artykuł - Postępy Biochemii

Metoda fotodynamiczna diagnostyki i leczenia
nowotworów — mechanizmy i zastosowania
STRESZCZENIE
N
owotwory są diagnozowane u ponad kilku milionów ludzi rocznie. Ze względu m.in.
na słabą antygenowość jak i lekooporność większości nowotworów, PDT może stać się
efektywną alternatywną, bądź uzupełniającą do chirurgii, metodą leczenia. PDT wymaga
trzech elementów: fotouczulacza, źródła światła oraz tlenu. PDT jest z sukcesem stosowana
w wielu klinikach na świecie, również w Polsce. Terapia ta jest wykorzystywana w leczeniu
schorzeń onkologicznych (m.in. nowotwory głowy, szyi, płuc, przełyku, trzustki, pęcherza
moczowego, narządu rodnego), jak i nieonkologicznych (liszaj twardzinowy, gronkowiec
złocisty, brodawczakowatość).
WPROWADZENIE — METODA FOTODYNAMICZNA
Pomimo ogromnego postępu w medycynie, wciąż wiele osób na świecie
umiera z powodu zbyt późnej diagnozy lub braku skutecznych metod leczenia
nowotworów (m.in. oporność wielolekowa komórek nowotworowych w chemioterapii stanowi poważny problem kliniczny).
Metoda fotodynamiczna jest nową obiecującą techniką diagnozowania (PDD
— Photodynamic Diagnosis) i leczenia (PDT — Photodynamic Therapy) nowotworów, która została zaakceptowana i jest obecnie stosowana w wielu klinikach
[1]. Metoda ta cieszy się dużym uznaniem, ponieważ pozwala przede wszystkim na selektywne niszczenie tkanki nowotworowej bez zbędnych uszkodzeń
tkanek zdrowych. Cechuje się znacznie mniejszymi efektami ubocznymi w porównaniu do standardowych terapii (chirurgia, radio- i chemioterapia) [2,3].
Poza zastosowaniami onkologicznymi PDD i PDT znalazły także zastosowanie
w leczeniu wielu schorzeń nieonkologicznych [4].
Terapia fotodynamiczna (PDT) wymaga trzech składników [5]:
• fotouczulacza, który uczula tkankę nowotworową na działanie światła;
• źródła światła, zdolnego do wzbudzenia skumulowanego w tkance nowotworowej fotouczulacza — źródło światła wzbudzającego musi być dobrane
do stosowanego fotouczulacza (pasmo emisji źródła światła musi się pokrywać z pasmem absorpcji fotouczulacza — jest to warunek zainicjowania reakcji fotochemicznej);
• tlenu rozpuszczonego w tkance.
MECHANIZMY DZIAŁANIA
Znane są dwa główne mechanizmy reakcji fotodynamicznej, które są ściśle
uzależnione od stężenia tlenu w środowisku reakcji [5-7]. W przypadku obu typów mechanizmów początkowe reakcje przebiegają podobnie (Ryc. 1). W wyniku absorpcji fotonu (fotouczulacz naświetlany światłem o długości fali pokrywającej się z jego maksimum absorpcji) fotouczulacz przechodzi z singletowego,
podstawowego stanu energetycznego (1P0) do wzbudzonego stanu singletowego (1P*). Część energii
zostaje wypromieniowana w postaci kwantu
fluorescencji (składowa
diagnostyczna — PDD),
a część energii na skutek
przejścia
międzysystemowego (ISC) przeprowadza fotouczulacz
do wzbudzonego stanu
trypletowego (3P*) (składowa terapeutyczna —
Rycina 1. Reakcje zachodzące w mechanizmie typu I oraz II [5].
PDT).
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
Agata Nowak-Stępniowska*
Paulina Pergoł
Alfreda Padzik-Graczyk
Pracownia Biochemii, Instytut Optoelektroniki, Wojskowa Akademia Techniczna, Warszawa
Pracownia Biochemii, Instytut Optoelektroniki, Wojskowa Akademia Techniczna, ul. Kaliskiego 2, 00-908 Warszawa; tel.: (22) 683 70 17,
e-mail: [email protected]

Artykuł otrzymano 22 lipca 2012 r.
Artykuł zaakceptowano 11 października 2012
r.
Słowa kluczowe: metoda fotodynamiczna,
fotouczulacze, reaktywne formy tlenu, nowotwory
Wykaz skrótów: 5-ALA (ang. 5-aminolaevulinic
acid) — kwas 5-aminolewulinowy; CIN (ang.
cervical intraepithelial neoplasia) — wewnątrznabłonkowa neoplazja szyjki macicy; EPR (ang.
enhanced vascular permeability and retention)
— wzmożona przepuszczalność naczyniowa
oraz zatrzymywanie cząsteczek w tkance nowotworowej; MLA (ang. methyl ester of 5-ALA)
— ester metylowy kwasu 5-aminolewulinowego; PACT (ang. photodynamic antimicrobial chemotherapy) — fotodynamiczna antybakteryjna
chemioterapia; PDD (ang. photodynamic diagnosis) — diagnostyka fotodynamiczna; PDT
(ang. photodynamic therapy) — terapia fotodynamiczna; ROS (ang. reactive oxygen specious)
— reaktywne formy tlenu; RRP (ang. recurrent
respiratory papillomatosis) — nawracająca brodawczakowatość układu oddechowego
53
Rycina 2. Reakcje kolejnych redukcji anionorodnika ponadtlenkowego (w oparciu o [9], zmodyfikowano).
W mechanizmie typu I (niskie stężenie tlenu w środowisku reakcji) zachodzą dalej następujące przemiany (Ryc.
1). Między wzbudzonym stanem trypletowym fotouczulacza (3P*) a substratem (RH) czyli tkanką nowotworową
dochodzi do przeniesienia atomu wodoru lub elektronu,
co prowadzi do wytworzenia rodników (R· i PH·) i anionorodników (P·- i RH·-) fotouczulacza i substratu, które reagują z tlenem będącym w podstawowym stanie trypletowym
(3Σg3O2), prowadząc do wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), które niszczą tkankę
nowotworową w procesie utleniania [5,6]. Powstanie anionorodnika ponadtlenkowego (O2·-) generuje w środowisku
fizjologicznym kolejne ROS (Ryc. 2) [8].
W mechanizmie typu II (wysokie stężenie tlenu w środowisku reakcji), zachodzą dalej następujące przemiany (Ryc.
1). W wyniku przejścia fotouczulacza do wzbudzonego stanu trypletowego (3P*), dochodzi do przekazania energii między fotouczulaczem we wzbudzonym stanie trypletowym
(3P*) a cząsteczką tlenu (3Σg3O2), znajdującego się w podstawowym stanie trypletowym (przekazanie energii między
cząsteczkami jest dozwolone, ponieważ oba indywidua
występują w tym samym stanie spinowym). W ten sposób
generowany zostaje tlen w stanie wzbudzonym, tzw. tlen
singletowy (1∆g1O2*) o silnych właściwościach utleniających.
Stan singletowy charakteryzuje się tym, że wszystkie elektrony w atomie są sparowane (spiny antyrównoległe). Natomiast w stanie trypletowym mogą występować atomy
oraz cząsteczki, które posiadają dwa niesparowane elektrony (spiny równoległe). Większość związków organicznych występuje w podstawowym stanie singletowym. Tlen
charakteryzuje się trypletowym stanem podstawowym, a
wzbudzonym singletowym. W związku z tym tlen posiadając dwa niesparowane elektrony może reagować tylko z
cząsteczką mającą również dwa niesparowane elektrony.
Reaktywność tlenu jest ograniczona, ponieważ znaczna
część cząsteczek ma sparowane elektrony. Dlatego też tlen
w stanie trypletowym, ze względu na trudność ze znalezieniem odpowiednich reagentów do reakcji dwuelektronowej, reaguje zazwyczaj ze związkami jednoelektronowo
tj. poprzez przyjęcie od nich jednego elektronu i generując
wolne rodniki. Istnieją dwie formy tlenu singletowego: delta (1∆g1O2*) i sigma (1Σg1O2*) (Ryc. 3) [8,9]. W reakcji fotodynamicznej główną rolę odgrywa jedynie niższy wzbudzony
stan singletowy delta (1∆g), ponieważ jest to stan metastabilny charakteryzujący się stosunkowo długim okresem półtrwania [5].
Mechanizm typu II jest dominujący ze względu na tlenowy charakter organizmu ludzkiego. Spadek stężenia tlenu
w czasie, w tkance poddanej fotodynamicznej terapii, jest
proporcjonalny do stężenia fotouczulacza i dawki energii
[7]. W miarę wyczerpywania się tlenu zaczyna przeważać
mechanizm typu pierwszego.
54
Wolne rodniki są w przeważającej większości czynnikami silnie utleniającymi, ale ze względu na krótkie okresy
półtrwania niszczą struktury komórkowe w najbliższym
sąsiedztwie ich powstawania. Natomiast tlen singletowy
charakteryzuje się dostatecznie długim okresem półtrwania
w środowisku wodnym, aby utlenić także struktury komórkowe poza obrębem jego powstania [5].
