Ocena przeciwwirusowej i immunomodulacyjnej

Ocena przeciwwirusowej i immunomodulacyjnej

MARIA CURIE-SKŁODOWSKA UNIVERSITY
INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
Department of Virology and Immunology
Akademicka 19, 20-033 Lublin, Poland
Fax: 81 537 59 59, tel 81 537 59 40
Ocena przeciwwirusowej i immunomodulacyjnej aktywności trójterpenów izolowanych z
kory brzozy (Betula alba) i jemioły (Viscum album)
Część I
Trójterpeny pentacykliczne są to związki posiadające 30-węglowy szkielet złożony z 4
pierścieni sześciowęglowych i jednego pięciowęglowego. Występują one w wielu roślinach i
posiadają aktywność przeciwzapalną, przeciwwirusową i przeciwnowotworową (7,16,17,18,21)
Ich przeciwwirusowe działanie skierowane jest w stosunku do wirusów, których genom
zbudowany jest z RNA jak i DNA, i które należą do różnych rodzin (systematyka wirusów). Na
przykład, hamują one replikację wirusa ospy wietrznej i półpaśca, zapalenia wątroby typu A,
opryszki, krowianki, adenowirusa typu 5, reowirusów, wirusa poliomyelitis, wirusa Semliki Forest
(2,3,4,5,13,14,15). Szczególnie interesujące jest to, że betulina i kwas betulinowy izolowane z kory
brzóz Betula alba oraz ich pochodne są aktywne przeciw wirusowi HIV (ludzkiego niedoboru
odporności), rodzina Retroviridae (1,8,9,10,11,20). Bardzo interesujący jest fakt, że pochodne
betuliny i kwasu betulinowego hamują wiele etapów replikacji tego wirusa w komórkach ludzkich.
Są więc inhibitorami enzymu wirusa - odwrotnej transkryptazy, hamują dojrzewanie cząstek wirusa
i jego uwalnianie z zakażonej komórki.
Skąpe doniesienia na temat przeciwwirusowej aktywności tych substancji w stosunku do innych
patogennych dla człowieka i zwierząt wirusów zostały w naszych badaniach poszerzone o ich
działanie na wirusy należące do rodziny Picornaviride (wirus zapalenia mózgu i mięśnia
sercowego) i Rhabdoviride (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy gębowej bydła). Należy
podkreślić, że do tej ostatniej rodziny należy także wirus wścieklizny.
Do naszych doświadczeń zostały użyte trójterpeny: betulina i kwas oleanolowy izolowane
z kory Betula alba i oczyszczone przez inż. Stanisława Pielę z firmy "Sylveco", Jasionka, oraz
kwas betulinowy firmy Sigma.
Jak wykazały badania identyfikacyjne i porównawcze laboratorium Chemii Organicznej
Politechniki Rzeszowskiej betulina przygotowana przez inż. Pielę jest preparatem bardzo wysokiej
czystości. Potwierdziliśmy to porównując preparat betuliny "Sylveco" ze standardem betuliny
(Sigma) w chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach Kieselgel 60 (Merck) stosując jako
eluent
chloroform/octan etylu (10:1). Preparat "Sylveco" i wzorzec wykazywały identyczne Rf (retention
factor) i nie stwierdzono plamek żadnych innych substancji po wywołaniu płytek jodem. Natomiast
kwas oleanolowy "Sylveco" zawierał pewne zanieczyszczenia betuliną, co stwierdzono w w/w
laboratorium Politechniki Rzeszowskiej i co potwierdziły nasze analizy TLC.
Jako wirusów testujących użyto: wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (Versicular
stomatitis virus - VSV) i wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (Encephalomyocarditis virus EMCV). Fibroblasty skóry ludzkiej (HSF) były stosowane jako komórki do mierzenia efektów
cytotoksyczności wpływu badanych substancji na replikację wirusów.
Wirusobójcza aktywność betuliny, kwasu betulinowego i kwasu oleanolowego polegająca na
bezpośrednim niszczeniu wirusów była niewielka, np. 26 mg/ml betuliny inaktywowało 50%
cząsteczek wirusa VSV. Powodem małej aktywności wirusobójczej badanych substancji była
prawdopodobnie ich słaba rozpuszczalność w wodzie, powodująca wytrącanie się trójterpenów w
płynie hodowlanym.
Natomiast w innym doświadczeniu stwierdzono, że wszystkie trzy badane trójterpeny
hamowały replikację obydwu wirusów obniżając ich miano o 50% (EC50) przy stężeniach
substancji poniżej 1,3 mg/ml. Ze względu na stosunkowo niską toksyczność (CC50 -stężenie
niszczące 50% komórek skóry ludzkiej) i wysoką aktywność przeciwwirusową, indeks
terapeutyczny (TI), czyli stosunek CC50/ED50 miał wartość powyżej 18. Stawia to betulinę, kwas
betulinowy i kwas oleanolowy w rzędzie potencjalnych substancji o aktywności przeciw wirusom
VSV i EMCV.
