Wyniki fałszywie pozytywne w PCR! Jak się przed nimi bronić? (II

O wypadaniu włosów u kobiet
Łysienie jest postrzegane raczej jako dolegliwość dotykająca mężczyzn, co
samo w sobie stanowi rażące uproszczenie. Okazuje się, że 40%
mieszkańców Stanów Zjednoczonych, którzy borykają się z problemem
nadmiernego wypadania włosów, to właśnie kobiety. Istnieje szereg
czynników wpływających na utratę włosów u kobiet. Zjawisko może mieć
charakter nie tylko sezonowy, ale także okazać się poważnym problemem
zdrowotnym, estetycznym oraz emocjonalnym.
Stopniowa utrata włosów jest to niezwykle trudny czas dla kobiet, które w
zupełnie inny sposób podchodzą do problemu. Mężczyzna często pozostaje
wyprostowany, z dumnie podniesioną, chociaż łysą głową. Taka opcja wydaje się
być mało prawdopodobna w przypadku płci pięknej. Termin medyczny „łysienie”
(łac. alopecia) określa nadmierną lub nieprawidłową utratę włosów skóry głowy.
Za głównego winowajcę uważa się pochodną testosteronu, dihydrotestosteron
(DHT) i jego wiązanie się do receptorów w mieszkach włosowych skóry głowy, co
powoduje ich obkurczenie oraz brak możliwości przetrwania zdrowego włosa.
Ratunku! Łysieję!
Zaobserwowanie własnych włosów na brzegu umywalki, prysznica, poduszce czy
innych miejscach nie zawsze powinno wiązać się z obawą przed łysieniem.
Każdego dnia fizjologicznie tracimy od 25 do 100 włosów znajdujących się w fazie
telogenowej (podczas mycia nawet do 200). Czas trwania fazy anagenowej
decyduje o długości włosa. Dzięki zjawisku wzrostu asynchronicznego włosów na
głowie i tym samym równoczesnego występowania różnych faz wzrostu nie
dochodzi do wypadania wszystkich włosów w tym samym czasie.
O pojawieniu się problemu możemy mówić, gdy ubywa ponad 100 włosów
dziennie i trwa to dłużej niż kilka tygodni.
Na wzrost włosów wpływają androgeny (testosteron inicjuje wzrost, zwiększa
średnicę i pigmentację włosa), estrogeny (prowadzą do ścieńczenia i odbarwienia
włosa) i progestageny (niewielki wpływ). The American Hair Loss Association
sprecyzowało możliwe przyczyny utraty włosów przez kobiety. Należą do nich
uwarunkowania genetyczne, stres, zmiany w mieszkach włosowych, niektóre
środki farmakologiczne, palenie papierosów i wiele innych [1, 5, 6].
Łysienie androgenowe
U kobiet ten typ łysienia zależy od poziomu androgenów i polega zazwyczaj na
przerzedzeniu się włosów rozpoczynając się od czubka głowy z pozostawieniem
grzywki. Przyczyną może być wiele czynników związanych ze zwiększonym
stężeniem androgenów takich jak choroby przysadki mózgowej, zespół
policystycznych jajników, guzy produkujące androgeny, otyłość czy
hiperandrogenizm idiopatyczny. Istotnym czynnikiem jest tu także dziedziczność
[1, 2, 4].
Telogenowe wypadanie włosów (TE)
W pewnych stanach organizmu włos może przejść nagle z fazy wzrostu (faza
anagenowa) czy fazy inwolucji (faza katagenowa) do fazy spoczynkowej (faza
telogenowa). Okres ten wynosi od 6 tygodni do 3 miesięcy od wystąpienia
czynnika stresogennego, takiego jak na przykład urodzenie dziecka, ostra
infekcja, nowotwory, zaburzenia hormonalne (zarówno niedoczynność jak i
nadczynność tarczycy), niektóre leki (przeciwzakrzepowe, beta-adrenolityki, leki
zmniejszające stężenie lipidów, leki przeciwdrgawkowe, cytostatyki), zatrucia
metalami ciężkimi, duży stres czy niedożywienie. W pełni rozwinięte TE może
nieraz wiązać się z utratą garści włosów. Uzyskanie remisji możliwe jest tak
długo, jak unika się czynników, które wywołały łysienie. Czasami znalezienie
przyczyny łysienia jest bardzo trudne lub niemożliwe [1, 7].
Anagenowe wypadanie włosów
Ten typ utraty włosów wynika z upośledzenia aktywności mitotycznej lub
metabolicznej mieszków włosowych. Jest to rzadka, nagła utrata włosów
dystroficznych, zwykle po zadziałaniu czynnika toksycznego na mieszki włosowe.
Dobrym przykładem wydaje się tu być chemioterapia, przy której leki działają na
szybko proliferujące komórki — także mieszków włosowych w fazie anagenowej.
Po chemioterapii można utracić ponad 90% włosów. Charakterystyczne są tutaj
zmiany polegające na miejscowym zwężaniu się łodygi włosa, co w konsekwencji
prowadzi do łamania się i wypadania. Innymi czynnikami przyczynowymi mogą
być zatrucia metalami ciężkimi, retinoidy, promieniowanie X, zatrucia roślinami
tropikalnymi i toksynami zwierzęcymi [1].
Łysienie „z ucisku”
Okazuje się, że ciasne upięcie włosów przez długi okres czasu może także
prowadzić do ich utraty. Wynika to ze wstrząsu mechanicznego, dotyczącego
mieszków włosowych, które są ciągnięte przez upięcia typu ciasny tak zwany
„koński ogon” czy warkocz. Wczesne wykrycie zmian pozwala na odrośnięcie
włosów. Podobne zmiany obserwuje się u osesków. W tym przypadku wynikają
one z ucisku okolicy potylicznej przy leżeniu [1, 3, 4].
Leki a łysienie
Ulotki informacyjne niektórych leków uwzględniają wypadanie lub przerzedzanie
się włosów jako efekt uboczny działania związków chemicznych. Wielu kobiet ten
problem nie dotyczy, niemniej jednak dla części jest to problem powszechny i
możliwy do przewidzenia. Wśród środków o takim działaniu można wymienić:
— leki przeznaczone do leczenia trądziku i innych schorzeń (izotretinoina —
Accutane)
— antykoagulanty (sól sodowa warfaryny — Panwarfarin, Sofarin, Coumadin,
heparyna)
— leki obniżające poziom cholesterolu we krwi (klofibraty — Atronid-S,
gemfibrozil — Lopid)
— leki przeciwdrgawkowe (trimetadon — Tridone)
— wiele leków antydepresyjnych (przykładowo hydrochlorek fluoksetyny —
Prozac, imipramina — Janimine, Tofranil, nortryptylina — Pamelor, Ventyl,
haloperidol — Haldol)
— amfetaminę
— środki przeciwgrzybicze
— beta-blokery w leczeniu jaskry (krople do oczu zawierające tymolol)
— środki w leczeniu dny moczanowej (allopurinol — Lopurin, Zyloprim)
— leki obniżające ciśnienie krwi i dbające o mięsień sercowy (atenolol —
Tenormin, metoprolol — Lopressor, nadolol — Corgard, propranolol — Inderal,
tymolom — Blocadren)
— wszystkie leki hormonalne, ponieważ mają one potencjalny wpływ na utratę
włosów (tabletki antykoncepcyjne, hormonalna terapia zastępcza, androgeny,
sterydy anaboliczne, Prednizon)
— leki przeciwzapalne stosowane przy bólu miejscowym, poceniu się, zranieniach
(NLPZ, leki na artretyzm, naproksen, indometacyna) oraz stosowane w
chemioterapii (metotreksat — Methotrexate, Rheumatex, Folex)
— leki w terapii choroby Parkinsona (lewodopa)
— wiele leków stosowanych w zaburzeniach tarczycy
— środki farmakologiczne stosowane w leczeniu wrzodów trawiennych, w tym
także leki sprzedawane bez recepty (ranitydyna — Zantac, famotydyna- Pepcid,
cymetydyna — Tagamet) [1, 4, 7].
Trichotillomania
Warto wspomnieć także o nawykowym, przymusowym wyrywaniu włosów zwanym
trichotillomanią. Dotyczy on osób znajdujących się pod wpływem stresu lub
pacjentów z zaburzeniami psychicznymi. Działanie jest niekontrolowane.
Nawykowe wyrywanie włosów wykazuje dwukrotnie większą częstotliwość
występowania u kobiet niż u mężczyzn [3].
Co i jak badać?
Przyczyn wypadania włosów u kobiet może być znacznie więcej niż u mężczyzn,
u których dominujący jest czynnik genetyczny.
W związku z powyższym diagnostyka jest dość złożona. Stosuje się kilka metod
diagnostycznych [1, 2, 5].
Diagnostyka oparta o badania krwi:
— poziom hormonów takich jak: DHEA, testosteron, androstendion, prolaktyna,
folikulotropina oraz lutropina
— poziom żelaza w surowicy
— poziom ferrytyny w surowicy
— poziom TIBC (ang. total iron binding capacity)
— poziom hormonów tarczycowych
— VDRL (test w kierunku kiły)
— morfologia
Metody alternatywne:
— biopsja skóry głowy
— określenie intensywności utraty włosów przez test ciągnięcia za włosy
— densytometria
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Włosy pełnią wiele istotnych dla organizmu funkcji. Chronią one przed czynnikami
zewnętrznymi a także odbierają i przekazują bodźce seksualne. Włosy usytuowane
na głowie stanowią ważny element wyglądu zewnętrznego, uzyskując u kobiet
znaczenie psychospołeczne. Utrata tak kluczowego dla wielu kobiet czynnika
atrakcyjności może nieść ze sobą nieprzyjemne implikacje.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Piśmiennictwo:
1. Dane The American Hair Loss Association.
2. Sobstyl M., Tkaczuk-Włach J., Jakiel G. Diagnostyka hormonalna łysienia kobiet.
Przegl Menopauzalny, 2010; 1: 52–55.
3. Lis-Święty A., Wcisło-Dziadecka D., Wyględowska-Kania M. The most common
diseases of scalp in childhood. Post Dermatol Alergol, 2009; XXVI, 5: 257–269
4. Camacho-Martínez FM. Hair loss in women. Semin Cutan Med Surg, 2009; 28,
1: 19-32.
5. Blume-Peytavi U., Vogt A. Androgenetic alopecia : Diagnosis and therapy- a
current review. Hautarzt, 2013; 64, 11: 820-829.
6. Trüeb RM. Association between smoking and hair loss: another opportunity for
health education against smoking? Dermatology, 2003; 206, 3: 189-191.
7. Patel M., Harrison S., Sinclair R. Drugs and hair loss. Dermatol Clin, 2013; 31,
1: 67-73.
Lipemia w próbce
Lipemia może stwarzać problemy diagnostyczne, wprowadzając zakłócenia
w oznaczenia niektórych parametrów. W wielu przypadkach wpływ ten jest
minimalny. Często dopiero lipemia o dużym nasileniu wywiera wpływ na
pomiar poszczególnych parametrów, przy czym wiele zależy od metody
oznaczeń.
W wyniku wzrostu zawartości lipoprotein osocze i surowica mogą stać się mętne.
Obserwuje się różne nasilenie tego zjawiska od lekkiego zmętnienia, aż po
mleczne. W większości przypadków jest ono wynikiem wzrostu stężenia
trójglicerydów, niemniej jednak zależy także od obecności wielkocząsteczkowych
lipoprotein. W praktyce laboratoryjnej próbki o mętnym osoczu/surowicy
określane są jako lipemiczne.
