plik PDF - Wydział Biologii i Biotechnologii

Transkrypt

Załącznik nr 2
TU München
Katedra Biotechnologii
Zwierząt Gospodarskich
Autoreferat przedstawiający opis dorobku
I osiągnięć naukowych
dr Tatiana Flisikowska
Freising, Niemcy, 07 stycznia 2016 r.
Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych
Spis treści
1. Imię i nazwisko
3
2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe
3
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach
naukowych
3
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14
marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o
stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.)
3
5. Opis osiągnięcia naukowego wskazanego w punkcie 4 oraz we
wniosku habilitacyjnym jako znaczny wkład w rozwój nauk
biologicznych w dyscyplinie biologia
5
5.1.
Wprowadzenie
5
5.2.
Wyniki
6
5.3.
Bibliografia
14
6. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
15
2
Autoreferat przedstawiający
opis dorobku i osiągnięć
naukowych
1. Imię i nazwisko: Tatiana Flisikowska (panieńskie: Adamowicz)
2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe:
!
2006 – Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, Wydział Medycyny Weterynaryjnej
i Nauk o Zwierzętach (dawniej Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt), stopień
doktora nauk rolniczych w zakresie zootechniki; rozprawa doktorka pt.:
„Polimorfizm wybranych genów bydła, badania filogenetyczne ras oraz związek z
wartością hodowlaną cech mlecznych i użytkowością rozpłodową buhajów“;
promotor: prof. dr hab. Marek Świtoński, recenzenci: prof. dr hab. Stanisław
Kamiński, prof. dr hab. Lech Zwierzchowski
!
2001 – Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii –
studia stacjonarne: I stopnia, inżynierskie na kierunku Biotechnologia, II stopnia,
magisterskie na kierunku Biotechnologia, na specjalności: Genetyka zwierząt;
praca magisterska: „Polimorfizm Leu127Val genu hormonu wzrostu u bydła a
liczba i przydatność oocytów do dojrzewania in vitro”; promotor: dr Dorota
Lechniak.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu
Od października 2005 roku do chwili obecnej jestem zatrudniona na stanowisku
adiunkta w Katedrze Biotechnologii Zwierząt Gospodarskich, Technische Univeristät
München w Niemczech.
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14
marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i
tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.)
" Załączono stosowne oświadczenia współautorów zgodnie z §12 ust. 3
Rozporządzenia z 30 października 2015 r. – Dz. U. z 2015 r., poz. 1842
(załącznik nr 7).
3
Osiągnięcie pod tytułem: „Modyfikowane genetycznie zwierzęta gospodarskie
jako model w badaniach chorób człowieka” tworzy cykl następujących publikacji:
a. Li, S., Edlinger, M., Saalfrank, A., Flisikowski, K., Tschukes, A., Kurome, M.,
Zakhartchenko ,V., Kessler, B., Saur, D., Kind, A., Wolf, E., Schnieke, A., Flisikowska,
T. (2015). Viable pigs with a conditionally-activated oncogenic KRAS mutation.
Transgenic Research, 24(3):509-17. doi: 10.1007/s11248-015-9866-8. [IF2014= 2.322;
MNiSW = 25]
b. Li, S., Flisikowska, T., Kurome, M., Zakhartchenko, V., Kessler, B., Saur, D., Kind, A.,
Wolf, E., Flisikowski, K., Schnieke, A. (2014). Dual fluorescent reporter pig for Cre
recombinase; transgene placement at the ROSA26 locus. PLoS One, 15;9(7):e102455.
doi: 10.1371/journal.pone.0102455. [IF2014= 3.234; MNiSW = 40]
c. Flisikowska, T., Merkl, C., Landmann, M., Eser, S., Rezaei, N., Cui, X., Kurome, M.,
Zakhartchenko, V., Kessler, B., Wieland, H., Rottmann, O., Schmid, R.M., Schneider, G.,
Kind, A., Wolf, E., Saur, D., Schnieke, A. (2012). A porcine model of familial
adenomatous
polyposis.
Gastroeneterology,
143(5):1173-5.e1-7
doi:
10.1053/j.gastro.2012.07.110 [IF2012= 12.821; MNiSW = 50]
d. Leuchs, S., Saalfrank, A., Merkl, C., Flisikowska, T., Edlinger, M., Durkovic, M., Rezaei,
N., Kurome, M., Zakhartchenko, V., Kessler, B., Flisikowski, K., Kind, A., Wolf, E.,
Schnieke, A. (2012) Inactivation and inducible oncogenic mutation of p53 in gene
targeted pigs. PLoS One, 7(10):e43323. doi: 10.1371/journal.pone.0043323. [IF2012=
3.73; MNiSW = 40]
e. Flisikowska, T., Thorey, I.S., Offner, S., Ros, F., Lifke, V., Zeitler, B., Rottmann, O.,
Vincent, A., Zhang, L., Jenkins, S., Niersbach, H., Kind, A.J., Gregory, P.D., Schnieke,
A.E., Platzer, J. (2011). Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted
replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS One, 6(6):e21045. doi:
10.1371/journal.pone.0021045 [IF2011= 4.092; MNiSW = 40]
f.
Zakhartchenko, V., Flisikowska, T., Li, S., Richter, T., Wieland, H., Durkovic, M.,
Rottmann, O., Kessler, B., Gungor, T., Brem, G., Kind, A., Wolf, E., Schnieke, A. (2011).
Cell-mediated transgenesis in rabbits: chimeric and nuclear transfer animals. Biology of
Reproduction, 84(2):229-37. doi: 10.1095/biolreprod.110.087098. [IF2011= 4.009; MNiSW
= 40]
Łącznie:
•
Impact faktor: 30.208
•
punkty MNiSW: 235
Wkład wnioskodawcy w ww. publikacje obejmuje: współautorstwo hipotez i koncepcji
badań, udział w wykonaniu większości doświadczeń, analizę i opracowanie wyników oraz
napisanie manuskryptów (załączono stosowne oświadczenia współautorów).
4
5. Opis osiągnięcia naukowego wskazanego w punkcie 4 oraz we wniosku
habilitacyjnym jako znaczny wkład w rozwój nauk biologicznych w
dyscyplinie biologia.
5.1. Wprowadzenie
Zwierzęta modyfikowane genetycznie pełnią ważną role w wielu dziedzinach nauk
biomedycznych. Należą do nich badanie podłoża genetycznego chorób człowieka,
modelowanie stanów chorobowych a także wytwarzanie oraz testowanie nowych białek
enzymatycznych
czy
hormonów.
Jak
dotąd
najczęściej
spotykanymi
zwierzętami
transgenicznymi są gryzonie a zwłaszcza myszy. Badania nad myszami transgenicznymi
przyczyniły się do wielu ważnych odkryć takich jak poznanie podłoża genetycznego wielu
chorób. Jeżeli jednak przenieść płaszczyznę badań z tematyki podstawowej do klinicznej
ich przydatność znacznie maleje. Wynika to przede wszystkim z różnic anatomicznych i
fizjologicznych wstępujących pomiędzy myszą a człowiekiem. Coraz częściej ukazują się
badania wskazujące na ograniczenia związane ze zastosowaniem myszy w różnych
badaniach nauk medycznych. Przykład stanowić mogą badania dowodzące, że choroby
zapalne u myszy w niewielkim stopniu odzwierciedlają procesy zapalne u ludzi (Seok et al.,
2013). Poza tym udokumentowano różnice gatunkowe w metabolizmie leków (Martignoni et
al., 2006), patologii raka piersi (Vargo-Gogola i Rosen, 2007) czy mukowiscydozy (Guilbault
et al., 2007). W związku z powyższym istnieje silne zapotrzebowanie na opracowanie
dodatkowych modeli genetycznych u zwierząt najbardziej podobnych anatomicznie i
fizjologicznie do człowieka. Głównymi gatunkami zwierząt będących w obszarze
zainteresowań naukowców należą świnia oraz królik. Dotychczas, produkcja genetycznie
modyfikowanych świń i królików była znacznie ograniczona ze względu na brak komórek
macierzystych oraz ograniczenia techniczne związane z niską wydajnością klonowania
somatycznego. Kluczowe techniki produkcji zwierząt transgenicznych takie jak klonowanie
somatyczne (ang. nuclear transfer) czy homologiczna wymiana genów (ang. gene targeting)
choć wprowadzone ponad 10 lat temu, dopiero niedawno zostały wystarczająco
dopracowane by znalazły zastosowanie w produkcji genetycznie modyfikowanych świń czy
królików.
