Artykuł naukowy

Emilia Wójtowicz
Markery molekularne i ich wykorzystanie w hodowli roślin
W pracach genetyczno – hodowlanych wykorzystuje się różne typy markerów
(wyznaczników), pozwalających na szybką identyfikacje genotypów, co znacznie skraca cykl
hodowlany i obniża koszty. Należą do nich markery morfologiczne, cytologiczne, oraz
stosowane w ostatnich latach coraz częściej markery molekularne. Markery molekularne mają
przewagę nad pozostałymi, gdyż umożliwiają identyfikację różnic i podobieństw niezależnie
od wieku badanych obiektów. Do analiz wystarczają bardzo małe próbki materiału, zatem nie
ma potrzeby niszczenia całego organizmu. Poza tym markery molekularne dziedziczą się
zgodnie z genetyką mendlowską i nie podlegają wpływom środowiska.
Pierwszymi wykorzystywanymi markerami molekularnym były różne formy białek
strukturalnych i funkcjonalnych (izoenzymy) (Bednarek i Chwedorzewska, 2001).
Umożliwiają one badanie struktury genetycznej populacji, oszacowanie stopnia
heterozygotyczności i polimorfizmu, analizę stopnia podobieństwa genetycznego, jak również
potwierdzenie czystości genetycznej lub mieszańcowości (Masojć, 2007). Jednak niewielka
liczba loci izoenzymatycznych jest utrudnieniem w ich szerszym zastosowaniu (Broda, 2000).
W ciągu ostatnich lat największego znaczenia nabrały markery DNA (Bednarek i
Chwedorzewska, 2001). Są to fragmenty kwasu deoksyrybonukleinowego uzyskane w formie
prążków na żelach lub membranach, będące efektem końcowym reakcji enzymatycznych lub
hybrydyzacji (Wolko i in., 1999). Markery DNA odgrywają obecnie zasadniczą rolę we
wszystkich aspektach hodowli roślin, od identyfikacji genów odpowiedzialnych za określone
cechy do kierowania programami krzyżowań (Schulman, 2007).
Przegląd technik
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Jedną z pierwszych metod, która umożliwiła identyfikację markerów DNA była
technika analizy polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych - RFLP (Masojć, 2007). Metoda ta
opiera się na zróżnicowanym rozmieszczeniu w genomie specyficznych sekwencji DNA o
długości 4-6 nukleotydów, rozpoznawanych i przecinanych przez specyficzne enzymy
restrykcyjne. Powstałe po cięciu fragmenty hybrydyzują z wyznakowaną radioaktywnie sondą
molekularną (Bostein i in., 1980). Polimorfizm markerów RFLP może wynikać ze zmian
sekwencji nukleotydów w miejscach restrykcyjnych oraz z modyfikacji we fragmentach
ulegających hybrydyzacji z sondą (Wolko i Kruszka, 1997). Metoda ta była używana do
mapowania genomów (Malyshev i in. 2003), lokalizacji QTL (Jordan i in., 2004) oraz analizy
pokrewieństwa genetycznego (Bautsta i in. 2001).
Markery VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)
Markery VNTR oparte są na analizie sekwencji minisatelitarnych – powtarzających
się motywów sekwencyjnych o długości 11-60 pz, występujących w genomach (Nybom i
Kraft, 1995). Motywy te wykazują duże zróżnicowanie pod względem długości, która zależy
od liczby powtórzeń podstawowego motywu (Masojć, 2007). Polimorfizm minisatelitarnych
loci wykrywany jest poprzez trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi, które rozpoznają
sekwencje otaczające te regiony. Dalsze etapy analizy przebiegają z zastosowaniem sond,
komplementarnych do minisatelitarnego DNA, a w końcowym wyniku uzyskuje się profile
molekularne, unikalne dla analizowanego osobnika (Sztuba – Solińska, 2005).
