Biomarkery_Prof. Rokita

Wydział Nauk o Zdrowiu
Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach
Klinika Położnictwa i Ginekologii
Wojewódzki Szpital Zespolony w Kielcach
BIOMARKERY W
DIAGNOSTYCE ZMIAN
SZYJKI MACICY
Jastarnia 20. 06. 2015 r..
dr hab. n. med., prof. UJK Wojciech Rokita
1
1
1
Rak Szyjki Macicy na Świecie
•
Liczba zachorowań 500.0000
•
Liczba zgonów 233.000
•
Drugi co do częstości występowania nowotwór u kobiet
•
•
Drugie miejsce wśród przyczyn zgonów nowotworowych
u młodych kobiet w Europie
Codziennie na raka szyjki macicy umiera w Europie 74
kobiety
Arbyn M., Raifu A.O., Autier P. [et al.] Burden of cervical cancer in Europe: estimates for 2004. Ann.Oncol.
2007, 18
2
2
Rak Szyjki Macicy w Polsce
• 3270 nowych zachorowań (2008 r.)
• 1745 zgonów (2008r.)
• 7 miejsce wśród przyczyn zgonów u kobiet na
nowotwory złośliwe
• współczynnik umieralności (standaryzowany) 5,3/100.000
Wojciechowska U., Didkowska J., Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2008 roku. Centrum Onkologii
Instytut. Warszawa 2010
3
3
Rak Szyjki Macicy w Polsce
• 3270 nowych zachorowań (2008 r.)
• 1745 zgonów (2008r.)
• 7 miejsce wśród przyczyn zgonów u kobiet na
nowotwory złośliwe
• współczynnik umieralności (standaryzowany) 5,3/100.000
Wojciechowska U., Didkowska J., Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2008 roku. Centrum Onkologii
Instytut. Warszawa 2010
4
4
Rozwój Cytodiagnostyki w Profilaktyce
Raka Szyjki Macicy
• 1926 Aurel Babes (1886-1961) Bukareszt (Rumunia)
odkrycie rozmazu cytologicznego jako narzędzia w
diagnostyce raka szyjki macicy
• 1928 George Nicholas Papanicolau (1883-1962) New
York (USA) cytologia w diagnostyce raka szyjki macicy
• 1942 G.N. Papaniculaou (USA) pierwsza klasyfikacja
rozmazów cytologicznych
Torres JE, Riopelle MA. History of colposcopy in the United States. Obstet Gynecol Clin N Am, 1993, 20, 1-12
5
5
Rozwój Cytodiagnostyki w Profilaktyce
Raka Szyjki Macicy
CoxTJ. The Road to Cervical Cancer Prevention: Historical Perspective. In: Modern Colposcopy
Textbook&Atlas ed. Mayeaux EJ Jr, Cox TJ. Wolters Kluwer, Philadelphia 2012, 1-13.
6
6
Rozwój Cytodiagnostyki w Profilaktyce
Raka Szyjki Macicy
• 1944 wprowadzenie skriningu cytologicznego w Europie
(Wielka Brytania, Skandynawia)
• 1947 Ayre (Kanada) opatentował szpatułkę do
pobierania rozmazów cytologicznych
• 1949 wprowadzenie skriningu cytologicznego w USA
• 1988 wprowadzenie systemu oceny rozmazów według
Bethesda (The Bethesda System)
Torres JE, Riopelle MA. History of colposcopy in the United States. Obstet Gynecol Clin N Am, 1993, 20, 1-12
7
7
Badania Profilaktyczne Raka
Szyjki Macicy w Polsce
• Lata 70-te XX wieku – skrining oportunistyczny:
Białystok (Kazanowska), Warszawa (Teter), Kielce
(Malarewicz)
• Lata 80-90 te XX wieku – początki skriningu aktywnego:
Białystok, Warszawa (Ursynów)
• 2005 r. Wprowadzenie Populacyjnego Programu
Profilaktyki i Wczesnego Wykrywania Raka Szyjki
Macicy
8
8
Skrining Cytologiczny
Raka Szyjki Macicy
Michalas SP. The Pap test: George N Papanicolaou (1883-1962) A screening test for the prevention of cancer of
uterine cervix. Eur J Obstet Gynecol Reprod 2000 Biol 90, 135-138.