Kiedy zobaczę zmętnienie?
Istotne zmętnienie widoczne jest makroskopowo. Niemniej jednak istnieje
możliwość określenia zmętnienia przy wykorzystaniu pomiaru absorbancji,
zazwyczaj przy długości fali w zakresie od 660 do 700 nm.
Poziom trójglicerydów związany ze zmętnieniem badanej próbki w dużej mierze
zależy od składu lipoprotein. Chylomikrony posiadają zdolność załamywania
światła (ze względu na wielkość cząsteczki) i ich obecność może być widoczna już
przy poziomie trójglicerydów poniżej 300 mg/dl. Tymczasem lipoproteiny o
pośredniej gęstości (IDL) oraz niskiej gęstości (LDL) nawet przy stężeniu
trójglicerydów 800 mg/dl mogą nie wywoływać widocznego zmętnienia. W
przypadku lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL) zmętnienie próbki może
mieć różne nasilenie w zależności od rozmiaru i budowy cząsteczki.
Stwierdziłem lipemię w próbce.. co dalej?
Stwierdzenie lipemii powinno zostać udokumentowane, odpowiednia informacja
umieszczona na wyniku, a próbka przechowana do ewentualnej weryfikacji. W
każdym laboratorium procedury postępowania w takim przypadku powinny być
częścią standardowych procedur operacyjnych (SOP). Co więcej wpływ lipemii
powinien być badany przez producentów odczynników, a informacja o wpływie
zjawiska na oznaczenie umieszczona w instrukcji poszczególnych zestawów
odczynnikowych.
Lipemia może odgrywać ważną rolę kliniczną. Surowica osób zdrowych nie jest
lipemiczna, za wyjątkiem zjawiska przejściowego wynikającego ze spożycia
posiłku bogatego w tłuszcze. Lipemia może zatem wskazywać na stany
patologiczne takie jak przykładowo hipertriglicerydemia wynikająca ze wzrostu
poziomu chylomikronów, VLDL, bądź też obydwu wymienionych. Dzięki metodzie
flotacji możliwe jest odróżnienie powyższych zjawisk. Jeżeli po przechowywaniu
badanego materiału przez co najmniej 12 godzin w temperaturze lodówki (od 4 do
6 st.C) na powierzchni utworzył się gruby kożuch, natomiast surowica jest
klarowna, świadczy to o obecności chylomikronów. Jeżeli jednak po odwirowaniu
próbki nadal utrzymuje się zmętnienie, w większości przypadków wynika ono ze
wzrostu poziomu VLDL [1, 4].
Dlaczego należy unikać próbek lipemicznych?
Lipemia może być czynnikiem zakłócającym pomiar różnych analitów.
Zafałszowanie wyników pomiarów może wynikać z:
– niejednorodności próbki
– interferencji spowodowanej zmętnieniem
– interferencji fizykochemicznej
– zmian zawartości wody osocza
Przechowywanie i wirowanie próbki może wpłynąć na niejednorodność
rozmieszczenia trójglicerydów i innych badanych parametrów, ze względu na
zjawisko flotacji z tym związane. W górnej warstwie próbki można zaobserwować
wysoki poziom lipidów i spadek zawartości wody osocza. Taki zmiany mogą
znacząco wpłynąć na oznaczenia substancji rozpuszczalnych w wodzie osocza.
Prowadzi to do zafałszowania wyników pomiarów składników lipidowych,
elektrolitów czy białka całkowitego. Wiadomo, że zmniejszenie zawartości wody
osocza może zawyżać poziom sodu i potasu oznaczanych metoda
potencjometryczną ( w porównaniu do fotometrii płomieniowej). Co więcej,
zmętnienie ma istotny wpływ jako czynnik zakłócający pomiar absorbancji.
Ponadto substancje litofilne mogą wiązać się z lipoproteinami próbki. Wpływa to
na zmniejszenie dostępności dla przeciwciał w testach immunochemicznych.
Lipoproteiny interferują również w oznaczenia elektroforetyczne i
chromatograficzne [1, 3, 4]. Producent danego testu ściśle określa czynniki
zakłócające pomiar.
Jak zminimalizować efekt lipemii?
Trójglicerydy można usunąć poprzez ultrawirowanie lub precypitację, po czym
wykonać pomiar w klarownej próbce. Niemniej jednak należy uwzględnić fakt, iż
sam proces usuwania lipidów może prowadzić do wystąpienia interferencji.
Czasami wprowadza się zmiany metodologiczne polegające na pomiarze
różnicowym (przy dwóch długościach fali). Innym sposobem jest odjęcie od
absorbancji próby badanej, absorbancji próby ślepej, zawierającej materiał
badany bez odczynnika [1, 3].
Na jakie oznaczenie zwrócić uwagę?
Przede wszystkim informacja o wpływie lipemii na oznaczenie poszczególnych
parametrów umieszczona w instrukcji zestawów odczynnikowych, stąd też należy
się z nią zapoznać. Przykładowo lipemia wpływa na oznaczenie poziomu Ddimerów metodą ELISA i immunoturbidymetryczną, fosfor, białko całkowite,
wapń, kreatyninę równocześnie nie wywierając znaczącego wpływu na oznaczenie
bilirubiny całkowitej czy glukozy[2, 4].
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Lipemia jest istotną zmianą w przejrzystości badanej próbki, w wielu przypadkach
zmieniającą wynik badania laboratoryjnego. Nie należy zatem zapominać o
dokładnych oględzinach makroskopowych pobadanych próbek, odpowiednich
działaniach zaradczych i weryfikacyjnych oraz odnotowaniu faktu pojawienia się
lipemii na wyniku, bowiem taka informacja może się stać cenną wskazówką dla
lekarza prowadzącego pacjenta.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Piśmiennictwo:
1. Guder WG. et al. Samples: From the Patient to the Laboratory: The Impact of
Preanalytical Variables on the Quality of Laboratory Results. Weinheim, 2008;
Wyd. Wiley.
2. Riley RS. D-dimer assays. Dep of Pathology, 2005.
3. Walker PL, Crook MA. Lipaemia: causes, consequences and solutions. Clin
Chim Acta, 2013; 15, 418: 30-32.
4. Calmarza P., Cordero J. Lipemia interferences in routine clinical biochemical
tests. Biochem Med, 2011; 21, 2: 160-166.
Wyniki fałszywie pozytywne w
PCR! Jak się przed nimi bronić?
(II)
„Kontaminacja” to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku
każdego biologa molekularnego. Przypadkowe przeniesienie produktu
PCR na blaty, plastiki lub sprzęt laboratoryjny może zamienić życie
pracowników laboratorium w koszmar na długie tygodnie. Jak nie
dopuścić do tej sytuacji? W części pierwszej przestawiłam podstawowe
sposoby na uniknięcie fałszywych pozytywów i obnażyłam słabości lamp
UV. Dziś przedstawiam Wam rozwiązania , które można zastosować, jeśli
już kontaminacja nam się zdarzyła.
1. Na kłopoty… wybielacz
W pierwszej części tego dwuodcinkowego cyklu wspominałam, że pomieszczenie
w którym pracować będziemy z produktami PCR powinno być odporne na
utleniacze. Co konkretnie miałam na myśli? Żeby pozbyć się DNA najprościej jest
je chemicznie unieszkodliwić. Są na to dziesiątki sposobów, a jak zwykle najlepsze
są te najtańsze i znane z naszych gospodarstw domowych.
*
W literaturze spotykamy różne pomysły na dekontaminację, prym wiedzie
HCl i mieszaniny kwasu z rozmaitymi substancjami (np.glicyną)
wspomagającymi. HCl 1M obniża pH do tego stopnia, że indukuje depurynację
i hydrolizę DNA. Gorący kwas solny z glicyną jest szczególnie polecany do
dekontaminacji końcówek pipet, jednak mycie nim większych powierzchni jest
kłopotliwe. Poza tym kwaśna hydroliza wymaga albo podwyższonej
temperatury, albo długiego czasu ekspozycji. Dlatego nie jest polecana do
ogólnych zastosowań.
*
DNA ulega hydrolizie także pod wpływem środków do sterylizacji i
dezynfekcji wysokiego stopnia, takich jak tlenek etylenu i gazowy formaldehyd
oraz aldehyd glutarowy. Jednakże tych związków każdy z nas chciałby unikać
jak ognia- uwierzcie na słowo. Są to środki bardzo korozyjne i niebezpieczne
dla błon śluzowych, używane w celu całkowitej eliminacji patogenów np. z
materiałów i narzędzi chirurgicznych. Nie wiem, czy gdziekolwiek stosuje się
rutynowo te środki (może poza formaldehydem, znam osobę która używa tej
nad wyraz nieprzyjemnej substancji).
*
Dostępne w katalogach niektórych firm produkujących odczynniki są
specjalne, przeznaczone do dekontaminacji preparaty typu „DNA-Away”.
Mogą to być roztwory DNAz lub środki chemiczne. Są stosunkowo drogie, a
ich skuteczność jest podobna jak rozwiązań opisanych poniżej.
*
Najlepsze w walce z kontaminacją DNA są … komercyjnie dostępne
wybielacze i środki czyszczące. Odpowiednio rozcieńczony roztwór NaOCl
tworzy nacięcia nici (nick’uje DNA) i tym samym uniemożliwia amplifikację.
Podobnie działa wiele innych środków dostępnych w sklepach z chemią
gospodarczą. Tabletki calgonitu, zawierające wodorotlenki sodu i potasu oraz
podchloryn, wszelkie środki w sprayu wydzielające wolny chlor lub tlen
rodnikowy (oparte na eterach, epoksydach, aldehydach) są jak najbardziej
skuteczne i bardziej bezpieczne dla użytkownika niż środki do sterylizacji
gazowej.
* Jak używać wybielacza? Ważne jest stężenie aktywnego chloru. DNAbójczo działa nawet 0,5% roztwór, wystarczy więc odpowiednio rozcieńczyć
wybielacz i przemyć blaty. Albo zastosować spryskiwacz. Ważne jest, by
pozostawić warstwę wybielacza na mytej powierzchni przez 15minut albo do
wyschnięcia, a potem zmyć wodą. Najlepsze działanie związków
generujących rodniki tlenowe i wolny cholor otrzymujemy przy
kontakcie preparatu z powietrzem, dlatego nanosimy cienką
warstewkę. Dlatego nie urządzamy kąpieli np. statywów w wybielaczu, raczej
je spryskujemy.
Tipsy z filtrem- koszt który warto ponosić
W połączeniu z regularnym myciem powierzchni wybielaczami i okresowymi
kąpielami końcówek pipet w HCL-glicynie, dobrze jest stosować tipsy z filtrem
jako prewencję w codziennej praktyce laboratoryjnej. Tipsy z odpowiednio
umiejscowionymi, grubymi filtrami pozwalają na ochronę pojedynczych próbek
przed aerozolami DNA, które mogą osadzić się na dispenserze podczas
pipetowania. Taka ochrona jest szczególnie polecana w laboratoriach
diagnostycznych i w placówkach korzystający z metod QPCR i nested PCR.
Warto zwrócić uwagę na jakość filtra. Spotkałam się z produktami, w których
silikonowa wkładka nie powinna w ogóle zostać uznana za filtr, gdyż jej niewielka
grubość nie zapewniała żadnej ochrony. Na rynku dostępne są końcówki
zawierające nawet 2 lub 3 warstwy filtrujące- takiemu rozwiązaniu nie oprze się
żaden aerozol DNA. Nie polecam oszczędzać na końcówkach z filtrem, jeżeli w
naszym laboratorium zdarzały się w przeszłości zanieczyszczenia, oraz w sytuacji,
gdy nie dysponujemy pomieszczeniami dedykowanymi do PCRu i komorami
laminarnymi. Oszczędność 10zł na opakowaniu tipsów może nas kosztować setki
złotych stracone na powtarzaniu reakcji PCR!