Opracowanie łańcuchowej reakcji polimerazy – PCR (Polymerase Chain Reaction)
stworzyło możliwość powstania kolejnych metod analizy molekularnej.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Markery RAPD bazują na reakcji PCR z wykorzystaniem krótkiego (9-11
nukleotydów) startera o przypadkowej sekwencji (Williams i in., 1990). Startery przyłączają
się w wielu miejscach badanego DNA prowadząc do amplifikacji kilku lub kilkunastu
różnych fragmentów (Wolko i in., 2001). Polimorfizm markerów RAPD wynika z mutacji
miejsc przyłączania starterów oraz z inercji/delecji w obrębie powielanych podczas PCR
fragmentów. Ze względu na dużą liczbę różnych sekwencji starterów metoda ta stała się
szczególnie przydatna do poszukiwania markerów ważnych cech użytkowych (Masojć, 2007).
Jej wadą jest wysoka wrażliwość na zmiany warunków reakcji (Devos i Gale, 1992), jak
również dominujący charakter dziedziczenia uzyskanych markerów - nie umożliwiają
rozróżnienia osobników hetero- i homozygotycznych (Wolko i in.,1997).
SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)
Sposobem odróżnienia homo- i heterozygot jest przekształcenie markerów RAPD
sprzężonych z konkretną cechą na markery SCAR (Paran i Michelmore, 1993). Jest to zadanie
pracochłonne i wymaga dużego nakładu kosztów, jednak umożliwia otrzymanie
specyficznych dla danej cechy markerów. Ich uzyskanie polega na wycięciu produktu RAPD
z żelu i jego zsekwencjonowaniu, a następnie zaprojektowaniu na podstawie otrzymanej
sekwencji specyficznych starterów o długości 20-24 nukleotydów. Startery te uczestniczą w
amplifikacji jednego fragmentu o długości odpowiadającej wyjściowemu odcinkowi DNA
(Masojć, 2007). Powielanie DNA przy użyciu tych markerów jest bardziej specyficzne i
prowadzi do poprawy powtarzalności reakcji PCR (Nair i in. 1996). Technika ta była
wykorzystywana m.in. do identyfikacji genów determinujących płeć papai (Deputy i in.,
2002).
SSR (Simple Sequence Repeat)
Markery SSR zwane również markerami mikrosatelitarnymi, bazują na obecności w
genomie sekwencji mikrosateliatrnych, w których motyw powtarzalny ma długość 1-4
nukleotydów. Każdy odcinek mikrosatelitarny sąsiaduje z unikatowymi sekwencjami, które
wykorzystuje się do projektowania specyficznych starterów, wiążących się po obu stronach
mikrosatelity (Masojć, 2007). Zaletą markerów SSR jest ujawnianie wysokiego polimorfizmu
oraz kodominujący sposób dziedziczenia (Koreth i in., 1996). W związku z tym markery te
znalazły szerokie zastosowanie w mapowaniu genomów, identyfikacji odmian, określaniu
stopnia heterozygotyczności oraz jako markery cech o znaczeniu rolniczym (Powell i in.,
1996).
ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
W metodzie ISSR amplifikacji ulega fragment DNA obecny pomiędzy dwoma
identycznymi sekwencjami mikrosatelitarnmi, skierowanymi w przeciwnych kierunkach. W
technice tej używany jest jeden starter o długości 16 - 25 nukleotydów. Startery mogą być
zakotwiczone na końcu 3’ albo 5’. Oznacza to obecność kilku dowolnych nukleotydów
(Zietkiewicz i in., 1994), co gwarantuje ich przyłączanie do końców sekwencji
mikrosatelitarnej na matrycowym DNA. Gdy używany jest starter niezakotwiczony ma on
tendencję do „poślizgów” na matrycy DNA, co prowadzi do powstawania smug między
prążkami na żelu (Pradeep - Reedy i in., 2002). ISSR jest prostą, szybką, wydajną techniką i
charakteryzuje się wysoką powtarzalnością (Zietkiewicz i in., 1994). Markery ISSR mają
charakter dominujący (Gupta i in., 1994), jednak w niektórych przypadkach mogą
segregować w sposób kodominujący, a zatem umożliwiać rozróżnienie homozygot i
heterozygot (Wu i in., 1994). Były one z powodzeniem wykorzystywane do oceny
polimorfizmu (Bornet i Branchard, 2004), jak również do mapowania (Kojima i in., 1999).