9
9
Struktura Organizacyjna
PPPWWRSZ w Polsce
10
10
Ograniczenia
konwencjonalnej cytodiagnostyki
•
niska czułość
•
wysoki odsetek wyników fałszywie
pozytywnych
•
niska jakość techniczna
konwencjonalnych rozmazów
cytologicznych
Belinson J, Qiao Y L, Pretorius R, et al. Shanxi Province Cervical Cancer Screening Study: A cross-sectional
comparative trial of multiple techniques to detect cervical neoplasia. Gynecol Oncol. 2001, 83, 439-44.
11
11
Nowe metody cytodiagnostyczne
Cytologia na podłożu płynnym (LBC)
USA
• 1996 ThinPrep® CYTYC Corporation, Boxborough, MA.
• 1999 BD SurePath™ (AutoCyte PREP, BD Diagnostics)
• 1999 ThinPrep-2000
• 2000 ThinPrep-3000
Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych
testów molekularnych i
immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań 2010,
45.
12
12
Nowe metody cytodiagnostyczne
Cytologia na podłożu płynnym (LBC)
Poza USA
•
CYTOscreen System® (Seroa)
•
Turbitec ® (Labonord)
•
PapSpin® (Shandon)
•
Cytoslide® (Menarini)
•
Spin Thin® (Shandon)
Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych
testów molekularnych i
immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań 2010,
45.
13
13
Cytologia na podłożu płynnym (LBC)
14
14
Cytologia na podłożu płynnym (LBC)
Rozmaz konwencjonalny
Cytologia na podłożu płynnym
15
15
Cytologia na podłożu płynnym (LBC)
Rozmaz konwencjonalny
Cytologia na podłożu płynnym
16
16
Cytologia na podłożu płynnym (LBC)
17
17
Skrining Cytologiczny
Raka Szyjki Macicy
Badanie
Liczba
przypadków
Punkt
końcowy
Czułość
(%)
Specyficzność
(%)
AHCPR
1999
> 5000
CIN2+
51
98
Rokita W
2006
180
CIN2+
64
87
Cuzick J
2006
60000
CIN 2+
52
96
Rokita W
2011
687
CIN1+
58
63
AHCPR Publication No. 99-E010, February 1999. , Rokita W. Przeg Gin Poł 2006, 6, 161-65., Cuzick J, Clavel C,
Petry KU [et al.] . Int J Cancer 2006, 119, 1095-101, Rokita W. Ginekol Pol 2011, 82, 607-11.
18
18
Skrining Raka Szyjki Macicy w USA
Nieprawidłowe wyniki badań cytologicznych
12,200
Ca
300,000
HSIL
1.25 mln LSIL
2-3 mln ASC-US
Gravitt PE, Belinson JL, Salmeron J [et al.]. Looking ahead: a case for human papillomavirus testing of selfsampled vaginal specimens as a cervical cancer screening strategy. Int J Cancer 2011, 129, 517-27.
19
19
Skrining Raka Szyjki Macicy w Polsce
Nieprawidłowe wyniki badań cytologicznych 01. 01. 2008 – 31.12. 2008
10
8
6
4
2
0
Spaczyński M, Kotarski J, Nowak-Markwitz E [et al.].Postępowanie w przypadku nieprawidłowego wyniku
przesiewowego badania cytologicznego. Rekomendacje Centralnego Ośrodka Koordynującego Populacyjny
Program Profilaktyki i Wczesnego Wykrywania Raka Szyjki Macicy, Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego,
Polskiego Towarzystwa Patologów i Polskiego Towarzystwa Kolposkopii i Patofizjologii Szyjki Macicy.
Ginekol Pol 2009, 80, 134-138.