Obecnie
rozwój
nowych
technik
biotechnologicznych
oferuje
znaczące
uproszczenie precyzyjnej inżynierii genetycznej u ssaków. Są to techniki edytowania
genomów zwane również „molekularnym skalpelem do cięcia genomów”. Należą do nich
nukleazy z motywem palca cynkowego (anf. zinc finger nucleases, ZFN), TALEN nukleazy
(ang. transcription activator-like effector nucleases, TALENs) oraz system CRISPR/Cas9.
5
5.2. Wyniki
Króliki zaraz po myszach i szczurach należą do najczęściej wykorzystywanych
zwierząt laboratoryjnych. Dużą zaletą królików jest ich masa ciała mieszcząca się pomiędzy
rozmiarami gryzoni a zwierzętami gospodarskimi. Króliki są szczególnie użyteczne w
badaniach nad chorobą sercowo-naczyniową. Poza tym, są bardzo wrażliwe na dietę
bogatą w cholesterol i podobnie jak ludzie mogą rozwijać się u nich ciężkie postacie
hipercholesterolemii. Genetycznie modyfikowane króliki wykorzystywane są powszechnie
jako bioreaktory do produkcji białek terapeutycznych (Kind and Schnieke, 2008). Ich
zastosowanie w biomedycynie byłoby niewątpliwie bardziej powszechne gdyby u królików,
podobnie jak u myszy, dostępne były takie technologie biotechnologiczne jak homologiczna
wymiana genów umożliwiająca celowaną, w pełni kontrolowaną manipulację genomu.
Niestety ze względu na brak komórek macierzystych oraz niską wydajność klonowania
somatycznego u królików nie udało się do tej pory wprowadzić precyzyjnej modyfikacji
fragmentu DNA na drodze mutagenezy miejscowo-specyficznej. Poniżej opisuje dwie moje
prace, w których przedstawiłam technologię produkcji królików transgenicznych, w tym
przypadku dotyczącą modyfikacji genu immunoglobuliny M (IgM).
Izolacja embrionalnych i mezenchymalnych komórek macierzystych oraz ich
zastosowanie w klonowaniu somatycznym u królika.
Część moich badań skupiła się na rozwiązaniu problemu produkcji transgenicznych
królików posiadających precyzyjną modyfikację genu docelowego, spowodowanego
brakiem komórek macierzystych oraz niską wydajność procesu klonowania somatycznego.
Głównym celem tych badań była ocena przydatności komórek pluripotencjalnych
(embrionalne komórki macierzyste) oraz multipotencjalnych (mezenchymalne komórki
macierzyste) do klonowania somatycznego u królika.
Pierwszym etapem było opracowanie metody izolacji komórek macierzystych z
węzła zarodkowego blastocysty u królika. W sumie wyizolowałam 13 linii króliczych
komórek macierzystych wykazujących umiejętność samo-odnawiania (ang. self-renewal).
Dziewięć z nich zostało scharakteryzowanych w sposób szczegółowy. Wszystkie wyróżniały
się wysoką aktywnością fosfatazy alkalicznej, przy czym tylko pięć wykazało ekspresję
kluczowych genów regulujących pluripotencję: POU5F1, REX1, NANOG, TERC, NODAL,
FOXD3, DPPA5 i BMP4. Pluripotencję wyizolowanych linii testowano następnie za pomocą
zdolności tworzenia embrioidów (ang. embryoid bodies) oraz ich różnicowania. Zdolność
różnicowania w różne typy komórek zaobserwowano dla pięciu linii, które wykazały również
ekspresję genów odpowiedzialnych za regulację pluripotencji. W przypadku jednej z linii
zaobserwowano dodatkowo różnicowanie w kierunku kardiomiocytów (linia rbES-1).
6
Ostatecznym testem pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych jest ich zdolność
do tworzenia osobników zwanych chimerami. W tym celu dokonano mikroiniekcji komórek
linii rbES-1 (wyizolowane z blastocysty osobnika o umaszczeniu albinos) do zarodków
królika rasy Black Alaska (czarno umaszczone). W sumie uzyskano 20 żywo urodzonych
królików oraz jednego martwego osobnika. Tylko jeden z 20 osobników wykazał wyraźne
umaszczenie wskazujące na chimeryzm. Urodzony osobnik chimerowy wykazywał jednak
słabą żywotność w związku z czym zdolność przekazania genów z embrionalnych komórek
macierzystych potomstwu (ang. germline competence) okazała się niemożliwa. Niemniej
jednak nasza praca stanowi pierwsze doniesienie o stworzeniu królika-chimery z
embrionalnych komórek macierzystych.
W drugim etapie badań podjęto próbę izolacji mezenchymalnych komórek
macierzystych ze szpiku kostnego królika rasy Ali/Bas. Zdolności multipotencjalne
wyizolowanych komórek udowodniono poprzez ich różnicowanie w kierunku komórek kości,
chrząstki oraz tłuszczu.
Przydatność do klonowania somatycznego testowano zarówno dla embrionalnych
jaki
i
mezenchymalnych
komórek
macierzystych.
Przeprowadzone
eksperymenty
klonowania pokazały, iż komórki mezenchymatyczne okazały się znacznie wydajniejsze
jako dawca jądra somatycznego. W sumie uzyskano 8 żywo urodzonych sklonowanych
zwierząt. Następnie przeprowadzono badania mające na celu wykazanie wpływu
modyfikacji genetycznej na wydajność klonowania. W związku z tym przeprowadzono
transfekcję wektora ekspresyjnego posiadającego gen EGFP (ang. enhanced green
fluorescence
protein)
lub
mCherry
do
komórek
mezenchymalnych.
Komórki
mezenchymalne posiadajace gen EGFP lub mCherry zostały następnie wykorzystane do
klonowania. Wykazano, że genetyczna modyfikacja nie wpłynęła na zmniejszenie
wydajności procesu klonowania. Jednocześnie nasze badania przyczyniły się do stworzenia
pierwszego transgenicznego królika za pomocą metody klonowania somatycznego.
Podsumowując tę część moich badań można stwierdzić z należytą pewnością, iż
komórki mezenchymalne w przeciwieństwie do embrionalnych komórek macierzystych
mogą z powodzeniem być wykorzystywane do klonowania somatycznego u królików.
Dowodem tego są żywo urodzone sklonowane króliki włączając w to genetycznie
zmodyfikowane klony. Należy jednocześnie wspomnieć, iż sklonowane osobniki nie
przetrwały do wieku rozrodczego. Wskazuje to na konieczność określenia czynników
odpowiedzialnych za poporodową przeżywalność sklonowanych zwierząt.
