALOGI NUKLEOZYDÓW I BADANIA
AKTYWNOŚCI BIOLOGICZNEJ
Zasadą stosowaną w zespole prof. Davida Shugara
było maksymalne wykorzystanie nowo syntetyzowanych
analogów nukleozydów w różnorakich badaniach, w tym,
jako potencjalnych środków przeciwwirusowych. Przykładowo, syntezy 5-alkilowanych nukleozydów i deoksynukleozydów pirymidynowych były wykonywane w
kontekście wspomnianych poprzednio, prowadzonych w
latach 60. ubiegłego stulecia, badań nad wpływem alkilowych podstawników w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego na strukturę kwasów nukleinowych [6-10]. Okazało
się, że 5-etylodeoksyurydna jest efektywnym inhibitorem
wirusa ospy, o podobnej aktywności jak 5-jodo- i 5-bromodeoksyurydyna. W odróżnieniu od 5-halogenopochodnych, nie wykazywała ona właściwości mutagennych
[85]. Elektrochemiczna redukcja pochodnych 3’-azydo
nukleozydów pirymidynowych [86] była prowadzona w
celu uzyskania informacji o własnościach i metabolizmie
3’-azydo-3’-deoxy-tymidyny (AZT), inhibitora odwrotnej
transkryptazy i środka stosowanego przeciwko wirusowi
HIV. W tym kierunku szły badania innych pochodnych o
287
potencjalnych własnościach antyHIV, takich jak modyfikowana w części cukrowej (podobnie jak AZT) stawudyna [87] czy rybawiryna, zawierająca 1,2,4-triazolo-3-karboxyamid zamiast zasady [88,89]. Punktem startowym w
testowaniu własności antywirusowych były zazwyczaj
badania in vitro ich własności jako inhibitorów enzymów
metabolizmu kwasów nukleinowych kodowanych przez
wirusy [90].
Dużym zainteresowaniem w zespole Prof. Shugara cieszyły się pochodne nukleozydów wykazujących znaczącą
emisję w zakresie nadfioletu. Do grupy tych związków
można zaliczyć przede wszystkim pochodne 8-azapuryny, m.in. formycynę A i formycynę B [91,92] oraz alkilowane ksantyny [93], z których niektóre wykazują własności antywirusowe [94]. Obszerna praca przeglądowa
na temat fizykochemicznych i spektralnych własności
8-azapuryn prezentuje możliwości ich wykorzystania
do śledzenia reakcji enzymatycznych, a także jako sond
fluorescencyjnych w zastosowaniach analitycznych i klinicznych [95]. Przykładowo, formycynę A z powodzeniem zastosowano do śledzenia kinetyki dezaminacji,
katalizowanej przez dezaminazę adenozynową [96], a
5’-fosforan formycyny jako substrat do badania własności dezaminazy AMP i jej inhibitorów [97].
UWAGI KOŃCOWE
Wszechstronne badania właściwości fizykochemicznych, struktury i dynamiki bardzo szerokiej klasy nukleozydów i nukleotydów, modyfikowanych w części
cukrowej i w zasadzie azotowej zaowocowały obserwacją szeregu interesujących efektów strukturalnych oraz
rozwiązaniem istotnych problemów konformacyjnych.
Korzystając ze spektroskopii 1H NMR nukleozydów i ich
3’-fosforanów wykonano jednoznaczne przyporządkowanie protonów H5’ i H5’’ na podstawie analizy różnic
w ich odsłanianiu przez fosforan [98]. Praca uzyskała ponad 100 cytowań i jest jedną z najlepiej cytowanych prac,
które powstały w Zakładzie Biofizyki. Bardzo ciekawy
efekt powstawania wewnątrzcząsteczkowego wiązania
wodorowego O5’H...O2’(-) zaobserwowano dla pochodnych arabinonukleozydów [45] i lyksonukleozydów [46],
w wyniku jonizacji grup hydroksylowych cukru w wysokim pH. Synteza i badania 1H oraz 13C NMR modelowych
analogów nukleozydów i nukleotydów purynowych o
zafiksowanych konformacjach syn i anti wokół wiązania
glikozydowego pozwoliły na wykonane ilościowej charakterystyki dynamicznej równowagi syn-anti w roztworze (seria publikacji zakończona pracą [62]). W ten sposób
została rozstrzygnięta (pozorna) sprzeczność między wynikami metod NMR opartych na analizie przesunięć chemicznych i metod wykorzystujących pomiary odległości
proton-proton na podstawie jądrowego efektu Overhausera (NOE).
