Wstęp: Przeczytaj raz! Protocol: Testing nuclear markers

Transkrypt

Wstęp: Przeczytaj raz!
Protocol: Testing nuclear markers developed from a focal species
Reagents and materials
PROCEDURE
Protokół: Przygotowanie szalek do klonowania (Blue-White Screening)
Odczynniki i materiały
PROCEDURA
Protocol: DNA extraction with Promega solution-based kit
PROCEDURE
Protokół: PCR
UWAGI WSTĘPNE
PROCEDURA
Protokół: Colony PCR
UWAGI WSTĘPNE
PROCEDURA
Protokół: Czyszczenie reakcji PCR metodą ExoAP
PROCEDURA
Protokół: Reakcja sekwencjonująca
PROCEDURA
Protokół: EDTA-EtOH purification of sequencing reactions reactions
Materials and reagents
PROCEDURA
Protokół: Ligacja produktu PCR w wektor przy użyciu kitu StrataClone
PROCEDURA
Protokół: Transformacja bakterii kompetentmych produktem ligacji
PROCEDURA
Protokół: RNA extraction using RNAzol
Introduction
Introductory remarks
PROCEDURE
Protokół: mRNA purification from total RNA using polyT-Dynabeads
PROCEDURE
Dynabeads washing
Purification of mRNA from total RNA
Protokół: Reverse transcription using RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis
Kit
PROCEDURE
Protokół: Second strand cDNA synthesis
PROCEDURE
Protokół: Izolacja całkowitego RNA zestawem RNeasy Mini
Wprowadzenie
UWAGI WSTĘPNE
PROCEDURA
Protokół: Trawienie DNazą
PROCEDURA
Protokół: Odwrotna transkrypcja kitem Omniscript (Qiagen)
UWAGI WSTĘPNE
PROCEDURA
Protokół: Amplification and Sanger sequencing of the 1200 bp mtDNA ND2 fragment in
newts Lissotriton montandoni and L. vulgaris
Reagents
PROCEDURE
Bufory i stoki
Binding Buffer for Dynabeads mRNA purification from total RNA
Washing Buffer B for Dynabeads mRNA purification from total RNA
Lysis/Binding Buffer for re-using of Dynabeads
EDTA
TAE
TBE
TE
Wstęp: Przeczytaj raz!
Protokoły zmieszczone w tym dokumencie są przedstawione tak, jak robimy poszczególne
procedury w ZEMiBie. W większości były sprawdzone wielokrotnie metodą prób i błędów,
często stanowią modyfikacje oryginalnych protokołów wprowadzone żeby: a) działały, b) były
szybsze, c) tańsze, d) wygodniejsze. Co wcale nie znaczy że są optymalne - wszelkie
sugestie modyfikacji, szczególnie oparte na doświadczeniu i zrozumieniu mechanizmu mile
widziane.
W opisie odczynników i materiałów potrzebnych do poszczególnych protokołów pominięto
rzeczy potrzebne zawsze lub prawie zawsze i ogólnie dostępne takie jak: probówki
eppendorfa, płytki do PCR, samoprzylepna folia aluminiowa, pipety automatyczne i końcówki
do nich, wodę destylowaną itd.
Protocol: Testing nuclear markers developed
from a focal species
This protocol assumes that primers to be tested were designed on the basis of sequences
derived from the same species.
Liophilized primers
Qiagen Multiplex kit
Nuclease Free water
PCR plates
Strip caps
TE buffer
1.5 ml centrifuge tubes
Genomic DNA - use > 10^3 genome copies per PCR reaction if possible; DNA concentration
can be measured using Nanodrop. When in doubt/starting with a new organism/expecting
low DNA concentration use Qubit (contact lab manager)
Guidelines for popular organisms [ng DNA per PCR reaction]
newt 30 - 300 ng
mouse 3-100 ng
Drosophila 0.2 - 20 ng
mite 0.3 -30 ng
PROCEDURE
1. Spin down liophilized primers
2. Prepare 100 uM stock solution of each primer: add the required volume of TE buffer to
the liophilized primer in the original tube. IMPORTANT! Stock solutions of primers should be
stored at -20C; freezing-thawing cycles should be minimized - prepare aliquots as indicated
below
3. Prepare aliquots (at least one per primer), 10-30 ul; if primers will be tested using a few
samples it may be more convenient (because of pipetting volumes) to prepare 20 uM
aliquots; these can be stored in fridge for a couple of days. After several freeze-thaw
cycles aliquots should be discarded.
4. Set up PCR reaction. Premix the amount required for (N+1[for negative control])*1.05 or
1.1 - to account for pipetting/calibration errors. The amount for a single PCR reaction is:
Qiagen Multiplex Mix
7.5 ul
F primer (100 uM)
0.1 ul
R primer (100 uM)
0.1 ul
DNA
required amount in a volume of 0.5-2 ul
PCR water
up to 15 ul
If a larger amount of PCR product is needed adjust the volumes accordingly. The final
concentration of primers should be 0.5-1 uM, if using stocks at concentrations
different than 100 uM, adjust the volumes accordingly.
5. Perform PCR reaction according to the following cycling scheme:
95C
15 min
30 x:
94C
30 s
55C
60 s
72C
60 s
72C
10 min
8C
forever
6. Run an aliquot on a 1.5% agarose gel
Protokół: Przygotowanie szalek do
klonowania (Blue-White Screening)
SIGMA
● LB Agar
●
L2897-1KG
Ampicilin sodium salt
A0166-5G
Roztwór ampicyliny w wodzie (100 mg/ml) zalikwotować i zamrozić w -20C
FERMENTAS
● X-Gal Solution ready-to-use
Przechowywać w lodówce
R0941
●
IPTG Solution ready-to-use (100mM) R1171
Przechowywać w -20C
Inne odczynniki i materiały
● woda dejonizowana
● szalki plastikowe 90 mm - standardowe szalki mikrobiologiczne
PROCEDURA
Przepis na 250 ml pożywki, wystarcza na wylanie 10 szalek 90 mm
1. W zlewce 500 ml odważyć 8.75 g LB Agar
2. Dodać wody dejonizowanej do objętości 250 ml
3. Wrzucić mieszadełko i mieszać na mieszadle magnetycznym ok. 5 min
4. Nakryć folią aluminiową i autoklawować ok. 30 min (nie wyjmując mieszadełka)
autoklawowanie musi być wystarczająco długie żeby agar się całkowicie rozpuścił, w
przeciwnym razie szalki nie wyjdą
5. Po ukończonym autoklawowaniu umieścić na mieszadle magnetycznym i mieszając
doprowadzić do temp ok. 40-50ºC (takiej, aby można było wziąć zlewkę do gołej ręki)
ciągle mieszając (można umieścić w pojemniku z zimną wodą)
6. Pod komorą laminarną dodać 250 ul roztworu X-Gal, 250 ul roztworu IPTG, oraz 250 ul
roztworu ampicyliny, wymieszać
7. Pod komorą laminarną wylać szalki, tak, aby roztwór pokrył dno
8. Szalki przykryć i pozostawić aż agar stężeje, następnie odwrócić dnem do góry. Szalki z
ampicyliną/X-Gal/IPTG opisujemy: pionowa czerwona kreska i napis XGal
9. Szalki można pozostawić do podeschnięcia w temp pokojowej przez 1 dzień,
przechowywać w worku foliowym w lodówce do 1 miesiąca.