Reaktywne formy tlenu generowane w wyniku reakcji
fotodynamicznej to czynniki o dużym potencjale destrukcyjnym. Czynniki te w pierwszej kolejności niszczą błony
komórek oraz organelli subkomórkowych w szczególności
błony plazmatyczne i mitochondrialne. Jednakże wszystkie
składniki subkomórkowe ulegają uszkodzeniu w zależności
od lokalizacji fotouczulaczy w komórce [5,8,9].
FOTOUCZULACZE
Fotouczulacze stosowane w diagnostyce i terapii metodą
fotodynamiczną muszą spełniać wiele warunków takich jak
[5]:
• powinny być związkami chemicznie czystymi, o znanym
i trwałym składzie;
• powinny wykazywać minimalną toksyczność w ciemności i być toksyczne tylko w obecności światła;
• powinny selektywnie zatrzymywać się w tkance nowotworowej przez co najmniej kilkadziesiąt godzin;
• nie powinny dawać efektów fototoksycznych w zdrowych tkankach;
Rycina 3. Formy tlenu singletowego w roztworach wodnych (w oparciu o [9],
zmodyfikowano).
www.postepybiochemii.pl
• powinny charakteryzować się wysoką reaktywnością
fotochemiczną, zdolnością do efektywnej produkcji tlenu singletowego i innych reaktywnych form tlenu oraz
długim czasem życia stanu trypletowego, co jest podstawą wysokiej cytotoksyczności dla komórek nowotworowych;
• powinny powodować jak najmniejsze skutki uboczne;
• pasma absorpcji fotouczulaczy nie powinny pokrywać
się z pasmami absorpcji barwników wewnątrz organizmu (endogennych).
1987), który jest prekursorem endogennej protoporfiryny IX
— ligandu hemu (Ryc. 4a,b) [5].
W rzeczywistości do tej pory nie znaleziono fotouczulacza, który spełniałby wszystkie te wymogi. Najbardziej
rozpowszechnioną grupą fotouczulaczy są pochodne porfirynowe jak protoporfiryna IX [10]. W latach 70. hematoporfiryna (Hp) oraz mieszaniny pochodnych hematoporfiryny
(HpD) były najczęściej stosowanymi fotouczulaczami określanymi jako pierwsza generacja fotouczulaczy. Pionierskie
wysiłki Doughertiego i innych z Centrum Onkologii Roswell Park dały początek rozwojowi PDD i PDT. Dougherty,
Kessel i współpracownicy z sukcesem wyizolowali dimery
i oligomery do n = 8 z HpD tworząc Photofrin II. Jego działanie okazało się dwukrotnie skuteczniejsze w stosunku do
stosowanych przez Lipsona pochodnych hematoporfiryny
(HpD). Dzięki temu terapia fotodynamiczna zaczęła być
stosowana w klinikach, a fotouczulacze dostępne komercyjnie [5,6].
W Pracowni Biochemii i Spektroskopii Instytutu Optoelektroniki Wojskowej Akademii Technicznej w Warszawie opracowano technologię otrzymywania i oczyszczania
nowej klasy fotosensybilizatorów amfifilowych, będących
diaminokwasowymi pochodnymi protoporfiryny PP(dAA)2Arg2 (Ryc. 4c) [19]. Opis otrzymywania PP(dAA)2 podano w patentach [20,21]. Związki te wykazują właściwości
lipofilowe i tylko w niewielkim stopniu rozpuszczają się w
wodzie. W celu uzyskania związków rozpuszczalnych w
wodzie dwie grupy karboksylowe w resztach kwasu propionowego pierścienia porfirynowego, wysolono argininą
uzyskując połączenia jonowe, co opisują patenty [22,23]. W
ten sposób otrzymuje się związki PP(dAA)2Arg2 dobrze rozpuszczalne w wodzie, ale jednocześnie dobrze dyfundujące
przez błony biologiczne.
W latach 80. powstała druga generacja fotouczulaczy
pochodzących z różnych rodzin chemicznych jak: TPPSn —
sulfonowana tetrafenyloporfiryna [11], ftalocyjaniny cynkowe i glinowe [12], m-THPC — meso-tetra(hydroksyfenylo)
chloryny [13], chloryna e6 [14], m-THPP — meso-tetra(3-hydroksyfenylo) porfiryna [15], merocyjanina 540 [16],
hyperycyna [17] czy pochodne błękitu metylenowego [18].
Ogromne zainteresowanie wzbudziło także zastosowanie
kwasu 5-aminolewulinowego (ALA) (Malik i Lugaci, rok
Liczne badania pokazują, że najlepsze właściwości wykazują fotouczulacze amfifilowe. Posiadają one w swej
strukturze domeny lipofilowe i zwykłe łańcuchy boczne
wykazujące właściwości hydrofilowe. Związki amfifilowe
dobrze kumulują się w komórkach nowotworowych, gdyż
są podwójnie umocowane; częścią cząsteczki w strukturach
lipidowych, a podstawnikami bocznymi w wodnej części
komórki [5].
Założono, że przyłączenie aminokwasowych podstawników do pierścienia porfirynowego zwiększy efektywność
oddziaływania z receptorami błonowymi komórek nowotworowych, co powinno się przyczynić do ułatwienia transportu tych związków do wnętrza komórek i skuteczniej
zwalczać komórki nowotworowe [5,24,25].
Kilka innych fotouczulaczy jest obecnie używanych eksperymentalnie w różnych fazach badań przedklinicznych i
klinicznych.
Rycina 4. Struktury związków: a — 5-ALA, b — protoporfiryny IX, c — PP(dAA)2Arg2.
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
55
SUBKOMÓRKOWA LOKALIZACJA FOTOUCZULACZY
Oddziaływanie fotouczulacza z komórkami w obrębie
tkanki docelowej lub nowotworowej znacząco wpływa na
wynik PDT. Kluczowym parametrem tych oddziaływań
jest subkomórkowa lokalizacja fotouczulaczy, ponieważ
fotouczulacze mogą lokować się w obrębie wielu różnych
organelli komórkowych takich jak: mitochondria, lizosomy,
siateczka śródplazmatyczna, aparat Golgiego i błony komórkowe. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja w komórkach
zależy m.in. od struktury fotouczulacza. Fotouczulacze, które są hydrofobowe mają dwu lub mniejszy ładunek ujemny
(tj.-2,-1,0 itd) mogą dyfundować przez błonę komórkową i
potem przemieścić się do błony organelli wewnątrzkomórkowych. Te fotouczulacze także mają zdolność największej
absorpcji w komórkach in vitro, a zwłaszcza gdy są obecne
w stosunkowo niskim stężeniu w obrębie komórkowego
medium. Fotouczulacze, które są mniej hydrofobowe mają
większy niż dwa ładunek ujemny (tj.-2,-3,-4 itd) są zbyt polarne, aby dyfundować przez błonę i są w związku z tym
pochłaniane w mechanizmie endocytozy. Absorpcja fotouczulacza przez komórki nowotworowe jest kluczowa dla
efektywnego PDT, ponieważ ROS mają krótki okres półtrwania i działają blisko miejsca ich powstania. Poznanie
lokalizacji fotouczulacza jest ważne by wybrać najbardziej
efektywny fotouczulacz dla każdego zastosowania [26].
FARMAKOKINETYKA I BIODYSTRYBUCJA
FOTOUCZULACZY
Podany dożylnie fotouczulacz może przyłączyć się do
różnych białek surowicy, co wpływa na jego farmakokinetykę i biodystrybucję w obrębie ciała ludzkiego. Farmakokinetyka fotouczulaczy zależy od miejsca jego kumulacji
oraz od tego jak mocno wiąże się w obrębie specyficznego
obszaru docelowego (np. komórek nowotworowych). Takie właściwości farmakokinetyczne fotouczulacza mogą
bezpośrednio wpływać na parametry luminescencji i determinować stopień niszczenia komórek nowotworowych.
Kontakt fotouczulaczy, związanych z białkami surowicy, z
powierzchnią komórek śródbłonka umożliwia związanie z
przydanką naczyń (zewnętrznej błony ściany naczyń). Od
tego etapu, fotouczulacz może albo wiązać się z zewnątrzkomórkową macierzą albo lokować w obrębie komórek nowotworowych. W końcowym etapie, fotouczulacz jest usuwany z obszaru docelowego przez naczynia limfatyczne lub
krwionośne i wydalany przez wątrobę lub nerki. Końcowy
efekt PDT w stosunku do komórek nowotworowych zależy
od tego, w którym stadium wchłaniania fotouczulacz zostanie wzbudzany przez światło o odpowiedniej długości fali
[26].
BIOLOGICZNE ASPEKTY ODPOWIEDZI ORGANIZMU
NA TERAPIĘ FOTODYNMICZNĄ (PDT)
Efekt fotodynamiczny przez szereg lat był uważany jako
efekt działający lokalnie, czyli tylko w tej tkance, w której
został wywołany [5].