Publikacja: Zakhartchenko, V., Flisikowska, T., Li, S., Richter, T., Wieland, H., Durkovic, M.,
Rottmann, O., Kessler, B., Gungor, T., Brem, G., Kind, A., Wolf, E., Schnieke, A. (2011). Cellmediated transgenesis in rabbits: chimeric and nuclear transfer animals. Biology of Reproduction
84(2):229-237.
7
Edytowanie genomu królika z zastosowaniem nukleaz z motywem palca cynkowego.
Jak wykazały wyniki moich poprzednich badań tworzenie transgenicznych królików
za pomocą techniki klonowania somatycznego, choć możliwe, wciąż obarczone jest
problemem
przeżywalności sklonowanych zwierząt. Na szczęście, rozwój technik
biotechnologicznych, takich jak edytowanie genomu, pozwalające na indukowanie mutacji w
określonym miejscu genomu znacznie przyczyniło się do przyspieszenia procesu tworzenia
genetycznie modyfikowanych zwierząt, w tym królików. Nukleazy z motywem palca
cynkowego (ang. zinc finger nucleases, ZFNs) jako pierwsze znalazły powszechne
zastosowanie w inżynierii genetycznej jako znakomite narzędzie umożliwiające precyzyjne
manipulowanie genomem wielu organizmów. Odpowiednio zaprojektowane ZFN mogą
prowadzić do pęknięcia podwójnej helisy DNA (ang. double strand break, DSB) w ściśle
określonym miejscu w genomowym DNA. W komórkach eukariotycznych podczas
odbudowy nici z wykorzystaniem jednego z dwóch szlaków naprawczych DSB dochodzi
często do przypadkowego wstawienia lub usunięcia (tzw. indele) nukleotydów w miejscu
wystąpienia pęknięcia (ang. non-homologous end joining, NHEJ). W konsekwencji powstałe
zmiany prowadzą najczęściej do inaktywacji genu (ang. knockout) lub przesunięcia ramki
odczytu (Urnov i wsp., 2010). Alternatywnym podejściem jest wprowadzenie do komórki,
donorowego DNA zawierającego homologiczną sekwencję do miejsca powstania pęknięcia
DNA. Uruchamia to wówczas mechanizm naprawy DSB na zasadzie homologicznej
rekombinacji (ang. homology recombination, HR), co prowadzi do integracji lub addycji
donorowego DNA w miejscu pęknięcia. HR umożliwia tym samym ukierunkowaną wymianę
genetyczną pomiędzy donorowym DNA a konkretnym locus chromosomalnym. Po raz
pierwszy HR indukowaną za pomocą ZFN zademonstrowano u muszki Drosophila
(Bibikowa i wsp., 2003) a następnie w komórkach ludzkich w warunkach in vitro (Urnov i
wsp., 2005, Moehle i wsp., 2007, Lombardo i wsp., 2007). Szczególnie interesujące okazały
się badania pokazujące możliwość inaktywacji genu bezpośrednio we wczesnych
zarodkach. Technikę tę z powodzeniem po raz pierwszy zastosowano u Danio rerio (Doyon
i wsp., 2008, Meng i wsp., 2008) a następnie u szczurów (Geurts i wsp., 2009, Mashimo i
wsp., 2010) i myszy (Carbery i wsp., 2010). Co więcej, niemalże w tym samym czasie
naukowcom udało się dokonać celowania genetycznego na zasadzie HR za pośrednictwem
ZFNs bezpośrednio w zarodkach myszy (Meyer i wsp., 2010) oraz szczura (Cui i wsp.,
2011). Odkrycie techniki edytowania genomu otworzyło tym samym nowe możliwości
wprowadzania precyzyjnych modyfikacji genetycznych u tych gatunków zwierząt, u których
technika klonowania somatycznego wciąż wymaga ulepszenia.
W związku z powyższym naturalnym było wypróbowanie techniki edytowania
genomu za pomocą ZFNs również u królika, bezpośrednio w zarodkach. W tym celu zostały
8
zaprojektowane dwie pary ZFNs dla eksonu pierwszego (ZFNs-E1) oraz drugiego (ZFNsE2) genu immunoglobuliny M (IgM). ZFNs w postaci mRNA zostały
wprowadzone do
zarodków (stadium przedjądrzy) królika za pomocą mikroiniekcji. W przypadku pary ZFNs
dla eksonu 1 mikroiniekcję wykonano do 267 zapłodnionych oocytów, z czego 208
zarodków
wszczepiono
samicom-biorczyniom.
Dla
pary
ZFN-E2
mikroiniekcję
przeprowadzono do 259 zapłodnionych zarodków, z czego 212 wszczepiono samicom. W
obu eksperymentach urodziło się w sumie 34 (17/eksperyment) zdrowych królików. Analiza
sekwencjonowania fragmentu genu IgM obejmującego eksony 1 i 2 wykazała obecność
mutacji w eksonie 1 u 6 spośród 17 zdrowo urodzonych królików, natomiast w eksonie 2 w
przypadku 4 osobników. Charakter mutacji był różny, włączając: delecje pomiędzy jedną
parą zasad (pz) a 25 pz, jednonukleotydowe insercje oraz kombinacje insercji i delecji (tzw.
indele). Jeden z żywo urodzonych królików posiadał również mutacje w układzie
homozygotycznym. Większość zaobserwowanych mutacji powodowała zmianę ramki
odczytu a w konsekwencji zaburzenie ekspresji genu IgM. Zwierzęta homozygotyczne w
pokoleniu F1 wykazywały całkowity brak produktu genu IgM.
Kolejnym etapem było wykazanie możliwości homologicznej wymiany genów (ang.
gene targeting) indukowanej nukleazami ZFNs bezpośrednio w zarodkach królika. W tym
celu zaprojektowano wektor do homologicznej rekombinacji – IgME1 (ang. gene targeting
vector) powodujący zamianę eksonu 1 genu IgM na kasetę PGK-neo. Tak zaprojektowany
wektor wprowadzono następnie w postaci linearnego DNA plazmidowego (pDNA) wraz z
parą ZFNs-E1 (w postaci mRNA) do zarodków, w stadium przedjądrzy, za pomocą
mikroiniekcji. W celu ustalenia optymalnych warunków mikroiniekcji, testowano różną
koncentrację pDNA oraz mRNA (ZFNs-E1). Zarodki były następnie hodowane w warunkach
in vitro do stadium blastocysty a następnie izolowano DNA do analizy w kierunku
homologicznej wymiany genów. W sumie DNA wyizolowano z 242 blastocyst, przy czym
zjawisko edytowania genu IgM na zasadzie HR zaobserwowano w 3 z nich. Najlepszą
wydajność (17% pozytywnych blastocyst, 2 blastocysty na 34 analizowane) uzyskano dla
koncentracji 9 ng/µl mRNA oraz 10-15 ng/µl pDNA. Kolejnym etapem był transfer zarodków
po mikroiniekcji DNA/mRNA do samic–biorczyń. W 15-tym dniu ciąży, wyizolowano DNA z
króliczych płodów oraz przeprowadzono analizę PCR w kierunku HR indukowanej ZFNs.
Pozytywny wynik uzyskano w przypadku 3 płodów spośród 15 analizowanych co daje
wydajność 18%. Nasza praca stanowi pierwsze doniesienie o możliwości produkcji
transgenicznych zwierząt poza gryzoniami na zasadzie celowanej, w pełni kontrolowanej
manipulacji docelowego genu z zastosowaniem najnowszej technologii w inżynierii
genetycznej jaką są syntetyczne nukleazy.
Publikacja: Flisikowska, T., Thorey, I.S., Offner, S., Ros, F., Lifke, V., Zeitler, B., Rottmann, O.,
Vincent, A., Zhang, L., Jenkins, S., Niersbach, H., Kind, A.J., Gregory, P.D., Schnieke, A.E., Platzer,
9
J. (2011). Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc
finger nucleases. PLoS One, 6(6):e21045.