Modyfikowany: 9.01.10 MK
Protocol: DNA extraction with Promega
solution-based kit
PROMEGA
● Nuclei Lysis Solution
●
Protein Precipitation Solution
FERMENTAS
● Proteinase K
A7943 or A7941
A7953 or A7951
EO0491 or EO0492
Other reagents and materials
● TE buffer
or other buffer suitable for DNA strorage
● Isopropanol 99%
● Ethanol 70%
PROCEDURE
1. If using ethanol preserved tissues, remove tissue from ethanol and place in a tube
containing ca 0.5 ml of distilled water for 15-30 min. Then remove water and proceed
further without transferring tissue to new tube.
2. Put a small tissue fragment (0.5 cm of mouse tail, a piece of soft tissue up to 100 mg;
the less tissue the purer extracted DNA will be) in 600 ul of Nuclei Lysis Solution
3. Add 5-10 ul of Proteinase K (depending on tissue, in case of soft tissues 5 ul is enough,
tougher or ethanol preserved may require 10 ul)
4. Mix well or vortex
5. Incubate at 55ºC for 1-12 h, if possible shake every half an hour or so. If after 2-3 h
tissue is still intact, add another 5-10 ul of Proteinase K and continue incubation. When
tissue is partially digested, shake the tube well - tissue will then disintegrate.
6. Cool lysate to room temperature
7. Add 200 ul of Protein Precipitation Solution
8. Mix well or vortex
9. Place in a freezer (-15-20C) for 10 min
10. Centrifuge for 4 min at maximum speed (10-15 krpm)
11. In the meantime prepare new labeled tubes containing 600 ul of isopropanol
12. Transfer supernatant to new tube containing isopropanol (transfer may be done
pipetting but it is usually easier and faster to simply pour; some supernatant should be
left in the tube); mix by inverting the tube. Precipitated DNA may become visible as
white strands.
13. Centrifuge for 2 min at maximum speed
14. Carefully remove isopropanol (precipitated DNA should be visible as white pellet)
Caution! Pellet may be loose and sometimes it may be necessary to remove
isopropanol by pipetting
15. Add 600 ul of 70% ethanol; mix
16. Centrifuge for 2 min at maximum speed
17. Remove ethanol and keeping the tube „upside down” place on a paper towel until dry
(usually up to 1 h, be careful not to overdry).
18. Add 100 ul of TE and rehydrate in a fridge for min. 12 h. Before measuring DNA
concentration mix well by pipetting
Depending on the needs, DNA may by stored also in other buffers.
DNA in TE can be stored for prolonged periods (months and longer) in a fridge and
forever in a -20C freezer
19. Quantity and quality of extracted DNA may be checked, again depending on the needs,
using Nanodrop, agarose gel electrophoresis of fluorescent Qubit quantification or any
combination of these methods.
Modified: 24.06.12 WB
Protokół: PCR
FERMENTAS
● polimeraza Taq (dostarczana z buforem i MgCl2)
EP0401-EP0406
● dNTP 10 mM
R0191-R0193
●
●
woda do PCR
startery (100 uM)
UWAGI WSTĘPNE
Istnieje wiele protokołów PCR, zależnie od tego co namnażamy, jakiego używamy enzymu,
jakie są właściwości starterów. W zeleżności od tych czynników odpowiednie protokoły mogą
się drastycznie różnić. Celem niniejszego protokołu jest dostarczenie punktu startowego.
Jeżeli nie wiesz prawie nic o genie który zamierzasz namnażać, wtedy zacznij od tego
protokołu. W zależności od wyników wstępnych eksperymentów modyfikuje się:
● rodzaj użytego enzymu
często lepsze wyniki uzyskuje się stosując polimeraz HotStart (Fermentas:
EP0601-EP0603; Qiagen: 203443, 45, 46). Szczególnie dotyczy to przypadków gdy
problemem jest niespecyficzna amplifikacja lub tworzenie się primer-dimerów
● stężenie starterów
stężenie standardowo może wynosić 0.1-1 uM, czasem pomaga zwiększenie, czasem
zmniejszenie ilości starterów
● temepartura przyłaczania starterów
ma zasadnicze znaczenie dla wyniku PCR; temperatura przyłączania waha się od 40 do
65C; zazwyczaj między 50 a 60C. Wbrew powszechnej opinii, zależnie od przypadku,
zarówno podniesienie jak i obniżenie temperatury może poprawić wyniki. Gdy zachodzi
potrzeba empirycznego ustalenia temperatury przyłaczania sterterów testujemy trzym
temperatury: 50, 53, 56C, chyba że mamy już jakieś dodatkowe informacje.
● ilość DNA (matrycy), zbyt mała ilość nie pomaga, ale i zbyt duża może przeszkadzać;
na ssaczym DNA PCR dobrze działa już na 1-5 ng, ilości ponad 500 ng na reakcje mogą
powodować problemy - niespecyficzną amplifikację lub brak amplifikacji
Natomiast zazwyczaj mniejsze znaczenie ma:
● Stężenie jonów magnezu
Zazwyczaj standardowe stężenie 1.5-2 mM jest dobre. Raczej nie ma szans że sama
zmiana stężenia magnezu spowoduje że PCR zacznie działać
● Objętość reakcji
Zwykle wynosi 10-20 ul, ale gdy zachodzi potrzeba reakcję PCR można przeprowadzać
w objętościach 5->50 ul.
PROCEDURA
1. Rozmrozić 10 x bufor z (NH4)2SO4, MgCl2, dNTP, startery i DNA. Po rozmrożeniu każdy
odczynnik wymieszać (pipetowanie, wortkesowanie i zwirować) i umieścić na lodzie.
2. Na lodzie przygotować mieszaninę, w ilości 1.05-1.1 x (N+1), gdzie N to liczba
3.
4.
5.
6.