Obecnie wiadomo, iż reakcja PDT prowadzi do ogólnoustrojowej antynowotworowej reakcji immunologicznej
[27,28]. W przypadku nowotworów indukowanych przez
wirusy, układ odpornościowy może rozpoznawać taki an-
56
tygen wirusowy i go unieszkodliwić. Identyfikacja antygenów związanych z nowotworami jest niezwykle trudna w
przypadku nowotworów nie wywołanych wirusami.
Większość nowotworów posiada mechanizmy, które
utrudniają ich eliminację z organizmu.
Należą do nich m.in.:
• słaba antygenowość,
• częste reakcje krzyżowe z antygenami własnymi,
• immunosupresja,
• zmienność antygenowa.
Komórki nowotworowe charakteryzują się zdolnością
rekrutowania pewnych komórek ze szpiku i krwioobiegu.
Są to m.in. makrofagi, granulocyty, komórki tuczne i fibroblasty. Niektóre z rekrutowanych komórek, głównie makrofagi i fibroblasty, pod wpływem komórek nowotworowych
podlegają przeprogramowaniu fenotypowemu. W ten sposób powstają charakterystyczne dla nowotworów makrofagi TAM (ang. Tumor Associated Macrophages) i fibroblasty
CAF (ang. Carcinoma Associated Fibroblast). Te zmienione
komórki wraz z pozostałymi zrekrutowanymi przez nowotwór komórkami łącznie z macierzą pozakomórkową tworzą tzw. mikrośrodowisko nowotworowe. To środowisko i
komórki nowotworowe są odpowiedzialne za angiogenezę
i immunosupresję [29,30].
PDT powoduje lub wzmaga odpowiedź antynowotworową, niszczy strukturę nowotworu i tym samym umożliwia bezpośrednie oddziaływanie pomiędzy komórkami
układu immunologicznego a nowotworowymi, prowadząc
do ogólnoustrojowej antynowotworowej odpowiedzi immunologicznej. PDT prowadzi do śmierci komórek nowotworowych na drodze bezpośredniej i pośredniej. Śmierć
na drodze bezpośredniej obserwuje się w wyniku naświetlania, gdy energia jest przekazywana z fotouczulacza w
stanie wzbudzonym do tlenu cząsteczkowego tworząc tlen
singletowy (typ II). Te wysoce reaktywne cząsteczki powodują bezpośrednie fotouszkodzenie białek, tłuszczów i innych cząsteczek w miejscu kumulacji fotouczulacza, prowadząc bezpośrednio do śmierci komórek nowotworowych w
mechanizmie nekrozy i/lub apoptozy. Należy wspomnieć,
że mechanizm śmierci zależy od wielu czynników. Najważniejsza jest wewnątrzkomórkowa lokalizacja fotouczulacza, ponieważ uszkodzenie mitochondriów generalnie
prowadzi do apoptozy, podczas gdy uszkodzenie np. błon
plazmatycznych może opóźnić lub zatrzymać apoptozę
i indukować nekrozę [31]. Z kolei dawka energii wpływa
na generację nekrozy albo apoptozy. Wysoka dawka energii dezaktywuje enzymy (kaspaza 3), które są niezbędne
do wywołania apoptozy i prowadzi zazwyczaj do nekrozy
[27,28].
Obserwuje się różnice w ogólnoustrojowej odpowiedzi
immunologicznej, ponieważ nekroza w większym stopniu
niż apoptoza prowadzi do stanu zapalnego, co stanowi
pierwszy krok indukcji specyficznej odpowiedzi immunologicznej.
Fototoksyczne zmiany w śródbłonku naczyń tkanki nowotworowej wywołane przez PDT prowadzą do trwałego
niedotlenienia komórek nowotworowych. Efekt naczyniowww.postepybiochemii.pl
wy wywołany PDT prowadzi do zwiększonej przepuszczalności naczyń, okluzji naczyń, a w rezultacie niedokrwiennej
śmierci pozostałych komórek nowotworowych (ścieżka pośrednia).
Bezpośredni efekt PDT na komórki odpornościowe może
być szkodliwy. Limfocyty kumulują fotouczulacz i też
mogą zostać zniszczone przy naświetlaniu, prowadząc do
lokalnej supresji układu immunologicznego [27,28].
Komórki układu immunologicznego są znajdowane w
podstawie tkanki nowotworowej, oddzielone od komórek nowotworowych przez zewnątrzkomórkową macierz.
PDT niszcząc strukturę tkanki nowotworowej umożliwia
bezpośrednie oddziaływanie między komórkami układu
immunologicznego a nowotworowymi. Po początkowym
uszkodzeniu komórek nowotworowych i komórek układu
odpornościowego silna reakcja zapalna zachodzi lokalnie,
która aktywuje i przyciąga nieuszkodzone leukocyty z innych miejsc. Fotouszkodzenie błon prowadzi do aktywacji
fosfolipaz błonowych powodując masowe uwalnianie produktów hydrolizy lipidów i metabolitów kwasu arachidonowego [30,32]. Oba te czynniki są mediatorami zapalenia.
Co więcej zmiany w ścianach naczyń krwionośnych przyciągają neutrofile i płytki krwi [33-36]. Te komórki uwalniają więcej mediatorów zapalnych, które mają właściwości chemotaktyczne zdolne do masowej rekrutacji komórek
układu odpornościowego i przemieszczania ich do miejsca
uszkodzenia. PDT jest związana z ekspresją genów i produkcją białka wielu cytokin: IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a,
G-CSF [37,38]. Te cytokiny są ważnymi białkami regulującymi proces zapalny. Uwalnianie tych czynników chemotaktycznych z tkanki nowotworowej powoduje przyciąganie i
kumulację nielimfoidalnych komórek charakterystycznych
dla procesu zapalnego. Kilka minut po zakończeniu reakcji PDT duża liczba neutrofilów przemieszcza się do tego
obszaru [27,28]. Inwazja neutrofilów poprzedza rekrutację
komórek tucznych, limfocytów T, monocytów i makrofagów [27,28]. Fagocyty usuwają martwe komórki [27,28]. W
celu zwalczenia i długoterminowej kontroli nowotworu jest
ważna ścieżka pośrednia jak i bezpośrednia.
Ze względu na wpływ terapii fotodynamicznej na układ
immunologiczny podejmuje się próby modulacji przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej z wykorzystaniem PDT i elementów układu odpornościowego. Poniżej opisano jedną z metod.
Modulacja przeciwnowotworowej
odpowiedzi immunologicznej z udziałem
komórek dendrytycznych i PDT
Odpowiedź immunologiczna jest aktywowana m.in.
przez sygnały niebezpieczeństwa (zagrożenia), rozpoznawane przez komórki, które stanowią odporność wrodzoną. Z tych komórek, komórki dendrytyczne (profesjonalne
komórki prezentujące antygen limfocytom T) są głównym
łącznikiem między wrodzoną a nabytą odpowiedzią immunologiczną [39]. Jednym z najważniejszych czynników
komórkowych indukowanych w wyniku PDT (który jest
uwalniany z nekrotycznych komórek nowotworowych) jest
zewnątrzkomórkowe HSP70 należące do rodziny białek
szoku cieplnego HSPs [40].
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
Ekspresję genów, które kodują HSPs indukuje wiele
szkodliwych czynników zarówno egzo- jak i endogennych,
na jakie narażona jest komórka (m.in. wolne rodniki, różne typy promieniowania). W warunkach prawidłowych,
zawartość HSP70 jest niska, wzrasta dopiero w warunkach stresu. Rola m.in. HSP70 w procesie nowotworzenia
związana jest przede wszystkim z ich antyapoptotycznymi
właściwościami, gdyż główną funkcją HSPs jest ochrona
przed czynnikami stresu. Co więcej HSP70 i inne (HSP90
i GRP96) zidentyfikowano w przestrzeni pozakomórkowej.
Okazuje się, że zewnątrzkomórkowo umiejscowione białka
biorą udział w odpowiedzi immunologicznej jak również
wpływają na reakcję zapalną, czego wynikiem jest synteza
cytokin zapalnych [41,42].
Komórki dendrytyczne posiadają specyficzne receptory
dla HSPs. Indukcja HSPs w wyniku PDT może stanowić
sygnał zagrożenia stymulujący różnicowanie komórek dendrytycznych i indukcję syntezy cytokin, włączając IL-15 i
IL-12, a przez to wzmagać prezentację antygenu limfocytom T CD8+). Dlatego prowadząc hodowlę komórek dendrytycznych w obecności lizatu komórek nowotworowych
uszkodzonych PDT można wzmóc przeciwnowotworową
odpowiedź immunologiczną [40].