Syntezy i wykorzystanie analogów o zmodyfikowanych lub nowych właściwościach spektralnych w porównaniu z naturalnymi nukleozydami (nukleotydami)
stworzyło unikalne możliwości badania szerokiej klasy
enzymów wiążących nukleozydy jako substraty lub jako
inhibitory. Jednym z przykładów osiągnięć zespołów
prof. Davida Shugara w tej dziedzinie jest zastosowanie
pochodnych 8-azapurynowych jako czułych sond fluorescencyjnych [95].
PIŚMIENNICTWO
1. Watson JD, Crick FHC (1953) Molecular structure of nucleic acids;
a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737-738
2. Topal MD, Fresco JR (1976) Complementary base pairing and the
origin of substitution mutations, Nature 263: 285-293
3. Meng H, Cao Y, Qin J, Song X, Zhang Q, Shi Y, Cao L (2015) DNA
methylation, its mediators and genome integrity. Int J Biol Sci 8:
604-617
4. Motorin Y, Helm M (2010) tRNA stabilization by modified nucleotides. Biochemistry 49: 4934-4944
5. Szer W, Shugar D (1961) The preparation and properties of high
molecular weight polymers of N-methyluridylic acid. Acta Biochim Polon 8: 235-249
6. Shugar D, Szer W (1962) Secondary structure in poly-ribothymidylic acid. J Mol Biol 5: 580-582
7. Świerkowski M, Szer W, Shugar D (1965) Some properties of poly-ribothymidylic acid, co-polymers of uridylic and ribothymidylic
acids, and their 1:1 complexes with polyadenylic acid. Biochem Z
342: 429-435
8. Szer W, Shugar D (1966) The structure of poly-5-methylcytidylic
acid and its twin-stranded complex with poly-inosinic acid. J Mol
Biol 17: 171-187
9. Świerkowski M, Shugar D (1970) Poly-5-ethylurydilic acid, a polyuridylic acid analogue. J Mol Biol 47: 57-67
10.Kulikowski T, Shugar D (1974) Preparation and properties of poly(5-ethylcytidylic acid), poly(5-methylcytidylic acid) analogue.
Biochim Biophys Acta 374: 164-175
11. Janion C (1984) Some problems of mutagenesis induced by base
analogues. Acta Biochim Polon 31: 183-192
12. Stolarski R, Kierdaszuk B, Hagberg CE, Shugar D (1987) Mechanism of hydroxylamine mutagenesis: tautomeric shifts and proton
exchange between the promutagen N6-methoxyadenosine and cytidine. Biochemistry 26: 4332-4337
13.Sepiol J, Kazimierczuk Z, Shugar D (1976) Tautomerism of isoguanine and solvent-induced keto-enol equilibrium. Z Naturforsch
31C: 361-370
14.Maciejewska AM, Lichota KD, Kuśmierek JT (2003) Neighbouring
bases in template influence base-pairing of isoguanine. Biochem J
369: 611-618
15.Altona C, Sundaralingam M (1972) Conformational analysis of
the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description
using the concept of pseudorotation. J Am Chem Soc 94: 8205-8212
16.de Leeuw HPM, Haasnoot CAG, Altona C (1980) Empirical correlations between conformational parameters in b-D-furanoside
fragments derived from a statistical survey of crystal structures of
nucleic acids constituents. Israel J Chem 20: 108-126
17.Karplus M (1963) Vicinal proton coupling in nuclear magnetic resonance. J Am Chem Soc 85: 2870-2871
18.Haasnoot CAG, de Leeuw FAAM, Altona C (1980) The relationship between proton-proton NMR coupling constants and substituent electronegativities - I. Tetrahedron 36: 2783-2792
19 Davies DB, Rajani P, Sadikot H (1985) Determination of glycosidic
bond conformations of pyrimidine nucleosides and nucleotides
using vicinal carbon-proton coupling constants. J Chem Soc Perkin
Trans II 279-285
20.Lankhorst PP, Haasnoot CAG, Erkelens C, Altona C (1984) Carbon-13 NMR in conformational analysis of nucleic acid fragments
3. The magnitude of torsion angle e in d(TpA) from CCOP and
HCOP coupling constants. Nucl Acids Res 12: 5419-5428
21.Vaya I, Gustavsson T, Miannay F-A, Douki T, Markovitsi D (2010)
Fluorescence of natural DNA: from the femtosecond to the nanosecond time scales. J Am Chem Soc 132: 11834-11835
288www.postepybiochemii.pl