7.
namnażanych próbek, +1 oznacza negatywną kontrolę. Uwaga! Polimerazę Taq
wjmujemy z zamrażarki bezpośrednio przed dodaniem do miksu. Poniżej podane ilości na
1 próbkę:
woda do PCR
14.8 ul
10 x bufor z (NH4)2SO4
2.0
25 mM MgCl2
1.2
10 mM dNTP
0.4
100 uM starter F
0.2
100 uM starter R
0.2
Taq (5u/ul)
0.2
Dokładnie wymieszać przez pipetowanie
Rozlać do probówek/dołków po 19 ul
Do N probówek/dołków dodać po 1 ul ekstraktu DNA (5-500 ng)
Do probówki/dołka N+1 można dodać 1 ul wody, ale można też nic nie dodawać.
Dokładnie zamknąć probówki, docisnąć wieczka
Wsadzić do maszyny do PCR i uruchomić program:
94C
150 s
35 cykli:
94C
30 s
52C
30 s
72C
60 s72C
180 s
8C
pauza
8. Produkt PCR przetrzymujywać przez parę dni w lodówce, do dłuższego przechowywania
zamrozić w -20C
Modyfikowany: 19.12.09 WB
Protokół: Colony PCR
FERMENTAS
● polimeraza Taq (dostarczana z buforem i MgCl2)
EP0401-EP0406
● dNTP 10 mM
R0191-R0193
●
●
woda do PCR
startery M13F i M13R (100 uM)
UWAGI WSTĘPNE
W tym PCR namnażamy insert wstawiony w wektor, używając starterów komplementarnych
do sekwencji wektora, położonych z obu stron, w odległości ok 100 pz od miejsca wstawienia
insertu. Wszystkie wektory których używamy zawierają sekwencje komplementarne do
starterów M13. Jeżeli komuś zależy na tym, aby startery używane w colony PCR znajdowały
się bliżej miejsca insercji można używać starterów T7 i SP6.
Jako matryca do PCR służy bezpośrednio pobrana z szalki kolonia bakteryjna zawierająca
wektor z insertem. Kolonie umieszcza się w wodzie destylowanej, gdzie bakterie pękają
uwalniając DNA w tym plazmidy do roztworu.
PROCEDURA
1. Przygotowujemy do pracy komorę laminarną w labie mikrobiologicznym
2. W labie przed-PCR do probówek PCR (lub dołków w płytce do PCR) nalać 15 ul wody do
PCR. Liczba probówek powinna wynosić N+1, gdzie N to liczba pikanych kolonii.
3. Płytkę przenosimy (można wzią stojaczek z labu po-PCR) do labu mikrobiologicznego.
4. Pod komorą laminarną, używając białych końcówek i pipety 0.5-10 ul przeniesionej z
labu po-PCR, pikamy z szalki (szalek) potrzebną ilość białych kolonii
Uwaga: Trzeba zwrócić uwagę żeby pikane kolonie były i) całkiem białe, bo obok
intensywnie niebieskich są jeszcze jasnoniebieskie, ii) dobrze odzdielone od innych
kolonii na szalce
5. Przenieść płytkę z pikniętymi koloniami do labu po-PCR. Po piknięciu kolonie mogą
pozostawać w wodzie przez 1-3 godziny, jednak nie jest to nienieczne, czyli można
zaraz przejść do kolejnego kroku.
Uwaga: Na tym etapie można piknięte kolonie w wodzie zamrozić w -20°C.
6. W labie pre-PCR na lodzie przygotować mieszaninę, w ilości 1.05-1.1 x (N+1), gdzie N
to liczba namnażanych próbek, +1 oznacza negatywną kontrolę. Uwaga! Polimerazę
Taq wjmujemy z zamrażarki bezpośrednio przed dodaniem do miksu. Poniżej podane
ilości na 1 próbkę:
10 x bufor z (NH4)2SO4
2.0
25 mM MgCl2
1.2
10 mM dNTP
0.4
100 uM starter F
0.1
100 uM starter R
0.1
Taq (5u/ul)
0.1
Dokładnie wymieszać przez pipetowanie
7. Przenieść mix do labu po-PCR
8. Rozlać do probówek/dołków po 3.9 ul
9. Dokładnie zamknąć probówki, docisnąć wieczka
10. Wsadzić do maszyny do PCR i uruchomić program:
94C
150 s
27 cykli:
94C
20 s
55C
20 s
72C
45 s72C
180 s
8C
pauza
Uwaga: czas wydłużania w 72C zależy od oczekiwanej długości produktu (dł. insertu +
ok. 200 pz)
11. Produkt PCR przetrzymywać przez parę dni w lodówce, do dłuższego przechowywania
zamrozić w -20C.
Protokół: Czyszczenie reakcji PCR metodą
ExoAP
FERMENTAS
● FastAP
● Exonuclease I (Exo I)
PROCEDURA
EF0651, EF0652, EF0653
EN0581, EN0582
1. o I i FastAP w stosunku 1:4. Na lodzie zmieszać Exardzo dokładnie wymieszać przez
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
pipetowanie, oba enzymy są dostarczane w buforze zawierającym wysokie stężenie
glicerolu, stąd gęstość i trudności zmieszaniem. Ten krok jest kluczowy!
Mieszaninę enzymów można przechowywać w -20C miesiącami, dlatego najlepiej
przygotować jej od razu dużo.
Na lodzie przygotować mieszaninę, w ilości 1.05-1.1 x N, gdzie N to liczba
oczyszczanych próbek. Poniżej podane ilości na 1 próbkę:
1 x Bufor do PCR (taki jak w oczyszczanej reakcji)
1.15 ul
Mieszanina ExoAP
0.35 ul
Dokładnie wymieszać przez pipetowanie.
Do 4 ul produktu PCR dodać 1.5 ul mieszaniny
Jeżeli chcemy oczyścić większą ilość produktu PCR dodajemy odpowiednio więcej
mieszaniny.
Szczelnie zamykamy probówki/płytkę.
Wirujemy płytkę przez kilka sekund żeby cały płyn znalazł się na dnie probówki dołka.
Wstawiamy do maszyny do PCR i uruchamiamy program:
37C
15 min
80C
15 min
Tak oczyszczony produkt można przechowywać kilka dni w lodówce, dłużej w -20C
Protokół: Reakcja sekwencjonująca
ABI
●
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
4337455
lub
● BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit
4337450
Kit zawiera BigDye Terminator Ready Reaction Mix i 5 x Sequencing Buffer
Prawie zawsze używamy kitu w wersji 3.1, protokół przygotowywania reakcji
sekwencjonującej jest taki sam dla obu kitów
BigDye Terminator Ready Reaction Mix przechowujemy w małych alikwotach w -20C
●
starter do sekwencjonowania w stężeniu 3.2 uM (3.2 pmol/ul)
PROCEDURA
Należy przygotować 5-10% więcej mieszaniny niż potrzebujemy, inaczej zabraknie
1. Na lodzie przygotowujemy mieszaninę, w ilości 1.05-1.1 x N, gdzie N to liczba
sekwencjonowanych próbek. Poniżej podane ilości na 1 próbkę
Woda do PCR
5.75 ul
5 x Sequencing Buffer
1.75 ul
Starter 3.2 uM
1.00 ul
BigDye Terminator Ready Reaction Mix
0.50 ul
BigDye Terminator Ready Reaction Mix po rozmrożeniu dokładnie mieszamy przez
pipetowanie i odwirowujemy.