Tabela 1. Wirusobójcza aktywność betuliny (B), kwasu betulinowego (Ba) i oleanolowego (Oa) w
stosunku do wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy gębowej bydła (VSV) I wirusa zapalenia
mózgu i mięśnia sercowego (EMCV)
EC50 mg/ml
Substancja
VSV
EMCV
B
26.8
39.5
Ba
26.8
87.4
Oa
31.7
32.4
Zawiesinę wirusa inkubowano z różnymi stężeniami badanych substancji przez 1 godzinę w 37 oC.
Stężenie, które powodowało spadek miana wirusa o 50% uznano za dawkę EC50.
Tabela 2. Cytotoksyczne i przeciwwirusowe działanie betuliny (B), kwasu betulinowego (Ba) i
kwasu oleanolowego (Oa).
Substancja
CC50(mg/ml)a
VSV
EC50
EMCV
TIc
EC50 (mg/ml)
TI
(mg/ml)b
a
B
30
1.2
25
1.26
23.8
Ba
20
1.0
20
1.1
18.1
Oa
25
1.0
25
1.26
19.8
Stężenie toksyczne dla 50% komórek HSF
bStężenie
c Indeks
hamujące replikację wirusa w 50%
terapeutyczny CC50/ EC50
Część II
Wspomniana powyżej przeciwzapalna aktywność trójterpenów wynika z ich zdolności do
wiązania się i hamowania aktywności wielu enzymów komórkowych. Betulina i kwas betulinowy
są inhibitorami fosfolipazy A, enzymu, który uwalnia z lipidów błony komórkowej kwas
arachidonowy. Kwas arachidonowy jest substratem dla dwu typów enzymów: cyklooksygenaz i
lipooksygenaz syntetyzujących prostaglandyny i leukotrieny, uczestniczące w procesie zapalnym.
Zarówno oksygenazy jak i lipooksygenazy są hamowane przez kwas ursolowy i oleanolowy. Oba
kwasy hamują także aktywność elastazy i serynowych proteaz, które odpowiedzialne są za
destrukcję tkanki w procesie zapalnym.
Do tych przeciwzapanych aktywności trójterpenów dochodzą jeszcze ich zdolności do
hamowania cytokin prozapalnych w tym czynnika martwicy nowotworów (TNF) i interleukiny 1
(IL-1). Jednak doniesienia piśmienictwa są sprzeczne. Niektóre z nich mówią, ze trójterpeny mogą
wzmacniać
produkcję
niektórych
cytokin
(1,2,4,5,6,7,9,10),
czyli
mogą
działać
immunomodulacyjnie.
Cytokiny są to białka, które służą komórkom uczestniczącym, np. w procesie zapalnym do
"porozumiewania" się między sobą. Ich wytwarzanie może być "markerem" toczącego się stanu
zapalnego. Oprócz cytokin prozapanych są cytokiny hamujące, wygaszające stan zapalny, np.
interleukina 10 (IL-10)
Stosując nowoczesne metody immunoenzymatyczne (ELISA), które pozwalają na ocenę nawet
niewielkich
zmian
w
ilości
wytworzonych
przez
komórki cytokin,
można wykazać
immunomodulacyjną aktywność badanych substancji.
W naszych badaniach przeprowadzonych in vitro, zastosowaliśmy model "stanu zapalnego"
składający się z komórek krwi człowieka oraz mitogenu fitohemaglutyniny jako induktora cytokin.
Stwierdziliśmy, że kwas betulinowy osłabia w komórkach krwi produkcję substancji o charakterze
prozapalnym - IFN-g a wzmacnia wytwarzanie IL-10. Ma więc podwójne przeciwzapalne działanie
- nie tylko wygasza produkcję prostaglandyn i leukotrienów jak wykazano w innych badaniach (1),
ale także wygasza produkcję cytokin prozapalnych takich jak IFN-g, stymulując wytwarzanie
przeciwzapalnych cytokin (IL-10). Betulina nie wykazuje takiego działania, gdyż w naszych
doświadczeniach stymulowała wytwarzanie TNF-a, czyli cytokiny prozapalnej.
Przypuszczamy, że łączne stosowanie betuliny i kwasu betulinowego może dawać najlepszy
immunomodulacyjny efekt terapeutyczny .