RODZAJE ŚMIERCI KOMÓRKOWEJ
Uszkodzenia komórkowe mogą prowadzić do:
• nekrozy (stanowi szybką i nagłą śmierć komórek, która
obejmuje całe grupy komórek powodując ostry stan zapalny na skutek utraty integralności błony komórkowej
i wycieku zawartości komórki. Nagłe uwolnienie dużej
objętości masy białkowej może spowodować nieodwracalne zatkanie kanalików nerkowych i poważne komplikacje zdrowotne) [5,43-46].
• apoptozy (programowana śmierć trwa znacznie dłużej
niż nekroza. Ponieważ nie następuje utrata integralności błony nie dochodzi do ostrego zapalenia w obrębie
leczonej tkanki. Dodatkowo, badania in vitro pokazują
obecność oddziaływań między komórką uszkodzoną a
nieuszkodzoną w wyniku PDT. Reakcja ta ma charakter
kaskadowy. Uszkodzona komórka indukuje apoptozę w
komórce nieuszkodzonej co jest zjawiskiem korzystnym
zwłaszcza w przypadku guzów o dużej masie, kiedy to
światło nie może tak głęboko dotrzeć) [5,31,43-52].
• autofagii (trwają badania nad znaczeniem tego mechanizmu w procesie PDT) [53].
Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedź komórkowa na uszkodzenie zależy od kilku czynników sklasyfikowanych jako
zewnętrzne (stężenie fotouczulacza, dawka energii) i wewnętrzne (metabolizm komórkowy, faza cyklu komórkowego) mających wpływ na wrażliwość komórek na PDT.
Lokalizacja subkomórkowa fotouczulacza wpływa na to czy
zajdzie apoptoza i w jakim stopniu zajdzie indukcja apoptozy w wyniku PDT [31]. PDT może bowiem prowadzić
do apoptozy lub nekrozy albo do kombinacji tych dwóch
mechanizmów [43-46]. Z tych względów, w metodzie PDT,
dąży się do generowania śmierci ze znaczną przewagą
apoptozy w stosunku do nekrozy.
57
Obecnie trwają prace nad optymalizacją warunków reakcji fotodynamicznej leczenia różnego typu nowotworów jak
i chorób nienowotworowych. Poniżej zestawiono obszary
medycyny, gdzie z powodzeniem stosuje się metodę PDT w
leczeniu różnych schorzeń.
ZASTOSOWANIA PDD I PDT
ZASTOSOWANIA PDT W LECZENIU NOWOTWORÓW
Przełyk
Choroby przełyku można z powodzeniem diagnozować
i leczyć metodą PDT. W UK PDT zaakceptowano do leczenia chorób przełyku [54,55].
Płuca
PDT jest metodą stosowaną w leczeniu nowotworów
płuc. PDT z użyciem lasera Nd:YAG w przypadkach paliatywnych przedłuża czas życia do nawrotu choroby. W
jednym z badań leczono 144 pacjentów w zaawansowanym
stadium nowotworu. U wszystkich pacjentów występowało 50% zwężenie światła oskrzeli, powodujące duszności.
Wszyscy pacjenci odpowiedzieli na leczenie PDT. Po 8 tygodniach średnica światła oskrzeli wzrosła do 58% u wszystkich pacjentów, zmniejszając duszności. Średnie przeżycie
wyniosło 5 miesięcy. Wśród pacjentów z wczesnym stadium leczono 16 osób. PDT indukowało kompletną odpowiedź już po 1 zabiegu. U osób z nawrotami choroby dalsze
zabiegi PDT również dały kompletną odpowiedź. Średnia
życia wyniosła 69 miesięcy [54,55].
Trzustka
Opisywane są próby kliniczne z wykorzystaniem fotouczulaczy: sulfonowanej ftalocyjaniny glinu (AlsPc), kwasu
5-ALA i mTHPC. W badaniach na ludziach (mTHPC (0,15
mg/kg i dawka energii z zakresu 20-40 J) z 16 pacjentów 7
przeżyło więcej niż rok (średnia życia 9,5 miesiąca) [54,55].
Głowa i szyja
PDT w leczeniu nowotworów głowy i szyi jest atrakcyjną
propozycją. mTHPC stosuje się w Europie do leczenia nowotworów głowy i szyi. U pacjentów z wczesnym rakiem
płasko-komórkowym 85% zostało wyleczonych (97 z 114
pacjentów). W przypadku stadium zaawansowanego nowotworu w badaniu z 45 osób 12 nie zareagowało na leczenie (średnia życia 2 miesiące). U reszty średnia życia wyniosła 16 miesięcy [54,55].
Mózg
W przypadku glejaka wielopostaciowego stosuje się zabieg chirurgiczny przy wsparciu obrazowania z użyciem
5-ALA i PDT z wykorzystaniem Photofrinu. W jednym z
badań klinicznych na 27 pacjentów (kontrola 14, a 13 leczonych) — przeżycie wyniosło 52,8 tygodni w stosunku do
24,6 tygodni u nie leczonych osób [54,55].
Terapia fotodynamiczna jako nieinwazyjna metoda znalazła olbrzymie zastosowanie w dermatologii w leczeniu
zmian przednowotworowych, nowotworowych jak i nienowotworowych.
W przypadku zmian nowotworowych w dermatologii [56] stosuje się dwa główne proleki, 5-ALA i jego ester
58
Rycina 5. Porównanie budowy bakterii gram ujemnych i dodatnich (w oparciu o
[57], zmodyfikowano).
metylowy (MLA). Główne wskazania dermatologiczne do
miejscowego stosowania PDT to powierzchniowe niemelanomowe nowotwory skóry i dysplazje (nieprawidłowa
budowa tkanki lub narządu powstająca w okresie rozwojowym). Silnie pigmentowane raki jak melanoma nie odpowiadają dobrze po leczeniu PDT, ponieważ melanina absorbuje promieniowanie czerwone.
Poniżej opisano wyniki przykładowych chorób leczonych PDT. AK — popromienne rogowacenie — uzyskuje
się odpowiedź na poziomie 70-90% (twarzowa i skórna postać dają lepsze rezultaty, a obwodowa słabiej odpowiada
na leczenie — 44-73% i rośnie wznowa do 19% po 3 latach).
PDT i krioterapia dają podobne rezultaty, ale ze względów
kosmetycznych pacjenci wybierają PDT. BCC — rak podstawno komórkowy — uzyskano 87% skuteczność w przypadku powierzchniowego i 53% dla postaci guzowatej ze
wznową 18% po 45 miesiącach. BD — choroba Bowen’a —
miejscowe PDT jest tu szeroko stosowane. Skuteczność wynosi 86-93% z 18% wznów w okresie 3-5 lat. Miejscowe PDT
może być potencjalnie używane w leczeniu pacjentów po
przeszczepie organów, w których znacząco wzrosło ryzyko
rozwoju dysplastycznych zmian skórnych i raków niemelanomowych skóry.
INNE ZASTOSOWANIA PDT
Rozwój bakterii lekoopornych na standardowe leczenie
wzmogło poszukiwania niestandardowych metod leczenia.
PDT ma szanse być metodą stosowaną do miejscowych infekcji. PDT może zmniejszyć potrzebę używania antybiotyków. Stąd wprowadzono pojęcie PACT — fotodynamiczna
antybakteryjna chemioterapia [57].
Tlen singletowy jako czynnik antybakteryjny ma krótki
okres półtrwania i ograniczony dystans dyfuzją (100 nm).
www.postepybiochemii.pl
Tabela 1. Badania przeżywalności gronkowca złocistego pod wpływem PDT w różnych warunkach. Testy in vitro (na podstawie [57], zmodyfikowano).
Szczep gronkowca
lub fenotyp
Stężenie fotouczulacza
Całkowita dawka
energii [J/cm2]
Efekt
S. aureus Cowan I
EMRSA-16
Bchlide-IgG (10 µM)
SnCe6-IgG (4,25 µg/ml)
42
21
>99.9%
70-99,9% w zależności od fazy wzrostu
S. aureus NCTC 6571,
MRSA (dwa szczepy:
EMRSA-15 i EMRSA-16)
EMRS-12
MRSA
Dimetylowy błękit metylenowy (0,5-2,0 µM)
Sulfonowana ftalocyjanina glinu (6,0 mg/l)
5-ALA (0,38 mM)
6.3
147
100
100% śmiertelność
100% śmiertelność
100% śmiertelność
W przypadku bakterii, efekt letalny związany z PDT zachodzi na poziomie kwasów nukleinowych [58] lub błony
komórkowej [59] lub na obu poziomach jednocześnie [60].
Bakterie gram ujemne mają dwie błony: cytoplazmatyczną
i zewnętrzną (Ryc. 5). Obecność lipopolisacharydów w zewnętrznej błonie bakterii gram ujemnych wiąże się z silnym
ujemnym ładunkiem, który czyni błonę nieprzepuszczalną
dla neutralnych i anionowych związków.
Badania ostatniej dekady pokazały, że anionowe fotouczulacze mogłyby być efektywne w połączeniu z czynnikami zwiększającymi przepuszczalność zewnętrznej błony
bakterii gram ujemnych m.in. polimiksyną i EDTA [61].