Mieszanine dokładnie mieszamy przez pipetowanie.
2. Do każdej probówki (dołka w płytce do PCR) dajemy 9 ul mieszaniny.
3. Do każdej probówki dodajemy 1 ul matrycy DNA (produkt PCR oczyszczony na
kolumnach (zgodnie z protokołem produceta) lub ExoSAP (Protokół: Czyszczenie reakcji
PCR metodą ExoSAP)
Jeżeli jest taka potrzeba można dodać do 4 ul matrycy. Wtedy odpowiednio
zmniejszamy ilość wody w mieszaninie, tak, żeby końcowa objętość reakcji wynosiła 10
ul.
4. Szczelnie zamykamy probówki/płytkę.
5. Wirujemy płytkę przez kilka sekun żeby cały płyn znalzł się na dnie probówki dołka.
6. Wstawiamy do maszyny do PCR i uruchamiamy program:
96C
60 s
35-40 cykli:
96C
10 s
50C
5s
60C
120 s
7. Po zakończeniu reakcji sekwencjonującej produkt oczyszczamy zgodnie z
protokołem:EDTA-EtOH purification of sequencing reactions reactions (BDT v. 1.1 or
3.1)
Protokół: EDTA-EtOH purification of
sequencing reactions reactions
●
●
●
0.125 M EDTA
prepare from stock solution
96% ethanol
70% ethanol
PROCEDURA
The procedure below is for 10 ul sequencing reactions; if sequencing was performed
in a different volume, adjust volumes accordingly.
The procedure assumes the use of the Eppendrorf 5804 centrifuge with the plate
rotor
The procedure is suitable for both BDT v. 1.1 and 3.1 kits
1. Add 2.5 µL of 125 mM EDTA to each well
IMPORTANT: Make sure the EDTA reaches the bottom of the wells
IMPORTANT: DO NOT use premix of EDTA and ethanol because EDTA would precipitate
2. Add 32 µL of 96% ethanol to each well
3. Seal the plates with adhesive foil and mix by inverting
4. Incubate in darkness at room temperature for 15 min
5. Centrifuge plate at the maximum speed for 30 min
IMPORTANT! Proceed to the next step immediately. If this is not possible, then spin the
plate for 2 minutes more immediately before performing the next step.
6. Remove the plate from the centrifuge, pour out the liquid and dry on a paper towel
(zdziera sie folie i nad zlewem wylewa sie plyn, trzeba strzepnac plytke, potem, nie
odwracajac plytki, odcisnac na reczniku papierowym)
7. Add 30 µL of 70% ethanol to each well
8. Centrifuge plate at the maximum speed for 15 min
9. Remove the plate from the centrifuge, pour out the liquid and dry on a paper towel
(zdziera sie folie i nad zlewem wylewa sie plyn, trzeba strzepnac plytke, potem, nie
odwracajac plytki, odcisnac na reczniku papierowym)
10. Dry in speed-vac, D-AL program, at room temp or at 60C
11. Plate with dry pellets sealed with the adhesive foil may be stored in a fridge; add 15 ul
formamide and mix by pipetting before running on a sequencer
Protokół: Ligacja produktu PCR w wektor przy
użyciu kitu StrataClone
STRATAGENE
StrataClone™ PCR Cloning Kit
240205
PROCEDURA
Uwaga: ten kit do klonowania opiera się na zastosowaniu topoizomerazy i działa na zupełnie
innej zasadzie niż np. Promega pGEM, wykorzystujący ligazę DNA. szczegóły można znaleźć w
manualu: http://www.stratagene.com/manuals/240205.pdf.
Uwaga: ten protokół zakłada że nie robimy kontroli. Zwykle nie są one potrzebne, jednak gdy
coś idzie źle można zrobić odpowiednie kontrole zgodnie z manualem.
Uwaga: Klonujemy produkt PCR uzyskany dołączającą A na końcu (prawie wszystkie
polimeray używane w ZEMiB); jeżeli chcemy klonować produkt uzyskany polimerazą
produkującą fragmenty o tępych końcach należy: 1) zastosować procedurę dodawania A do
końców produktu PCR (opisana np w: http://www.stratagene.com/manuals/240205.pdf) albo
2) użyć innego zestawu do klonowania.polimerazą
Uwaga: Produkt PCR przed klonowaniem oczyszczamy na kolumnach (np. Qiagen MinElute
PCR Purification Kit).
Uwaga: Jeżeli produkt PCR ma więcej niż 1 prążek, lub jeżeli chcemy klonować długie
fragmenty, produkt PCR rozdzielamy w żelu agarozowym, wycinamy interesujący nas prążek i
oczyszczamy na kolumnach (np. np. Qiagen MinElute Gel Extraction Kit).
Po oczyszczeniu na kolumnach produkt zawieszamy w buforze EB (Qiagen), lub jakimś innym
lekko zasadowym buforze nie zawierającym EDTA.
1. W probówce umieścić:
2 μl StrataClone Cloning Buffer (z kitu)
1.4 μl oczyszczoneo produktu PCR
0.6 μl StrataClone Vector Mix amp/kan (z kitu)
2. Delikatnie wymieszać przez pipetowanie
3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min
4. Zamrozić w -20C lub użyć bezpośrednio do transformacji bakterii (Protokół:
Transformacja bakterii kompetentnych produktem ligacji)
Uwaga: do transformacji reakcją ligacji StrataClone zawsze używamy bakterii
StrataClone SoloPack. Informacje dlaczego można znależć w manualu:
http://www.stratagene.com/manuals/240205.pdf
Protokół: Transformacja bakterii
kompetentmych produktem ligacji
SIGMA
● medium SOC
S1797
●
Bakterie kompetentne odpowiednie dla użytego wektora
dla zestawu pGEM T (Promega) będą to bakterie JM109, dostarczane z kitem
lub kupowane osobno (#L2001)
dla zestawu StrataClone (Stratagene) będą to bakterie StrataClone
SoloPack dostarczane z kitem
dla innych syetemów do klonowania odpowiednie bakterie, sprawdzić czy nadaje się
dla nich standardowy protokół transformacji
Uwaga: Bakterie kompetenthe muszą być przechowywane w -70C,
przechowywane w niższej temperaturze lub rozmrażane i zamrażane tracą kompetencję
● Szalki do Blue/White screeningu (Protokół: Przygotowanie szalek do klonowania
(Blue-White Screening))
● Blok grzejny na probówki Eppendorfa z wytrząsaniem
● Komora laminarna
● Produkt PCR wstawiony w wektor (Protokoły: Ligacja produktu PCR...)