Genetycznie modyfikowane świnie jako model chorób nowotworowych człowieka
Według danych szacunkowych liczba zachorowań na choroby nowotworowe w
Europie i na świecie stale wzrasta. Do najczęściej rozpoznawalnych nowotworów należą rak
jelita grubego natomiast największa liczba zgonów dotyczy raka trzustki. Obecnie, głównym
modelem zwierzęcym dla ludzkich chorób nowotworowych są genetycznie modyfikowane
myszy. Modele te choć bardzo przydatne do badań podstawowych obarczone są wieloma
czynnikami ograniczającymi możliwość ich wykorzystania w badania molekularnych na
nowotworach. Są nimi przede wszystkim niewielkie rozmiary, krótka długość życia, różnice
w fizjologii, anatomii oraz diecie w porównaniu z człowiekiem. Dlatego tez świnie jako
zwierzęta dorównujące rozmiarem, anatomią i fizjologią człowiekowi coraz częściej
rozpatrywane są jako dopełniający model w badaniach biomedycznych.
Celem naszej pracy było stworzenie genetycznie zmodyfikowanych świń, które
mogłyby stanowić lepiej odzwierciedlające modele chorób nowotworowych człowieka w
porównaniu z dostępnymi obecnie modelami mysimi. Świnia jako model dla metabolizmu
nowotworów
umożliwiłaby
bowiem
testowanie
nowych
technik
diagnostycznych
i
terapeutycznych w wymiarze zbliżonym do człowieka. Poniżej przedstawiam wyniki moich
badań mające na celu stworzenie transgenicznych świń jako modelu różnego rodzaju
nowotworów.
Świnia jako model do badań rodzinnej polipowatości gruczolakowej oraz raka jelita
Rodzinna polipowatość gruczolakowa (ang. familial adenomatous polyposis, FAP)
charakteryzuje
się
licznymi
polipami
gruczolakowatymi
jelita
grubego.
Większość
przypadków FAP wywołana jest mutacjami typu nonsens w genie APC (ang. Adenomatous
Polyposis Coli). Spontaniczne mutacje tego genu występują także w większości
przypadków nowotworu jelita grubego.
Celem tej części moich badań było stworzenie transgenicznych świń poprzez
wprowadzenie do świńskiego genu APC mutacji najczęściej spotykanych w zespole FAP u
ludzi. Są to mutacje powodujące przedwczesne pojawienie się kodonu stop w pozycji 1061
oraz 1311 (kodony ortologiczne do kodonów 1061 i 1309 u człowieka) białka APC. W tym
celu zastosowano technikę homologicznej wymiany fragmentu genu APC u świni w
komórkach somatycznych (komórki mezenchymalne) w warunkach in vitro. Komórki
posiadające wspomniane mutacje w genie APC zostały następnie wykorzystanie do
klonowania somatycznego. W efekcie otrzymano sklonowane potomstwo z mutacją w
10
pozycji 1311 (APC1311) oraz w pozycji 1061 (APC1061).
U osobnika w wieku jednego roku z mutacją APC1311 wykazano obecność licznych
polipów w stadium mało (ang. high–grade) oraz najbardziej zróżnicowanym (ang. low–grade
adenomas) zarówno w jelicie grubym jak i w esicy. Podobne rozmieszczenie polipów
obserwuje się również u ludzi z zespołem FAP, podczas gdy w mysich modelach dla FAP,
polipy występują prawie wyłącznie w jelicie cienkim. Molekularne podłoże ścieżki
patogenezy zarówno raka jelita grubego dotyczy w pierwszej kolejności mutacji jednego z
alleli APC a w następnej utratę drugiego allelu tego genu. Badania w kierunku ustalenia
utraty heterozygotyczności genu APC u świni APC1311 wykazały brak drugiej kopii genu we
wszystkich badanych polipach w stadium mało jak i najbardziej zróżnicowanym. Wyniki te
potwierdzają doniesienia wskazujące na utratę drugiej kopii genu APC w bardzo wczesnym
etapie rozwoju raka jelita grubego. Poza tym w polipach zaobserwowano silną akumulację
białka beta–kateniny zarówno w jądrze komórkowym jak i cytoplazmie, zwiększoną
ekspresję onkogenu c–MYC oraz wzmożoną fosforylację białka ERK1 oraz ERK2 (ang.
extracellular signal-related kinase) należące do rodziny MAPK (ang. mitogen-activated
protein kinase), odgrywającej role w inicjacji procesu nowotworzenia.
Reasumując, wyniki naszych badań potwierdzają, że u świni, w przeciwieństwie do
myszy wprowadzenie mutacji występującej powszechnie u ludzi z zespołem FAP oraz
sporadycznym
rakiem
jelita
grubego,
jest
wystarczającym
promotorem
procesu
nowotworzenia. Jednocześnie badania te dowodzą, iż model świni do badania FAP oraz
raka okrężnicy dokładnie odzwierciedla patologie rozwoju tego nowotworu u ludzi.
Publikacja: Flisikowska, T., Merkl, C., Landmann, M., Eser, S., Rezaei, N., Cui, X., Kurome, M.,
Zakhartchenko, V., Kessler, B., Wieland, H., Rottmann, O., Schmid, R.M., Schneider,
G., Kind, A., Wolf, E., Schnieke, A. (2012). A porcine model of familial adenomatous
polyposis. Gastroeneterology, 143(5):1173-75.e1-7. Wyprodukowanie transgenicznych świń z utajoną formą genu TP53 (TP53R167H)
Czynnik
transkrypcyjny
p53
jest
znanym
supresorem
nowotworowym
zaangażowanym w regulację bardzo ważnych procesów komórkowych takich jak
zatrzymanie
cyklu
komórkowego
w
celu
naprawy
uszkodzeń
DNA
i
indukcji
zaprogramowanej śmierci komórki. Zdolność p53 do zatrzymania wzrostu komórki jest
podstawą jego funkcji jako supresora nowotworowego. Brak normalnej funkcji p53 w
komórkach
wzmaga
procesy
nowotworzenia.
Germinalne
mutacje
genu
TP53
odpowiedzialne są za występowanie u ludzi zespołu predyspozycji do nowotworzenia
(zespół Li Fraumeni). Badania przesiewowe wykazały, iż najczęściej spotykana mutacja w
genie TP53 występuje w obrębie kodonu 175.
Celem moich badań było wyprodukowanie świń z mutacją R167H w eksonie piątym
11
genu TP53 (kodon ortologiczny do kodonu 175 u ludzi). W tym celu skonstruowano wektor
do
homologicznej
rekombinacji
zawierający
fragment
świńskiego
genu
TP53
z
wprowadzoną mutacją w eksonie piątym zmieniającą glicynę na histydynę w pozycji 167
białka. Do tkankowo-specyficznej aktywacji zmutowanego genu TP53 wykorzystano system
Cre/loxP. W intronie pierwszym genu TP53 wprowadzono kasetę STOP dla transkrypcji
otoczonej sekwencjami loxP (tzw. lox-STOP-lox kaseta). Dzięki temu zmutowana wersja
genu może zostać aktywowana tylko po wycięciu kasety lox-STOP-lox przez rekombinazę
Cre w zdefiniowanej tkance. Tak skonstruowany wektor wykorzystano następnie do
homologicznej rekombinacji w świńskich komórkach mezenchymalnych w celu zastąpienia
jednego lub obu alleli genu TP53 sekwencją zmodyfikowaną. Klony komórkowe z kasetą
lox-STOP-lox w układzie homozygotycznym, z całkowitym brakiem ekspresji genu TP53
oraz heterozygotycznym, poddane zostały analizie in vitro. Komórki homozygotyczne, w
porównaniu z klonami posiadającymi kasetę w układzie heterozygotycznym, wykazywały się
znacznie
wzmożoną
proliferacją,
charakteryzowały
się
wzrostem
niezależnym
od
zakotwiczenia (ang. anchorage independent growth) oraz odpornością na doxorubicynę,
stosowaną w medycynie jako induktora apoptozy. Wszystkie wspomniane czynniki są
charakterystyczne dla procesu transformacji nowotworowej. Poza tym, po uaktywnieniu
mutacji R167H za pośrednictwem rekombinazy Cre w komórkach tych zaobserwowano 10cio krotny wzrost ekspresji zmutowanej formy genu na poziomie białka; zjawisko
powszechnie występujące w różnych typach nowotworów u ludzi.