20
20
Koszty Skriningu Raka Szyjki Macicy
w USA
Goldie SJ. Chapter 15: Public health policy and cost-effectiveness analysis. J Natl Cancer Inst Monogr 2003,
102-110
21
21
Postępowanie w przypadku
nieprawidłowego wyniku
badania cytologicznego
•
kontrolny rozmaz cytologiczny
•
kolposkopia z biopsją celowaną
•
diagnostyczno-terapeutyczne usunięcie zmiany
(LLETZ/LEEP, konizacja)
•
test HPV (DNA HPV HR, mRNA HPV HR)
•
diagnostyka immunocytochemiczna (p16, Ki67)
Spaczyński M, Kotarski J, Nowak-Markwitz E [et al.].Postępowanie w przypadku nieprawidłowego wyniku
przesiewowego badania cytologicznego. Rekomendacje Centralnego Ośrodka Koordynującego Populacyjny
Program Profilaktyki i Wczesnego Wykrywania Raka Szyjki Macicy, Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego,
Polskiego Towarzystwa Patologów i Polskiego Towarzystwa Kolposkopii i Patofizjologii Szyjki Macicy.
Ginekol Pol 2009, 80, 134-138.
22
22
Skrining raka szyjki macicy – testy DNA
HPV
•
wysoka czułość
•
niska swoistość
•
wysoki koszt pojedynczego badania
•
mała przydatność w selekcji pacjentek
z ASC-US i LSIL
•
brak możliwości zróżnicowania
zakażenia latentnego i przetrwałego
Rokita W, Kędzia W, Gaj A, Kulig B. Aspekt ekonomiczny wykorzystania wybranych biomarkerów w badaniach
przesiewowych raka szyjki macicy. Ginekologia Polska 2010, 81, 774-777.
23
23
Biomarker (marker) nowotworowy
Immunocytochemiczna identyfikacja ekspresji białek p16 i Ki67
24
24
Biomarker (marker) nowotworowy
•
substancja wielkocząsteczkowa
•
białko lub glikolipid
•
wytwarzana wyłącznie w komórkach
nowotworowych, albo
•
w komórkach nowotworowych i
prawidłowych, ale wytwarzanie w
komórce nowotworowej znacząco
wyższe niż w komórce prawidłowej
Będkowska GE, Ławicki S, Szmitkowski M. Molekularne markery karcynogenezy w diagnostyce raka szyjki
macicy. Postepy Hig Med. Dośw, 2009, 63, 99-105.
25
25
Biomarkery raka szyjki macicy
•
Białka MCM (monichromosome
maintenance proteins)
•
Białko CDC6 (cell division cycle 6)
•
PCNA (proliferating cell nuclear
antygen)
•
Telomeraza
Będkowska GE, Ławicki S, Szmitkowski M. Molekularne markery karcynogenezy w diagnostyce raka szyjki
macicy. Postepy Hig Med. Dośw, 2009, 63, 99-105.
26
26
Biomarkery raka szyjki macicy
•
Inhibitory cyklinozależnej kinazy
(A/E-cdk2 oraz Cip/Kip (P21, P27, P57)
•
Czynniki transkrypcyjne Brn-3a
i Brn-3b
•
Metylacja DNA
•
Białko p53
•
Białko Bcl2
Będkowska GE, Ławicki S, Szmitkowski M. Molekularne markery karcynogenezy w diagnostyce raka szyjki
macicy. Postepy Hig Med. Dośw, 2009, 63, 99-105.
27
27
Biomarkery raka szyjki macicy
•
Białko p16 INK4a
•
Białko Ki-67
Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych testów molekularnych
i immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań 2010.
28
28
Biomarkery raka szyjki macicy
Rola białka p16
•
kontrola prawidłowego cyklu komórkowego
•
inhibitora cyklinozależnej kinazy CDK
•
hamowanie fosforylacji białka retinoblastoma
•
zatrzymanie podziału komórki w fazie G1
•
wzrost ekspresji po zapoczątkowaniu
transformacji nowotworowej
Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych testów molekularnych
i immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań
2010.