PROCEDURA
1. Po wyjęciu z –70ºC bakterie umieścić na lodzie, ponieważ znajdują się w 50% glicerolu
rozmrożą się szybko nawet na lodzie.
2. Gdy bakterie się rozmrożą zamieszać delikatnie przez pipetowanie
3. W probówce eppendorfa umieścić 1-5 ul mieszaniny ligacyjnej (Ilość mieszaniny
ligacyjnej zależy od spodziewanej efektywności transformacji, jeżeli nie jeteś
pewien(na) dodaj całość)
4. Do probówki dodać 20-25 ul świeżo rozmrożonych na lodzie bakterii.
5. Bardzo delikatnie wstrząsnąć
6. Umieścić probówki na lodzie na 20 min
7. Przenieść probówki do bloku grzejnego nastawionego na dokładnie 42ºC i inkubować
przez 45-50 sek.
8. Natychmiast przenieść probówki na lód i trzymać na lodzie przez 2 min
9. Dodać 500 ulmedium SOC
10. Inkubować w 37ºC z wytrząsaniem przez 1 h
11. Wysiać całość na szalki
Jeżeli nie jesteś pewien(na) jak dużo koloni otrzymasz to trzeba wysiać produkt
transformacji na 2 szalki: na jedną 50 ul a na druga resztę (450+ ul). Gdy gęstość
kolonii jest zbyt duża, co zdarza się gdy klonujemy bradzo mocny lub krótki produkt
PCR, używać do transformacji tylko część reakcji ligacji.
Uwaga: Powyższa procedura nie obejmuje kontroli zalecanych przez producenta, należy je
przeprowadzać gdy istnieją podejrzenia co do jakości odczynników lub bakterii kompetentnyc,
lub gdy klonowanie przestaje wychodzić.
Protokół: RNA extraction using RNAzol
Introduction
This protocol is a streamlined version of the protocol available at
http://www.mrcgene.com/rnazol.htm tailored for the typical applications in our lab. For full
explanation and modifications see the web page
●
●
ethanol 96-100%
ethanol 75%
Caution! RNAse free water must be used for preparation of ethanol solutions
●
RNAse free pipette tips and eppendorf tubes, essential! both 1.5 and 2 ml. We buy
RNAse free plasticware
●
DEPC-treated metal homogenizer tips. They should be soaked (min 12 h) in water
containing 0.1% DEPC, and then dry in the drier, individually wrapped in the aluminium foil for
ca. 24 h.
1.
Using this method large amounts of RNA can be extracted, the producer
reccommends up to 100 mg of tissue per 1 ml of RNAzol, we recommend a little bit les, say
up to 80 mg/ml
2.
RNA can be extracted from tissues fixed in RNALater
3.
Disposable gloves MUST be used at all times and changed frequently, human hands
are a major source of RNAses
4.
Thorough homoenization of tissues is crucial for high RNA yield. However adequate
homogenization time is crucial for RNA quality, and it is different for different tissues. For
example for voles heart or brain it is 30s and 2 x 15s, but for liver 3 x 10 s (with about 10s
breaks). Extended period of time causes RNA degradation. Appropriate homogenization time
for mites (ca 100 ind.) 3 x 15 s.
PROCEDURE
1.
Homogenize sample using up to 80 mg of tissue per 1 ml of RNazol. In our lab
homogenization must be performed in 2 ml tubes, because only then the tips of our
homogenizator are working well. It is safer to keep the total volume (tissue + RNAzol) below
1 ml; if processing more tissue, then distribute it to several tubes, alternatively, additional
RNAzol may be added after homogenization.
2.
Add to the homogenate/lysate 0.4 ml of water per 1 ml of RNAzol®RT used for
homogenization. Shake the resulting mixture vigorously for 15 seconds and store it for 15
min.
3.
Centrifuge samples at 12,000 g for 15 min. Following centrifugation, DNA, proteins
and most polysaccharides form a semisolid pellet at the bottom of the tube. The RNA
remains soluble in the supernatant.
4.
Transfer 75% of total supernatant volume to a new tube, leaving a layer of the
supernatant above the DNA/protein pellet. Precipitate RNA by mixing the transferred
supernatant with 75% ethanol (0.4 ml of 75% ethanol (v/v) per 1 ml of supernatant).
5.
Store samples for 10 min
6.
Centrifuge samples at 12,000 g for 8 min. RNA precipitate forms a white pellet at the
bottom of a tube.
7.
Remove supernatant with pipette or by pouring.
8.
Add 0.5 ml of 75% ethanol
9.
Centrifuge at 8,000 g for 3 min
10.
Remove the alcohol solution using a micropipette.
11.
Add 0.5 ml of 75% ethanol
12.
Centrifuge at 8,000 g for 3 min
13.
Remove the alcohol solution using a micropipette.
14.
Dissolve the RNA pellet, without drying, in 50-100 ul of water and store on ice
15.
Heat to 65°C for 3 min to disrupt secondary structures. Immediately place on ice.
16.
Store at -70°C
17.
RNA concentration may be measured using NanoDrop or Tecan
Modified: 07.02.2012 MK
Protokół: mRNA purification from total RNA
using polyT-Dynabeads
All the rules for working with RNA aplly. Composition of buffers can be found at the Buffers
section of the document.
The following protocol is designed for the 75 ug of starting total RNA. If more RNA is used
adjust the volumes of all reagents. Alternatively, the procedure may be performed several
times, following steps descibed in the Protocol: polyT-Dynabeads reuse. For some
applications it is possible to perform downstream applications with mRNA attached to beads.
RNA needs to have a reasonable concentration. The protocol is presented for the RNA
concentration of 750 ng/ul, if concentration is lower, volumes of the buffers (but not beads)
must be adjusted accordingly.
PROCEDURE
Dynabeads washing
1. Resuspend the Dynabeads Oligo (dT)25 thoroughly in the vial to obtain a uniform brown
2.
3.
4.
5.
6.
suspension and transfer 200 μl (1 mg) of beads to a tube.
Place the tube on a magnet (Dynal MPC™) for 1-2 min. The Dynabeads Oligo (dT)25
will migrate to the side of the tube nearest the magnet.
Remove the supernatant with a pipette while the tube remains on the magnet.
Remove the tube from the magnet and add 100 μl Binding Buffer to resuspend the
beads. Again place the tube on the magnet for 1-2 min.
Remove the supernatant while the tube remains on the magnet.
Resuspend the beads in 100 ul Binding Buffer.
