Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR. Manipulowanie stężeniami i

Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR. Manipulowanie stężeniami i

Poradnik: Optymalizacja reakcji
PCR. Manipulowanie stężeniami i
programem termocyklera
Jak przeprowadzić „optymalizację” reakcji PCR? Co zmienić w metodyce,
by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od
czego zacząć? Czego unikać?
Dziś zwiększamy tempo, starając się już nie tylko otrzymać produkt, ale
dopracować amplifikację do perfekcji poprzez różne zabiegi chemiczne i fizyczne.
Manipulowanie stężeniami i programem termocyklera
W poprzednich częściach pisaliśmy o podstawach. O tym, jak otrzymać produkt.
Jednakże kinetyka reakcji jest często równie ważna jak sam efekt w postaci
obecności prążka na żelu. Co jeszcze możemy zrobić, by poprawić wydajność
amplifikacji?
A. Zmieniamy stężenia starterów – jeżeli na żelu po PCR widzimy na wysokości
poniżej 25-5o pz prążek, świadczy to o zbyt dużej ilości starterów dodanych do
PCR lub o słabej amplifikacji i tworzeniu par primer-dimer (czyli startery się
„kleją” same do siebie i amplifikują się zamiast matrycy!). Pary primer-dimer
możemy wyrugować podwyższając temperaturę annealingu, zaś słabą amplifikację
powinniśmy poprawić albo przez zmianę stężeń MgCl2, albo inne modyfikacje
omówione w częściach I-II.
Jeżeli nie widzimy w ogóle starterów na żelu, możemy zaryzykować podwyższenie
ich stężenia, uważając by nie przesadzić. Może to pomóc zwiększyć plon
amplifikacji lub nie, warto jednak spróbować (byle nie doprowadzić do
przeładowania starterami, widocznego na żelu).
Co jeszcze możemy zrobić ze starterami? Może się okazać że różnią się one
długością lub temperaturą annealingu,wtedy możemy zrównoważyć te różnice,
zwiększając stężenie tego z nich, który jest krótszy i ma niższą temperaturę
topnienia. Jest to stosowane najczęściej w reakcjach multiplex, w których
poszczególne pary starterów wchodzą ze sobą w interakcje i często może być
potrzebna taka ingerencja.
B. Zwiększamy ilość dNTP – raczej rzadko stosowany zabieg, może pomóc
poprzez zmianę siły jonowej roztworu. Nie należy dodawać więcej niż 2-krotnie
większej dawki dNTP niż zalecana przez producenta. bo to już w niczym nie może
pomóc.
C. Zatężanie buforu reakcyjnego – metoda wykorzystywana czasami dla
amplifikacji w multiplexie. Wiele polimeraz toleruje zwiększenie stężenia buforu
reakcyjnego od 1,1x do nawet 2x. Wyższa siła jonowa rzekomo pomaga w
amplifikacji na krótkich primerach i w reakcjach multiplex. Przy użyciu mojego
zestawu do PCR nie widziałam różnic w amplifikacji wielu różnych matryc po
zatężeniu buforu, ale wg autorów licznych publikacji (m.in. tej z Biotechniques) to
może zadziałać.
D. Ilość matrycy – zwykle rozsądną minimalną ilością DNA dodawaną do reakcji
PCR jest 10ng. Poniżej tej ilości da się wciąż otrzymać wyraźny produkt, jednak
podczas wstępnego dopracowywania warunków lepiej mieć pewność, że zbyt mała
ilość matrycy nie zakłóca przebiegu reakcji. Oczywiście matryca powinna być
wolna od zanieczyszczeń organicznych i soli, najlepiej sprawdzona uprzednio w
innej reakcji PCR i/lub oceniona spektrofotometrycznie pod kątem czystości i
stężenia.
"Stutter"
po polsku nazywany bywa "czkawką" lub "jąkaniem się" polimerazy
Co do cDNA nie ma tak precyzyjnych wytycznych, amplifikacja zależy w bardzo
dużym stopniu od rodzaju amplifikowanej matrycy RNA- czy jest to gen
wysokokopijny, czy też niskokopijny? Czy amplifikujemy koniec 3′ czy też 5′
transkryptu? Czy odwrotna transkrypcja była wykonana na oligo-dT, na
heksamerach,czy też na starterze specyficznym? Jakiego zestawu użyliśmy do RT?