W celu stworzenia zwierząt transgenicznych, pozytywne heterozygotyczne klony
komórkowe zostały następnie wykorzystane do klonowania somatycznego czego efektem
było 15 zdrowo urodzonych prosiąt z utajoną formą genu TP53. Zwierzęta te mogą posłużyć
jako model do badań chorób nowotworowych zarówno germinalnych jak i spontanicznych,
w których występuje brak ekspresji genu TP53 lub jego zmutowana forma.
Publikacja: Leuchs, S., Saalfrank, A., Merkl, C., Flisikowska, T., Edlinger, M., Durkovic, M., Rezaei,
N., Kurome, M., Zakhartchenko, V., Kessler, B., Flisikowski, K., Kind, A., Wolf, E.,
Schnieke, A. (2012) Inactivation and inducible oncogenic mutation of p53 in gene
targeted pigs. PLoS One 7(10):e43323.
Uzyskanie transgenicznych świń z mutacją genu KRAS aktywowanej tkankowo
specyficznie.
Mutacje aktywujące w proto-onkogenie KRAS są jednymi z najwcześniej i
najczęściej wykrywanych mutacji w przypadku raka trzustki i wielu innych typach raka np.
płuc czy jelita grubego. Pojawienie się mutacji aktywującej genu KRAS podczas procesu
nowotworzenia wiąże się jednocześnie w każdym przypadku z gorszym rokowaniem
spowodowanym brakiem reakcji na terapie antynowotworową. Najczęściej spotykana
mutacja w genie KRAS występuje w eksonie drugim i wywołuje zamianę glicyny na kwas
12
asparaginowy w obrębie kodonu 12 białka (G12D). Mutacja ta powoduje nieprzerwany stan
aktywacji białka KRAS (związanej z GTP). Oznacza to, że w sposób ciągły wysyłany jest
sygnał do jądra komórkowego o proliferacji oraz różnicowaniu komórki, niezależnie od
obecności stymulacji zewnątrzkomórkowej.
Celem moich badań było stworzenie modelu świni z mutacją genu KRAS
aktywowanej tkankowo specyficznie do badań różnych typów raka a w szczególności raka
trzustki oraz płuc. Poza tym świnie z tą mutacją umożliwią badanie roli onkogenu KRAS w
naszym modelu dla raka jelita grubego (patrz powyżej, Flisikowska i wsp. 2012). Podobnie
jak w przypadku genu TP53 stworzono wektor z fragmentem genu KRAS z wbudowaną
mutacją w kodonie 12 (G12D). Do wektora wprowadzono również kasetę lox-STOP-lox w
celu umożliwienia aktywacji mutacji w docelowych tkankach (np. trzustce, płucach czy
okrężnicy). Homologiczną rekombinację pomiędzy wektorem a genem endogennym KRAS
przeprowadzono w komórkach mezynchemalnych izolowanych z tkanki tłuszczowej świni.
Pozytywne klony komórkowe użyto do klonowania somatycznego w efekcie czego
otrzymano transgeniczne świnie z utajoną formą genu KRAS. Komórki użyte do klonowania
przetestowano dodatkowo w warunkach in vitro pod względem możliwości aktywacji mutacji
G12D za pomocą rekombinazy Cre. Publikacja: Li S, Edlinger M, Saalfrank A, Flisikowski K, Tschukes A, Kurome M, Zakhartchenko V,
Kessler B, Saur D, Kind A, Wolf E, Schnieke A, Flisikowska T (2015). Viable pigs with a
conditionally-activated oncogenic KRAS mutation. Transgenic Research, 24(3):509-17.
Świnie z podwójnym fluorescencyjnym systemem reporterowym w genie ROSA26.
System Cre/loxP stosowany do tzw. rekombinacji miejscowo specyficznej jest
obecnie jednym z najbardziej wszechstronnych i wydajnych narzędzi inżynierii genetycznej
do wprowadzania modyfikacji genetycznych u zwierząt. Pozwala on na komórkowo
specyficzna aktywację ekspresji wybranego genu lub w wybranym czasie.
Naszym zamiarem jest pokazanie, iż technologia Cre/loxP może zostać z
powodzeniem zastosowana również u świń. System ten pozwoli w przyszłości na aktywację
mutacji onkogennych u wyżej opisanych transgenicznych świń z mutacjami genów TP53
oraz KRAS. Ważnym jest jednak, aby mieć możliwość monitorowania lokalizacji, zakresu
oraz poziomu ekspresji rekombinazy Cre. U myszy dostępnych jest wiele linii
reporterowych, które służą do tego celu. Naszym celem było więc stworzenie alternatywnej
linii reporterowej u świń.
W naszej pracy opisujemy stworzenie reporterowych świń posiadających dwa geny
reporterowe: mTomato (czerwona fluorescencja) otoczony sekwencjami loxP oraz mGFP
(zielona fluorescencja) kierowane jednym, silnym promotorem CAG. Zastosowany system
podwójnej „kasety” fluorescencyjnej umożliwia monitorowanie procesu przełączania
13
ekspresji pomiędzy mTomato a mGFP indukowanego rekombinacją Cre kierowanej
tkankowo specyficznym promotorem. Kaseta reporterowa została wprowadzona do genu
ROSA26 na zasadzie homologicznej wymiany genu. Transgeniczne świnie reporterowe
zostały stworzone za pomocą techniki klonowania somatycznego.
W pracy tej opisujemy poza tym identyfikację świńskiego genu ROSA26. Wyniki
naszych badań potwierdzają doniesienia opisane u myszy wykazujące, iż proces wymiany
homologicznej w obrębie genu ROSA26 zachodzi z dużą wydajnością. Podobnie jak u
myszy transgen wprowadzony do genu ROSA26 ulega ekspresji we wszystkich komórkach.
Opisane przez nas zwierzęta z podwójną kasetą reporterową posłużą w przyszłości
do stworzenia linii reporterowej, która umożliwi charakteryzację oraz monitorowanie
ekspresji rekombinazy Cre u zwierząt posiadających ten gen pod kontrolą promotorów
kierujących ekspresją w różnych tkankach. Zwierzęta te mogą posłużyć także do badań nad
oceną poziomu ekspresji genu Cre wprowadzanego do komórek docelowych „in vivo” za
pomocą np. wirusowej transdukcji czy transfekcji DNA. Jesteśmy przekonani, że stworzony
przez nas model reporterowy stanowi ważny oraz użyteczny wkład do inżynierii genetycznej
zwierząt gospodarskich. Pozwoli on w przyszłości na udoskonalenie techniki modyfikacji
genetycznych oraz precyzyjnej kontroli genów u świń.