Purification of mRNA from total RNA
make sure that you've got cold 10mM Tris-HCl prepared. Set the heating block for 1.5 ml
tubes to 65°C, then, after step 3 set it to 75°C
1. Adjust the volume of the 75 μg total RNA sample to 100 μl with distilled DEPC-treated
2.
3.
4.
5.
6.
7.
water or with 10 mM Tris-HCl pH 7.5.
Add 100μl of Binding Buffer. If total RNA is more dilute than 75 μg/100 μl, then simply
add an equal volume of Binding Buffer to the beads.
Heat to 65°C for 2 min to disrupt secondary structures. Immediately place on ice.
Add the 200 μl of total RNA (from p. 2) to the 100 μl washed beads. For every 75 μg
total RNA use 1 mg beads which have been washed and resuspended in 100 μl of
Binding Buffer.
Mix thoroughly and anneal by rotating continuously on a mixer for 5 min at room
temperature.
Place the tube on the magnet for 1-2 min and carefully remove all the supernatant.
Remove the tube from the magnet and add 200 μl Washing Buffer B. Mix by pipetting
carefully a couple of times. Again use the magnet to pull the beads to the side of the
tube. Carefully remove all the supernatant.
8. Repeat the washing step as described in step 7.
9. Add the desired amount (10 - 20 μl) of cold 10 mM Tris-HCl. Heat to 75-80°C for 2 min
and place the tube immediately on the magnet. Quickly transfer the eluted mRNA to a
new RNase-free tube.
10. Check mRNA concentration on NanoDrop, probably it would be in the 50-200 ng/ul
range - this has consequences for reverse transcription, the higher concentration the
better, that's why, if substantial amounts of mRNA are neede, it might be better to use
more beads at the beginning instead of repeating the procedure multiple times with the
same beads, because then mRNA will have higher concentration.
Protokół: Reverse transcription using
RevertAid™ Premium First Strand cDNA
Synthesis Kit
RNAse free pipette tips and eppendorf tubes, essential! both 1.5 and 2 ml. We buy RNAse
free plasticware
FERMENTAS
RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit #K1651 OR K1652
contains: polyT and random hexamer primers, 10 mM dNTP mix, buffer, enzyme mix
PROCEDURE
Have a PCR machine or thermoblock set to 50°C available
The following procedure is for up to 1 ug of mRNA or up to 5 ug of total RNA. If larger amount
of RNA is to be reverse transcribed, increase the volumes of reagents accordingly. polyT,
dT_disr, or random hexamer primers (in case of mRNA) may be used depending on the
application.
1. Add the following reagents into a sterile, nuclease-free tube on ice in the indicated
order (if the amount and volume of mRNA sample after Dynabeads is known, this tube
may be used for reaction):
RNA, up to 1 (in case of mRNA) or up to 5 (total RNA) ug <=13 ul
- Primer (100 uM)
1 ul
10 mM dNTP mix
1 ul
water, nuclease free
2.
3.
to 15 ul
If the RNA template is GC-rich or contains secondary structures, mix gently,
centrifuge briefly and incubate at 65°C for 5 min. Chill on ice, spin down and place the
vial back on ice.
Add the following components to the reaction tube in the indicated order:
5x RT buffer 4 ul
- RevertAid™ Premium Enzyme Mix
4. Mix gently and centrifuge
5. Incubate:
1 ul
– if an oligo(dT)18 primer or gene-specific primer is used, incubate for 30 min at 50°C
- if dT_disr primer is used conditions not established; I would try identical as for
random hexamers.
– if a random hexamer primer is used, incubate for 10 min at 25°C followed by 30 min at
50°C
6. Terminate the reaction by heating at 85°C for 5 min
7. The reverse transcription reaction product can be used immediately in second strand
cDNA synthesis reactions or stored at -20°C for up to one week. For longer storage,
-70°C is recommended.
Protokół: Second strand cDNA synthesis
RNase free water
RNAse free pipette tips and eppendorf tubes, essential! both 1.5 and 2 ml. We buy RNAse
free plasticware
0.5 M EDTA pH 8.0
FERMENTAS
RNase H
DNA Polymerase I with suitable buffer
T4 DNA Polymerase with buffer
EN0201
EP0041
EP0061
PROCEDURE
The following procedure is for 20 ul first strand cDNA reactions (like the one from the Reverse
transcription using RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit protocol). If the
volume is higher, use higher reagent volumes. It may be convenient to set up the reaction in
0.5 ml tubes if incubation is to be performed in a PCR machine.
1. Add the following reagents to 20 ul of the first strand cDNA synthesis reaction mixture
on ice:
10X reaction )
buffer for DNA Polymerase I
8.0 ul
RNase H (5 u/ul)
0.2 ul
DNA Polymerase I (10u/ul)
3.0 ul
RNase free water
68.8 ul
2. Mix by pipetting
3. Incubate at 15°C for 2 hours. Do not let the temperature to rise above 15°C.
4. Add 2.5 ul (12.5 u) of T4 DNA Polymerase and incubate at 15°C for 5 min.
5. Terminate the reaction by adding 5 ul of 0.5 M EDTA
Purify using PCR purification kits, e.g. MinElute or QIAquick (Qiagen)
Protokół: Izolacja całkowitego RNA zestawem
RNeasy Mini
Wprowadzenie
Zestawy RNeasy Mini firmy Qiagen przeznaczone są do izolacji całkowitego RNA z hodowli
komórkowych, tkanek zwierzęcych, bakterii oraz drożdży. Najpierw próbki są lizowane i
homogenizowane w obecności wysoce denaturującego buforu zawierającego izotiocyjcanian
guanidyny (GITC), który natychmiast denaturuje RNazy (a przy okazji i wszystkie inne białka),
by zapobiec degradacji RNA. Następnie wchodzące w skład kitu bufory pozwalają na
związanie z membraną do 100 µg RNA dłuższego niż 200 pz, które jest wypłukiwane wolną od
RNaz wodą. Otrzymujemy całkowite RNA wzbogacone w mRNA, ponieważ RNA < 200
nukleotydów takie jak 5.8 S rRNA, 5S rRNA i tRNAs, które razem obejmują 15 – 20% z
całkowitego RNA nie przyłączają się do membrany.
QIAGEN
● RNeasy Mini kit
74104, 74106
Bezpośrednio przed użyciem buforu RLT trzeba do niego dodać β-ME (10µl β-ME na 1 ml
buforu)
Gdy zestaw używany jest po raz pierwszy to trzeba pamiętać by dodać do koncentratu
buforu RPE 4 objętości 96-100% etanolu.
Bufor RPE w czasie przechowywania może wytworzyć osad, który należy przed użyciem
rozpuścić przez podgrzanie buforu.