22. Naik SR, Robins MJ (1971) Nucleic acid related compounds. II. A
rapid and quantitative preparation of 2’-0- and 3’-0-methyl nucleosides. Biochim Biophys Acta 246: 341-343
23. Kuśmierek JT, Shugar D (1971) Alkylation of cytosine glycosides
in alkaline medium: a new route to the preparation of O’-alkylated
nucleosides and nucleotides of cytosine and uracil. Acta Biochim
Polon 18 :413-418
24. Kuśmierek JT, Giziewicz J, Shugar D (1973) Preparation of O’-alkyl derivatives of cytosine and uracil nucleosides. Biochemistry 12:
194-200
25. Darzynkiewicz E, Kuśmierek JT, Shugar D (1972) O’-Methyl derivatives of arabinosylcytosine. Biochem Biophys Res Commun 46:
1734-1741
26 Kazimierczuk Z, Darzynkiewicz E, Shugar D (1976) Methylation of
adenosine in strongly alkaline medium: Preparation and Properties of O’-methyl derivatives of adenosine and N6-methyladenosine. Biochemistry 15: 2735-2740
27. Darzynkiewicz E, Kazimierczuk Z, Shugar D (1976) Preparation
and properties of the O-methyl derivatives of 9-beta-D-arabinofuranosyladenine. Cancer Biochem Biophys 1: 203-209
28.Darzynkiewicz E, Ekiel I, Dudycz L, Rudzińska A, Shugar D (1977)
Preparation of O’-methyl derivatives of 9-beta-D-xylofuranosyladenine. Acta Biochim Polon 24: 215-224
29.Altona C, Sundaralingam M (1973) Conformational analysis of
the sugar ring in nucleosides and nucleotides. Improved method
for the interpretation of proton magnetic resonance coupling constants. J Am Chem Soc 95: 2333-2344
-5-ethylpyrimidine nucleosides. Selective antiherpes activity of
1-(b-D-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil. J Med Chem 22: 647-653
42.De Clercq E, Descamps J, Krajewska E, Shugar D (1977) Antiviral
activity of O’-methylated derivatives of adenine arabinoside. Biochem Pharmacol 26: 794-797
43.De Clercq E, Darzynkiewicz E, Shugar D (1975) Antiviral activity
of O’-alkylated derivatives of cytosine arabinoside. Biochem Pharmacol 24: 523-527
44.Shugar D (1974) Progress with antiviral agents. FEBS Lett 40,
Suppl: S48-S62
45.Remin M, Darzynkiewicz E, Dworak A, Shugar D (1976) Proton
magnetic resonance studies of the effects of sugar hydroxyl dissociation on nucleoside conformation. O(5’) and O(2’). J Am Chem
Soc 98: 367-376
46.Ekiel I, Darzynkiewicz E, Birnbaum GI, Shugar D (1979) Structure
and conformation of pyrimidine lyxofuranosides. 1-b-D-lyxofuranosyluracil, 1-beta-D-lyxofuranosilcytosine, and some O’-methyl
derivatives. J Am Chem Soc 101: 4724-4729
47.Ekiel I, Shugar D (1979) Solution conformations of the antimetabolite 9-b-D-xylofuranosyladenine and its 8-bromo analogue. Acta
Biochim Polon 26: 435-444
48.Ekiel I, Darzynkiewicz E, Dudycz L, Shugar D (1978) Solution
conformation and relative acidities of the sugar hydroxyls of the
O’-methylated derivates of the antimetabolite 9-b-D-xylofuranosyladenine. Biochemistry 17: 1530-1536
30.Levitt M, Warshal A (1978) Extreme conformational flexibility of
the furanose ring in DNA and RNA. J Am Chem Soc 100: 2607-2613
49.Poznanski J, Felczak K, Bretner M, Kulikowski T, Remin M (2001)
1
H NMR conformational study of a variety of a-anomers of C5-substituted 2’-deozyuridines: comparison to their antiherpetic b
counterparts. Biochem Biophys Res Commun 283: 1142-1149
31.Biswas G, Banerjee A, Shugar D, Duax WL (1988) Structure and
conformation of a nucleoside analog 5-nitro-1-b-D-arabinofuranosyluracil. Acta Crystallogr C 15: 853-856
50.Schirmer RE, Davis JP, Noggle JH, Hart PA (1972) Conformational
analysis of nucleosides in solution by quantitative applicaytion of
the nuclear overhauser effect. J Am Chem Soc 94: 2561-2572
32.Ekiel I, Remin M, Darzynkiewicz E, Shugar D (1979) Correlations
of conformational parameters and equilibrium conformational states in a variety of beta-D-arabinonucleosides and their analogues.