UNG: rozwiązanie wygodne, ale nie zawsze praktyczne
Uracylo-N-glikozylacja to elegancka metoda unieszkodliwiania kwasów
nukleinowych po reakcji PCR. Używana jest już od wielu lat i pozwala na większą
swobodę pracy z produktami PCR.
*
UNG to system amplifikacji opartej na deoksyurydynie zamiast
deoksytymidynie. Po reakcji PCR otrzymujemy produkt z inkorporowanym dU,
który (o ile zostanie przeniesiony do kolejnej reakcji) jest niszczony przez
specjalny, dodawany do reakcji enzym urydylo-N-glikozylazę przed
rozpoczęciem właściwej amplifikacji PCR. Tym sposobem nici zawierające dU
degradują i nie mogą stanowić matrycy w tej reakcji.
*
Warto zasygnalizować, że UNG pozwala na uniknięcie kontaminacji tylko
matrycami z inkorporowanym dU z poprzednich reakcji PCR< nie daje
natomiast żadnej ochrony przed kontaminacją na pierwszych etapach pracy z
analitem. Tak więc wracamy do punktu wyjścia, czyli opisanego w I części
tego opracowania GLP.
*
Drugim ważnym mankamentem może być bezzasadność wykorzystania
UNG w reakcjach nested-PCR, w których konieczne jest reamplifikowanie
matrycy z poprzedniego PCRu. Można do drugiego MIXu nie dodawać UNG,
ale w ten sposób znowu wystawiamy się na kontaminację!
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Tak oto wspólnie dotarliśmy do końca opracowania, które może ułatwi
Wam pracę w czystym, wolnym od kontaminacji otoczeniu. Czego Wam i
sobie życzę!
Opracowanie powstało na bazie własnych doświadczeń, jednak niezwykle
pomocne okazały się artykuły z BiteSizeBio:
Eliminate PCR Amplicon Carry-Over With UNG
PCR: The Right Way to Decontaminate and Eliminate False Positives
Wyniki fałszywie pozytywne w
PCR! Jak się przed nimi bronić? (I)
„Kontaminacja” to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku
każdego biologa molekularnego. Przypadkowe przeniesienie produktu
PCR na blaty, plastiki lub sprzęt laboratoryjny może zamienić życie
pracowników laboratorium w koszmar na długie tygodnie. Jak nie
dopuścić do tej sytuacji? Przedstawiam Wam rozwiązania, które uchronią
Was przed fałszywymi pozytywami i oszczędzą mnóstwa frustracji.
1. GLP przede wszystkim
Niestety nie istnieje rozwiązanie, które pozwoli nam zupełnie beztrosko poczynać
sobie z produktami PCR w laboratorium. Podstawą każdej czynności, począwszy
od pipetowania, skończywszy na usuwaniu odpadów, musi być dobra praktyka
laboratoryjna i należy mieć tego pełną świadomość. Zacznijmy od
najważniejszego: myślmy nad każdą wykonywaną czynnością. Niech nie
zgubi nas rutyna!
*
Aby nie dopuścić do kontaminacji, spróbujmy rozdzielić przestrzennie
czynności wykonywane w laboratorium. Przypiszmy pipety do poszczególnych
stanowisk laboratoryjnych i nie wychodźmy z nimi poza obszar roboczy, do
którego są przyporządkowane.
*
Pilnujmy tipsów- czy nakładane są do pudełek w innym miejscu niż
wykonujemy PCR? Czy personel który to robi, używa zawsze świeżych
rękawic? Czy pudełka na tipsy są zamykane, gdy z nimi nie pracujemy?
*
Uważajmy na standardy do Real-Time PCRu i próbówki z produktami
reakcji. Kwestia warta rozważenia: jeżeli w każdym mikrolitrze standardu jest
sto milionów kopii matrycy, to co się stanie, jeśli taki mikrolitr kapnie nam na
stół a następnie zostanie roztarty przez sprzątaczkę ścierką po całym blacie?
Albo gdy kapnie nam na rękę, którą następnie złapiemy za pipetę, klamkę lub
mikropłytkę?
*
Zachowujmy szeroko rozumiany porządek wokół siebie
*
Dbajmy o reagenty: gdy to tylko możliwe, pipetujmy duże objętości na
małe alikwoty do jednorazowego użytku. Zmieniajmy tipsy dodając po sobie
kolejne reagenty. Nigdy nie przelewajmy resztek z jednej buteleczki do
drugiej, bo możemy zepsuć kolejną partię odczynnika lub buforu!
2. Odpowiednie pomieszczenia laboratoryjne są na wagę złota
Jeżeli planujemy dopiero rozkład pomieszczeń laboratoryjnych, od początku
miejmy na uwadze, że będziemy wykonywać w tych pomieszczeniach rożne etapy
naszej pracy. Oddzielenie przestrzenne PCRu od reszty zadań laboratoryjnych jest
najłatwiejszą i najskuteczniejszą bronią w walce z kontaminacją. Walczmy o każdą
piędź ziemi z tymi, którzy finansują przedsięwzięcie, bo im więcej zainwestujemy
w pomieszczenia, tym mniej stracimy na powtarzaniu nieudanych reakcji. To się
zwróci- nie od razu, ale z cała pewnością.
*
Pomieszczenie, w którym będziemy trzymać nowe odczynniki,
przygotowywać MIXy i bufory, DEPCować wodę, powinno być jak najbardziej
oddalone od reszty pomieszczeń. Jest to pomieszczenie czyste.
*
Drugie pomieszczenie, które powinno oddzielać część brudną od czystej,
to pomieszczenie biurowe/socjalne/sala komputerowa- miejsce na
dokumentację, seminaria, pracę z komputerem itp. W nim w ogóle nie
powinny znajdować się próbki ani reagenty.
*
Trzecie pomieszczenie to pomieszczenie brudne do preparatyki próbek.
Ideałem byłoby, gdyby odbywała się tam tylko wstępna preparatyka próbek,
izolacja DNA i RNA, ewentualnie katalogowanie i mrożenie analitów.
*
W ostatnim pomieszczeniu przygotowujemy PCR, rozcieńczamy matryce,
puszczamy żele i utylizujemy materiał. Jest to najbardziej narażona na
skażenie cześć laboratorium, idealny pokój tego typu jest całkowicie wyłożony
kafelkami i powierzchniami zmywalnymi, odpornymi na silne utleniacze.
Zamiast komory laminarnej (radzę sobie ją całkowicie odpuścić o ile nie
pracujemy z próbkami o wysokim zagrożeniu biologicznym lub z
mikrośladami!) radzę właśnie kafelki. Zero półek, zakamarków, tylko stół,
krzesło, 1 zestaw pipet i nic poza tym. Wszystko powinno dać się odkazić po
zakończonym dniu pracy! (czym odkażać? O tym będzie traktować druga część
opracowania!)
3. Mit lampy UV
W laboratoriach medycznych i badawczych złotym standardem jest
dekontaminacja przy użyciu światła UV. Jest to bardzo dobre rozwiązanie, ale dla
mikrobiologów i osób pracujących z hodowlami in vitro.
*
UV absolutnie nie nadaje się za to do pozbywania się DNA z powierzchni
roboczych, jest na to zbyt mało wydajne! Światło UV ma moc biobójczą, i
mutagenną, ale nie lityczną w stosunku do polimerów DNA. Poza tym jego
działanie jest ograniczone do przestrzeni nieporowatych, wystawionych
bezpośrednio na promieniowanie.
*
UV zażółca papier i niszczy niektóre tworzywa sztuczne, więc nie
powinniśmy trzymać tam dokumentacji.
*
Jeszcze jedna ważna rzecz, o której się nie pamięta. Światło UVC jest
potężne, ale świetlówki szybko się zużywają. Po roku tracą nawet połowę
swojej emisji UVC- taka świetlówka już nie nadaje się do dekontaminacji.
Komu więc polecać UV?
Pracowniom, które pracują z ludzkimi płynami ustrojowymi do pomieszczeń, w
których wykonuje się np. ekstrakcję białek czy kwasów nukleinowych i gdzie
utylizuje się materiał. Obowiązkowo do pracowni mikrobiologii i tam, gdzie
prowadzi się hodowle komórkowe. UV nie radzi sobie z wirusami tak wydajnie jak
z bakteriami, ale i tak pomaga w walce np. z fagami. Natomiast UV w
pomieszczeniach do PCR i pod komorami laminarnymi sprawdza się raczej słabo.
Można je stosować jako dodatkowy środek ochronny- wszak nie zaszkodzi, ale
pożytku z niego niewiele.
W drugiej części opracowania dowiecie się, jakie chemiczne i fizyczne
środki zaradcze można zastosować, by pozbyć się niechcianego DNA z
powierzchni laboratoryjnych.
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Trombocytopatie – przyczyny
często niewyjaśnionych krwawień
Zaburzenia czynności płytek krwi mogą pojawić się już w dzieciństwie,
jako skłonności do sińców, krwawienia z nosa, z dziąseł lub nadmierne
krwawienia miesiączkowe. Ponieważ w większości wypadków krwawienia
te mają małe nasilenie i nie wymagają interwencji medycznej, często są
ignorowane.
O zapewnieniu prawidłowej hemostazy decyduje nie tylko odpowiednia liczba
płytek krwi, lecz także ich funkcjonowanie. Defekty oraz zaburzenia funkcji płytek
mogą być przyczyną trombocytopatii i prowadzić do wystąpienia krwawień [2].
Trombocytopatie ze względu na skomplikowaną diagnostykę oraz objawy
wskazujące na inne przyczyny skazy krwotocznej często pozostają nierozpoznane.
Niezdiagnozowane wcześniej zaburzenia czynności płytek mogą skutkować
wystąpieniem silnych, zagrażających życiu krwotoków w przypadku urazów, w
trakcie zabiegów chirurgicznych lub inwazyjnych procedur medycznych [2].
Pojawienie się u chorych ciężkiej skazy krwotocznej może być także spowodowane
przyjmowaniem leków przeciwpłytkowych, powszechnie stosowanych w leczeniu
lub zapobieganiu zakrzepicy tętniczej [3].
Trombocytopatie ze względu na swoje pochodzenie można podzielić na
wrodzone i nabyte.
Wrodzone zaburzenia czynności płytek krwi występują bardzo rzadko i z tego
względu nie zawsze są brane pod uwagę, jako przyczyna skazy krwotocznej.
Najczęściej stosowana klasyfikacja trombocytopatii wrodzonych została oparta na
nieprawidłowościach w pełnieniu określonej funkcji. Ponieważ funkcje płytek krwi
takie jak adhezja, agregacja, aktywacja, sekrecja i aktywność prokoagulacyjna są
ze sobą powiązane, podział ten w wielu wypadkach jest problematyczny [1].
Wrodzone trombocytopatie można podzielić na:
-pierwotne defekty adhezji płytek krwi
-pierwotne defekty agregacji płytek krwi
-zaburzenia ziarnistości płytkowych
-zaburzenia sekrecji lub transdukcji sygnału [2].
Do grupy pierwotnych defektów adhezji płytek krwi można zaliczyć zespół
Bernarda-Souliera (BSS) oraz płytkowy typ choroby von Willebranda (PT-vWD).