SIGMA
● Diethyl pyrocarbonate (DEPC)
●
●
●
●
●
40718
14,3M β-merkaptoetanol (β-ME)
znajduje się pod dygestorium u Mikrobiologów
etanol 96-100%
etanol 70%
Uwaga! Rozcieńczamy etanol wodą wolną od RNAz!
wolne od RNaz końcówki do pipet i probówki eppendorfa, koniecznie! zarówno 1.5 jak i
2 ml. Plastiki wolne od RNaz kupujemy
metalowe końcówki do homogenizatora wymoczone w DEPC. Należy je moczyć przez
noc (minimum 12 godzin) w wodzie zawierającej 0.1% DEPC, a następnie suszyć
zawinięte pojedynczo w folię aluminiową w suszarce przez ok. 24 h.
Uwaga, jeżeli w tym czasie końcówki nie wyschną całkiem można ich używać
(sprawdzone).
UWAGI WSTĘPNE
1. Aby uzyskać dużo i wysokiej jakości RNA należy wziąć maksymalnie 30mg tkanki. Zaleca
się rozpoczynanie procedury z nie więcej niż 10mg tkanki.
2. RNA w tkankach szybko ulega degradacji, dlatego zaleca się przechowywanie tkanek w
RNA Later (Qiagen, Sigma).
3. Należy bezwzględnie nosić rękwiczki, na palcach są RNazy.
4. Aby proces pozyskiwania RNA z tkanki zwierzęcej był wydajny należy dobrze
zhomogenizować i zlizować tkankę.
5. Wszystkie kroki protokołu, włączając w to wirowanie powinny być prowadzone w
temperaturze 20-25°C, nie wolno zejść poniżej 20°C bo niektóre chemikalia się
wytrącają w niższej temperaturze.
PROCEDURA
1. Dokładnie wyczyścić blat wybielaczem, przygotować końcówki, probówki itp, sprawdzić
czy działa wyciąg
2. Pod wyciągiem do probówki 2 ml dodać odpowiednią ilość buforu RLT z uprzednio
dodanym β-ME (patrz wyżej)
3. Umieścić próbkę tkanki, z której biedzie izolowane RNA w probówce z pkt. 2
4. Zhomogenizuj tkankę homogenizatorem elektrycznym (ok. 30 s na próbkę), używając
dla każdej póbki świeżej końcówki homogenizującej
5. Wiruj homogenizat przez 3 min na maksymalnych obrotach. Nastaw pipetę na objętość
6.
7.
8.
9.
mniejszą niż ilość buforu RLT (np. 300 lub 550 ul). Ostrożnie przenieś pipetą
supernatant do nowej probówki 1.5 ml.
Dodaj 1 objętość 70% etanolu i wymieszaj przez pipetowanie. Nie wirować!
Przenieś najwyżej 700µl na podpisaną kolumnę RNeasy. Zamknij kolumnę delikatnie i
wiruj przez 15 s w ≥8000 g. Wylej przesącz z probówki (dolnego zbiorniczka).
Uwaga: Jeśli roztworu jest więcej niż 700µl powtarzaj krok 4 aż do przepuszczenia
przez kolumnę całej ilości.
Opcjonalnie: Można zastosować w tym punkcie protokołu trawienie DNAzą (Protokół:
Trawienie DNAzą)
Uwaga: Opuść ten etap, jeśli robione jest opcjonalne trawienie DNazą.
Dodaj na kolumnę 700µl buforu RW1. Zamknij kolumnę delikatnie i wiruj przez 15 s w
8000 g. Wylej przesącz z probówki
Przenieś kolumnę do nowej 2 ml probówki (dostarczonej z zestawem) i dodaj 500 µl
buforu RPE. Zamknij kolumnę delikatnie i wiruj przez 15 s w ≥ 8000 g. Wylej przesącz z
probówki.
Uwaga: Bufor RPE jest dostarczany jako koncentrat. Upewnij się, przed użyciem, czy
został dodany etanol do buforu (patrz wyżej)
10. Dodaj 500µl buforu RPE do kolumny. Zamknij kolumnę delikatnie i wiruj przez 2 min w ≥
8000 g
11. Przenieś kolumnę do nowej probówki (nie z zestawu!) i wiruj kolumnę przez 1 min z
maksymalną prędkością.
12. Aby wypłukać RNA, przenieś kolumnę do nowej podpisanej probówki 1.5 ml (dostarczone
wraz z zestawem). Dodaj 30–50µl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę
kolumny .Zamknij kolumnę delikatnie i wiruj przez 1 min w ≥8000 g.
Uwaga: Jeśli chce się uzyskać więcej niż 30µg, to trzeba powtórzyć wypłukiwanie (pkt.
10) taką sama ilością wody wolnej od RNaz co w pkt. 10.
Protokół: Trawienie DNazą
●
strzykawka insulinowa z igłą
QIAGEN
● RNase-Free DNase set
79254
UWAGA: Przed przystąpieniem do wykonywania procedury należy rozpuścić, DNazę I
dostarczana jest w postaci proszku. Igłą strykawki insulinowej przebijamy wieczko,
dodajemy 550 ul wody wolnej od RNaz dokładnie mieszamy. Tak przygotowaną DNazę
przechowujemy w -20C
PROCEDURA
1. Na lodzie przygotować mieszaninę, w ilości 1.05-1.1 x N, gdzie N to liczba trawionych
próbek. Poniżej podane ilości na 1 próbkę:
DNAza
10 ul
Bufor RDD
70 ul
2. Wymieszać przez odwracanie.
3. Dodać 350µl buforu RW1 do kolumny RNeasy i wirować przez 15s w ≥8000 g. Wylać
przesącz z probówki.
4. Pipetować 80 ul mieszaniny z p. 1 bezpośrednio na membranę kolumny RNeasy, a
następnie inkubować na stole przez 15 min w temp. 20-30°C.
5. Dodać 350µl buforu RW1 do kolumny RNeasy i wirować przez 15s w ≥8000xg (≥10000
rpm). Wylać przesącz z probówki.
6. Przejdź do pkt. 9 protokołu: Izolacja całkowitego RNA zestawem RNeasy Mini
Protokół: Odwrotna
Omniscript (Qiagen)
transkrypcja
kitem
QIAGEN
● Omniscript RT Kit
205110, 205111, 205113
PROMEGA
● RNasin® Ribonuclease Inhibitor lub Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor
N2511, N2515, N2111
SIGMA
●
primer oligo-dT(N)
O4387
Uwaga: przed użyciem rocieńczyć do 10 uM
Rozważyć zakup primera oligo-dT(N) w Genomedzie, jest wielokrotnie tańszy
●
wolne od RNaz końcówki do pipet i probówki eppendorfa. Plastiki wolne od RNaz
kupujemy
UWAGI WSTĘPNE
1. Stężenie RNA musi być znane (np. Nanodrop)
2. Aby zmniejszyć ryzyko degradacji RNA wszystkie kroki procedury należy wykonywać na
lodzie
3. Należy bezwzględnie nosić rękwiczki, na palcach są RNazy
PROCEDURA
1. Na lodzie rozmróź RNA. Starter, 10x bufor RT, Mix dNTP i wodę wolną od RNaz
rozmrażaj w temperaturze pokojowej i po roztmrożeniu przenieś do lodu. Przed użyciem
każdy roztwórmusi być dokładnie wymieszany (worteksowane, pipetowanie).