Czasami brak produktu RT-PCR może świadczyć nie o braku amplifikacji, ale o
bardzo niskiej ekspresji amplifikowanego genu w danej próbce, albo też o
degradacji/zanieczyszczeniu matrycy. Jeśli chodzi o ilość cDNA poddawaną
amplifikacji, to starajmy się korzystać (w przeliczeniu na RNA użyte do reakcji RT)
z co najmniej 50ng RNA (dla przykładu może to być 1µl cDNA, jeżeli do 20µl
reakcji RT dodane było 1000ng RNA, bo 1000/20=50).
Jeżeli nie jesteśmy pewni, czy w naszej próbce znajduje się mało czy dużo kopii
amplifikowanego cDNA, możemy w niektórych przypadkach bardziej znanych
organizmów posiłkować się profilami ekspresji genów, dostępnymi np.w bazie
GEO lub TiGER.
Warto pamiętać jeszcze o jednym szczególe: wiele genów posiada kilka izoform
tego samego genu ( alternatywny splicing!). Dlatego przed wyrzuceniem
starterów podejrzanych o niespecyficzna amplifikację sprawdźcie, czy dodatkowe
produkty to nie warianty splicingowe!
E. Program amplifikacji: czas i temperatura (szczególnie annealingu) mają
znaczenie dla wydajności amplifikacji. Niestety tak jak w przypadku składników
mieszaniny reakcyjnej, dla każdej matrycy idealne warunki amplifikacji trzeba
wyznaczyć empirycznie. Generalnie programy PCR dzielimy na 2- i 3-etapowe.
Dwuetapowe używane są zwykle w reakcjach qRT-PCR, ale nic nie stoi na
przeszkodzie, by stosować je także w konwencjonalnym PCR. Wówczas
naprzemiennie stosuje się temperaturę annealingu (zwykle ok. 60 stopni) i
denaturację (94-95 stopni). Programy trójstopniowe pomiędzy annealingiem a
denaturacją zawierają etap elongacji w optimum termicznym enzymu, ok. 72
stopni.
Warto wspomnieć także o drugim kluczowym dla reakcji PCR elemencie: o
denaturacji wstępnej, która w przypadku enzymów rekombinowanych typu
HotStart jest niezbędna dla aktywacji polimerazy. Ten etap może być zasadniczo
pominięty dla enzymów nierekombinowanych (stosuje się zwykle tylko krótką, np.
2-minutową denaturację w 94 stopniach). Dla enzymów HotStart programujemy
cykler na dłuższą denaturację wstępną zgodnie z instrukcją producenta, zwykle na
5-15 minut w temperaturze 95 stopni.
Oczywiście manipulowanie temperaturą nie wyczerpuje możliwości
modyfikowania przebiegu reakcji. Możemy np. próbować wydłużać czas
annaelingu i/lub elongacji. Bardzo skrajnym przykładem takiego postępowania
jest tzw. rapid PCR. Ten wariant PCR polega na zerosekundowych (sic!),
naprzemiennych etapach denaturacji (95-98 stopni) i annealingu (50-65 stopni) w
namnażaniu krótkich (<100pz) amplikonów. W rezultacie cała reakcja PCR może
trwać zaledwie kwadrans i dawać całkiem ładny profil amplifikacji! (drobna
uwaga: większość zwykłych termocyklerów nie ma możliwości technicznych, by
oscylować pomiędzy temperaturą 50 stopni i 98 stopni w odpowiednich
interwałach czasowych, więc takie reakcje prowadzi się w termocyklerach do
qRT-PCR)
Kolejną ciekawą modyfikacją programu reakcji jest stosowanie tzw. „touchdown
PCR„. Jest to ciekawa propozycja szczególnie dla osób, które chcą optymalizować
multiplex PCR.