Zespół Bernarda-Souliera jest spowodowany zaburzeniami w przyleganiu płytek
krwi za pośrednictwem czynnika von Willebranda do warstwy podśródbłonkowej
w miejscu uszkodzenia naczynia. Wynika to ze zmniejszonej ilości lub
nieprawidłowej budowy kompleksu białkowego na płytkach krwi GPIb/IX/V, który
jest receptorem dla czynnika von Willebranda. Zmniejszenie wiązania czynnika
von Willebranda do płytki, a tym samym zaburzenia adhezji w miejscu
uszkodzenia, ma duże znaczenie w naczyniach o szybkim przepływie krwi [1].
Skaza krwotoczna może mieć ciężki przebieg, mogą wystąpić krwawienia z nosa,
dziąseł, z przewodu pokarmowego lub krwawienia pourazowe [2].
Płytkowy typ choroby von Willebranda jest spowodowany nieprawidłowościami w
budowie glikoproteiny GPIbα występującej na płytkach krwi, na skutek jej zmian
konformacyjnych. Powoduje to wiązanie się dużych multimetrów czynnika von
Willebranda z białkiem GPIbα i tym samym szybkie usuwanie ich z krwiobiegu.
Brak lub niedobór multimerów czynnika von Willebranda we krwi obniża
krzepliwość i może być przyczyną krwawień. Podobne objawy oraz etiopatogenezę
można zaobserwować w podtypie 2B choroby von Willebranda. W przypadku
silnych krwawień lub przed zabiegami chirurgicznymi należy stosować
przetoczenia koncentratów krwinek płytkowych, natomiast desmopresyna,
rekombinowany czynnik VIII i czynnik von Willebranda są przeciwwskazane lub
nieskuteczne [2].
Do grupy pierwotnych defektów agregacji płytek krwi należy Trombastenia
Glanzmanna (GT).
Tromabastenia Glanzmanna jest spowodowana obniżoną ekspresją lub
nieprawidłową budową płytkowej integryny GPIIb/IIIa. Integryna ta pełni bardzo
ważną rolę w agregacji płytek, gdyż do niej przyłącza się fibrynogen tworząc
mostki pomiędzy sąsiednimi płytkami, co skutkuje wytworzeniem czopu
pierwotnego [1]. Skaza krwotoczna może mieć ciężki przebieg, u chorych mogą
wystąpić wybroczyny, sińce, krwawienia z nosa, rzadziej krwawienia z przewodu
pokarmowego lub krwiomocz [2].
Zaburzenia ziarnistości płytkowych występują bardzo rzadko i obejmują różne
nieprawidłowości w funkcjonowaniu płytek krwi spowodowane zmniejszeniem
liczby ziarnistości w komórce, stężenia białek lub też zaburzeniami w
mechanizmach ich uwalniania. Między innymi można wśród nich wymienić: zespół
szarych płytek, chorobę puli magazynowej δ, zespół Hermansky-Pudlak, zespół
Chediaka-Higashi’ego lub skazę płytkową Quebec [2].
Zaburzenia sekrecji lub transdukcji sygnału są heterogenną grupą wrodzonych
zaburzeń aktywacji płytek krwi. Nieprawidłowa czynność lub niedobór receptorów
błonowych hamuje aktywację płytek krwi oraz upośledzenie procesów uwalniania
substancji, agregacji a także zaburzenia w budowie cytoszkieletu. Należą do nich
między innymi defekty receptorów dla ADP, tromboksanu A2, kolagenu lub
receptorów α adrenergicznych [2].
Nabyte zaburzenia czynności płytek krwi mają największe znaczenie kliniczne w
warunkach intensywnej opieki medycznej, u chorych z koagulopatią,
posocznicą, niewydolnością wielonarządową lub w leczeniu
przeciwzakrzepowym ostrych zespołów wieńcowych [3].
Nabyte trombocytopatie mogą być spowodowane: wpływem leków, obecnością
chorób nerek, wątroby, chorób układu krwiotwórczego, chorób
autoimmunologicznych lub wystąpieniem zespołu wykrzepiania
wewnątrznaczyniowego [3].
Najczęstszą przyczyną obniżenia czynności płytek, mogącą objawiać się
występowaniem krwawień są leki przeciwpłytkowe powszechnie stosowane w
leczeniu lub zapobieganiu chorób tętnic. Działanie leków przeciwpłytkowych
polega na blokowaniu albo hamowaniu szlaków metabolicznych prowadzących do
aktywacji i agregacji płytek.
Do leków hamujących czynność płytek krwi należą przede wszystkim:
-kwas acetylosalicylowy (np. aspiryna) blokujący szlak aktywacji zależny od
tromboksanu A2
-pochodne tienopirydyny (np. klopidogrel) hamujące szlak prowadzący do
agregacji płytek zależny od ADP
-leki blokujące receptory (GPIIb/IIIa) dla fibrynogenu (np. abcyksymab,
eptyfibatyd, tirofiban).
Wśród innych leków wpływających na czynność płytek można wymienić:
niesterydowe leki przeciwzapalne, antybiotyki (penicyliny, cefalosporyny), leki
krążeniowe (nitrogliceryna, antagoniści wapnia, β-adrenolityki), heparynę,
protaminę, streptokinazę [4]. Nabyte zaburzenia czynności płytek krwi mogą
wystąpić w chorobach nerek np. w mocznicy, u pacjentów hemodializowanych a
także w zaburzeniach czynności wątroby, gdzie współwystępują z
małopłytkowością oraz koagulopatią. Dysfunkcja płytek krwi może ujawnić się w
przebiegu chorób układu krwiotwórczego: w zespołach mieloproliferacyjnych,
białaczkach, w szpiczaku plazmocytowym, w chorobach autoimmunologicznych
lub w zespole wykrzepiania wewnątrznaczyniowego [3].
Diagnostyka trombocytopatii obejmuje ocenę kliniczną, wykluczenie choroby von
Willebranda i innych przyczyn zaburzeń hemostazy oraz ocenę wpływu leków [4].
Do testów przesiewowych należą badania czasu krwawienia (BT) i czasu okluzji
(CT) w aparacie PFA-100 lub PFA-200. W celu zróżnicowania trombocytopatii z
małopłytkowością oznacza się morfologię krwi z liczbą płytek oraz parametrami
obrazującymi różnice w ich wielkości (MPV – średnia objętość, PDW – wskaźnik
zmienności objętości, P-LCR – odsetek płytek dużych) [5]. Dla określenia rodzaju
defektu płytkowego wykonuje się agregację płytek metodą agregometrii
impedancyjnej pod wpływem różnych agonistów (kolagenu, rystocetyny, ADP,
kwasu arachidonowego) oraz oznaczenie ekspresji receptorów błonowych metodą
cytometrii przepływowej [5,6].
Najczulszymi metodami diagnostycznymi potwierdzającymi obecność
wrodzonych trombocytopatii są badania genetyczne.
Metodami biologii molekularnej można przeprowadzić analizę mutacji
odpowiedzialnych na występowanie określonych defektów płytek krwi. W tym celu
przeprowadza się sekwencjonowanie egzonów genomowego DNA zawierających
fragmenty dla białek, w których zmiany są przyczyną dysfunkcji płytek [7]. Nabyte
zaburzenia czynności płytek można także wykryć metodą tromboelastometrii, co
znalazło zastosowanie u chorych przebywających na oddziałach chirurgicznych
[3].
Terapia zaburzeń czynności płytek krwi polega na leczeniu choroby podstawowej,
zmniejszeniu dawek leków przeciwpłytkowych, stosowaniu leków
antyfibrynolitycznych, rekombinowanych czynników krzepnięcia, desmopresyny
lub przetoczeniach koncentratów krwinek płytkowych [2,4].
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Zaburzenia czynności płytek krwi ze względu na rzadkie występowanie lub
towarzyszenie innym chorobom pozostają często niezdiagnozowane. Mogą być
one jednak przyczyną ciężkich krwawień, szczególnie w zespole BernardaSouliera, w Trombastenii Glanzmanna, u chorych po urazach, w momencie
przeprowadzania zabiegów chirurgicznych lub u pacjentów przyjmujących leki
przeciwpłytkowe. W ostatnich latach metody badań czynności płytek krwi
znacznie się rozwinęły i stały się bardziej dostępne, co zapewnia wczesną
diagnostykę i terapię w przypadku podejrzenia trombocytopatii.
Piśmiennictwo:
1. Cattaneo M. Congenital disorders of platelet function. [In:] Gresele P, Fuster V,
Lopez J, Page C, Vermylen J, ed. Platelets in hematologic and cardiovascular
disorders. A clinical handbook. New York: Cambridge University Press; 2008:
201-224.
2. Chojnowski K. i wsp. Część III: Zasady postępowania we wrodzonych
zaburzeniach czynności płytek krwi. Acta Haematol Pol2009; 40 (3): 731-752.
3. Kroll MH, Hassan AA. Acquired disorders of platelet function. [In:] Gresele P,
Fuster V, Lopez J, Page C, Vermylen J, ed. Platelets in hematologic and
cardiovascular disorders. A clinical handbook. New York: Cambridge University
Press; 2008: 225-241.
4. Gresele P, Born G, Patrono C, Page C, ed. Antiplatelet agents. Berlin,
Heidelberg: Springer-Verlag; 2012: pp. 471-606.
5. Gresele P. et al. Diagnosis of suspected inherited platelet function disorders:
results of a worldwide survey. J Thromb Haemost. 2014; 12 (9): 1562-1569.
6. Bienias J. et al. Standaryzacja metody oznaczenia ekspresji P-selektyny na
płytkach krwi przy pomocy cytometru przepływowego oraz analiza porównawcza z
metodą agregometrii impedancyjnej u chorych na ostrą białaczkę szpikową. Post
Nauk Med 2015; 28 (6): 384-390.
7. Solh T. et al. Glanzmann’s thrombasthenia: pathogenesis, diagnosis, and
current and emerging treatment options. J Blood Med. 2015; 6: 219-227.
Różnorodność
morfologiczna
erytrocytów
—
anizoi
poikilocytoza.
Podczas oceny rozmazu krwi obwodowej często skupiamy się wyłącznie na
ilościowej i jakościowej ocenie układu białokrwinkowego, zapominając o
istotności zmian w obrębie układu czerwonokrwinkowego. W związku z
powyższym warto zwrócić uwagę na zmiany morfologiczne erytrocytów,
które możemy napotkać w codziennej praktyce laboratoryjnej.
Występowanie różnych wariantów erytrocytów może wiązać się z wahaniami w
obrębie wielkości, kształtu, stopnia wybarwienia oraz obecności nieprawidłowych
struktur i wtrętów w cytoplazmie. Znalezienie w oglądanych preparatach
charakterystycznych cech morfologicznych znacznie ułatwia dalszą diagnostykę.
Aby zrozumieć istotę pojawiających się zmian należy przytoczyć najpierw kilka
podstawowych danych fizjologicznych i stosowanych powszechnie pojęć.
Za produkcję erytrocytów jest odpowiedzialny układ czerwonokrwinkowy. Krwinki
czerwone powstają w procesie zwanym erytropoezą, który zachodzi w szpiku
kostnym. Erytrocyty jako dojrzałe krwinki czerwone znajdują się we krwi
obwodowej. Prawidłowy erytrocyt jest formą okrągłą, dwuwklęsłą w środku o
średnicy od 6 do 9 um [1].
Specyficzny kształt erytrocytu zapewnia nadmiar powierzchni do objętości, co
sprzyja wymianie gazowej i odkształcaniu krwinki.