Pokazano, że przyłączenie fotouczulaczy jak ftalocyjaniny,
porfiryny i chloryny do kationowych polipeptydów daje
efektywną inaktywację bakterii gram + i — (Tab. 1)[62].
Metoda fotodynamiczna znalazła także zastosowanie w
leczeniu brodawczakowatości spowodowanej przez ludzki
wirus brodawczaka HPV. Nawracająca brodawczakowatość układu oddechowego (RRP, ang. Recurrent Respiratory
Papillomatosis), wywołana przez HPV typu 6 i 11 jest najczęstszym łagodnym nowotworem krtani u dzieci. Konwencjonalne metody nie zapobiegają przed wielokrotnymi
nawrotami choroby. W jednym z badań klinicznych zastosowano miejscowo PDT z wykorzystaniem eteru dihematoporfiryny (4,25 mg/kg, 50J) na 48 pacjentach. Zaobserwowano wyraźną poprawę. Obiecujące wyniki uzyskali także
inni badacze (statystycznie 50% poprawy). HPV wywołuje
także brodawczaki układu rozrodczego. U kobiet HPV infekuje szyjkę macicy (typ 16 lub 17) i może prowadzić do
rozwoju wewnątrznabłonkowej neoplazji szyjki macicy
(CIN, ang. Cervical Intraepithelial Neoplasia), a nawet raka
szyjki macicy. W badaniach klinicznych PDT z użyciem eteru/estru polihematoporfiryny (2 mg/kg, laser YAG-OPO)
uzyskano wysoką skuteczność w leczeniu CIN, ale też raka
szyjki macicy. Miejscowo stosuje się PDT z wykorzystaniem
5-ALA lub MLA w leczeniu kłykciny sromu, prącia i pochwy (20% 5-ALA, 100 J/cm2, skuteczność 95% po 1 zabiegu, 100% po 2 zabiegach, % wznów 6,3) [63-65].
Na koniec przedstawiono zastosowania PDT w leczeniu
schorzeń skórnych różnego pochodzenia (Tab. 2).
NANOTECHNOLOGIA W PDT
W terapii fotodynamicznej jednym z problemów ograniczających zastosowanie wielu fotouczulaczy jest trudność z
przygotowaniem formuły farmaceutycznej, która umożliwi
ich pozajelitowe podanie.
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
Problemy fotouczulaczy I-szej generacji to: są mieszaninami kilku częściowo niezidentyfikowanych porfiryn, słaba selektywność, niski współczynnik ekstynkcji (wymagają
podania sporej ilości by uzyskać satysfakcjonujący efekt);
słaba penetracja tkanek (maximum absorpcji przy stosunkowo krótkich długościach fal, 630 nm) oraz wysoka kumulacja w skórze (6-8 tygodni wrażliwości na światło po
PDT). Problemy Photofrinu II dały rozwój fotouczulaczom
II-ej generacji, które są czyste, dobrze scharakteryzowane,
silnie generują tlen singletowy, mają silne pasma absorpcji
w zakresie 650-800 nm i głęboko penetrują tkanki. Wadą
jest ich hydrofobowość. Słaba rozpuszczalność w wodzie,
hydrofobowych fotouczulaczy ogranicza ich dożylne podanie [68,69].
Z tych powodów powstały różne strategie rozwoju systemów dostarczania leków. Należą do nich m.in. osadzanie
fotouczulacza na nośniku koloidalnym jak: liposomy, cząsteczki polimerowe czy olejowe układy zdyspergowane;
pułapkowanie fotouczulacza w lipofilowym rdzeniu lipoproteiny niskiej gęstości LDL oraz koniugaty fotouczulacz-przeciwciało monoklonalne (mAb), fotouczulacz-nanocząsteczka-mAb [68-73].
Pasywne systemy dostarczania fotouczulaczy
Pasywne systemy docelowe wykorzystują naturalne
ścieżki dystrybucji: dyfuzję pasywną, fagocytozę. Zaliczamy do nich: liposomy, olejowe układy zdyspergowane,
biodegradowalne cząsteczki polimerowe i hydrofilowe polimery.
Badania pokazują, że selektywna kumulacja tych nośników następuje na skutek wzmożonej przepuszczalności
naczyniowej oraz zatrzymywania różnych cząsteczek w
tkance nowotworowej (EPR, ang. Enhanced Vascular Permeability and Retention) [74,75]. Nieszczelna sieć naczyń krwionośnych tkanki nowotworowej prowadzi do wytworzenia
nieprawidłowej bariery śródbłonkowej; słaby drenaż limfatyczny natomiast upośledza układ limfatyczny lub prowadzi do niedrożności limfatycznej i wzrostu przepuszczalności naczyń. Te mechanizmy dają sposobność nośnikom aby
osiągnąć cel przez dyfuzję prostą. Wzrost przepuszczalności naczyń włosowatych wielu nowotworów następuje
wskutek zaburzenia śródbłonkowej integralności komórki
prowadząc do aktywacji czynników wydzielniczych lub
prozapalnych. Te zjawiska mogą wzmóc zewnątrznaczyniowy transport makrocząsteczek. Pasywne gromadzenie
się makrocząsteczek długo krążących w tkance nowotworowej na skutek EPR zwiększa stężenie fotouczulacza w tkance nowotworowej [68-70].
59
Tabela 2. PDT w leczeniu nienowotworowych chorób skóry [66].
Nienowotworowe choroby skórne odpowiadające na leczenie 5-ALA-PDT
Brodawka wirusowa
Grudkowa zmiana skórna wywołana wirusem HPV. Trwają badania nad PDT
z użyciem 20% kremu 5-ALA i różnych źródeł światła: lampy, LED, lasery, by
osiągnąć najefektywniejsze leczenie przy min. skutkach ubocznych [67].
Trądzik młodzieńczy
(pospolity)
Nie opracowano optymalnych parametrów PDT. Testuje się różne
źródła światła i moce dla PDT z użyciem 5-ALA.
Łuszczyca
Prowadzono badania pilotażowe z użyciem różnych stężeń 5-ALA (0, 2, 10 lub 20 %) i dawek energii
z zakresu 1-30 J/cm2. Polepszenie było widoczne u niektórych pacjentów już po 1 zabiegu, ale
efektywne leczenie obserwowano po kilkukrotnych zabiegach. Metoda wymaga dalszych badań.
Ropne zapalenie
gruczołów potowych
Choroba wywołana przez gronkowca wywołująca w gruczołach potowych i otaczającej tkance łącznej stan
zapalny. W leczeniu tej choroby metoda PDT wymaga dalszych badań nad potwierdzeniem skuteczności.
Liszaj twardzinowy
Przewlekła choroba zewnętrznych narządów płciowych. Następuje pogrubienie skóry z
wytworzeniem białawych grudek czemu towarzyszy ból i swędzenie. Uzyskano objawowe
polepszenie po PDT z użyciem 20% kremu 5-ALA i dawki energii 80 J/cm2. Po 6-8 tyg. u
10 z 12 kobiet nastąpiła redukcja objawów. Efekt utrzymywał się 3-9 miesięcy.
Twardzina skóry
Przewlekła choroba autoimmunologiczna, charakteryzująca się stwardnieniem skóry i tkanek na skutek
nadmiernego gromadzenia się kolagenu. Stosowano PDT z użyciem 3% 5-ALA i dawki energii 10 J/cm2. Zabiegi
przeprowadzano raz lub dwa razy na tydzień, przez 3-6 miesięcy w zależności od odpowiedzi klinicznej.
Choroba cofnęła się. Metoda wymaga dalszych badań aby potwierdzić jej skuteczność w badanych warunkach.
Choroba Darier’a
Genetycznie uwarunkowana choroba skóry wywołana zaburzeniem procesu rogowacenia
w obrębie mieszków włosowych i poza nimi. Zmiany dotyczą skóry, błon śluzowych oraz
paznokci. PDT z użyciem 20% 5-ALA i dawki energii 150 J/cm2 może być wspomagającą
terapią, ale nie może zastąpić standardowego leczenia retinoidami.
Choroba Hailey-Hailey
Rzadka choroba pęcherzowa o dziedziczeniu autosomalnym, dominującym. Leczono z
powodzeniem 2 pacjentów z wykorzystaniem 20% kremu 5-ALA i naświetlano dawką
energii 120 J/cm2. Leczenie powtórzono po 2 miesiącach. Biopsje wykazały prawidłowy
naskórek. Nastąpiły remisje po 19 i 25 tygodniach. Mechanizm jest niejasny.
Nadmierne owłosienie
Prowadzono badania z użyciem 20% 5-ALA, dawek energii 100 i 200 J/cm2 z wykorzystaniem lasera
argonowego. 3 miesiące po PDT 100 J/cm2 90% włosów odrosło w stosunku do 50% w obszarach naświetlonych
200 J/cm2. Wysokie dawki mogą zapewnić całkowitą utratę owłosienia. Biopsja przed i po leczeniu
wskazuje na selektywne niszczenie naskórka i mieszków włosowych oszczędzając skórę właściwą.
