Ćwiczenie 5 - Wydział Biologii i Ochrony Środowiska UMK

Ćwiczenie 5 - Wydział Biologii i Ochrony Środowiska UMK

Ćwiczenie 5
PREPARATYKA DNA Z JĄDER KOMÓRKOWYCH IZOLOWANYCH
Z ETIOLOWANYCH SIEWEK PSZENICY
Część doświadczalna obejmuje:
- izolowanie jąder komórkowych z etiolowanych siewek pszenicy
- preparatyka DNA z wyizolowanych jąder
- ocena czystości preparatu DNA na podstawie analizy spektrofotometrycznej
WPROWADZENIE
Izolacja jąder komórkowych
Wyodrębnienie poszczególnych struktur subkomórkowych rozpoczyna się od rozdrobnienia
badanego materiału i homogenizacji (roztarcia komórek) w odpowiednim środowisku (roztworze
homogenizacyjnym). W pozyskiwaniu nieuszkodzonych organelli uŜywa się roztworu izotonicznego tzn. takiego, którego ciśnienie osmotyczne jest równe ciśnieniu osmotycznemu wewnątrz
komórki. W roztworach hipotonicznych organelle wchłaniają wodę i pękają, natomiast w roztworach hipertonicznych się kurczą.
Homogenizacja tkanki umoŜliwia zgrubną filtrację homogenatu przez gazę lub nylon, pozwalającą oddzielić nieroztarte, całe komórki czy fragmenty tkanek. Frakcjonowanie składników komórkowych moŜna przeprowadzić w drodze tzw. wirowania róŜnicowego polegającego na kolejnych wirowaniach przy odpowiednio wzrastających przyspieszeniach podawanych jako wielokrotność przyspieszenia ziemskiego wywołanego przyciąganiem ziemskim (g = 9,81 m x s-2).
Ze względu na zróŜnicowaną wielkość, kształt i gęstość poszczególnych organelli moŜna je w
ten sposób wyodrębnić z zawiesiny (Ryc. 1).
Jądra komórkowe osadzają się juŜ przy małych przyspieszeniach (600 x g), które moŜna osiągnąć w prostych wirówkach stołowych. Przez ostroŜne usunięcie roztworu znajdującego się nad
osadem (supernatantu) i zawieszenie osadu jąder w izotonicznym roztworze moŜna uzyskać frakcję wzbogaconą w duŜą liczbę jąder komórkowych. Taka „surowa” frakcja jądrowa zawiera jeszcze inne komponenty komórkowe jako „zanieczyszczenia”. Oczyszczoną frakcję jądrową moŜna
otrzymać na drodze wirowania w skokowym lub ciągłym gradiencie gęstości np. roztworu sacharozy lub glicerolu. W tym wypadku, rozdzielające się w czasie wirowania frakcje są stabilizowane
przez gradienty gęstości środowiska, które hamują przepływy konwekcyjne utrudniające rozdzielanie cząstek.
1
Ryc. 1. Schemat frakcjonowania struktur subkomórkowych metodą wirowania róŜnicowego (Koolman, Röhm 2005)
Przy frakcjonowaniu struktur subkomórkowych duŜe znaczenie ma analiza stopnia czystości
otrzymanych frakcji. Obecność określonych organelli w wyizolowanej frakcji moŜna potwierdzić
oznaczając w niej aktywność odpowiednich enzymów markerowych lub innych cząsteczek
znacznikowych. Np. DNA jest znacznikiem jąder komórkowych, rRNA - rybosomów, a mitochondria moŜna identyfikować oznaczając dehydrogenazę bursztynianową lub oksydazę cytochromową. Stopień jednorodności izolowanej frakcji moŜna określić oznaczając w niej aktywność enzymów lub zawartość cząsteczek znacznikowych charakterystycznych dla innych frakcji
subkomórkowych.
Poszczególne etapy izolacji organelli komórkowych wykonuje się w niskich temperaturach
(przewaŜnie przy 0-50 C) spowalniając w ten sposób reakcje trawienia przez uwolnione enzymy
proteolityczne oraz ograniczając inne niekorzystne procesy np. utlenianie grup hydrosulfitowych w
białkach.
2
Preparatyka DNA z izolowanych jąder komórkowych
Organizacja genomów roślinnych
Genom roślin składa się z trzech części: genomu jądrowego, genomu mitochondrialnego i genomu chloroplastowego. Genom jądrowy zawarty jest w chromosomach, których liczba u róŜnych organizmów waha się od kilku do kilkudziesięciu. Genomy organelli są w większości koliste, chociaŜ niektóre doniesienia sugerują, Ŝe obok genomów kolistych koegzystują wersje liniowe, a w przypadku chloroplastów mniejsze fragmenty koliste, które zawierają część całego genomu. Genomy organelli mogą występować pojedynczo lub, jak to stwierdzono w mitochondriach
ludzkich, nawet w 10, a w przypadku innych organizmów nawet w 100 kopiach w jednym mitochondrium.
Genomy jądrowe
Na ryc. 2 pokazano zakres wielkości haploidalnych genomów jądrowych roślin oraz, dla porównania, rozpiętość wielkości genomów bakterii, grzybów i zwierząt. Wielkość genomów jądrowych roślin wyŜszych jest niezwykle zróŜnicowana, gdyŜ najmniejszy genom rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) zawarty w pięciu chromosomach liczy 7x 107 par zasad (70 Mpz), a największy
genom szachownicy (Fritillaria assyriaca) ma 1,2x 1011 par zasad (120 000 Mpz).
pz
Rys. 2. Porównanie wielkości haploidalnych genomów bakterii, grzybów, roślin i zwierząt (Buchanan, Gruissem, Jones 2000).