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Technika SNP polega na amplifikacji fragmentu genomu za pomocą reakcji PCR a
następnie sekwencjonowaniu powstałego produktu. Po zsekwencjonowaniu fragmentów
należących do różnych osobników porównuje się je ze sobą w celu identyfikacji różnic w
sekwencji (miejsc SNP). Markery te pozwalają na wykrycie polimorfizmu pojedynczego
nukleotydu w obrębie całej sekwencji analizowanego fragmentu DNA (Brookes, 1999). Wadą
tej metody jest wysoki koszt analiz, natomiast ogromną zaletą możliwość obserwacji bardzo
dużego polimorfizmu analizowanej sekwencji na poziomie pojedynczych nukleotydów
(Alberts i in., 2002). Metoda SNP jest wykorzystywana m.in. do identyfikacji mutacji
punktowych (Tyrka i in., 2004).
AFLP (Amplified Fragmeny Leght Polymorphism)
Techniki generujące tzw. markery mieszane wykorzystują właściwości zarówno
enzymów restrykcyjnych, jak i reakcji PCR (Bednarek i Chwedorzewska, 2001). Do tej grupy
należą markery AFLP (Vos i in., 1995).W metodzie tej wyizolowany i oczyszczony DNA
trawi się dwoma enzymami restrykcyjnymi. Jeden z nich rozpoznaje sekwencje dłuższe i
dlatego przecina DNA rzadziej, drugi rozpoznaje krótsze fragmenty - cięcia restrykcyjne
wprowadzane są częściej (Morgante i Vogel, 1994). Otrzymane produkty liguje się z tzw.
adaptorami, czyli fragmentami dwuniciowego DNA o określonej sekwencji, które posiadają
lepkie końce komplementarne do miejsc restrykcyjnych. Następnie przeprowadza się wstępną
reakcję PCR (Paglia i Morgante, 1998), z użyciem starterów komplementarnych do sekwencji
adaptorów i miejsc restrykcyjnych oraz zawierającymi jeden selektywny nukleotyd na końcu
3’. W celu ograniczenia liczby generowanych produktów w kolejnym etapie – amplifikacji
selektywnej – stosuje się startery o takiej samej sekwencji jak w poprzednim, ale posiadają
one 2-4 nukleotydy selektywne na końcu 3’ (Masojć, 2007). System ten był on
wykorzystywany zarówno w mapowaniu (Singrun i in., 2004) jak określaniu stopnia
zróżnicowania genetycznego genomów roślin(Vos i in.,1995).
SAMPL (Selectively Amplified Microsatelite Polimorphic Loci)
SAMPL to system markerów molekularnych, który łączy elementy metody SSR i
AFLP. Początkowe etapy przebiegają tak samo jak w technice AFLP. Otrzymane po wstępnej
amplifikacji fragmenty DNA stanowią matrycę dla właściwej reakcji PCR. Używane są w niej
dwa startery: jeden wiążący się z końcem fragmentu zawierającego sekwencję rozpoznawaną
przez rzadziej tnący enzym, drugi komplementarny do sekwencji DNA mikrosatelitarnego.
Dzięki zastosowaniu takiej kombinacji powielane są odcinki DNA pochodzące od
fragmentów zawierających sekwencję pomiędzy dwoma enzymami, enzymem a mikrosatelitą
oraz dwoma mikrosatelitami. Markery SAMPL mogą dziedziczyć się w sposób dominujący
lub kodominujący (Tosti i Negri, 2002) i są wykorzystywane m.in. do identyfikacji
polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych (Morgante i Vogel, 1994).
CAPS (Clevaed Amplified Polymorphic Sequence)
Technika CAPS (Konieczny i Ausubei, 1993) jest oparta na reakcji PCR połączonej z
trawieniem restrykcyjnym. Pierwszy etap to klasyczna reakcja PCR, do której startery
konstruowane są na podstawie znanych sekwencji. Amplifikowany produkt jest następnie
trawiony jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi i rozdzielany na żelu agarozowym.
System CAPS jest alternatywnie określony jako PCR-RFLP i służy do identyfikacji
zmienności w sekwencji DNA, gdy amplifikowane fragmenty DNA nie dają się rozróżnić pod
względem długości. Pozwala na rozróżnienie alleli hetero- i homozygotycznych (SztubaSolińska, 2005). Wykorzystywane były często do identyfikacji genów warunkujących
określone cechy (Chełkowski i in., 2003; Varshney i in., 2004) oraz do oceny zróżnicowania
genetycznego (Barth i in., 2002).