W przypadku występowania różnic w zakresie wielkości erytrocytów mówi się o
anizocytozie. Gdy w rozmazie pojawiają się krwinki o różnych kształtach mamy do
czynienia z poikilocytozą. Wielobarwliwość krwinek czerwonych nosi miano
polichromatofilii.
Anizocytoza
Pod względem wielkości erytrocyty można podzielić na mikrocyty, normocyty i
makrocyty. Normocyty to erytrocyty o prawidłowej średnicy, mikrocyty to
mniejsze krwinki (średnica poniżej 6 um), makrocyty – większe (średnica powyżej
9 um). W przypadku średnicy większej niż 12 um mówi się o megalocytach,
występujących przede wszystkim w niedokrwistościach megaloblastycznych.
Obecność mikrocytów związana jest z kilkoma jednostkami chorobowymi.
Odnotowano takie zmiany wielkości krwinek czerwonych w niedoborze żelaza,
talasemiach, niedokrwistości syderoblastycznej oraz niedokrwistościach w
chorobach przewlekłych.
Makrocyty obserwuje się w chorobach wątroby, przy nadużywaniu alkoholu, w
ciąży, u noworodków, w niedokrwistości z niedoboru witaminy B12 lub kwasu
foliowego, przy stosowaniu antymetabolitów, niedoczynności tarczycy, przewlekłej
niedoczynności oddechowej, niedokrwistości aplastycznej, MDS (eng.
myelodysplastic syndrome) oraz zwiększonej retykulocytozie [2]. Ich obecność
odzwierciedla zazwyczaj nieprawidłowości w erytropoezie – spada liczba
podziałów komórkowych podczas dojrzewania ich prekursorów [3].
Poikilocytoza
Pod względem różnokształtności krwinki można podzielić na:
— sferocyty
— eliptocyty
— stomatocyty
— krwinki tarczowate
— krwinki sierpowate
— schistocyty
— akantocyty
— lakrymocyty
— echinocyty
Sferocyty to małe, okrągłe, równomiernie wybarwione krwinki bez środkowego
przejaśnienia. Są one mniejsze od normocytów. Spotyka się je w sferocytozie
wrodzonej, AIHA z ciepłymi przeciwciałami (eng. autoimmune hemolytic anemia),
późnej reakcji poprzetoczeniowej, chorobie hemolitycznej noworodków, DIC (eng.
disseminated intravascular coagulation), MAHA (eng. microangiopathic hemolytic
anemia), po splenektomii. Sferocytoza wrodzona jest chorobą dziedziczoną
autosomalnie dominująco (75% przypadków), związaną z zaburzeniami w obrębie
błony erytrocytu. Zaburzenia dotyczą interakcji poziomej białek błonowych
(zachodzą między łańcuchami spektryny alfa i beta, między spektryną beta i
białkiem prążka 4.1 oraz między białkiem 4.1 i aktyną). Wzrasta przepuszczalność
błony dla jonów sodu i wody, nasila się glikoliza. Erytrocyty pęcznieją – powstają
sferocyty. Sferocyty zawierają taką samą ilość hemoglobiny co prawidłowe
erytrocyty, ale średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej jest znacznie
wyższe. Dzieje się tak dlatego, że spada średnica napęczniałego erytrocytu. Spada
integralność błony komórkowej, sferocyty są mniej wytrzymałe, mniej elastyczne i
łatwiej ulęgają hemolizie [1, 2, 4]. Oprócz podłoża genetycznego powstawania
sferocytów, ich pojawienie się może być także wynikiem aktywności uczulonych
przez przeciwciała makrofagów, które usuwają część błony erytrocytu, formując
nowy wariant krwinki. Istotny wpływ mogą mieć także siły tnące prądu krwi [3].
Powszechne występowanie sferocytów obserwuje się w przebiegu malarii.
Potwierdzeniem są obserwacje zakażonych dzieci z rejonu jeziora Wiktorii
(Afryka). Pojawienie się sferocytów przypuszczalnie jest wynikiem
przemieszczania się zarodźca malarii wewnątrz erytrocytu [5].
Eliptocyty znane są także jako owalocyty. Jak sama nazwa wskazuje krwinki mają
owalny kształt. W niewielkim odsetku dopuszczalne jest występowanie tego
rodzaju krwinek we krwi. Znaczną liczbę eliptocytów spotyka się w dziedzicznej
owalocytozie (od 25 do 75% erytrocytów), niedokrwistości złośliwej,
niedokrwistości z niedoboru żelaza, MPD (eng. myeloproliferative disease) i MDS.
Eliptocytoza wrodzona dziedziczona jest autosomalnie dominująco. Powstanie
eliptocytów wynika z defektu błony erytrocytu. Charakter zmian jest głównie
jakościowy i wynika przede wszystkim z defektów białka 4.1 oraz występowania
różnych wariantów spektryny [1, 6].
Stomatocyty to erytrocyty charakteryzujące się podłużnym centralnym
przejaśnieniem. Kształtem przypominają otwarte usta. Występują w
stomatocytozie wrodzonej oraz nabytych niedokrwistościach hemolitycznych.
Stomatocytozadziedziczona jest w sposób autosomalny dominujący. Mechanizmy
regulujące przepływ kationów sodu i potasu przez błonę komórkową nie działają
prawidłowo, co powoduje wzrost przepuszczalności błony erytrocytu i w
konsekwencji powadzi do nadmiernego uwodnienia erytrocytu [1, 5].
Zmiany morfologiczne erytrocytów w kierunku stomatocytozy może wywoływać
także lek przeciwmalaryczny Lupeol oraz niektóre związki amfifilowe. W wyniku
transformacji błony komórkowej rozwój pasożytów ulega inhibicji [6]. Stomatocyty
spotyka się w dużych ilościach u alkoholików [3].
Krwinki tarczowate to erytrocyty charakteryzujące się obecnością hemoglobiny na
obwodzie i w samym środku krwinki z przejaśnieniem pomiędzy tymi dwoma
warstwami. Wyglądem przypominają tarczę wojownika, skąd ich nazwa.
Powstawanie tych krwinek może mieć podłoże genetyczne w talasemii. U ludzi
zdrowych mogą występować pojedyncze krwinki tarczowate. Większe ilości
pojawiają się w hemoglobinopatiach, niedoborze żelaza, po splenektomii, w
chorobach obstrukcyjnych wątroby (wzrasta zawartość cholesterolu w częściach
powierzchniowych erytrocytów). Mniejsze ilości tych erytrocytów spotyka się w
anemii sierpowatej, niedoborze żelaza oraz zatruciu ołowiem [1, 2, 3].
Krwinki sierpowate, znane także pod nazwą drepanocyty, to erytrocyty
przypominające kształtem sierp lub półksiężyc. Są typowe dla szczególnego
rodzaju hemoglobinopatii, jakim jest niedokrwistość sierpowatokrwinkowa. Po
dodaniu do krwi substancji redukujących lub inkubacji w warunkach
beztlenowych krwinki są łatwiej wykrywalne. Niedokrwistość sierpowata to
anemia wrodzona. Wynika ona z nieprawidłowej budowy hemoglobiny. W wyniku
mutacji punktowej w genie łańcucha beta hemoglobiny dochodzi do zmiany
pojedynczego aminokwasu w sekwencji białka (w pozycji 6 dochodzi do zamiany
kwasu glutaminowego na walinę). Zmieniona w ten sposób hemoglobina
określana jest jako hemoglobina S. Choroba jest rozpowszechniona głównie w
niektórych rejonach Afryki, rzadko występując u rasy białej [2, 4].
Schistocyty, znane także jako fragmentocyty, to rozfragmentowane krwinki
czerwone. Pojawiają się w niedokrwistości hemolitycznej mikroangiopatycznej,
niedokrwistości polekowej, mechanicznej, talasemii, DIC, MAHA, HUS (eng.
hemolytic-uremic syndrome), TTP (eng. thrombotic thrombocytopenic purpura)
oraz niewydolności nerek. Mogą być skutkiem mechanicznego uszkodzenia przez
wiązania fibryny, siły tnące prądu krwi, zmienione powierzchnie (zastawki w
wadach serca), ciała obce w krążeniu, skupiska komórek nowotworowych,
czasami działanie płytek krwi lub uszkodzenia termiczne (oparzenia II i III
stopnia) [1, 2]. Występowanie schistocytów jest typowe w stanach po przeszczepie
macierzystych komórek hematopoetycznych szpiku (SCT). Udowodniono
przydatność systematycznego określania liczby schistocytów po SCT. Wzrost
odsetka schistocytów może służyć jako dodatkowy, choć niespecyficzny marker
wystąpienia komplikacji po mikroangiopatii zakrzepowej [7].
Akantocyty zwane krwinkami kolczystymi to sferoidalne erytrocyty posiadające od
2 do 20 ‘kolców’ rozmieszczonych nieregularnie na powierzchni krwinki. ,Kolce’
to długie, ostro zakończone wypustki cytoplazmy. Występują one przede
wszystkim we wrodzonej abetalipoproteinemii, polekowej niedokrwistości
hemolitycznej mikroangiopatycznej, niedokrwistości hemolitycznej u chorych z
wszczepionymi sztucznymi zastawkami serca, mocznicy, nocnej napadowej
hemoglobinurii oraz w przewlekłych chorobach wątroby (zespół Zievego) [2].
Akantocyty i inne poikilocyty pojawiają się we krwi obwodowej po splenektomii
oraz są charakterystyczne dla zaburzeń kłębuszków nerkowych. W alkoholowej
chorobie wątroby wzrasta zawartość cholesterolu przy zachowanym prawidłowym
poziomie fosfolipidów w częściach powierzchniowych erytrocytu [3, 8].
Lakrymocyty, zwane także dakriocytami czy krwinkami kroplowatymi, to
erytrocyty w kształcie spadającej kropli lub łzy. Są one typowe dla zwłóknienia
szpiku (mielofibroza). Występują przy nacieczeniu szpiku przerzutami MDS. Obraz
jest bardzo charakterystyczny — silna anizo- i poikilocytoza we krwi obwodowej
[3].
Echinocyty mianowane także krwinkami karbowanymi to wariant erytrocytu
posiadającego od 10 do 30 krótkich, regularnych wypustek cytoplazmatycznych.
Pojawiają się przykładowo w mocznicy, hiperlipidemii, po splenektomii czy przy
niewydolności nerek. Zazwyczaj jednak występują jako artefakt w rozmazie krwi
obwodowej(wynik zakłócenia równowagi osmotycznej przez nieodpowiednie lub
długie przechowywanie, EDTA) [2]. W przypadku deficytu kinazy pirogronianowej
erytrocytów (spada produkcja ATP, dochodzi do ucieczki wody i potasu z
erytrocytów), w niektórych nowotworach oraz krótko po transfuzji dłużej
przechowywanej krwi pojawiają się echinocyty [3].
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Istnieje szereg wariantów morfologicznych krwinek czerwonych mniej lub
bardziej charakterystycznych dla określonych jednostek chorobowych.
Niewątpliwie jednak prawidłowa ocena abberacji od prawidłowego kształtu
erytrocytu stanowi istotny element diagnostyki.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Piśmiennictwo:
1. Mariańska B., Fabijańska-Mitek J., Windyga J. Badania laboratoryjne w
hematologii. Warszawa; Wyd Lek. PZWL, 2006.
2. Provan D. et al. Hematologia kliniczna. Warszawa; Wyd.Lek. PZWL, 2006.
3. Lynch E. Peripheral blood smear [In:] Walker HK., Hall WD., Hurst JW.
ed. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3rd
ed., Boston; Butterworths, 1990.
4. Matysiak M., Adamowicz A. Wrodzone niedokrwistości hemolityczne. Acta
Haematologica Polonica, 2009; 40: 455–462.