29
29
Biomarkery raka szyjki macicy
Rola białka Ki 67
•
marker proliferacji komórkowej
•
uczestnictwo w rybosomalnej biosyntezie
•
ekspresja w fazach: późnej G1, S, G2 i M
•
brak ekspresji w fazie G0
•
uczestniczy w rybosomalnej biosyntezie
Whitfield M.L., George L.K., Grant G.D., Perou C.M.: Common markers of proliferation. Nat. Rev. Cancer,
2006; 6: 99–106.
30
30
Mechanizm ekspresji białka p16
31
31
Białko p16 a rak szyjki macicy
•
białko wpływające na regulację cyklu komórkowego
•
silna ekspresja w stanach przedrakowych i raku szyjki
macicy związana z zakażeniem wirusem HR HPV
(niezależnie od typu wirusa)
•
bezpośredni związek ekspresji p16 z inaktywacją
białka Rb
•
zastępczy marker dla zakażeń HR HPV
powodujących transformację nowotworową komórek
32
32
Immunocytodetekcja
p16 a p16/Ki67
•
o
•
o
o
immunocytodetekcja p16
wymaga dodatkowo oceny morfologicznej komórek
nabłonkowych
immunocyodetekcja p16/Ki67
równoczesna identyfikacja dwóch biomarkerów w tej
samej komórce
marker świadczący o zaburzeniu regulacji cyklu
komórkowego poprzez inaktywację białka RB w
proliferujacych komórkach nabłonka szyjki macicy
33
33
Immunocytodetekcja p16/Ki67
Rozmaz konwencjonalny
Cytologia na podłożu płynnym
34
34
Immunocytodetekcja p16/Ki 67
35
35
Immunocytodetekcja p16/Ki 67
36
36
Immunocytodetekcja p16/Ki 67
37
37
Immunocytodetekcja p16/Ki 67
38
38
Immunocytodetekcja p16, Ki 67
(test CINtecPlus®
Cytology)
•
wykrywanie ekspresji białka p16
•
wykrywanie ekspresji białka Ki67
•
wykrywanie zmian na poziomie komórkowym
•
lokalizacja komórek z zaburzonym cyklem
komórkowym
•
wysoka czułość w detekcji zmian CIN2+
•
wysoka specyficzność
•
wygoda stosowania (brak konieczności
ponownego wzywania pacjentki)
39
39
Cel pracy
•
•
Określenie efektywności wykrywania patologii szyjki
macicy realizowanej za pomocą cytodiagnostyki w
oparciu o założenia metodologiczne programu
profilaktyki raka szyjki macicy, na przykładzie wybranych
rozpoznań cytologicznych ASC-US, LSIL, HSIL.
Analiza zmian w efektywności wykrywania patologii
szyjki macicy jakie zachodzą przy modyfikacji
stosowanego w skriningu narzędzia diagnostycznego
uzupełnionego o oznaczenie DNA HPV HR lub mRNA
HPV HR lub immunocytodetekcję białka p16 i Ki67
40
40
Cel pracy
•
Analiza ekonomiczna opłacalności proponowanych
zmian metody diagnostycznej wykorzystywanej w
badaniach przesiewowych raka szyjki macicy.
•
Ocena kosztów wykorzystania detekcji molekularnej
DNA HPV HR, mRNA HPV HR oraz
immunocytochemicznej identyfikacji p16INK4A i Ki67
jako metod wykrywających CIN2+ w skriningu raka szyjki
macicy.
41
41
Materiał
•
630 kobiet w wieku 25–65 lat (średnia 45 lat ± SD) z nieprawidłowym
wynikiem badania cytologicznego
•
okres prowadzonych badań 01. 01. 2008 – 31.10.2010 r.