Znamię łojowe
Występuje w postaci pojedynczego guza o zrazikowej lub brodawkowatej powierzchni
i żółtym zabarwieniu. Lokalizuje się zazwyczaj na owłosionej skórze głowy bądź
twarzy. 20% 5-ALA i dawka energii 50 J/cm2 zapewniają efektywne leczenie.
Prąciowy liszaj płaski
Towarzyszy często chorobom autoimmunologicznym. Jest to przewlekła choroba skóry i błon
śluzowych atakująca często skórę genitaliów. Leczenie z użyciem 20% 5-ALA i dawką energii
50 J/cm2 dało wyraźne polepszenie po 4 tyg. Po 6 miesiącach nie nastąpił nawrót choroby.
Metoda może być z powodzeniem stosowana w leczeniu prąciowego liszaja płaskiego.
Sarkoidoza
Choroba związana z układem odpornościowym. Charakteryzuje ją powstawanie ziarniniaków,
czyli małych grudek zapalnych nie ulegających martwicy. Guzowata sarkoidoza skórna jest
podatna na leczenie PDT z wykorzystaniem 5-ALA (żel 3% 5-ALA i dawka energii 20 J/
cm2). Po 3 miesięcznym leczeniu zmiany ustąpiły. Leczenie bez procesu zapalnego.
Międzypalcowe grzybice
Badania nie wykazały skuteczności stosowania PDT z wykorzystaniem 5-ALA. Badacze sądzą,
że pewne dotknięte chorobą obszary skóry mogą nie być osiągalne w leczeniu z powodu
skomplikowanego kształtu przestrzeni między palcowej wyjaśniają słabe rezultaty lecznicze.
Łysienie plackowate
Choroba skórna o nieustalonej do tej pory etiopatogenezie (prawdopodobnie o podłożu genetycznym).
Charakteryzuje się występowaniem przejściowych bądź trwałych ognisk wyłysienia (brak ognisk
zapalnych). Obserwuje się brak efektów leczniczych po PDT z użyciem 5-ALA. Badacze podają,
że być może serie 20 zabiegów leczniczych mogłyby dać zauważalną odpowiedź na terapię.
Nienowotworowe choroby skórne oporne na działanie 5-ALA-PDT
Liposomy to lipidowe pęcherzyki złożone z jednej lub
więcej koncentrycznie ułożonych biwarstw fosfolipidowych. Ich główne składniki to fosfolipidy i cholesterol,
które są obecne w organizmie w dużych ilościach, dlatego
powinny być biokompatybilne. Prowadzone są badania
eksperymentalne oraz kliniczne z udziałem nośników liposomowych jako efektywnych systemów dostarczania fotouczulacza w PDT. Liposomalny BPD-MA zaaprobowano do
leczenia w Szwajcarii i USA [68-70].
Olejowe układy zdyspergowane to m.in. CRM — Cremophor-EL niejonowy polioksyetylowany olej rycynowy
60
stosowany jako czynnik emulsyfikujący. Badania pokazują
preferencyjne pochłanianie fotouczulacza zdyspergowanego w CRM przez tkankę nowotworową. W badaniu PDT z
wykorzystaniem fotouczulacza hematoporfiryny oraz CRM
nastąpiła regresja przeszczepionego nowotworu pęcherza
moczowego u szczura przy znacząco niższym stężeniu fotouczulacza w porównaniu z Hp-PDT. Z kolei CRM okazał się
skuteczniejszy niż liposom DPPC (dipalmitylofosfatydylocholina) przy zastosowaniu fotuczulacza SnET2 w leczeniu
tego samego typu nowotworu [69].
www.postepybiochemii.pl
Biodegradowalne nanocząsteczki (m.in. PLA — poli(D,L-kwas mlekowy) są alternatywą dla liposomów dzięki szerokiej różnorodności materiałów i procesu wytwarzania. Dla
PDT doświadczenia prowadzono m.in. z hematoporfiryną,
ftalocyjaniną i m-THPC osadzonych na biodegradowalnych nanocząsteczkach [68]. Obiecujące wyniki uzyskano
w stosunku do nowotworu EMT-6 z użyciem fotouczulacza
ZnPcF16 z PLA i emulsji CRM. Uzyskano 100% skuteczność
z PLA w porównaniu do 60% z CRM [69].
Terapeutyczne zastosowania pozajelitowo podanych nośników koloidalnych są ograniczone z powodu ich szybkiej
eliminacji z krążenia. Pochłanianie nośników przez jednojądrowe fagocyty jest promowane przez opsonizację. Aby
przedłużyć ich cyrkulację w krwioobiegu dodatkowo modyfikuje się ich powierzchnię (zmiana ładunku, hydrofobowości, stabilizacja steryczna) [69].
Aktywne systemy dostarczania
fotouczulaczy
Selektywne dostarczanie fotouczulacza do tkanki nowotworowej jest możliwe dzięki ukierunkowaniu fotouczulacza poprzez tworzenie koniugatów z udziałem cząstek nakierowanych na receptor docelowy (fotouczulacz-mAb lub
fotouczulacz-nanocząsteczka-mAb) [68-70]. Do głównych
zalet tej strategii należą: wysokie powinowactwo wiążącej
cząstki do receptora lub antygenu docelowej powierzchni
komórki; bezpośrednia lub bardziej specyficzna lokalizacja
dzięki czemu można zwiększyć wydajność i selektywność
PDT stosując niższe stężenia fotouczulacza. Niezbędnym
wymogiem tej strategii jest nietoksyczność, nieimmunogenność i biodegradowalność koniugatów; stabilność koniugatów w krwioobiegu i zdolność do pokonania barier
fizjologicznych i osiągnięcia miejsca docelowego przed internalizacją.
W tych celach wykorzystuje się m.in. lipoproteiny i przeciwciała monoklonalne. W klasie lipoprotein, lipoproteiny
niskiej gęstości LDL odgrywają ważną rolę w transporcie
i uwalnianiu cząsteczki fotouczulacza do komórek nowotworowych. Synteza receptorów LDL na powierzchni komórki jest regulowana przez jej zapotrzebowanie na cholesterol. Wiadomo, że szybko proliferujące komórki mają
wysokie zapotrzebowanie na cholesterol do syntezy błon
komórkowych. Badania pokazują, że fotouczulacz złączony niekowalencyjnie z LDL przed podaniem prowadzi do
wzrostu wydajności PDT w porównaniu z podaniem samego fotouczulacza [69,70,73].
Inna strategia zakłada koniugację fotouczulacza z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko specyficznym antygenom komórek nowotworowych. Istnieją
bowiem różnice między komórkami zdrowymi i nowotworowymi, m.in. wyższa synteza specyficznych antygentów
i onkobiałek przez komórki nowotworowe [74,76,77]. We
wstępnych badaniach Hp-PDT z przeciwciałami skierowanymi przeciw antygenom mięśniako-mięsaka M1 uzyskano 95% skuteczność (równoważne stężenie samego Hp lub
mAb stosowano jako kontrole).
Pomimo zachęcających rezultatów in vitro wiele problemów trzeba jeszcze pokonać przed próbami klinicznymi.
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
Wydajność in vivo koniugatów fotouczulacz-mAb lub fotouczulacz-nanocząsteczka-mAb zależy bowiem od wielu
czynników, które mogą wpływać na dostępność do tkanki
nowotworowej. Zmiany w profilu antygenowym komórek
nowotworowych prowadzą do utraty specyficzności receptorów. Sugeruje się podawanie mieszanin przeciwciał
skierowanych przeciwko różnym antygenom, aby osiągnąć
maksymalną skuteczność. Do niedawna większość przeciwciał używanych w badaniach klinicznych stanowiły przeciwciała mysie, mogące powodować reakcje antyidiotypowe reakcje. Obecnie dostępne są już mniej immunogenne
przeciwciała chimeryczne, humanizowane i ludzkie [69-72].
Wzrost efektu PDT i zmniejszenie stężenia fotouczulacza
można osiągnąć używając specyficznych cząsteczek „wyszukujących” komórki nowotworowe jak czynnik wzrostu
EGF, specyficzne białka (transferyna) [78] czy hormony
(insulina) jako alternatywę dla mAb [69,71,72]. Nowe rozwiązania pozwalające na większą selektywność, większą
kumulację fotouczulacza, a przez to mniejsze dawki leku
dają obiecujące rezultaty. Przed naukowcami jeszcze wiele
lat badań nad optymalizacją leczenia nowotworów z wykorzystaniem nanotechnologii i ich bezpieczeństwem, ale dotychczasowe wyniki dają duże nadzieje.
PDT W POLSCE
W Polsce prowadzone są badania diagnostyczne oraz
terapeutyczne z zakresu: dermatologii, gastroenterologii,
laryngologii, pulmonologii, ginekologii i ortopedii z użyciem 5-ALA i Photofrinu. Do głównych klinik zajmujących
się PDT w Polsce należą: Centrum Laserowej Diagnostyki i
Terapii Fotodynamicznej w Bytomiu i Klinika Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi oraz Katedra Ginekologii i
Położnictwa Śląskiego Uniwersytetu Medycznego, Klinika
Ginekologii Onkologicznej B Centrum Onkologii w Warszawie oraz Klinika Chorób Przyzębia Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku [5,79,80].