2. Przygotować mieszaninę, w ilości 1.05-1.1 x N, gdzie N to liczba przepisywanych
próbek. Poniżej podane ilości na 1 próbkę:
10 x bufor RT (zimny)
0.10 ul
Inhibitor RNaz (40u/ul)
0.25
Woda wolna od RNAz (zimna)
0.65
wymieszać przez pipetowanie lub na worteksie (do 5 s), zwirować aby zebrać resztki
płynu ze ścianek naczynka.
Uwaga: Przygotowuj zawsze świeży roztwór inhibitora RNaz.
3. Na lodzie przygotować mieszaninę, w ilości 1.05-1.1 x N, gdzie N to liczba
przepisywanych próbek. Poniżej w tabeli podane ilości na 1 próbkę. Wymieszać
ostrożnie przez pipetowanie lub na worteksie (nie dłużej niż 5s). Zwirować krótko, aby
zebrać płyn ze ścianek i przechowywać w lodzie.
Jeżeli potrzeba więcej cDNA reakcję można skalować w górę
4. Dodać RNA do poszczególnych probówek z miksem. Wymieszać ostrożnie przez
pipetowanie lub na worteksie (nie dłużej niż 5s). Zwirować krótko, aby zebrać płyn ze
ścianek i przechowywać w lodzie.
5. Inkubować przez 60 min w 37 ° C (maszyna do PCR lub termoblok).
Otrzymany jednoniciowy DNAjest mniej stabilny niż dwuniciowy, przechowujemy w
-20C.
Protokół: Amplification and Sanger
sequencing of the 1200 bp mtDNA ND2
fragment in newts Lissotriton montandoni and
L. vulgaris
Reagents
This protocol uses normal Fermentas Taq, we found that HotStart taq from fermentas
works poorly
ADD catalog numbers for Fermentas chemicals
primers L3780, H5018, ND2Seq3, ND2seq6
and usual PCR stuff
PROCEDURE
1. Set up PCR reaction. Premix the amount required for (N+1[for negative
control])*1.05 or 1.1 - to account for pipetting/callibration errors. The amount for a
single PCR reaction is:
10 x Taq Buffer with (NH4)2SO4
2.0 ul
25 mM MgCl2
1.2
dNTP (10 mM)
0.4
Taq
0.2
L3780 (100 uM)
0.1 ul
H5018 (100 uM)
0.1 ul
DNA
10-100 ng in a volume of 0.5-2 ul
PCR water
up to 20 ul
If a larger amount of PCR product is needed adjust the volumes accordingly. The final
concentration of primers should be 0.5 uM, if using stocks at concentrations different
than 100 uM, adjust the volumes accordingly.
2. Perform PCR reaction according to the following cycling scheme:
94C
210 sec
40 x:
72C
94C
30 s
56C
30 s
72C
80 s
180 sec
3. Run an aliquot on gel
4. Purify an aliquot using the ExoAP protocol
5. Purified PCR product will be used as a template for three reactions using
primers:separate sequencing 1) L3780 (or L3780), 2) ND2seq3, 3) ND2seq 6
6. All sequencing reactions will be performed according to this protocol, and their
products will be purified using this protocol
Bufory i stoki
Binding Buffer for Dynabeads mRNA purification from
total RNA
20 mM Tris-HCl, pH 7.5,
1.0 M LiCl,
2 mM EDTA
prepare as 1 x solution just before use
all solutions MUST be RNAse free (either purchased or prepared with RNAse-free water)
e.g. from Sigma:
1 M Tris-HCl pH 7.4 #93313-1L
0.5 M EDTA in water, pH 8.0 #03690-100ML
For 10 ml
5M LiCl
2 ml
1 M Tris-HCl
0.2 ml
0.5 M EDTA
0.04 ml
RNAse free water
7.76 ml
Washing Buffer B for Dynabeads mRNA purification from
total RNA
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
0.15 M LiCl,
1 mM EDTA
Normally, less than 500 ul is used for mRNA purification from 75ug of total RNA
For 10 ml
5M LiCl
0.3 ml
1 M Tris-HCl
0.1 ml
0.5 M EDTA
0.02 ml
Lysis/Binding Buffer for re-using of Dynabeads
100 mM Tris-HCl, pH 7.5,
500 mM LiCl,
10 mM EDTA,
1% LiDS,
5 mM dithiothreitol (DTT).
If any precipitation is observed, warm to room temperature and shake until all the
components are fully resuspended.
all solutions MUST be RNAse free (either purchased or prepared with RNAse-free water)
e.g. from Sigma:
1 M Tris-HCl pH 7.4 #93313-1L
0.5 M EDTA in water, pH 8.0 #03690-100ML
EDTA
Jako stoku używa się roztworu 0.5 M o pH 8.0
Na 1 l 0.5 M 186g EDTANa2.2H20
Ustalić pH na 8.0 przy pomocy HCl lub NaOH
TAE
Przygotować jako stok stężony 50 x
Na 1 l 50 x TAE:
Tris 242 g
Lodowaty kwas octowy 57.1 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 100 ml
Sprawdzić pH – powinno być 8.0, w razie potrzeby ustalić pH
Używać w stężeniu 1 x, rozcieńcza się wodą dejonizowaną lub destylowaną
TBE
Na 1 l 10 x TBE:
Tris 108 g
Kwas borowy 55 g
0.5 M EDTA (pH 8.0) 40 ml
Sprawdzić pH, powinno być ok. 8.3, w razie potrzeby ustalić pH
Używać w stężeniu 1 x, rozcieńcza się wodą dejonizowaną lub destylowaną
TE
Na 1 l 10x TE:
Tris 12.1 g
0.5M EDTA (pH 8.0) 20 ml
Ustalić pH na 8.0.
Sterylizować – TE używać w stężeniu 1 x lub 0.1 x do rozpuszczania DNA genomowego.

Wstęp: Przeczytaj raz! Protocol: Testing nuclear markers

Transkrypt

Podobne dokumenty

Optymalizacja reakcji PCR. Część I: podstawy

Real Time PCR — podstawy i historia metody

pcr-rapd optimization for hospital wastewater

USŁUGI SERWISOWE

Formularz zlecenia badania