5. Anyona SB., Schrier SL., Gichuki CW. et al. Pitting of malaria parasites and
spherocyte formation. Malar J, 2006; 5: 64.
6. Ziegler HL., Staerk D., Christensen J. et al. In vitro Plasmodium falciparum
drug sensitivity assay: inhibition of parasite growth by incorporation of
stomatocytogenic amphiphiles into the erythrocyte membrane. Antimicrob Agents
Chemother. 2002; 46, 5: 1441-1446.
7. Lesesve JF., Alla F., Dugué F. et al. Evaluation of schistocyte monitoring after
haematopoietic stem cell transplantation. Int J Lab Hematol. 2011; 33, 4: 343-356.
8. Köhler H., Wandel E., Brunck B. Acanthocyturia–a characteristic marker for
glomerular bleeding. Kidney Int. 1991; 40, 1: 115-20.
Cystatyna
C
jako
marker
oceniający filtrację kłębuszkową
Wiarygodna i rzetelna ocena funkcji nerek stanowi jeden z
najważniejszych kierunków w diagnostyce. Szacuje się, że w Polsce
przewlekła choroba nerek (PChN) może dotyczyć 4 mln osób. Wydłużenie
średniej długości życia, jak i powszechne występowanie chorób
cywilizacyjnych, takich jak cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, miażdżyca,
powodują wzrost częstości występowania niewydolności omawianego
narządu [1,3]. Ostre uszkodzenie nerek jest obarczone dużą
śmiertelnością i wymaga szybkiej diagnostyki. Również u dzieci poważne
schorzenia nerek mogą przebiegać bez charakterystycznych objawów,
dlatego zdarza się, że są wykrywane zbyt późno, kiedy konieczny jest już
przeszczep nerki lub dializoterapia [2].
Parametrem laboratoryjnym stosowanym do oceny funkcji nerek jest wskaźnik
przesączania kłębuszkowego GFR (ang. Glomerular Filtration Rate). Wskazuje on
na zdolność tego narządu do oczyszczania osocza w jednostce czasu.
Stężenie kreatyniny w surowicy jest najczęściej stosowanym w diagnostyce
parametrem, odzwierciedlającym GFR, którego poziom ujemnie koreluje z
wielkością przesączania kłębuszkowego. Podwyższone stężenie kreatyniny w
surowicy wiąże się z pogorszeniem funkcji nerek [4,5].
Wykorzystanie kreatyniny w ocenie funkcji nerek ma jedynie przybliżoną
wartość diagnostyczną.
Korelacja poziomu kreatyniny w surowicy z wydolnością nefronów jest zależna od
wielu czynników. Na stężenie kreatyniny wpływa wiek (wyższe wartości u ludzi
młodych), płeć (wyższe u mężczyzn), masa mięśniowa, masa ciała, dieta
(spożywanie pokarmów wysokobiałkowych powoduje wzrost o ok. 10%),
aktywność fizyczna oraz rasa (wyższe stężenie u ludzi rasy białej) [1,5]. Spore
ograniczenia w zastosowaniu kreatyniny napotykamy u pacjentów z żółtaczką oraz
u noworodków, u których współistniejąca hiperbilirubinemia ujemnie interferuje z
poziomem kreatyniny. U noworodków w pierwszych dniach życia poziom
kreatyniny w surowicy odzwierciedla stężenie we krwi matki, ponieważ związek
ten swobodnie przechodzi przez łożysko [2].
Aby zwiększyć dokładność oceny przesączania kłębuszkowego na podstawie
pomiaru kreatyniny opracowano szereg wzorów antropometrycznych, które
pozwalają ograniczyć wpływ czynników pozanerkowych. Najczęściej stosuje się
wzory według Cockcrofta i Gaulta, MDRD (ang. Modification of Diet in Renal
Disease) oraz wzór Schwartza dla dzieci do obliczania szacowanego GFR (ang.
estimate GFR). Mimo że wzory te umożliwiły znaczny postęp w diagnostyce
nefrologicznej, to szacowanie filtracji nerkowej za ich pomocą nie jest wolne od
ograniczeń [4,6].
Tabela 1. Równania empiryczne stosowane do szacowania GFR [1]
Równanie MDRD jest to wskaźnik mało dokładny u ludzi starszych i u osób o
granicznych wartościach BMI (otyłych lub z niedowagą). Wzory MDRD nie
doszacowują eGFR u ludzi dobrze umięśnionych lub stosujących dietę bogatą w
białko, u których stężenie kreatyniny w surowicy jest wyższe. Natomiast u
pacjentów o niskiej masie mięśniowej (osoby w podeszłym wieku lub przewlekle
chorzy) na podstawie równania MDRD uzyskujemy fałszywie zawyżone wyniki
eGFR.
Ograniczenia w interpretacji oznaczeń kreatyniny powodują wzrost
zapotrzebowania na bardziej wiarygodny wskaźnik oceny funkcji nerek.
Prawdopodobnie taką rolę może pełnić cystatyna C.
Cystatyna C to drobnocząsteczkowe białko, składające się z jednego łańcucha
polipeptydowego. Jest ona wydzielana do krwi w jednakowym tempie przez
wszystkie komórki jądrzaste, dlatego jej zawartość w organizmie jest stała [1,6].
Cystatyna C z racji swojej niskiej masy cząsteczkowej ulega przefiltrowaniu w
kłębuszkach nerkowych w 98%. W dalszych częściach nefronu jest niemal w
całości resorbowana i w prawidłowym moczu występuje w minimalnych ilościach,
a jedynie w niewielkim stopniu jest usuwana z organizmu drogą pozanerkową
[2,6].
Duże znaczenie przypisuje się cystatynie C w diagnostyce PChN w stadium
przedklinicznym oraz w umiarkowanej niewydolności nerek.
Istotnym faktem, potwierdzającym użyteczność pomiaru cystatyny C w
diagnostyce nefrologicznej, jest jej wysoka czułość (81%). Jest więc ona czulszym
wskaźnikiem niewielkich zmian w nefronach niż oznaczanie kreatyniny, której
czułość wynosi 69%, a znamienny wzrost poziomu kreatyniny następuje dopiero,
gdy GFR obniży się do około połowy wartości prawidłowej [1]. Dużą zaletą
cystatyny C jest brak istotnej zależności między jej stężeniem a czynnikami
osobniczymi oraz dietą. Względna niezależność poziomu omawianego białka od
masy mięśniowej czyni z niego dobry marker oceny funkcji nerek u dzieci.
Cystatyna C jest lepszym od kreatyniny wskaźnikiem oceny GFR u noworodków z
uwagi na brak interferencji z bilirubiną, a także fakt, że nie przechodzi ona przez
barierę łożyskową [5].
Poziom cystatyny C w surowicy jest zależny od wieku, a ustalone wartości
referencyjne mieszczą się w granicach 0,53-0,92 mg/L (dla dorosłych poniżej 50.
roku życia) [5]. Stężenie tego białka jest kilkukrotnie wyższe u noworodków i
niemowląt, niż u ludzi dorosłych i wyrównuje się dopiero po drugim roku życia.
Obserwuje się stopniowy wzrost poziomu cystatyny C u osób po 50. roku życia
[2,6].
Poza stanami z niedoczynnością nerek podwyższone stężenie cystatyny C
występuje w chorobach nowowtworowych oraz w gorączce reumatycznej. Co
więcej, nadczynność tarczycy oraz terapia glikokortykosteroidami odwracalnie
zwiększają stężenie cystatyny C, natomiast niedoczynność tarczycy i terapia
cyklosporyną obniżają jej poziom [1,3].
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Cystatyna C pomimo pewnych ograniczeń wydaje się być lepszym wskaźnikiem
oceny pracy nerek niż kreatynina. Jedną z największych korzyści jest wzrost jej
stężenia już przy bardzo nieznacznej redukcji filtracji kłębuszkowej oraz niewielki
wpływ na jej poziom czynników pozanerkowych. Niestety oznaczanie cystatyny C
nadal nie wchodzi w skład ogólnie przyjętych procedur rutynowej diagnostyki.
Obecnie największym ograniczeniem w rozpowszechnieniu tego badania jest cena,
która około 10-krotnie przewyższa koszty związane z oznaczeniem kreatyniny.
Należy jednak pamiętać, że niejednokrotnie szybka i trafna diagnoza, pozwala
uniknąć również kosztownego i obciążającego dla pacjenta leczenia
nerkozastępczego.
Piśmiennictwo:
1. Imiela J., Lewandowicz A. Cystatyna C w diagnostyce przewlekłej choroby
nerek. Nefrol Dial Pol, 2007; 11: 126-132.
2. Konopska B., Grzebyk E., Warwas M. Postępy badań nad użytecznością
oznaczania cystatyny C u dzieci. Diagn Lab, 2013; 49, 1: 39-47.
3. Sodolska M., Walczak K., Krysicka A. i wsp. Użyteczność cystatyny C w ocenie
funkcji nerek u osób po 65. roku życia bez cukrzycy. Geront Pol, 2010; 18, 3:
120-127.
4. Skalska A., Klimek E. Przydatność cystatyny C jako markera funkcji nerek u
osób w starszym wieku. Geront Pol, 2006; 14, 2: 91-97.
5. Ciach E., Bobilewicz D. Zastosowanie stężenia cystatyny C w ocenie filtracji
kłębuszkowej u dzieci i ludzi starszych. Diagn Lab, 2012; 48, 4: 423-431.
6. Rozentryt P. Cystatyna C – co wiemy w roku 2008. LabForum, grudzień 2008:
3-6.
Wskaźnik rezerwy jajnikowej
Niepłodność jest poważnym problemem społecznym. Czasem jednoznaczne
wyjaśnienie przyczyny takiego stanu jest niemożliwe. Badania ostatnich
lat wskazują na ogromne znaczenie określenia poziomu hormonu
antymüllerowskiego we krwi pacjentek z problemami rozrodu. Wydaje się,
że AMH stanowi unikalny parametr endokrynologiczny, oceniający funkcje
żeńskich gonad płciowych.
Hormon antymüllerowski (ang. anti-müllerian hormone, AMH) jest dimeryczną
glikoproteiną produkowaną przez komórki ziarniste obecne w preantralnych i
małych antralnych pęcherzykach w jajniku. Należy on do nadrodziny peptydowych
czynników wzrostu i różnicowania czynnika wzrostu TGFβ. Występuje on zarówno
u kobiet jak i u mężczyzn, odgrywając zupełnie inna rolę u poszczególnych płci.
AMH stanowi:
— wskaźnik oceny płodności
— marker rezerwy jajnikowej
— czynnik prognostyczny przedwczesnego wygasania funkcji jajników
Okazuje się, że u zdrowych kobiet od okresu dojrzewania do 25 roku życia nie
obserwuje się znacznych zmian poziomu AMH w osoczu. Sytuacja zmienia się
diametralnie w okresie perimenopauzalnym, gdzie wartości AMH znacznie się
obniżają i mogą być nieoznaczalne. Z podobną sytuacją mamy do czynienia u
kobiet z przedwczesnym wygaśnięciem czynności jajników (eng. premature
ovarian failure, POF). Wyniki badań z ostatnich lat wskazują, że pomiar stężenia
AMH we krwi u kobiet z zespołem policystycznych jajników (ang. polycystic ovary
syndrome, PCO) może być markerem oceny ciężkości choroby, natomiast u kobiet
z POF wskaźnikiem obniżającej się rezerwy jajnikowej [1]. Wiadomo, że wraz z
wiekiem spada ilość wytwarzanych pęcherzyków jajnikowych. U kobiet
posiadających wiele małych pęcherzyków, a także z zespołem PCO, stężenie AMH
jest wysokie. U kobiet z niewielką ilością pęcherzyków oraz kobiet po menopauzie
występuje niski poziom hormonu antymülerrowskiego.