Prace firmy "Sylveco" idące w kierunku izolacji i oczyszczania aktywnych biologicznie
substancji naturalnych, zawartych między innymi w korze brzozy, wychodzą naprzeciw potrzebom
współczesnej preparatyki farmaceutycznej coraz częściej bazującej na preparatach otrzymywanych
z różnych części roślin.
Tabela 3. Cytokiny indukowane przez betulinę i kwas betulinowy w hodowli komórek krwi ludzkiej
Substancja mg/ml-1
Cytokina
TNF-a
IFN-g
IL-10
1.18ą1.0
1.36ą0.4
0
10
7.56ą5.7*
1.0ą0.4
0
5
5.4ą4.7
1.2ą0.7
0
10
1.42ą0.5
1.4ą0.5
0
5
1.04ą1.0
1.7ą0.8
0
Betulina
Kwas betulinowy
ˇStatystycznie istotna różnica w porównaniu z kontrolą przy p<0.05
Wykres 1. Wpływ betuliny (B) I kwasu betulinowego (BA) na wytwarzanie cytokin w hodowlach
komórek krwi ludzkiej indukowanej PHA+LPS
* statystycznie istotna różnica w porównaniu z kontrolą (PHA+LPS)
Piśmiennictwo (część I)
1.Akihisa T., Ogihara J., Kato J., Yasukawa K., Ukiya M., Yamanouchi S., Oishi K (2001):
Inhibitory effects of triterpenoids and sterols on human immunodeficiency virus-1 reverse
transcriptase. Lipids 36, 507-512.
2.Baba M., Shigeta S. (1987): Antiviral activity of glycyrrhizin against varicella-zoster virus in
vitro. Antiviral Res. 7, 99-107.
3.Crance J.M., Leveque F., Biziagos E., van Cuyck-Gandre H., Jouan A., deloince R. (1994):
Studies on mechanism of action of glycyrrhizin against hepatitis A virus replication in vitro.
Antiviral Res. 23, 63-76.
4.Dargan D.J., Galt C.B., Subak-Sharpe J.H. (1992): The effect of cicloxolone sodium on the
replication of vesicular stomatitis virus in BSC-1 cells. J. Gen. Virol. 73, 397-406.
5.Dargan D.J., Galt C.B., Subak-Sharpe J.H. (1992): The effect of cicloxolone sodium on the
replication in cultured cells of adenovirus type 5, reovirus type 3, poliovirus type 1, two
bunyaviruses and Semliki Forest virus. J. Gen. Virol. 73, 407-411.
6.De Clerq E. (2001) :New developments in anti-HIV therapy Curr. Med. Chem. 8, 1543-1572.
7.Fulda S., Debatin K.M. (2000): Betulinic acid induces apoptosis through a direct effect on
mitochondria in neuroectodermal tumors. Med. Pediatr. Oncol. 35, 616-618.
8.Hashimoto F., Kashiwada Y., Cosentino L.M., Chen C.H., Garrett P.E., Lee K.H. (1997): AntiAIDS agents-27. Synthesis and anti-HIV activity of betulinic acid and dihydrobetulinic acid
derivatives. Bioorg. Med. Chem. 5, 2133-2143.
9.Holz-Smith S.L., Sun IC., Jin L., Matthews T.J., Lee K.H., Chen C.H. (2001):Role of human
immunodeficiency virus (HIV) type 1 envelope in the anti-HIV activity of the betulinic acid
derivative IC9564. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 60-66.
10. Kanamoto T., Kashiwada Y., Kanbara K., Goth K., Yoshimori M., Goto T., Sano K., Nakashima
H. (2001): Anti-human immunodeficiency virus activity of YK-FH312 (a betulinic acid derivative),
a novel compound blocking viral maturation. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 1225-1230.
11. Kashiwada Y., Chiyo J., Ikeshiro Y., Nagao T., Okabe H., Cosentino L.M., Fowke K., Lee K.H.
(2001): 3,28-di-0-(dimethylsuccinyl)-betulin isomers as anti-HIV agents. Bioorg. Med. Chem. Lett.
22, 183-185.
12. Kashiwada Y., Nagao T., Hashimoto A., Ikeshiro Y., Okabe H., Cosentino L.M., Lee K.H.
(2000): Anti-AIDS agents. 38. Anti-HIV activity of 3-0-acyl ursolic derivatives. J. Nat. Prod. 63,
1619-1622.
13. Kinjo J., Yokozimo K., Hirakawa T., Shii Y., Nohara T., Uyeda M. (2000): Anti-herpes virus
activity of fabaceous triterpenoidal saponins. Biol. Pharm. Bull. 23, 887-889.
14. Kurokawa M., Basnet P., Ohsugi M., Hozumi T., Kadota S., Namba T., Kawana T., Shiraki K.
(1999): Anti-herpes simplex virus activity of moronic acid purified from Rhus javanica in vitro and
in vivo. J. Pharmacol Exp. Ther. 289, 72-78.