Biochim Biophys Acta 562: 177-191
51.Hart PA (1978) Conformation of mononucleotides and dinucleoside monophosphates P{H} and H{H} nuclear Overhauser effects.
Biophys J 24: 833-848
33.Remin M, Darzynkiewicz E, Ekiel I, Shugar D (1976) Conformation
in aqueous medium of the neutral, protonated and anionic forms
of 9-b-D-arabinofuranosyladenine. Biochim Biophys Acta 435: 405416
34.Birnbaum GI, Darzynkiewicz E, Shugar D (1975) Crystal structure
and conformation of the 3’-O-methyl derivative of 1-b-D-arabinofuranosylcytosine. J Am Chem Soc 97: 5904-5908
35.Darzynkiewicz E, Sierakowski H, Shugar D (1975) Spectrophotometric determination of the pK values for dissociation of the sugar
hydroxyls in pyrimidine arabinonucleosides. Z Naturforsch 30C:
565-570
36.Remin M, Shugar D (1973) Conformational analysis of cytidine,
1-b-D-(arabinofuranosyl)cytosine and their O’-methyl derivatives
by proton magnetic resonance spectroscopy. J Am Chem Soc 95:
8146-8156
37.Giziewicz J, Shugar D (1973) Direct synthesis of the 2’-O-methyl
analogues of 1-b-(D-arabinofuranosyl)cytosine and uracil and
some related derivatives. Acta Biochim Polon 20: 73-81
52.Birnbaum GI, Shugar D (1978) A purine nucleoside unequivocally
constrained in the syn form. Crystal structure and conformation
of 8-(a-hydroxyisopropyl)-adenosine. Biochim Biophys Acta 517:
500-510
53.Lassota P, Stolarski R, Shugar D (1984) Conformation about the
glycosidic bond and susceptibility to 5’-nucleotidase of 8-substituted analogues of 5’-GMP. Z Naturforsch 39C: 55-63
54.Stolarski R, Pohorille A, Dudycz L, Shugar D (1980) Comparison
of theoretical and experimental approaches to determination of
conformation of nucleosides about the glycosidic bond. Biochim
Biophys Acta 610: 1-19
55.Dudycz L, Stolarski R, Pless R, Shugar D (1979) A 1H NMR study
of the syn-anti dynamic equilibrium in adenine nucleosides and
nucleotides with the aid of some synthetic model analogues with
fixed conformations. Z Naturforsch 34C: 359-373
56.Birnbaum GI, Lassota P, Shugar D (1984) 8-Chloroguanosine: solid-state and solution conformations and their biological implications. Biochemistry 23: 5048-5053
38.Giziewicz J, Kuśmierek JT, Shugar D (1972) 5’-O-methyl derivatives of 1-b-D-arabinofuranosylcytosine and 1-b-D-arabinofuranosyluracil. J Med Chem 15: 839-840
57.Pless R, Dudycz L, Stolarski R, Shugar D (1978) Purine nucleosides
and nucleotides unequivocally in the syn conformation: guanosine
and 5’-GMP with 8-tert-butyl and 8-(a-hydroxyisopropyl) substituents. Z Naturforsch 33C: 902-907
39.Kulikowski T, Zawadzki Z, De Clercq E, Shugar D (1984) 5-substituted arabinofuranosyluracil nucleosides: synthesis and antiviral
properties. Acta Biochim Polon 31: 341-356
58.Salomon J, Elad D (1973) Photochemical reactions of nucleic acids
constituents. Peroxidate-initiated reactions of purines with alcohols. J Org Chem 38: 3420-3421
40.Kulikowski T, Zawadzki Z, Shugar D, De Clercq E (1981) Pyrimidine arabinofuranosyl nucleosides with 5-substituted long, branched
and unsaturated chains: synthesis and antiherpes properties. Nucleic Acids Symp 9: 103-106
59.Dudycz L, Shugar D (1979) Susceptibility to various enzymes of
the carbon-bridged (R) and (S) diastereoisomers of 8,5’-cycloadenosine and their 5’-phosphates. FEBS Lett 107: 363-365
41.Kulikowski T, Zawadzki Z, Shugar D, Descamps J, De Clercq E
(1979) Synthesis and antiviral activities of arabinofuranosyl-
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
60.Birnbaum GI, Cygler M, Dudycz L, Stolarski R, Shugar D (1981)
Comparison of solid state and solution conformations of R and S
epimers of 8,5’-cycloadenosine and their relevance to some enzymatic reactions. Biochemistry 20: 3294-3301
289
61.Stolarski R, Dudycz L, Shugar D (1980) NMR studies in the syn-anti dynamic equilibrium in purine nucleosides and nucleotides.