Markery molekularne są wykorzystywane w hodowli roślin głównie do:
- określania stopnia podobieństwa materiałów wyjściowych
- rejestracji nowych odmian – wzór prążków służy do identyfikacji odmiany co ułatwia
ochronę praw autorskich
- ustalania genetycznej czystości nasion i jednorodności klonów
- eliminowania z kolekcji (banków genów) powtarzających się genotypów zarejestrowanych
pod różnymi nazwami.
- prowadzenia selekcji w oparciu o markery sprzężone z cechami ważnymi pod względem
gospodarczym
Dobre markery molekularne powinny być jednocześnie wysoce informatywne i
wiarygodne, a koszty ich otrzymania powinny być możliwie jak najmniejsze. Powinny zatem
cechować się silnym polimorfizmem, kodominującym charakterem dziedziczenia, wysoką
frekwencją i równomiernym rozłożeniem w genomie, dużą powtarzalnością oraz prostą i
szybką metodą wykrywania. Dodatkowo powinny wykazywać neutralność selekcyjną (czyli
brak sprzężenia z niekorzystnymi genami) (Masojć, 2007). Markery molekularne stały się
niezbędnym narzędziem w nowoczesnej hodowli roślin. Stosowane są w kolejnych etapach
tworzenia nowych odmian roślin uprawnych, których prawidłowy przebieg umożliwia
powodzenie prowadzonych prac hodowlanych (Sztuba – Solińska, 2005).
Piśmiennictwo:
1.
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, R., Roberts, K., and Walker, P. (2002).
Molecular Biology of the Cell, 4th ed. Garland Publishing, New York.
2.
Barth S., Melchinger A. R., Lubberstedt T., 2002. Genetic diversity in Arabidopsis
thaliana L. Heynh. Investigated by cleaved amplification polymorphic sequence (CAPS) and
inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Mol. Ecol. 11, 495–505.
3.
Bautista N. S., Solis R., Kamijima O., Ishii T., 2001. RAPD, RFLP and SSLP analyses
of phylogenetic relationships between cultivated and wild species of rice. Genes Genet. Syst.
76, 71–79.
4.
Bednarek P.T., Chwedorzewska K. 2001. Markery molekularne, ich charakterystyka
genetyczna oraz wybrane zastosowania w analizie genetycznej roślin. Biotechnologia 1(52): 9
- 34.
5.
Bornet B., Branchard M. 2004. Use of ISSR fingerprints to detect microsatellites and
genetic diversity in several related Brassica taxa and Arabidopsis thaliana. Hereditas 140: 245
– 248.
6.
Bostein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. 1980. Constructions of genetic
linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32:
314 - 331.
7.
Broda Z. 2000. Diagnostyka molekularna w badaniach zmienności genetycznej roślin.
Hodowla roślin i nasiennictwo 4: 36 - 37.
8.
Brookes A. J., 1999. The essence of SNPs. Gene 234, 177–186.
9.
Chełkowski J., Golka L., Stępień Ł., 2003. Application of STS markers for leaf rust
resistance genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. Thatcher. J. Appl. Genet. 44, 323–
338.
10.
Deputy J. C., Ming R., Ma H., Liu Z., Fitch M. M.,Wang M., Manshardt R., Stiles J. I.
2002., Molecular markers for sex determination in papaya (Carica papaya L.). Theor. Appl.
Genet. 106,107–111.
11.
Devos K.M., Gale M.D. 1992. The use of random amplified polymorfic DNA markers
in wheat. Theor. Appl. Genet. 84: 573-578.
12.
Gupta M., Chyi Y.S., Romero - Severson J., Owen J.L. 1994. Amplification of DNA
markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple - sequence
repeats. Theor. Appl. Genet. 89: 998 - 1006.
13.
Jordan D. R., Casu R. E., Besse P., CarrollB. C., Berding N., Mcintyre C. L., 2004.
Markers associated with stalk number and suckering in sugarcane, colocate with tillering and
rhizomatousness QTLs in sorgium. Genome 47, 988–993.