PODSUMOWANIE
Opracowywanie nowoczesnych i skutecznych metod
diagnozowania oraz terapii nowotworów jest wciąż ważnym elementem medycyny. Metoda fotodynamiczna może
stać się istotnym narzędziem współczesnej onkologii miedzy innymi ze względu na częstą immunosupresję standardowych metod, jak naświetlanie czy chemioterapia. PDT
natomiast w leczeniu miejscowych infekcji bakteryjnych
pozwala w zasadniczy sposób zredukować czas leczenia,
efekty uboczne obserwowane po podaniu antybiotyków i
w wielu przypadkach obniżyć koszty terapii. Zastosowanie
natomiast nanotechnologii w PDT daje bardzo obiecujące
wyniki pozwalające na znaczące podwyższenie efektywności PDT przy obniżeniu skutków ubocznych terapii.
PIŚMIENNICTWO
1. Schuitmaker JJ, Baas P, van Leengoed HLLM, van der Meulen FW,
Star WM, van Zandwijk N (1996) Photodynamic therapy: a promising
new modality for the treatment of cancer. J Photochem Photobiol B
34: 3-12
2. Sibata CH, Colussi VC, Oleinick NL, Kinsells TJ (2001) Photodynamic
therapy in oncology. Expert Opin Pharmacother 2: 917-927
61
3. Agostinis P, Berg K, Cengel KA, Foster TH, Girotti AW, Gollnick
SO, Hahn SM, Hamblin MR, Juziene A, Kessel D, Korbelik M, Moan
J, Mroz P, Nowis D, Piette J, Wilson B, Golab J (2011) Photodynamic
Therapy of Cancer: an update. Cancer J Clin 61: 250-281
4. Szeimies RM, Landthaler M, Karrer S (2002) Non-oncologic indications for ALA-PDT. J Dermatolog Treat 13(Suppl1): 13-18
mediated photodynamic therapy and early stage of apoptosis induction in prostate cancer in vitro. Acta Biochim Pol 4: 495-505
26.Robertson CA, Hawkins D, Abrahamse H (2009) Photodynamic therapy (PDT): A short review on cellular mechanisms and cancer research
applications for PDT. J Photochem Photobiol B 96: 1-8
5. Graczyk A (1999) Photodynamic diagnosis and treatment of cancer,
Bellona, Warszawa, ch.1-2, pp. 21-159 (in Polish)
27.van Duijnhoven FH, Aalbers RIJM, Rovers JP, Terpstra OT, Kuppen P
(2003) The immunological consequences of photodynamic treatment
of cancer, a literature review. Immunobiol 207: 105-113
6. Juzeniene A, Moan J (2007) The history of PDT in Norway Part one:
identification of basic mechanisms of general PDT. Photodiagn Photodyn Ther 4: 3-11
28.Nowis D, Stokłosa T, Legat M, Issat T, Jakóbisiak M, Gołąb J (2005) The
influence of photodynamic therapy on the immune response. Photodiagn Photodyn Ther 2: 283-298
7. Castano AP, Demidova TN, Hamblin MR (2005) Mechanisms in photodynamic therapy: part two-cellular signaling, cell metabolism and
modes of cell death. Photodiagn Photodyn Ther 2: 1-23
29.Szala S (2009) Angiogeneza i immunosupresja: jin i jang progresji nowotworów. Postepy Hig Med Dosw 63: 598-612
8. Bartosz G (2006) Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie.
PWN, Warszawa
31.Oleinick NL, Morris R, Belichenko I (2002) The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why how. Photochem
Photobiol Sci 1: 1-21
9. Halliwell B, Gutteridge JM (1984) Free radicals, lipid peroxidation, and
cell damage. Lancet 2: 1095
30.Jakóbisiak M, Gołąb J (2007) Immunologia. PWN, Warszawa, pp.
10.Sternberg ED, Dolphin D (1998) Porphyrin-based photosensitizers for
use in photodynamic therapy. Tetrahedron 54: 4151-4202
32.Almeida RD, Manadas BJ, Carvalho AP, Duarte CB (2004) Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy. Biochim Biophys
Acta 1704: 59-86
11.Evensen JF, Moan J, Winkelman JW (1987) Toxic and phototoxic effects
of tetraphenylpophinesulphonate and haematoporphyrin derivative
in vitro. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 51: 477-491
33.Cecic I, Korbelik M (2002) Mediators of peripheral blood neutrophilia
induced by photodynamic therapy of solid tumors. Cancer Lett 183:
43-51
12.Berg K, Bommer JC, Moan J (1989) Evaluation of sulfonated aluminum
phthalocyanines for use in photochemotherapy. A study on the relative efficiences of photoinactivation. Photochem Photobiol 49: 587-594
34.Cecic I, Parkins S, Korbelik M (2001) Induction of systemic neutrphill
response in mice by photodynamic therapy of solis tumors. Photochem Photobiol 74: 712-720
13.Ma L, Moan J, Berg K (1994) Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroksyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a
comparison of its photobiological properties with those of two other
photosensitizers. Int J Cancer 57: 883-888
35.Cecic I, Korbelik M (2002) Mediators of peripheral blood neutrophilia
induced by photodynamic therapy of solid tumors. Cancer Lett 183:
43-51
14.Cunderlikova B, Gangeskar L, Moan J (1999) Acid-base properties of
chlorin e6: relation to cellular uptake. J Photochem Photobiol B 53: 8190
36.Cecic I, Stott B, Korbelik M (2006) Acute phase response-associated
systemic neutrophil mobilization in mice bearing tumors treated by
photodynamic therapy. International Immunopharmacol 6: 1259-1266
15.Friberg EG, Cunderlikova B, Pettersen EO, Moan J (2003) PH effects on
the cellular uptake of four photosensitizing drugs evaluated for use in
photodynamic therapy of cancer. Cancer Lett 195: 73-80
37.Gollnick SO, Evans SS, Baumann H, Owczarczak P, Maier P, Vaughan
L, Wang WC, Unger E, Henderson BW (2003) Role of cytokines in
photodynamic therapy-induced local and systemic inflammation. Br
J Cancer 88: 1772-1779
16.Cunderlikova B, Sikurova L, Moan J (2003) PH, serum proteins and
ionic strength influence the uptake of merocyanine 540 by WiDr cells
and its interaction with membrane structures. Bioelectrochemistry 59:
1-10
38.de Vree WJA, Essers MC, Koster JF, Sluiter W (1997) Role of interleukin 1 and granulocyte colony-stimulating factor in photofrin-based
photodynamic therapy of rat rhabdomyosarcoma tumors. Cancer Res
57: 2555-2558
17.Uzdensky AB, Bragin DE, Kolosov MS, Kubin A, Loew HG, Moan J
(2003) Photodynamic effect of hypericin and a water-soluble derivative on isolated crayfish neuron and surrounding glial cells. J Photochem Photobiol B 72: 27-33
39.Kopeć-Szlęzak J (2008) Biologia komórek dendrytycznych. Onkol Pol
11: 106-110
18.Peng Q, Brown SB, Moan J (1993) Biodistribution of a methylene blue
derivative in tumor and normal tissue of rats. J Photochem Photobiol
B 20: 63-71
19.Ye S, Czuba M, Romiszewska A, Karolczak J, Graczyk A (2003) Investigation of photo-physical properties of selected diaminoacid photoporphyrin derivatives PP(AA)Arg2. I determination of quantum yield
of fluorescence. Optica Applicata 2-3(XXXIII0): 489-503
20.Padzik-Graczyk A, Konarski J, Sobczyńska J (1994) Sposób otrzymywania hemin. Patent PL 165248 B1/94
21.Konarski J (1990) Sposób otrzymywania nowych pochodnych di(l-etylo)deuteroporfiryny. Patent PL 148775/1990
22.Padzik-Graczyk A, Konarski J (1994) Sposób otrzymywania soli
kompleksowych hematoporfiryny i jej pochodnych. Patent PL165249
B1/1994
23.Graczyk A, Konarski J (1995,1997) Complex salts of hematoporphyrin
and its derivatives, their synthesis and therapeutic agents. Patents US
5, 45, 599A/95, EPO 539960 A2/97
24.Misiewicz-Krzemińska I, Skupińska K, Graczyk A, Kasprzycka-Guttman T (2009) Influence of protoporphyrin IX amino acid substituents
on affinity to human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. Biotech Histochem 84: 1-7
25.Nowak-Stępniowska A, Wiktorska K, Małecki M, Romiszewska A,
Padzik-Graczyk A (2011) Cytotoxicity of PP(Arg)2 and PP(Ala)2(Arg)2-
62
40.Jung NC, Kim HJ, Kang MS, Lee JH, Song JH, Seo HG (2012) Photodynamic therapy-mediated DC immunotherapy is highly effective for
the inhibition of established solid tumors. Cancer Lett 324: 58-65
41.Laskowska E (2007) Małe białka szoku termicznego — rola w apoptozie, kancerogenezie i chorobach związanych z agregacją białek. Postepy Biochem 1: 19-26
42.Kazimierczuk A, Kiliańska ZM (2009) Plejotropowa aktywność białek
szoku cieplnego. Postepy Hig Med Dosw 63: 502-521
43.Kessel D (2006) Death pathways associated with photodynamic therapy. Med Laser Appl 21: 219-224
44.Plaetzer K, Kiesslich T, Verwanger T, Krammer B (2003) The modes
of cell death induced by PDT: an overview. Med Laser Appl 18: 7-19
45.Buytaert E, Dewaele M, Agostinis P (2007) Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy. Biochim
Biophys Acta 1776: 86-107
46.Kłyszejko-Stefanowicz L (2002) Cytobiochemia. Biochemia niektórych
struktur komórkowych. Wydawnictwo naukowe PWN
47.Grądzka I (2006) Mechanizmy i regulacja programowanej śmierci komórek. Postepy Biochem 2: 157-165
48.Wojtczak L, Zabłocki K (2008) Mitochondria w życiu, chorobie i śmierci komórki. Postepy Biochem 2: 129-141
49.Kmita H, Stobienia O (2006) Kanał VDAC jako regulator funkcji mitochondriów. Postepy Biochem 2: 129-136
www.postepybiochemii.pl
50.Skalska J, Dębska-Vielhaber G, Głąb M, Kulawiak B, Malińska D, Bednarczyk P, Dołowy K, Szewczyk A (2006) Mitochondrialne kanały jonowe. Postepy Biochem 2: 137-144
51.Jóźwiak Z, Marczak A (2006) Rola kanałów jonowych w procesie
apoptozy. Postepy Biochem 4: 373-382
52.Czarna M, Jarmuszkiewicz W (2006) Rola mitochondriów w wytwarzaniu i usuwaniu reaktywnych form tlenu; związek z przesyłaniem
sygnałów i programowaną śmiercią komórki. Postepy Biochem 2: 145156
53.Chen N, Karantza-Wadsworth V (2009) Role and regulation of autophagy in cancer. Biochim Biophys Acta 1793: 1516-1523
54.Mitton D, Ackroyd R (2008) A brief overview of photodynamic therapy in europe. Photodiagn Photodyn Ther 5: 103-111
55.Bredell MG, Besic E, Maake C, Walt H (2010) The application and challenges of clinical PD-PDT in the head and neck region: a short review.