Eur J Biochem 108: 111-121
62.Stolarski R, Hagberg CE, Shugar D (1984) Studies on the dynamic
syn-anti equilibrium in purine nucleosides and nucleotides with
the aid of 1H and 13C NMR spectroscopy. Eur J Biochem 138: 187192
63.Sehgal PB, Darnell JE, Tamm I (1976) The inhibition of DRB
(5,6-dichloro-1-β-d-ribofuranosylbenzimidazole) of hnRNA and
mRNA production in HeLa cells. Cell 9: 473-480
64.Egyházi E, Ossoinak A, Tayip U, Kazimierczuk Z, Shugar D (1982)
Specific inhibition of hnRNA synthesis by 5,6-dichloro-1-b-D-ribofuranosylbenzimidazole. Requirement of a free 3’-hydroxyl group,
but not 2’- or 5’-hydroxyls. Biochim Biophys Acta 697: 213-220
65.Sehgal PB, Tamm I (1978) Halogenated benzimidazole ribosides:
Novel inhibitors of RNA. Biochem Pharmacol 27: 2475-2485
66.Borowski P, Deinert J, Schalinski S, Bretner M, Ginalski K, Kulikowski T, Shugar D (2003) Halogenated benzimidazoles and benzotriazoles as inhibitors of the NTPase/helicase activities of hepatitis C and related viruses. Eur J Biochem 270: 1645-1653
67.Kazimierczuk Z, Dudycz L, Stolarski R, Shugar D (1980) Preparation of 1-a-D-arabinofuranosylbenzimidazole and its 5,6-dichloro
derivative, and the direct bromination of benzimidazole nucleosides. Z Naturforsch 35C: 30-35
68.Kazimierczuk Z, Dudycz L, Stolarski R, Shugar D (1981) Solution
conformation of benzimidazole nucleosides with the aid of model
analogues. Z Naturforsch 36C: 126-134
69.Kazimierczuk Z, Dudycz L, Stolarski R, Shugar D (1982) Synthesis
of, and conformational studies on, 2-trifluoromethyl substituted
benzimidazole ribofuranosides. Nucleosides Nucleotides 1: 275287
70.Kazimierczuk Z, Stolarski R, Shugar D (1985) Stereospecific synthesis by the sodium salt glycosylation method of halogeno benzimidazole 2’-deoxyribose analogues of the inhibitor of hnRNA synthesis, 5,6-dichloro-1-(beta-D-ribofuranosyl)benzimidazole (DRB).