15. Lampis G., Ingianni A., Pompei R. (1997): Synergistic effects of triterpenic compounds with
prostaglandin A1 on vaccinia virus infected L929 cells. Antiviral Res. 36, 191-195.
16. Mahato S.B., Sarkar S.K., Poddar G. (1988): Triterpenoid saponins. Phytochemistry 27,
3037-3067.
17. Recio M.C., Giner R.M., Manez S., Gueho J., Julien H.R., Hostettmann K., Rios J.L. (1995):
Investigations on the steroidal anti-inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros
leucomelas. Planta Med. 61, 9-12.
18. Ryu S.Y., Oak M.H., Yoon S.K., Cho D.I., Yoo G.S., Kim T.S., Kim K.M. (2000): Anti-alergic
and anti-inflammatory triterpenes from herb of Prunella vulgaris. Planta Med. 66, 358-360.
19. Simoes C.M., Amoros M., Girre L. (1999): Mechanism of antiviral activity of triterpenoid
saponins. Phytother. Res. 13, 323-328.
20. Vlietinck A.J., De Bruyne T., Apers S., Pieters L.A. (1998): Plant-derived leading compounds
for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Planta Med. 64, 97-109.
21. Zuco V., Supino R., Righetti S.C., Cleris L., Marchesi E., Gambacorti-Paserini C., Formelli F.
(2002): Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer
Lett. 175, 17-25.
Piśmiennictwo (część II)
1. Bernard P., Scior T., Didier B., Hibert M., Berthon J.Y.: Ethnopharmacology and bioinformatic
combination for leads discovery: application to phospholipase A2 inhibitors. Phytochemistry,
2001,58, 865-874.
2.Choi C.Y., You H.J., Jeong H.G: Nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production by
oleanolic acid via nuclear factor-kappaB activation in macrophages. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 2001, 288, 49-55.
3.Fernandez M.A., Delas Heras B., Garcia M.D., Saenz M.T., Villar A.: New insights into the
mechanism of action of anti-inflammatory triterpene lupeol. J. Pharm. Parmacol., 2001, 53,
1533-1539.
4.Giner-Larza E.M., Manez S., Recio M.C., Giner R.M., Prieto J.M., Cerda-Nicolas M., Rios J.L.:
Oleanonic acid, a 3-oxotriterpene from Pistacia, inhibits leukotriene synthesis and has antiinflammatory activity. Eur. J. Pharmacol., 2001, 428, 137-143.
5.Rajic A., Akihisa T., Ukiya M., Yasakawa K., Sandeman R.M., Chandler D.S., Polya G.M.:
Inhibition of trypsin and chymotrypsin by anti-inflammatory triterpenoids from Compositae
flowers. Planta Med., 2001, 67, 599-604.
6.Suh N., Honda T., Finlay H.J., Barchowsky A., Williams C., Benoit N.E., Xie Q.W., Nathan C.,
Gribble G.W., Sporn M.B.: Novel triterpenoids suppress inducible nitric oxide synthase (iNOS) and
inducible cyclooxygenase (COX-2) in mouse macrophages. Cancer Res., 1998, 58, 717-723.
7.Suh N., Wang Y., Honda T., Gribble G.W., Dmitrovsky E., Hickey W.F., Maue R.A., Place A.E.,
Porter D.M., Spinella M.J., Williams C.R., Wu G., Dannenberg A.J., Flanders K.C., Letterio J.J.,
Mangelsdorf D.J., Nathan C.F., Nguyen L., Porter W.W., Ren R.F., Roberts A.B., Roche N.S.,
Subbaramaiach K., Sporn M.B.: A novel synthetic oleanane triterpenoid, 2,-cyano-3,12dioxoolean-1,9-dien-28-oic
acid,
with
potent
differentiating,
antiproliferative,
and
anti-
inflammatory activity. Cancer Res., 1999, 59, 336-341.
8.Wang B.H., Polya G.M.: Selective inhibition of cyclic AMP-dependent protein kinase by
amphiphilic triterpenoids and related compounds. Phytochemistry, 1996, 41, 55-63.
9.Ying Q.L., Rinerart A.R., Simon S.R., Cheronis J.C.: Inhibition of human leukocyte elastase by
ursolic acid. Evidence for a binding site for pentacyclic triterpenoids. Biochem J., 1991, 277, 521526.
10. You H.J., Choi C.Y., Kim J.Y., Park S.J., Hahm K.S., Jeong H.G.: Ursolic acid enhances nitric
oxide and tumor necrosis factor-alpha production via nuclear factor kappaB activation in the resting
macrophages. FEBS Lett., 2001, 509, 156-160.