Stosujemy go jeżeli:
-mamy w mieszaninie reakcyjnej 2 pary starterów, z których jedna amplifikuje się
preferencyjnie w wyższej temperaturze, a druga w niższej,
-gdy dana para starterów tworzy pary primer-dimer
-gdy w reakcji tworzą się oprócz produktu głównego także produkty
niespecyficzne
Tradycyjnie w tych przypadkach możemy wybierać w kwestii temperatury
amplifikacji: albo amplifikujemy z gorszą wydajnością w wyższej temperaturze,
albo godzimy się na niespecyficzną amplifikację/powstawanie dimerów
starterów/nierówną amplifikację w multiplexie w niższej temperaturze. Wyjściem
pośrednim, niejako kompromisem jest sztuczka z „opadającym PCR”. Idea jest
prosta: z każdym cyklem temperatura annealingu obniża się o zadeklarowaną
ilość stopni celcjusza. Wobec tego w początkowych cyklach amplifikacja jest
gorsza (bo temperatura wyższa niż optimum), ale faworyzowany jest wyłącznie
specyficzny produkt. W kolejnych cyklach warunki amplifikacji są coraz
łagodniejsze, dążą do optimum, ale ilość specyficznego produktu
wygenerowanego w pierwszych cyklach w wyższej temperaturze jest na tyle duża,
że ma on przewagę amplifikacji nad wszelkimi „śmieciami”, które mogłyby z nim
konkurować, o ile nie zostałby zastosowany „touchdown”. Tym samym pomagamy
żądanemu amplikonowi „wybić się” w tłumie niespecyficznych produktów reakcji.
Jeszcze inną, interesującą modyfikacją programu PCR jest „pomostowanie”
annealingu i elongacji (tzw. „ramp-PCR„). Polega to w dużym skrócie na
powolnym podwyższaniu temperatury annealingu do temperatury elongacji.
Wówczas nie deklarujemy czasu trwania etapu annealingu, za to wyznaczamy jak
„stromy” ma być pomost, np.możemy zastosować „ramp” od 56 stopni do 72
stopni ze wzrostem temperatury co 1 sekundę o 0,1 stopnia albo o wiele szybszy,
jeżeli będziemy zwiększać temperaturę o 0,5 stopień. Parametr „ramp”
wpisywany jest zwykle do programu termocyklera jako %.
Co nam daje pomostowanie w PCR? Przede wszystkim może poprawić
amplifikację specyficznego produktu, szczególnie dla primerów o bardzo różnej
temperaturze annealingu. Są także matryce, które cechują się sekwencją
repetytywną. Na takich sekwencjach polimeraza lubi się „jąkać”, „mieć czkawkę”
lub „ślizgać się” (takie nazwy potoczne funkcjonują w różnych laboratoriach),
tworząc niespecyficzne produkty o kilka par zasad mniejsze lub większe niż
produkt główny. Jest to bolączką np. genotypowania polimorfizmu STR w
kryminalistyce. Pomostowanie pomaga pozbyć się tych „zająknięć” (ang.
„stuttter”), co jest kluczowe dla analiz sądowych. Poniżej przedstawiamy przykład
takiego właśnie „zająknięcia”.
Rycina 1: Zjawisko „stutter” powoduje tworzenie się małych ilości
produktów niespecyficznych o obniżonej lub (rzadko) podwyższonej
długości w stosunku do właściwego amplikonu. W tym przypadku jest to
zanieczyszczenie o niewielkim znaczeniu, niedopracowana reakcja PCR
może jednak spowodować „stutter” obciążający nawet o ponad 20%
produkt amplifikacji! Źródło ryciny.
Tym oto sposobem dobrnęliśmy do końca części trzeciej. W ostatnim odcinku
zaprezentujemy chemiczne dodatki, które pomogą stopić trudne matryce, bogate
w pary GC, podsumujemy też cały cykl artykułów. Dziś nie pozostaje mi już nic
innego, jak życzyć Wam dalszych udanych optymalizacji.
Piśmiennictwo:
Doświadczenia własne
Data publikacji: 18.02.2016r.