Z Naturforsch 40C: 715-720
71.Schaeffer HJ, Beauchamp L, De Miranda P, Elion GB, Bauer DJ,
Collins P (1978) 9-(2-Hydroxyethoxymethyl)guanine activity against viruses of the herpes group. Nature 272: 583-585
72.Smith KO, Galloway KS, Kennell WL, Ogilvie KK, Radatus BK
(1982) A new nucleoside analog, 9-[[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)
ethoxyl]methyl]guanine, highly active in vitro against herpes simplex virus types 1 and 2. Antimicrob Agents Chemotherapy 22: 5561
73.Focher F, Lossani A, Verri A, Spadari S, Maioli A, Gambino JJ, Wright GE, Eberle R, Black DH, Medveczky P, Medveczky M, Shugar
D (2007) Sensitivity of monkey B virus (Cercopithecine herpesvirus 1) to antiviral drugs: role of thymidine kinase in antiviral
activities of substrate analogs and acyclonucleosides. Antimicrob
Agents Chemotherapy 51: 2028-2034
78.Stolarski R, Ciesla JM, Shugar D (1990) Monophosphates and
cyclic phosphates of some antiviral acyclonucleosides: synthesis,
conformation and substrate/inhibitor properties in some enzyme
systems. Z Naturforsch 45C: 293-299
79.Cieśla JM, Stolarski R, Shugar D (1993) Cyclic phosphates of some
antiviral acyclonucleosides: relationship between conformation
and substrate/inhibitor properties in some enzyme systems. Acta
Biochim Polon 40: 251-260
80.Birnbaum KB, Stolarski R, Shugar D (1994) Structure and conformation of the cyclic phosphate of Ganciclovir, a broad-spectrum
antiviral agent. Biochim Biophys Acta 1200: 55-63
81.Birnbaum KB, Stolarski R, Shugar D (1995) Solid state and solution structure and conformation of the antiviral acyclonucleoside 9-[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl0-butyl]guanine. Nucleosides
Nucleotides 14: 1359-1377
82.Grazin J, Saenger W, Stolarski R, Shugar D (1990) Solid state and
solution structure of an adenine analogue of the antiviral acyclonucleoside 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine. Z Naturforsch 45C: 915-921
83.Birnbaum GI, Stolarski R, Kazimierczuk Z, Shugar D (1985) Solid
state and solution conformations of 1-(b-D-2’,3’-secoribofuranosyl)5,6-dichlorobenzimidazole, an acyclonucleoside analogue. Can J
Chem 63: 1215-1221
84.Lassota P, Kazimierczuk Z, Zan-Kowalczewska M, Shugar D (1986)
2’,3’-seco pyrimidine nucleosides and nucleotides, including structural analogues of 3’:5’-cyclic CMP and UMP, and their behavior
in several enzyme systems. Biochem Biophys Res Commun 137:
453-460
85.Świerkowski M, Shugar D (1969) A nonmutagenic thymidine analog with antiviral activity. 5-Ethyldeoxyuridine. J Med Chem 12:
533-534
86.Kawczyński W, Czochralska B, Shugar D (1993) Electrochemical
reduction products of azido nucleosides, including zidovudine
(AZT): mechanisms and relevance to their intracellular metabolism. Acta Biochim Polon 40: 213-223
87.Singh RK, Miazga A, Dąbrowska A, Lipniacki A, Piasek A, Kulikowski T, Shugar D (2014) Myristoylated derivatives of 2’,3’-didehydro-2’,3’-dideoxythymidine (stavudine) bi-functional prodrugs
with potent anti-HIV-1 activity and low cytotoxicity. Antivir Chem
Chemother 23: 231-235
88.Drabikowska AK, Dudycz L, Shugar D (1979) Studies on the mechanism of antiviral action of 1-(beta-D-ribofuranosyl)-1,2,4-triazole-3-carboxamide (ribavirin). J Med Chem 22: 653-657
89.Dudycz L, Shugar D, Clercq ED, Descamps J (1977) Synthesis and
determination of antiviral activity of the 2’(3’)-O-methyl derivatives of ribavirin (1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide). J Med Chem 20: 1354-1356
90.Shugar D (1982) Viral encoded enzymes of nucleic acid metabolism and their role in the development of antiviral agents. Prog
Clin Biol Res 102 Pt C: 127-138
74.Birnbaum GI, Cygler M, Kusmierek JT, Shugar D (1981) Structure
and conformation of the potent antiherpes agent 9-(2-hydroxyethoxymethyl) guanine (acycloguanosine). Biochem Biophys Res
Commun 103: 968-974
91.Wierzchowski J, Kuśmierek J, Giziewicz J, Salvi D, Shugar D (1980)
Analogues of formycins A and B: synthesis and some properties of
methyl derivatives of 7-amino and 7-keto pyrazolo(4,3-d)pyrimidines. Acta Biochim Polon 27: 35-56