14.
Kojima T., Nagaoka T., Noda K., OgiharaY., 1998.Genetic linkage map of ISSR and
RAPD markers in Einkorn wheat in relation to that of markers. Theor. Appl. Genet., 96, 37–
45.
15.
Konieczny, A., and Ausubei, F.M. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis
mutations using co-dominant ecotype-specific PCR based markers. Plant J. 4: 403–410.
16.
Koreth J., O’Leary J. J., McGee J. O., 1996. Microsatellites and PCR genomic
analysis. J. Path.178:239-248.
17.
Malyshev S. V., Korzun V. N., Zaben’kova K. I., Voilokov, A. V., Berner A., Kartel
N. A., 2003. Comparitive molecular-genetic mapping of genomes of ryse (Secale cereale L.)
and other cereals. Tsitol. Genet. 37, 9–20.
18.
Masojć P. 2007. Ustalanie tożsamości genetycznej. Biotechnologia roślin, Red.
19.
Morgante M., Vogel J., 1994. Compound microsatellite primers for the detection of
genetic polymorphisms U.S. Patent Appl 08/326456.
20.
Nair S., Kumar A., Srivastava M. N., Mohan M., 1996. PCR- based DNA marjers
linced to a gall midge resistance gene Gm4t has potential for marker-aided selection in rice.
Theor. Appl. Genet. 92:660-665.
21.
Nybom, H. & Kraft, T. 1995. Application of DNA fingerprinting to the taxonomy of
European blackberry species. Electrophoresis 16: 1731–1735.
22.
Paglia G., Morgante M., (1998), Molecular Breeding, 4, 173-177.
23.
Paran I, Michelmore RW 1993. Development of reliable PCR-based markers linked to
downy resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet 85: 985-993.
24.
Powell W., Machray G., Provan J. 1996. Polymorphism revealed by simple sequence
repeats. Trends Pl. Science. 1:215-222.
25.
Pradeep Redy M., Sarla N., Siddiq E.A. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR)
polymorphism and its applications in plant breeding. Euphytica 128:
26.
Schulman A.H. 2007. Molecular markers to assess genetic diversity. Euphytica 158:
313 - 321.
27.
Sinrun CH., Hsam S. L., Zeller F. J., Wenzel G., MohlerV., 2004. Localization of a
novel recessive powdery mildew resistance gene from commo wheat line RD30 in the
terminal region of chromosome 7AL. Theor. Appl. Genet. 109, 210–214.
28.
Sztuba – Solińska J. 2005. Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w
hodowli roślin. Kosmos 54: 227–239.
29.
Tosti N., Negri V., (2002), Genome, 45, 268-275.
30.
Tyrka M., Błaszczyk L., ChełkowskiI J., Lind V., Kramer I., Weilepp M., Wiśniewska
H., Ordon F., 2004. Development of the single nucleotide polymorphism marker of the wheat
Lr1 leaf rust resistance gene. Cell. Mol. Biol. Lett. 9, 879–889.
31.
Varshney A., Mohapatra T., Sharma R. P., 2004. Development and validation of
CAPS and AFLP markers for white rust resistance gene in Brassica juncea. Theor. Appl.
Genet. 109, 153–159.
32.
Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Plot
J., Peleman J., Kupier M., Zebau M. 1995. AFLP – a new technique for DNA fingerprinting.
Nucl. Acids Res.23:4407-4414.
33.
Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K. J., Rafalski J. A, Tingey S.V. 1990. DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markcrs. Nucl. Acid. Res.
18:6531-6535.
34.
Wolko B., Irzykowska L., Święcicki W. K. 1999. AFLP i SSR – systemy markerowe
przydatne w hodowli roślin. Postępy Nauk Rolniczych 2: 59 - 70.
35.
Wolko B., Kruszka K. 1997. Markery molekularne w badaniach zmienności
genetycznej roślin. Postępy Nauk Rolniczych 3.
36.
Wolko Ł., Witułka-Wall H., Siemieniako B.,Wolko B., Słomki R. 2001. Poszukiwanie
markerów cech użytkowych metodą RAPD-PCR. Przykłady analiz DNA. Red.R. Słomski.
Poznań 158-165.
37.
Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple
sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176
- 183.