•
ośrodki badawcze
•
Pracownia Patofizjologii Szyjki Macicy GPSK im. Karola
Marcinkowskiego w Poznaniu
•
Oddział Położniczo Ginekologiczny Szpitala Kieleckiego w Kielcach
42
Materiał
43
43
Materiał
Kolposkopia – biopsja celowana
44
44
Materiał
Wyłączenia
•
kobiety ciężarne
•
podejrzenie w rozmazie cytologicznym zmian w
obrębie nabłonka gruczołowego (2 przypadki)
45
45
Metodyka
Zastosowane metody badawcze
• Kolposkopia z biopsją celowaną i badaniem histopatologicznym
• Diagnostyka cytologiczna (barwienie metodą Papanicolaou)
• Identyfikacja DNA HPV HR (test Amplicor)
• Wykrywanie transkryptów mRNA HPV HR
(test NucliSENS EasyQ®)
• Immunocytochemiczna identyfikacja białek p16 i Ki67
(test CINtecPlus® Cytology)
46
46
Metoda
Test AMPLICOR™
• test PCR
• amplifikacja DNA
• 13 typów wirusa (16, 18, 31,33, 35, 39, 45,
51, 52, 56, 58, 59, 68)
• możliwość wykonania genotypowania
• bardzo wysoka czułość testu
47
47
Metoda
Test NucliSENS EasyQ®
•
wykrywanie transkryptów mRNA
onkogenu E6 HPV16 oraz E7 HPV: 18,
31, 33, 45
•
wysoka czułość
•
bardzo wysoka specyficzność
48
48
Metoda
Immunocytodetekcja p16, Ki 67
(test CINtecPlus® Cytology)
•
wykrywanie ekspresji białka p16
•
wykrywanie ekspresji białka Ki67
•
wysoka czułość w detekcji zmian CIN2+
•
wysoka specyficzność
•
wygoda stosowania (brak konieczności
ponownego wzywania pacjentki)
49
49
Materiał
50
Wyniki
Cała badana populacja
Rozmaz cytologiczny (p<0,00001)
200
520
110
222
252
46
277
121
0
51
51
Wyniki
Wynik badania histopatologicznego
10
8
6
222
408
287
4
121
2
0
52
52
Analiza statystyczna
• Czułość (sensitivity – SENS)
• Specyficzność (specificity – SPEC)
• Wskaźnik wiarygodności dodatniego wyniku testu
(likelihood ratio-LR+)
• Wskaźnik wiarygodności ujemnego wyniku testu
(likelihood ratio-LR-)
• Dodatnią wartość predykcyjną (Positive Predictive Value – PPV)
• Ujemną wartość predykcyjną (Negative Predictive Value – PPV)
• Dokładność (Accuracy – ACC)
53
53
Wyniki
Rodzaj
badania
Cytologia
Test DNA
HPV HR
Test mRNA
HPV HR
Wynik
Wynik badania histopatologicznego
Analiza
statystyczna
prawidłowy
LGSIL
HGSIL
(CIN2+)
norma
51 (23,0%)
39 (14,1%)
20(15,3%)
ASC-US
102(45,9%)
87 (31,4%)
33 (25,2%)
LSIL
61 (27,5%)
139 (50,2%)
52 (39,7%)
HSIL
8 (3,6%)
12 (4,3%)
26 (19,8%)
patologia
171 (77,0%)
238 (85,9%)
111 (84,7%)
dodatni
140 (67,0%)
212 (91,4%)
107 (91,5%)
ujemny
69 (33,0%)
20 (8,6%)
10 (8,5%)
dodatni
42 (33,3%)
148 (69,5%)
65 (79,3%)
ujemny
84 (66,7%)
65 (30,5%)
17 (20,7%)
dodatni
10 (33,3%)
11 (47,8%)
15 (100%)
x²=18,20
p<0,00001
ujemny
20 (66,7%)
12 (52,2%)
0 (0,0%)
V=0,52
p16 Ki 67
x²=69,79
p<0,00001
V=0,24
x²=53,41
p<0,00001
V=0,31
x²=58,23
p<0,00001
V=0,37
54
54
Wyniki
Kobiety z
rozpozaniem CIN2+
SENS
(%)
SPEC
(%)
LR+
LR-
PPV
(%)
NPV
(%)
ACC
(%)
Cytologia- ASC-US
62
33
0,93
1,13