75.Stolarski R, Kazimierczuk Z, Lassota P, Shugar D (1986) Acyclo
nucleosides and nucleotides: synthesis, conformation and other
properties, and behavior in some enzyme systems, f 2’3’-seco purine nucleosides, nucleotides and 3’:5’-cyclic phosphates, analogues
of sAMP and Cgmp. Z Naturforsch 41C: 758-770
92.Giziewicz J, Shugar D (1977) Preparation and properties of formycin analogues methylated on the pyrazolo ring nitrogens and/or
the ribose cis-hydroxyls. Acta Biochim Polon 24: 231-246
76.Stolarski R, Lassota P, Kazimierczuk Z, Shugar D (1988) Solution
conformations of some acyclo nucleoside and nucleotide analogues of antiviral acyclonucleosides, and their substrate/inhibitor
properties in several enzyme systems. Z Naturforsch 43C: 231-242
77.Kazimierczuk Z, Stolarski R, Shugar D (1984) Acyclonucleosides:
acyclobenzimidazole nucleoside and nucleotide analogues and
conformations of the acyclic chains by means of NMR spectroscopy. Acta Biochim Polon 31: 33-48
93.Medza G, Wierzchowski J, Kierdaszuk B, Shugar D (2009) Fluorescence emission properties of 8-aza analogues of caffeine, theophylline, and related N-alkyl xanthines. Bioorg Med Chem 17:
2585-2591
94.Giziewicz J, De Clercq E, Luczak M, Shugar D (1975) Antiviral and
antimetabolic activities of formycin and its N1-, N2-, 2’-O- and
3’-O-methylated derivatives. Biochem Pharmacol 24: 1813-1817
95.Wierzchowski J, Antosiewicz JM, Shugar D (2014) 8-Azapurines as
isosteric purine fluorescent probes for nucleic acid and enzymatic
research. Mol Biosyst 10: 2756-2774
290www.postepybiochemii.pl
96.Wierzchowski J, Shugar D (1983) Sensitive fluorimetric assay for
adenosine deaminase with formycin as substrate; and substrate
and inhibitor properties of some pyrazolopyrimidine and related
analogues. Z Naturforsch 38C: 67-73
98.Remin M, Shugar D (1972) Conformation of the exocyclic 5’-CH2OH
in nucleosides and nucleotides in aqueous solution from specific
assignments of the H 5’ and H 5’’ signals in the NMR spectra. Biochem Biophys Res Commun 48: 636-642
97.Bzowska A, Shugar D (1989) Properties of 5’-AMP deaminase and
its inhibitors with the aid of a continuous fluorimetric assay with
formycin-5’-phosphate as substrate. Z Naturforsch 44C: 581-589
Synthesis, conformation, and spectroscopy of nucleoside
analogues concerning their antiviral activity
Jarosław T. Kuśmierek1,*, Ryszard Stolarski2
Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 5A Pawińskiego St., 02-106 Warsaw, Poland
Division of Biophysics, Institute of Experimental Physics, Faculty of Physics, University of Warsaw, 93 Żwirki i Wigury St., 93, 02-089 Warsaw,
Poland
1
2
*
e-mail: [email protected]
Key words: nucleosides, syntheses, conformation, antiviral activity, enzymology
ABSTRACT
Chemically modified analogues of nucleosides and nucleotides, have been thoroughly investigated since the discovery of DNA double helix
by Watson and Crick in 1953 (Nature 171: 737). Chemical structures, first of all tautomerism, of the nucleic acid bases, as well as the conformations of the nucleic acids constituents, determine the secondary and tertiary structures of DNA and RNA polymers. Similarly, structural
and dynamic parameters of nucleoside derivatives determine their biological activity in mutagenesis, neoplastic transformation, as well as
antiviral or anticancer properties. In this review, a multidisciplinary approach of Prof. David Shugar’s group is presented in the studies on
nucleosides and nucleotides. It consists in chemical syntheses of suitable analogues, measurements of physicochemical and spectral parameters, conformational analysis by means of nuclear magnetic resonance (NMR) and X-ray diffraction, as well as characteristics of the nucleoside
analogues as inhibitors of some selected, target enzymes, crucial in respect to antiviral activity of the analogues. These long-lasting studies
follows upon the line of the main paradigm of molecular biophysics, i. e. structure-activity relationship.
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
291