Publikacja: Li, S., Flisikowska, T., Kurome, M., Zakhartchenko, V., Kessler, B., Saur, D., Kind, A.,
Wolf, E., Flisikowski, K., Schnieke, A. (2014). Dual fluorescent reporter pig for Cre
recombinase; transgene placement at the ROSA26 locus. PLoS One, 15;9(7):e102455.
5.3. Bibliografia:
Bibikova M, Beumer K, Trautman JK, Carroll D (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc
finger nucleases. Science 300: 764.
Carbery ID, Ji D, Harrington A, Brown V, Weinstein EJ, et al. (2010) Targeted Genome Modification
in Mice Using Zinc Finger Nucleases. Genetics 186: 451–459.
Cui X, Ji D, Fisher DA, Wu Y, Briner DM, et al. (2011) Targeted integration in rat and mouse embryos
with zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 29: 64–7.
Doyon Y, McCammon JM, Miller JC, Faraji F, Ngo C, et al. (2008) Heritabletargeted gene disruption
in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 26: 702–708.
Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, Zeitler B, Miller JC, et al. (2009) Knockout rats via embryo
microinjection of zinc-finger nucleases. Science 325: 433.
Guilnault C, Saeed Z, Downey GP, Radzioch D. (2007) Cystic fibrosis mouse model. Am J Respir
Cell Mol Biol. 36(1):1-7. Epub 2006, 3.
Kind A, Schnieke A. (2008) Animal pharming, two decades on. Transgenic Res. 17(6):1025-33.
Lombardo A, Genovese P, Beausejour M, Colleoni S, Lee Y, et al. (2007) Gene editing in human
14
stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat
Biotechnol 25: 1298–1306.
Mashimo T, Takizawa A, Voigt B, Yoshimi K, Hiai H, et al. (2010) Generation of knockout rats with Xlinked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS One, Jan 25;
5(1): e8870.
Meng X, Noyes MB, Zhu LJ, Lawson ND, Wolfe SA (2008) Targeted gene inactivation in zebrafish
using engineered zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 26: 695–701.
Meyer M, Hrabe´ de Angelis M, Wurst W, Kuhn R (2010) Gene targeting by homologous
recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci USA 107:
15022–15026.
Moehle EA, Rock JM, Lee Y, Jouvenot Y, DeKelver RC, et al. (2007) Targetedgene addition into a
specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc Natl Acad Sci
USA 104: 3055–3060.
Seok J, Warren HS, Cuenca AG, Mindrinos MN, Baker HV, Xu W, Richards DR, et al. (2013).
Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad
Sci USA 26;110(9):3507-12.
Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, et al. (2005) Highlyefficient endogenous
human gene correction using designed zinc-fingernucleases. Nature 435: 646–651
Vargo-Gogola T, Rosen JM. (2007) Modelling breast cancer: one siye does not fit all. Nat. Rev.
Cancer 7(9):659-72.
6. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
Moją pracę naukową rozpoczęłam w 2001 roku jako doktorantka w zespole prof. dr
hab. Marka Świtońskiego (Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Uniwersytet
Przyrodniczy w Poznaniu). W roku 2005 wyjechałam na staż podoktorski do zespołu prof.
Angeliki
Schnieke
(Katedra
Biotechnologii
Zwierząt
Gospodarskich,
Politechnika
Monachijska), gdzie zostałam zatrudniona na stanowisku adiunkta. Zebrane w tym czasie
doświadczenie naukowe, pozwoliło mi wypracować własny warsztat badawczy oraz
ukształtować oryginalne zainteresowania badawcze, które koncentrują się obecnie wokół
wykorzystania świni jako modelu zwierzęcego w badaniach biomedycznych. Moja
aktywność naukowa skupia się głównie na uzyskiwaniu zwierząt transgenicznych do badań
chorób nowotworowych u ludzi, ale także chorób układu krążenia. Innym nurtem moich
badań jest uzyskiwanie multi-transgenicznych świń dla celów ksenotransplantacji.
Na początku mojej kariery naukowej zajmowałam
się głównie badaniami
asocjacyjnymi, czyli poszukiwaniem zależności pomiędzy polimorfizmem genów a
wartościami cech ilościowych. Badania te prowadziłam na różnych gatunkach zwierząt,
takich jak bydło i świnie.
Mój projekt badawczy pracy doktorskiej obejmował badanie wpływu znanych
polimorfizmów w genach hormonu wzrostu (ang. growth hormone, GH; mutacja Leu127Val),
insulino-podobnego hormonu wzrostu typu I (ang. insulin-like growth hormone-I, IGF-I;
polimorfizm SnaBI) oraz leptyny (ang. leptin, LEP, polimorfizmy: HphI, Kpn2I oraz Sau3AI )
15
na wartości hodowlane cech produkcji mlecznej i rozrodczych buhajów wykorzystywanych
do sztucznej inseminacji. Analiza statystyczna wykazała, że tylko polimorfizm HphI
(genotypy CC, CT i TT) genu LEP miał wpływ na wartości hodowlane dla cech użytkowości
mlecznej (P<0.006). Krowy o genotypie TT charakteryzowały się dwukrotnie wyższą
wydajnością mleczną oraz zawartością białka i tłuszczu w mleku w porównaniu do krów o
genotypie CC i CT.
Część
moich
badań
polegała
również
na
poszukiwaniu
nowych
miejsc
polimorficznych zarówno w rejonach kodujących jak i promotorowych wspomnianych
genów. Tę część moich badań wykonałam we współpracy z zespołem prof. Lecha
Zwierzchowskiego (Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt w
Jastrzębcu).
W
wyniku
sekwencjonowania
zidentyfikowano
jedną
nową
mutację
(substytucja G na C, w pozycji -105) w regionie promotorowym genu LEP. Analiza in silico
za pomocą programu TESS oraz TRANSFAC wykazała obecność miejsca łączenia
czynników transkrypcyjnych (Sp1, C/EBP i HINF-1) w pozycji -105. W związku z tym
podjęto badania mające na celu wykazania wpływu tej mutacji na ekspresję genu leptyny w
wątrobie zwierząt o genotypach GG, GC oraz CC. Analiza real-time PCR wykazała, iż
zwierzęta o genotypie CC charakteryzowały się zwiększoną ekspresją w porównaniu z
osobnikami o genotypie GG. Poza tym przeprowadzono test EMSA (ang. electrophoretic
mobility shift assay) w celu zbadania efektu mutacji C/G w poz. -105 na zdolność łączenia
się czynników transkrypcyjnych. Analiza pokazała, że transwersja C na G zmniejsza
wiązanie czynników transkrypcyjnych do promotora genu leptyny, potencjalnie białka Sp1.
Poza tym, zidentyfikowano nowy polimorfizm DNA w genie IGF-2 u bydła rasy
holsztyńsko-fryzyjskiej oraz HSP70-1 u bydła rasy holsztyńsko-fryzyjskiej oraz zebu.
Wykazano wpływ mutacji indel w eksonie 6 genu IGF-2 na wartości hodowlane bydła.
W 2003 roku w trakcie mojej pracy doktorskiej otrzymałam stypendium na 5
miesięczny staż naukowy w zespole dr. Juhy Kantanen (Department of Animal Production
Research, MTT Agrifood Research Institute, Jokioinen, Finlandia). Moje badania podczas
pobytu w zespole dr. Kantanena skupiały się na analizie porównawczej polimorfizmów
genów GH, IGF-I oraz LEP w różnych prymitywnych rasach bydła pochodzącego z Polski,
państw skandynawskich (Finlandia, Norwegia, Szwecja), Rosji, Ukrainy oraz Białorusi.