Oznaczenie stężenia AMH może służyć aktualnej ocenie potencjału
macierzyńskiego, pozwalając określić zdolność pacjentki do uzyskania własnych
komórek jajowych oraz oszacować czas, w jakim kobieta będzie w stanie zajść w
ciążę.
Przypuszcza się, że szanse powodzenia zapłodnienia in vitro rosną wraz ze
wzrostem poziomu AMH, a tym samym stężenie AMH koreluje z odsetkiem
prawidłowo zapłodnionych komórek. Znajomość poziomu rezerwy jajnikowej,
dzięki oznaczeniu AMH, pozwala na zaplanowanie leczenia w razie problemów z
zajściem w ciążę. Niski poziom rezerwy jajnikowej może wiązać się z
koniecznością pobrania i zamrożenia komórek jajowych zanim rezerwa ulegnie
wyczerpaniu [2,5].
Dodatkowym atutem AMH jest możliwość wykorzystania oznaczenia w
przewidywaniu momentu wejścia w okres menopauzy. Wraz ze wzrostem
pęcherzyka poziom AMH stopniowo się obniża. Mimo to stężenie AMH w osoczu
jest dość stabilne, co pozwala na wykonanie badania w dowolnym dniu cyklu.
AMH odzwierciedla stały FSH-niezależny wzrost pierwotnych pęcherzyków
jajnikowych [2].
Ze względu na stosunkowo krótki okres wykorzystania oznaczenia i braku
rutynowego badania poziomu AMH w przeszłości, wyznaczenie zakresów
referencyjnych może nastręczać pewne trudności. Wysokie poziomy AMH we krwi
(powyżej 4,0 ng/ml) zwykle wiążą się z PCOS. Poziom prawidłowy wynosi
zazwyczaj ponad 1,5 ng/ml aczkolwiek wartości w granicach 1,0 do 1,5 ng/ml
mogą być traktowane jako wartość prawidłowa niska. O bardzo niskim poziomie
mówi się gdy wartości AMH są poniżej 0,5 ng/ml [3]. Wartości prawidłowe mogą
różnić się pomiędzy poszczególnymi laboratoriami.
Należy także wspomnieć, że AMH u mężczyzn wytwarzany jest przez jądra w
okresie życia płodowego i przed okresem dojrzewania płciowego. W życiu
płodowym AMH powoduje zanik przewodów Müllera, natomiast w okresie
przedpokwitaniowym wpływa na rozwój i czynność jąder. Stężenie AMH pozwala
na dobrą ocenę czynności tkanki jądrowej przed okresem dojrzewania. Wykonanie
oznaczenia AMH może ułatwić decyzję terapeutyczne u dzieci z wnętrostwem i
zaburzonym rozwojem narządów płciowych. Pomiar poziomu AMH może okazać
się przydatny w badaniach niepłodności mężczyzn, niemniej jednak nie powinien
być traktowany jako jedyny marker efektywności spermatogenezy [4,5].
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Do tej pory powszechnie stosowany w ocenie rezerwy jajnikowej był poziom
folikulotropiny, wykonywany w pierwszych dniach cyklu pacjentki. Obecnie
okazuje się, że rewolucyjnym osiągnięciem w zakresie kontroli płodności i
planowania potomstwa jest możliwość określenia poziomu AMH. Tempo życia
nowoczesnych kobiet często prowadzi do odwlekania decyzji o podjęciu
macierzyństwa. AMH może stać się nie tylko sposobem na terapię zaburzeń
płodności, ale także istotnym wskaźnikiem wpływającym na zmianę życiowych
priorytetów kobiety.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Piśmiennictwo:
1. Skałba P., Cygal A. Stężenie hormonu antymüllerowskiego w surowicy u kobiet
z zespołem policystycznych jajników i w zespole przedwczesnego wygasania
czynności jajników.Przegląd Menopauzalny, 2011; 3: 232-236.
2. . Waszak K., Łukaszuk K. AMH – anti-Müllerian hormone – nowoczesna ocena
rezerwy jajnikowej. Invicta.
3. Sherbahn R. Anti-Mullerian Hormone Testing of Ovarian Reserve. Advanced
Fertility Center of Chicago.
4. La Marca A., Sighinolfi G., Radi D. et al. Anti-Mullerian hormone (AMH) as a
predictive marker in assisted reproductive technology (ART). Hum Reprod
Update, 2010; 16, 2: 113-130.
5. Alshiek JA., Lessing JB., Amit A. et al. Anti mullerian hormone (AMH)–is it a
new reliable marker of the ovarian reserve? Its role in predicting the ovarian
response in assisted reproductive technology (ART). Harefuah, 2012; 151, 7:
416-420, 435.
Nużyca – czy to problem wyłącznie
naszych pupili?
Pasożyty z rodziny Demodicidae są bardzo dobrze znane lekarzom
weterynarii, ponieważ ich obecność stwierdza się u większości psów. U
tych zwierząt zazwyczaj nie dochodzi do wystąpienia objawów
chorobowych. Natomiast w przypadku ludzi, świadomość konsekwencji
płynących z zakażenia tym pasożytem jest znacznie niższa. Niespecyficzne
objawy są często przyczyną niewłaściwego rozpoznania i wdrożenia
błędnego sposobu leczenia, pomimo że dostępna metoda wykrywania
obecności nużeńca jest stosunkowo prosta i szybka.
Nużeniec – charakterystyka
Nużyca, zwana także demodekozą jest chorobą skórną wywoływaną przez
nużeńce – pasożyty należące do rodziny Demodicidae. Nużeniec jest roztoczem
kosmopolitycznym o wysokiej specyficzności gatunkowej, a więc występuje u
różnych gatunków ssaków, a dodatkowo dany żywiciel jest związany z określonym
typem pasożyta. Cechy charakterystyczne nużeńca to przede wszystkim
robakowaty kształt ciała przypominający cygaro, zredukowane odnóża oraz
stosunkowo niewielki rozmiar. Taka budowa jest wynikiem przystosowania
nużeńców do miejsc ich bytowania, jakimi są między innymi skóra, mieszki
włosowe oraz zewnętrzne warstwy naskórka, gdzie odżywiają się łojem skórnym i
lipidami. Nużeńce unikają światła słonecznego, są więc aktywne głównie nocą i
wtedy też obserwuje się nasilone, nieprzyjemne objawy zakażenia [1].
Nużyca u psów i kotów
Nużeńce u psów występują powszechnie i uważane są za fizjologiczną faunę skóry
naszych czworonogów. Gatunkiem najczęściej występującym u psów jest Demodex
canis. Opisano również dwa inne gatunki charakterystyczne dla psów, jednak
występujące znacznie rzadziej: Demodex injai oraz Demodex cornei. Jeśli układ
odpornościowy psa działa prawidłowo, niewielka liczba pasożytów nie prowadzi
do wystąpienia objawów choroby. Do zakażenia dochodzi najczęściej w wyniku
bezpośredniego kontaktu, w trakcie wylizywania szczeniąt przez matkę, bądź
podczas karmienia.
W przypadku kotów nużyca jest wywoływana przez Demodex gatoi, który może
być przenoszony bezpośrednio pomiędzy zwierzętami, mimo to choroba występuje
stosunkowo rzadko. Objawami są łuszczące się zmiany i wyłysienia w okolicach
oczu i na powiekach, a także świąd [2].
Diagnostyka nużycy u psów i kotów opiera się na wykonaniu badania
mikroskopowego zeskrobin skóry z miejsca występowania zmian chorobowych i
stwierdzenia występowania nużeńców lub ich jaj.
Nużyca u ludzi
Do tej pory znane są dwa gatunki tego pasożyta bytujące na człowieku.
Rozwijający się głównie w mieszkach włosowych nużeniec ludzki Demodex
folliculorum (osiąga rozmiary do 0,4 mm długości) oraz zasiedlający gruczoły
łojowe nużeniec krótki Demodex brevis (osiąga rozmiary do 0,3 mm długości).
Najbardziej narażona na obecność pasożyta jest skóra twarzy (przede wszystkim
skóra nosa, czoła brody), rzadziej klatki piersiowej czy okolic brzucha.
Nużeńce przenoszone są na drodze bezpośredniego kontaktu ze skórą chorego,
za pośrednictwem zakażonych ubrań, pościeli czy przyborów kosmetycznych,
ale także wskazuje się na możliwość przenoszenia jaj pasożyta wraz z kurzem.
Bardziej podatne na zakażenie są osoby starsze, najprawdopodobniej ze względu
na obniżoną odporność. Stwierdza się także częstsze występowanie zakażenia u
kobiet niż u mężczyzn. Wzrost częstości występowania zakażeń obserwuje się
wiosną, kiedy to pasożyty te wykazują wzmożoną aktywność [1]. Jeżeli układ
immunologiczny gospodarza działa prawidłowo to obecność nużeńców najczęściej
przebiega bezobjawowo, a choroba rozwija się dopiero w momencie spadku
odporności.
Do najczęściej wymienianych objawów zakażenia nużeńcem należą: zapalenie
brzegów powiek oraz zapalenie spojówek, pieczenie, zaczerwienienie oraz
swędzenie powiek czy skóry.
Demodex folliculorum jest odpowiedzialny za wystąpienie przewlekłego
przedniego zapalenia brzegów powiek. Obecne w torebce rzęsy roztocza,
poruszają się i drażnią cebulkę włosową na drodze mechanicznej. Natomiast
drażnienie chemiczne wywołane jest przez ich produkty przemiany materii, i
prowadzi do rozdęcia cebulki włosowej. Konsekwencją obecności pasożytów w
mieszkach włosowych może być także nadmierne wypadnie rzęs oraz zmiana
kierunku ich wzrostu. Jest to powodowane podrażnieniem i hiperplazją nabłonka
oraz wystąpieniem reakcji alergicznej na chitynowy pancerz.
Z kolei Demodex brevis jest uznawany za przyczynę występowania tylnego
zapalenia brzegów powiek. Zaczopowanie ujść gruczołów łojowych przez roztocza
prowadzi do ograniczenia sekrecji fosfolipidów, a następnie wzmożonego
odparowania filmu łzowego i pojawienia się objawów zespołu suchego oka
(łzawienia, zaczerwienienia, swędzenia, podrażnienia oka, suchości i uczucia
„piasku” w oku) [3, 4].
W przypadku ludzi stwierdza się występowanie demodekozy pierwotnej i
wtórnej. Demodex folliculorum jest uznawany za czynnik wywołujący
demodekozę pierwotną, objawiającą się występowaniem zmian skórnych na około
8 -15% powierzchni twarzy. Natomiast z demodekozą wtórną mamy do czynienia
gdy w wyniku rozwoju na chorej skórze Demodex brevis, zmiany skórne obejmą
30-40% twarzy. Występujący na skórze twarzy nużeniec jest także uznawany za
jeden z czynników prowadzących do wystąpienia trądziku różowatego [5].
Obserwowane zmiany na twarzy zależą od występującego gatunku. Rumień i
złuszczanie naskórka wskazują na obecność Demodex folliculorum, natomiast za
pojawienie się wykwitów grudkowo – krostkowych odpowiada Demodex brevis.