J Photochem Photobiol B 101: 185-190
56.Sally H, Ibbotson MBChB (2010) An overview of topical photodynamic therapy in dermatology. Photodiagn Photodyn Ther 7: 16-23
57.O’Riordan K, Akilov OE, Hasan T (2005) The potential for photodynamic therapy in the treatment of localized infections. Photodiagn
Photodyn Ther 2: 247-262
58.Salmon-Divon M, Nitzan Y, Malik Z (2004) Mechanistic aspects of
Eschericia coli photodynamic inactivation by cationic tetra-meso(Nmethylpyridyl)porphine. Photochem Photobiol Sci 3: 423-429
59.Schafer M, Schmitiz C, Facius R, Horneck G, Milow B, Funken KH,
Ortner J (2000) Systematic study of parameters influencing the action
of rose Bengal with visible light on bacterial cells: comparison between
the biological effect and singlet-oxygen production. Photochem Photobiol 71: 514-523
60.Bertoloni G, Lauro FM, Cortella G, Merchat M (2000) Photosensitizing
activity of hematoporphyrin on Staphylococcus aureus cells. Biochim
Biophys Acta 1475: 169-174
61.Caminos DA, Spesia MB, Pons P, Durantini EN (2008) Mechanisms
of Escherichia Coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochem Pchotobiol Sci 7: 1071-1078
62.Hamblin MR, O’Donnell DA, Murthy N, Rajagopalan K, Michaud
N, Sherwood ME, Hasan T (2002) Polycationic photosensitizer conjugates: effects of chain length and Gram classification on the photodynamic inactivation of bacteria. J Antimicrob Chemother 49: 941-951
63.Dai T, Huang YY, Hamblin MR (2009) Photodynamic therapy for localized infections-state of the art. Photodiagn Photodyn Ther 6: 170-188
64.Chen K, chang BZ, Ju M, Zhang XH, Gu H (2007) Comparative study
of photodynamic therapy vs CO2 laser vaporization in treatment of
condylomata acuminata: a randomized clinical trial. Br J Dermatol 156:
516-520
65.Szeimies RM, Schleyer V, Moll I, Stocker M, Landthaler M, Karrer S
(2009) Adjuvant photodynamic therapy does not prevent reccurence
of condylomata acuminata after carbon dioxide laser ablation-A phase
III, prospective, randomized, bicentric, double-blind study. Dermatol
Surg 35: 757-764
66.Mitra MRCP A, Stables GI (2006) Topical photodynamic therapy for
non-cancerous skin conditions. Photodiagn Photodyn Ther 3: 116-127
67.Wang XL, Wang HW, Zhang LL, Guo MX, Huang Z (2010) Topical
ALA PDT for the treatment of severe acne vulgaris. Photodiagn Photodyn Ther 7: 33-38
68.Chatterjee DK, Fong LS, Zhang Y (2008) Nanoparticles in photodynamic therapy an emerging pradigm. Adv Drug Del Rev 60: 1627-1637
69.Konan YN, Gurny R, Allemann E (2002) State of the art in the delivery
of photosensitizers for photodynamic therapy. J Photochem Photobiol
B 6: 89-106
70.Paszko E, Ehrhardt C, Senge MO, Kelleher DP, Reynolds JV (2011) Nanodrug applications in photodynamic therapy. Photodiagn Photodyn
Ther 8: 14-29
71.Pucińska J, Podbielska H (2009) Nanomateriały we wspomaganiu terapii fotodynamicznej. Acta Bio-Opt Inf Med 2: 178-181
72.Donnelly RF, McCarron PA, Woolfson D (2009) Drug delivery systems
for photodynamic therapy. Recent Pat Drug Deliv Formul 3: 1-7
73.Das M, Mohanty C, Sahoo SK (2009) Ligand-based targeted therapy
for cancer tissue. Expert Opin Drug Deliv 6: 285-304
74.Nerozhay D, Kańska U, Budzyńska R, Boratyński J (2007) Współczesny stan badań nad koniugatami i innymi systemami dostarczania
leków w leczeniu schorzeń nowotworowych i innych jednostek chorobowych. Postepy Hig Med Dosw 61: 350-360
75.Maeda H, Bharate GY, Daruwalla J (2009) Polymeric drugs for efficient tumor-targeted drug delivery based on EPR-effect. Eur J Pharm
Biophar 3: 3409-3419
76.Powroźnik B, Kubowicz P, Pękala E (2012) Przeciwciała monoklonalne w terapii celowanej. Postepy Hig Med Dosw 66: 663-673
77.Jóźwiak Z (2010) Rola przeciwciał monoklonalnych w transporcie leków do komórek nowotworowych. Nowotwory 5: 442-450
78.Łubgan D, Marczak A, Distel L, Jóźwiak Z (2006) Koniugaty transferyny — nadzieja w walce z nowotworami. Postepy Biochem 1: 72-79
79.Sieroń A, Kwiatek S (2009) Twenty years of experience with PDD and
PDT in Poland — review. Photodiagn Photodyn Ther 6: 73-78
80.Sieroń A, Gibinski P, Pustelny T, Kwiatek S, Opilski Z, KawczykKrupka A, Woznica T, Maciak E, Kubica W, Urbanczyk M, Latos W
(2008) Optical biopsy using spectral camera in BCC and oral leukoplakia. Photodiagn Photodyn Ther 5: 271-275
Photodynamic method of cancer diagnosis and
therapy — mechanisms and applications
Agata Nowak-Stępniowska*, Paulina Pergoł, Alfreda Padzik-Graczyk
Biochemistry Laboratory, Institute of Optoelectronics, Military University of Technology, 2 Kaliskiego St., 00-908 Warsaw, Poland
*
e-mail: [email protected]
Key words: photodynamic method, photosensitizers, reactive oxygen specious, cancers
ABSTRACT
Cancers are diagnosed in over few millions patients annually. Due to inter alia weak antigenicity as well as drug-fastness of most cancers,
PDT can become an effective alternative or complementary method to surgery. Photodynamic method requires tree elements: photosensitizer,
light energy source and oxygen. Photodynamic therapy is successfully used method in many clinics all over the world, also in Poland. PDT is
used in treatment of oncological (cancers of head, neck, lung, oesophagus, pancreas, urinary bladder and ginecological cancers) as non oncological diseases (lischen sclerosus, staphylococcus aureus, papillomatosis).
Postępy Biochemii 59 (1) 2013
63