Badania te wykazały istnienie znaczącego spadku różnorodności genetycznej z zachodu na
wschód wśród północno-europejskich ras bydła. Zaobserwowane zjawisko pozwoliło na
wysunięcie wniosku, że odnotowana różnorodność geograficzna jest efektem lokalnej
adaptacji do
warunków
środowiska
oraz
procesu
udomowienia. Nie
wykluczono
jednocześnie naturalnych czynników wpływających na proces ewolucji różnych ras bydła.
Załącznik nr 4, pozycje: II.A.10, II.A.11, II.A.12, II.A.13, II.A.14, II.A.15.
16
Po ukończeniu pracy doktorskiej nadal kontynuowałam współpracę z zespołami
Prof. Świtońskiego skupiającą się na poszukiwaniu nowych polimorfizmów DNA w genach,
które potencjalnie mogłyby mieć wpływ na wartości hodowlane i
produkcyjne zwierząt
gospodarskich.
Współpraca ta zaowocowała wydaniem dwóch publikacji w czasopismach z listy
filadelfijskiej. W pierwszej z nich opisano identyfikację siedmiu nowych polimorfizmu w
obrębie sekwencji promotorowej genu adiponektyny (ADIPOQ). Analiza asocjacyjna
wykazała korelację dwóch z nich, a mianowicie mutacji c.-67G>A oraz 16-nukleotydowej
mutacji typu indel z masą mięśnia najdłuższego grzbietu w rasie świń polskiej białej
zwisłouchej oraz syntetycznej linii 990. Ponadto za pomocą testu lucyferazy wykazano, iż
zidentyfikowana mutacja typu indel zmienia aktywność promotorową genu ADIPOQ. Pomiar
ekspresji genu lucyferazy był większy w przypadku sekwencji promotorowej z insercja 16-to
nukleotydową w porównaniu z sekwencją posiadającą delecję
W naszej drugiej pracy dzięki badaniom sekwencjonowania porównawczego
różnych ras świń (polska biała zwisłoucha, polska biała duża, Duroc, Pietrain oraz
puławska) udało się zidentyfikować dziewięć nowych polimorfizmów w rejonie 3’-UTR genu
PPARA. Analiza in silico badanego fragmentu genu PPARA wykazała obecność miejsc
wiązania dla sześciu potencjalnych microRNA. Dodatkowo stwierdzono, iż mutacja
c.636A>G znajduje się w obrębie miejsca wiązania dla miR-224. W związku z tym podjęto
analizę wpływu owej mutacji na wiązanie miR-224 za pomocą testu lucyferazy. Wykazano,
że miR-224 może działać jako negatywny regulator ekspresji genu PPARA w procesie
adipogenezy u świń. Z drugiej jednak strony nie zaobserwowano różnic w wiązaniu miR-224
do sekwencji 3’-UTR genu PPARA z wariantem A i G. W związku z tym wysunięto hipotezę,
iż dwa dominujące haplotypy występujące u świń różniące się w czterech pozycjach
badanego odcinka genu PPARA (włączając mutację c.636A>G) mogą powodować zmianę
konformacji w rejonie 3’-UTR tego genu a tym samym wpływać na jego ekspresję. Poza tym
wykazano wpływ mutacji c.636A>G na grubość słoniny oraz zawartość tłuszczu
międzymięśniowego u świń rasy polskiej białej zwisłouchej. Reasumując można stwierdzić,
iż mutacja c.636A>G genu PPARA może znaleźć zastosowanie jako marker genetyczny dla
cech otłuszczenia u świń rasy polskiej białej zwisłouchej.
Załącznik nr 4, pozycje: II.A.4, II.A.8.
W roku 2005 dołączyłam do zespołu prof. Angeliki Schnieke. Głównym celem badań
grupy jest uzyskiwanie genetycznie modyfikowanych zwierząt, głównie świń do badań
różnych chorób u ludzi oraz dla celów ksenotransplantacji. W zespole tym jestem
zaangażowana w projekty mające na celu uzyskanie transgenicznych świń posiadających
mutacje, które u ludzi znane są jako zwiększające ryzyko wystąpienia chorób
17
nowotworowych oraz chorób układu krążenia. Moim zadaniem jest także wprowadzanie
nowych technologii umożliwiających skuteczniejsze uzyskiwanie transgenicznych zwierząt
gospodarskich. Należą do nich ZFNs, TALENs oraz CRISPR-Cas9. Część wyników tych
badań została uwzględniona jako mój dorobek naukowy do habilitacji. Poza tym
opublikowałam trzy artykuły przeglądowe z dziedziny zastosowania świń do badań różnych
chorób człowieka.
Załącznik 4, pozycje: II.A.2, II.A.6, II.A.7
Jestem również zaangażowana w projekt mający na celu stworzenie modelu świni
do badań chorób układu krążenia u ludzi. Choroby układu krążenia należą do najczęściej
występujących chorób na całym świecie. Proces starzenia się jest nieodzownym czynnikiem
zwiększającym ryzyko zachorowalności na choroby związane z układem krążenia. Obecnie
istnieje kilka mysich modeli odzwierciedlających proces starzenia się oraz związanych z tym
chorób serca. Większość z nich posiada inaktywację genu ERCC1. Naszym celem jest
stworzenie adekwatnego modelu świni poprzez wprowadzenie dwóch mutacji w świńskim
genie ERCC1. Jedna z nich polega na wprowadzeniu przedwczesnego kodonu stop w
eksonie
10
genu
czego
wynikiem
jest
powstanie
krótszego
białka
ERCC1
charakteryzującego się obniżoną aktywnością. Druga mutacja ma charakter tkankowo
specyficzny i polega na całkowitej inaktywacji jednego allelu genu ERCC1 (ang. conditional
gene knockout). W celu osiągnięcia inaktywacji allelu ERCC1 w docelowych tkankach (np.
w sercu) zastosujemy system Cre/loxP. Pozwoli to na wywołanie symptomów związanych z
procesem starzenia się wyłącznie w danej tkance.
Od 2012 roku jestem kierownikiem interdyscyplinarnego projektu badawczego
wykonywanego w ramach konsorcjum naukowego “Biology of xenogenic cell, tisse and
organ transplantation – from bench to bedside” finansowanego przez Niemiecką Fundację
Naukowa (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). Głównym założeniem konsorcjum jest
możliwość wykorzystania organów świńskich do ksenotransplantacji. Program badawczy
mieści się w obrębie trzech głównych celów: A) zrozumienia i wyjaśnienia procesów
regulujących odpowiedź immunologiczna kseno-organów B) produkcji transgenicznych świń
posiadających transgeny chroniące przeszczepiane organy przed aktywacją komórek
śródbłonka, wystąpieniem stanu zapalnego, zakrzepicy oraz odrzutu immunologicznego C)
przedklinicznej i klinicznej ksenotransplantacji. Głównym celem naszego projektu jest
uzyskanie tzw. „kseno-świń” posiadających wiele modyfikacji genetycznych pozwalających
na ochronę organu przed procesem odrzutu nadostrego, osrego i przewlekłego. W
pierwszym etapie naszej pracy uzyskaliśmy multi-transgeniczne świnie z wysoką ekspresją
transgenów ludzkich genów układu dopełniacza: CD46, CD55, CD59. Świnie te posiadają
dodatkowo ludzki gen A20 oraz HO1, których ekspresja chroni dodatkowo przed rozwojem
18
stanu zapalnego oraz zakrzepicy. Poza tym, za pomocą technologii CRISPR-Cas9 z
powodzeniem udało się nam deaktywować geny GGTA1 oraz CMAH, które u ludzi w trakcie
ewolucji uległy mutacjom, efektem których była utrata aktywności produktów białkowych
tych genów.