Sugeruje się, że nużeniec może być wektorem dla Gram-ujemnej bakterii Bacillus
oleronius. Obecność tej pałeczki prowadzi do wystąpienia odpowiedzi zapalnej
mieszka włosowego, zwiększenia proliferacji, podwyższenia stężenia limfocytów T
oraz pojawienia się zmian grudkowo – krostkowych [6,7].
Badanie w kierunku nużycy jest wskazane w przypadkach rozpoznawania
trądziku różowatego, bowiem obecność nużeńca jest przyczyną nieskuteczności
leczenia przy użyciu antybiotyków.
Diagnostyka
Potwierdzenie występowania pasożytów u pacjenta jest niezwykle proste i
szybkie, bowiem opiera się na obserwacji mikroskopowej zeskrobin skórnych,
włosów czy też rzęs. Pobrany materiał umieszczony na szkiełku podstawowym
zakrapla się 20% roztworem KOH i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym. Tak
przygotowany preparat ogląda się w mikroskopie świetlnym (powiększenie 10x i
20x) w celu stwierdzenia obecności jaj, nimf, bądź postaci dorosłych pasożyta.
Coraz częściej stosowaną praktyką przez okulistów jest wstępne obejrzenie zmian
z wykorzystaniem lampy szczelinowej i wskazanie diagnoście konkretnego miejsca
na powiece, z którego ma pobrać rzęsy do badania. Inną metodą jest metoda
standaryzowanej biopsji powierzchni skóry (SSBS), która pozwala na stwierdzenie
obecności żywych, ruchliwych roztoczy oraz określenie gęstości nużeńców na 1
cm2. Na szkiełku podstawowym oznacza się powierzchnię 1 cm2 i na zaznaczone
miejsce nanosi się niewielką ilość kleju cyjanoakrylatowego, po czym przykłada
się szkiełko na 30 sekund do miejsca zmienionego chorobowo. Wykonany w ten
sposób preparat przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym i ogląda w mikroskopie
pod imersją [7,8].
Pacjent w dniu pobrania materiału nie powinien stosować na skórę żadnych
kosmetyków oraz tuszować rzęs. Dozwolone jest umycie twarzy przegotowaną
wodą.
Leczenie nużycy jest długotrwałe i obejmuje antybiotykoterapię połączoną z
odpowiednimi, regularnymi zabiegami higienicznymi, które mają na celu
mechaniczne usunięcie roztoczy. Zastosowanie w terapii zakażenia nużeńcem
znajdują też preparaty naturalne takie jak np. olejek z drzewa herbacianego [4,8].
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Nużyca u zwierząt, prawdopodobnie ze względu na cięższy przebieg choroby, jest
znacznie lepiej rozpoznawana niż u ludzi. Mało specyficzne objawy są często
przyczyną mylenia demodekozy ocznej z zapaleniem spojówek, a demodekozy
skórnej z łojotokowym zapaleniem skóry, dermatozą, trądzikiem czy alergią.
Leczenie jest tym trudniejsze i dłuższe, im później została postawiona diagnoza.
Dlatego też nie można bagatelizować objawów, których przyczyną może być
obecność nużeńca.
Małgorzata Gawin
Piśmiennictwo:
1. Sędzikowska A., Grytner-Zięcina B. Nużeniec jako czynnik etiologiczny
demodekozy – charakterystyka ogólna. Okulistyka, 2013; wydanie specjalne
październik: 3 – 5.
2. Kowalska A. Demodekoza [W:] Kowalska A. Zwalczanie pasożytniczych roztoczy
u psów i kotów – przewodnik ESCCAP nr 4. Warszawa; ESCCAP Polska; 2009: 7 –
9.
3. Schmidt P. i wsp. Nowe spojrzenie na terapię zapalenia brzegów powiek
wywołanego roztoczem z rodzaju Demodex. Farm Współ, 2010; 3: 210 – 213.
4. Rusiecka – Ziółkowska J. Rola nużeńców w etiopatogenezie przewlekłych
stanów zapalnych brzegów powiek i powierzchni oka. Okulistyka, 2013; wydanie
specjalne październik: 6-8
5. Akilov O.E. et al. A clinico-pathological approach to the classification of human
demodicosis. J Dtsch Deramtol Ges, 2005; 3, 8: 607 – 614.
6. Robak E., Kulczycka L. Trądzik różowaty – współczesne poglądy na
patomechanizm i terapię Rosacea. Potępy Hig Med Dosw, 2010; 64: 439 – 450.
7. Jarmuda S. Ocena udziału roztoczy Demodex folliculorum i laseczek Bacillus
oleronius w patogenezie trądziku różowatego. Rozprawa doktorska, Uniwersytet
Medyczny, 2013.
8. Puacz E., Maciąg E. Demodex – patogen wart przypomnienia. Diagnosta
Laboratoryjny, 2012; 3, 28: 14 – 15.
Przydatność
wskaźników
płytkowych w diagnostyce
Płytki krwi są najmniejszymi, bezjądrzastymi elementami morfotycznymi
krwi. Powstają z cytoplazmy megakariocytów. Dorosły człowiek produkuje
100 miliardów płytek dziennie, a liczba ta w ciągu dnia może wzrosnąć
nawet 20-krotnie. Regulacja wielkości płytek jest wieloczynnikowa, a same
płytki mogą być niejednorodne pod względem wielkości i gęstości.
Automatyczne metody analityczne dają możliwość obliczania wskaźników
płytkowych, które są standardowo wykonywane podczas oznaczania morfologii
krwi. Pomimo że analizatory hematologiczne wyliczają wskaźniki płytkowe już od
dawna, to ich znaczenie kliniczne nie zostało jeszcze w pełni poznane. Poniżej
przedstawiono obecny stan wiedzy na temat ich przydatności diagnostycznej [2].
Do wskaźników płytkowych wyliczanych przez rutynowo stosowane w
laboratoriach analizatory hematologiczne, należą:
– MPV (ang. mean platelet volume) – średnia objętość płytek krwi (wartość
referencyjna: 7-12 fl)
– PDW – wskaźnik zmienności objętości płytek krwi, będący
odzwierciedleniem anizocytozy (wartości referencyjne: 6,1-11 fl, a PDW%
40-60%)
– PCT – płytkokryt, stosunek objętości masy płytkowej do całkowitej
objętości krwi (wartości referencyjne: 0,14-0,36%)
– P-LCR – odsetek dużych płytek krwi (płytek olbrzymich) o objętości
powyżej 20 fl (wartości referencyjne: 0,2-5%) [4,8].
Liczba trombocytów może być oceniania tylko łącznie ze wskaźnikiem MPV,
ponieważ liczba płytek krwi jest odwrotnie proporcjonalna do ich wielkości. MPV
zależy także od czynników genetycznych, środowiskowych, biologicznych, a także
od metody badania i przygotowania próbki do analizy [4].
Im większa liczba trombocytów, tym ich średnia objętość jest mniejsza.
Duże płytkie krwi i płytki krwi olbrzymie powyżej 20 fl pochodzą z
megakariocytów o większej ploidii. Są aktywniejsze w procesach adhezji,
agregacji i sekrecji oraz mają dłuższy czas przeżycia. Pobudzenie trombopoezy
jest związane ze zwiększeniem liczby dużych płytek, a co za tym idzie wskaźnika
P-LCR [2,3,7].
Podwyższone wartości MPV występują w przypadku wzmożonej odnowy układu
płytkotwórczego i zaburzonej pierwotnej trombopoezie. W stanach rozrostowych
układu krwiotwórczego we krwi obecne są megatrombocyty i płytki olbrzymie.
Wzrost MPV obserwujemy również w nadczynności tarczycy oraz w zespole
małopłytkowości Bernarda-Souliera [1,3,4,7].
Wzrost MPV i PDW towarzyszy infekcjom bakteryjnym już we wczesnej fazie
zapalenia. Równoczesny wzrost tych wskaźników płytkowych obserwujemy
również w plamicy małopłytkowej oraz w przewlekłych białaczkach. Natomiast
wzrost PDW przy towarzyszącym spadku MPV występuje w anemii
hipoplastycznej, niedokrwistości megaloblastycznej oraz w trakcie chemioterapii
[4,7].
Wzrost MPV jest uważany za niezależny czynnik ryzyka zakrzepicy, chorób
sercowo-naczyniowych, zawału mięśnia sercowego, udaru niedokrwiennego.
W badaniach naukowych wykazano również zależność między wzrostem
wskaźników płytkowych a zespołem metabolicznym i cukrzycą typu 2 (szczególnie
u osób z powikłaniami naczyniowymi) [2,3,5,6].
Mikrotrombocytoza jest charakterystyczna dla niedokrwistości samoistnej i
pokrwotocznej oraz dla zespołu małopłytkowości Wiskott-Aldricha. Obniżenie
MPV obserwujemy również w leczeniu cytostatykami oraz w hipoplazji linii
megakariocytowej [1,4,7].
Niektóre aparaty hematologiczne mogą wyliczać dodatkowo liczbę mikropłytek
oraz płytek retikulocytarnych.
Mikropłytki (ang. platelet-derived microparticles, PDMP) są to submikroskopowe
pęcherzyki wielkości 0,1-1µm, które odłączają się od płytek krwi podczas ich
aktywacji. Pełnią one istotne funkcje prokoagulacyjne, mają również udział w
procesach zapalnych, odpornościowych oraz angiogenezie [4].
Płytki retikulocytarne (PLRET) są to młode płytki krwi, pojawiające się
najszybciej w krążeniu, uwalniane ze szpiku. Zawierają one resztki mRNA w
cytoplazmie i żyją średnio 1,8 dnia. Są dobrymi wskaźnikami trombopoezy [4].
Łysienie to problem, który dotyka także wielu kobiet
Źródło: Wikimedia Commons, autor Lovebug11768, licencja CC BY SA 3.0
Pomimo, że wskaźniki płytkowe są dostępne w diagnostyce od wielu lat, to ich
znaczenie kliniczne nie zostało jeszcze do końca poznane. Ze względu na
problemy związane ze standaryzacją metody analitycznej oraz wrażliwość pomiaru
na takie czynniki jak zastosowane antykoagulanty, czas i temperatura
przechowywania próbek oraz całkowita liczba płytek krwi, pojedyncze oznaczenie
nie może być decydującym wskaźnikiem diagnostycznym.
mgr Małgorzata Kalaga
Piśmiennictwo:
1. Dembińska-Kieć A., Naskalski W. J. Diagnostyka laboratoryjna z elementami
biochemii klinicznej. Wrocław, 2005; Elsevier Urban & Partner
2. Celik M., Yuksel U.C., Yalcinkaya E. et al. Increased Mean Platelet Volume is
Associated with Left Atrial Spontaneous Echo Contrast in Patients with Atrial
Fibrillation. J Cardiol Clin Res 2014; 2, 2: 1023.
3. Rafieian-Kopaie M., Nasri H. Platelet counts and mean platelet volume in
association with serum magnesium in maintenance hemodialysis patients. J Ren
Inj Prev 2012;1,1:17-21
4. Wasiluk A. Trombocytopenia – istotny problem kliniczny w neonatologii.
Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, 2010; 3, 1:5-9
5. Zahed A., Rostamzadeh A., Mehrpooya M. et al. Prognostic value od mean
platelet volume in patnients undergoing elective percutaneous coronary
intervention. Anadolu Kardiyol Derg 2014; 14
6. Patel S.D., Desai K.N., Gami B.N. et al. Platelet volume indices (PVI) in
metabolic Syndrome (MS). Int J Pharm Bio Sci 2014; 5, 1:59-64
7. Buttarello M., Plebani M. Automated Blood Cell Counts. State of art. Am J Clin
Pathol 2008; 130:104-116