24
72
41
Cytologia - LSIL
72
46
1,33
0,61
46
72
56
Cytologia - HSIL
57
86
4,17
0,50
76
72
73
Rozmaz cytologiczny
85
23
1,10
0,66
39
72
46
Test DNA HPV HR
91
33
1,37
0,26
43
87
54
Test mRNA HPV HR
79
67
2,38
0,31
61
83
72
p16 Ki67
100
67
3,00
0,00
60
100
78
55
55
Wyniki
Grupa kobiet ze zmianami CIN2+
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
56
56
Koszt wykrycia pojedynczego
przypadku patologii szyjki macicy
KPT
Koszt =
ACC
KPT – koszt pojedynczego testu
ACC – dokładność testu
57
57
Koszt wykrycia pojedynczego przypadku CIN2+
Rodzaj badania
Koszt w
PLN
Dokładność
testu
(ACC ) %
Koszt
wykrycia
CIN2+ w PLN
Cytologia
65,00
46
141,00
Test DNA HPV HR
219,00
54
405,00
Test mRNA HPV HR
389,00
72
540,00
P16 Ki67
ok. 100,00
78
128,00
Kolposkopia
z biopsją celowaną
600,00
100
600,00
58
58
Koszt wykrycia pojedynczego
przypadku CIN2+ w PLN
10
8
6
4
2
0
59
59
Szacunkowe koszty realizacji
Etapu Pogłębionego
Metoda
diagnostyczna
Szacunkowy
PPPWWRSzM
koszt
całkowity (PLN)
Szacunkowa
oszczędność
(PLN)
Kolposkopia z
biopsją
celowaną
20935200,00
0,00
Test DNAHPV
14131260,00
6803940,00
Test mRNA
18841680,00
2093520,00
CINtecPlus®
P16 Ki67
4466176,00
16469024,00
60
Szacunkowe koszty (w PLN) realizacji
etapu pogłębionego PPPWWRSzM
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
61
61
Wnioski
1.
Wykorzystanie metody immunocytochemicznej w
badaniach przesiewowych do wykrywania zmian typu
CIN2+ jest najbardziej ekonomicznie uzasadnione w
porównaniu do testów DNA HPV HR i mRNA HPV HR
oraz cytodiagnostyki
62
62
Wnioski
2.
Efektywność cytodiagnostyki konwencjonalnej,
stosowanej w polskim programie profilaktyki
wtórnej raka szyjki macicy dorównuje europejskim
standardom, ale nie zapewnia osiągnięcia
wysokich parametrów czułości, swoistości i
dokładności tej metody w wykrywaniu patologii
szyjki macicy.
63
63
Wnioski
3.
Najwyższą efektywność cytodiagnostyki
konwencjonalnej uzyskano dla wykrycia
rzeczywistej patologii szyjki macicy, czyli zmian
przedrakowych dużego stopnia CIN2+.
64
64
Wnioski
4.
Satysfakcjonującą efektywność diagnostyczną, wyrażoną
maksymalną czułością i wysoką swoistością oraz
najwyższą dokładnością w wykrywaniu rzeczywistej
patologii szyjki macicy, czyli zmian przedrakowych CIN2+
wykazano dla modyfikacji konwencjonalnej cytodiagnostyki
za pomocą immunocytochemicznej identyfikacji
biomarkerów p16INK4a i Ki-67.
65
65
Wnioski
5.
Analiza kosztów wykrycia patologii szyjki macicy,
wykonana pod kątem dokładności metody modyfikującej
efektywność konwencjonalnej cytodiagnostyki, wykazała,
że immunocytochemiczna identyfikacja biomarkerów
p16INK4a i Ki-67 jest najbardziej uzasadnioną
ekonomicznie metodą mającą zastosowanie w
profilaktycznych badaniach przesiewowych.
66
66
67
67
68
68
69
69
70
70
71
71
Dziękuję za uwagę
72
72