Nasz zespół stale współpracuje z grupą prof. Eckharda Wolfa (Ludwig-Maximilian
Universität in München), który to posiada ogromne doświadczenie w dziedzinie klonowania
somatycznego zwierząt gospodarskich włączając bydło, króliki oraz świnie. Klonowanie
somatyczne choć po raz pierwszy z powodzeniem zastosowane ponad 10 lat temu wciąż
pozostaje mało wydajną techniką uzyskiwania klonowanych zwierząt a zwłaszcza świń.
Dlatego też razem z zespołem prof. Wolfa podjęliśmy próbę identyfikacji czynników
wpływających na wydajność procesu klonowania somatycznego. Pod uwagę wzięto
sezonowość, jakość sklonowanych zarodków, liczbę seryjnych transplantacji jąder, typ
komórek użytych jako dawcy jąder oraz rodzaj modyfikacji genetycznej. Ogólna wydajność
klonowania dla wszystkich eksperymentów wyniosła 3.95%. Eksperymenty klonowania
somatycznego z użyciem fibroblastów izolowanych z nerek oraz płodów, przeprowadzone w
okresie zimowym przyniosły najlepsze wyniki, charakteryzujące się największą liczbą
zdrowo urodzonych prosiąt. Sądzimy, że wyniki naszych badania przybliżyły nas do
zidentyfikowania najważniejszych czynników wpływających na efektywność procesu
klonowania somatycznego u świń.
Załącznik 4, pozycje: II.A.9.
Jako, że posiadam obszerną wiedzę w dziedzinie projektowania wektorów do
transgenezy
Monachijskiej.
współpracuje
Pomagam
również
często
w
z
innymi
grupami
projektowaniu
oraz
badawczymi
konstruowaniu
Politechniki
wektorów
ekspresyjnych pozwalających na syntezę kodowanego białka. Współpraca moja z grupą
prof. Luksch’a z Katedry Zoologii zaowocowała publikacją dotyczącą możliwości
monitorowania aktywności neuronalnej w zarodkach kurzych poprzez znakowanie eGFP
(ang. enhanced green fluorescence protein).
Załącznik 4, pozycja: II.A.3
Od roku 2009, zespół nasz współpracuje z fińską grupą badawczą kierowaną przez
prof. Magnusa Andersona (Veterinary Clinic of the University of Helsinki). Główny nurt
naszych
wspólnych
badań
koncentruje
się
na
genetycznym
podłożu
problemów
rozrodczych u bydła. W ramach tej współpracy zaangażowana byłam w projekt badawczy
dotyczący problemu zwiększonej liczby poronień u krów po sztucznej inseminacji z
wykorzystaniem buhaja YN51. Grupa ta w swoich poprzednich badaniach zidentyfikowała
mutację przyczynową związaną z zamieraniem płodów u bydła, a mianowicie delecję około
19
110 kpz w obrębie genu MIMT1. Poza tym, wykryto również znaczny wzrost poziomu
globalnej metylacji w płodowej części łożyska u ciężarnych krów z płodami z zaburzonym
wzrostem, o genotypie MIMTdel/WT. W związku z tym podjęto dalszą badania mające na celu
zbadanie
poziomu
metylacji
wysp
CpG
w
obrębie
genu
MIMT1.
Wykonane
sekwencjonowanie po reakcji z wodorosiarczynem (ang. bisulfite sequencing) wykazało
hypometylację regionu promotorowego genu MIMT1, oraz hypermetylacje na końcu 3’. Dla
badanego fragmentu genu MIMT1 na końcu 3’ wykryto statystycznie istotne różnice
pomiędzy poziomem metylacji u osobników o genotypie MIMT1del/wt (100%) i MIMT1wt/wt
(89,4%; P < 0.001). Szczegółowa analiza fragmentu na końcu 3’ wykazała występowanie
niestandardowej formy metylacji, a mianowicie
trinukleotydowych powtórzeń CAG.
Dodatkowo wykryto, że metylowana wersja CAG występuje w łożysku jedynie u
najmłodszych płodów o genotypie MIMT1del/wt. U ssaków, do tej pory występowanie
metylacji w kontekście innym niż CpG opisane zostało głównie w komórkach macierzystych.
Nasze badania jako pierwsze wskazały na znaczenie funkcjonalne metylacji non-CpG.
Załącznik 4, pozycja: II.A.5.
Istotny postęp w dziedzinie izolowania komórek macierzystych u myszy oraz
zastosowanie po raz pierwszy technologii homologicznej wymiany genów przyczynił się do
uzyskania nieograniczonej niemal liczby mysich modeli oraz poznania funkcji wielu genów.
Ukoronowaniem osiągnięć z tej dziedziny nauki było wręczenie nagrody Nobla naukowcom
zaangażowanym w prace badawcze nad komórkami macierzystymi oraz homologiczna
rekombinacją.
Oczywistym
jest,
iż
możliwość
rozszerzenia
tej
technologii
na
zwierzęta
gospodarskie znalazłaby szerokie zastosowanie. Do tej pory, pomimo wielu prób, niestety
nie udało się opracować skutecznej metody izolacji komórek macierzystych u zwierząt
gospodarskich.
Genetycznie
modyfikowane
zwierzęta
na
drodze
homologicznej
rekombinacji mogą być obecnie uzyskiwane poprzez klonowanie somatyczne. Technologia
ta wciąż obarczona jest jednak problemem niskiej wydajności. Alternatywą może wkrótce
okazać
się
niedawno
wprowadzona
nowa
technologia
inżynierii
genetycznej
z
zastosowaniem techniki „molekularnego cięcia genomu” bezpośrednio w zarodkach. W
jednej z naszych prac, uwzględnionej do dorobku habilitacyjnego (patrz, paragraf 5
„Edytowanie genomu królika z zastosowaniem nukleaz z motywem palca cynkowego”)
pokazaliśmy, iż technologia ta z powodzeniem może być stosowana u królików.
Rozszerzenie tej technologii do świń wydaje się jednak wciąż trudne. Spowodowane jest to
faktem, iż wydajność metody hodowli zarodków świńskich w warunkach in vitro wciąż
pozostaje niska. Jednym z ważniejszych kryteriów tej techniki jest opracowanie wydajnej
metody dojrzewania oocytów świńskich w warunkach in vitro. W tym celu opracowaliśmy
20
nową, nieinwazyjną metodę oceny jakości kompleksów kumulus-oocyt izolowanych z
jajników świń. Polega ona na ich wybarwieniu barwnikiem lissamine green B co pozwala na
szybka selekcję oocytów dobrych jakościowo do zapłodnienia in vitro.
W tym kontekście, doświadczenie w dziedzinie izolacji oraz hodowli oocytów
bydlęcych oraz świńskich, jakie zdobyłam podczas wykonywania mojej pracy magisterskiej
okazało się tu bardzo przydatne. Ponadto wyniki badań uzyskane podczas mojej pracy
magisterskie zostały uwieńczone dwiema publikacjami. W pierwszej z nich prezentowane
są wyniki dotyczące badania wpływu polimorfizmu w genie GH na produkcję zarodków
bydlęcych uzyskanych techniką dojrzewania i zapłodnienia in vitro. W drugiej natomiast
prezentowane są wyniki dotyczące wpływu tego polimorfizmu na proces rozwoju zarodków
do stadium blastocysty.
Załącznik 4, pozycje: II.A.1, II.A.16, II.A.17.
Freising, 7 stycznia 2016 r.
21

plik PDF - Wydział Biologii i Biotechnologii

Transkrypt

Podobne dokumenty

Ćwiczenie 5-6 Baza PUBMED i OMIM (użycie MapViewer)

Praca kontrolna