3
Na ryc. 3 pokazany jest pokrój rzodkiewnika (A. thaliana), rośliny o najmniejszym genomie i
szachownicy (F. assyriaca), rośliny z rodziny liliowych, której genom jest około 1 700 razy większy od genomu rzodkiewnika. Porównując wielkość genomów róŜnych organizmów zwraca uwagę
brak bezpośredniego związku między wielkością genomu, a poziomem komplikacji organizmu.
Rys. 3. Porównanie wyglądu: A, rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) (genom jądrowy - 70 Mpz) i
B, szachownicy (Fritillaria assyriaca) (genom - 120 000 Mpz) (Buchanan, Gruissem, Jones,
2000).
Brak dokładnej korelacji pomiędzy złoŜonością organizmu i wielkością jego genomu określany
jest mianem paradoksu wartości C. Obecnie juŜ wiemy, Ŝe w genomach mniej złoŜonych organizmów (droŜdŜe, C. elegans), przestrzeń jest wykorzystywana oszczędniej, gdyŜ ich geny leŜą
bliŜej siebie. Inaczej jest w przypadku genomu kukurydzy (Zea mays) (6 600 Mpz) zawartego w
10 chromosomach i genomu pszenicy (Triticum aestivum) (17 000 Mpz), które są odpowiednio
ponad dwu- i prawie sześciokrotnie większe od genomu ludzkiego. Genomy jądrowe tych roślin
zdominowane są przez elementy powtarzające się, które obejmują cztery główne rodzaje rozproszonych sekwencji powtarzających się: długie rozproszone sekwencje jądrowe LINE (ang. long
interspersed nuclear elements); krótkie rozproszone sekwencje jądrowe SINE (ang. short interspersed nuclear elements); długie powtórzenia końcowe LTR (ang. long terminal repeats) i
transpozony DNA zawierające sekwencje kaŜdego z pozostałych typów.
Genom A. thaliana, małego chwastu z rodziny krzyŜowych, zawiera około 70 000 kilo par zasad (70 Mpz) w przeliczeniu na haploidalny garnitur chromosomów. Genom ten jest tylko około
sześciokrotnie większy od genomu droŜdŜy i piętnastokrotnie większy od genomu E. coli. Szacuje
się, Ŝe rzodkiewnik ma około 26 500 genów. Liczba genów u pozostałych roślin, wg aktualnych
poglądów, jest podobna, a podstawowa róŜnica między rzodkiewnikiem a innymi roślinami polega
na tym, Ŝe u rzodkiewnika około 80% całkowitego jądrowego DNA stanowią sekwencje występu-
4
jące w jednej lub w kilku kopiach i są to w większości sekwencje kodujące białka. Niemal całkowity brak w genomie rzodkiewnika rozproszonych sekwencji powtarzających się ułatwia
znajdowanie genów, co m. in. zdecydowało o tym, Ŝe ten mały chwast stał się modelową rośliną w
biologii molekularnej roślin.
Genomy organellarne roślin
Wielkość genomów mitochondrialnych jest zróŜnicowana i niepowiązana ze stopniem złoŜoności organizmu. Genom mitochondrialny człowieka, liczący 16 569 par zasad (16,5 kpz), znacząco odbiega wielkością od genomu mitochondrialnego roślin, który u rzodkiewnika liczy 367
kpz, 570 kpz u kukurydzy, a u melona aŜ 2 500 kpz. Wielkość genomu chloroplastowego róŜnych gatunków roślin jest zbliŜona i mieści się w przedziale od 120 do 160 kpz (około 200 genów). Przyjmując, Ŝe komórka roślinna ma przeciętnie od 200 do nawet 3000 mitochondriów i od
kilkudziesięciu do kilkuset chloroplastów, to całkowita ilość DNA w tych organellach jest porównywalna z ilością DNA jądrowego. Np. zakładając, Ŝe komórka rzodkiewnika zawiera 500 mitochondriów i 50 chloroplastów, a genomy w tych organellach występują tylko w pojedynczych kopiach, to całkowita ilość organellarnego DNA w 1 komórce będzie wynosić około 189 500 kpz
(189,5 Mpz) (183 500 kpz w mitochondriach i 6000 kpz w chloroplastach), co znaczy, Ŝe jest niemal półtora razy większa od ilości DNA zawartego w jądrze kaŜdej komórki diploidalnej (2 x 70
Mpz).
Preparatyka DNA
W preparatyce DNA wykorzystuje się zdolność białek i cukrowców do tworzenia nierozpuszczalnych kompleksów z dodecylosiarczanem potasu, co umoŜliwia rozdzielenie tych związków
od kwasów nukleinowych. Ponadto, uŜycie w ostatnim etapie oczyszczania 0,3 M octanu sodowego i 40% izopropanolu pozwala na oddzielenie DNA o wysokiej masie cząsteczkowej od pozostałych w roztworze cukrowców oraz pozwala na uzyskanie DNA w postaci długich włókien,
które łatwo moŜna przemyć i wysuszyć w alkoholu etylowym. Otrzymany w tej procedurze wielkocząsteczkowy DNA jest dobrym substratem dla większości enzymów restrykcyjnych uŜywanych w biologii molekularnej i moŜe być wykorzystany do analizy struktury genomu roślinnego.
Metoda ta pozwala na preparatykę jądrowego DNA bez ultrawirowania preparatu w gradiencie
CsCl. Szybkość oczyszczania oraz niewielka ilość materiału potrzebna do izolacji DNA (mniej niŜ
1 g tkanki) daje moŜliwość analizy tego związku w bardzo wczesnym stadium rozwoju rośliny.
Nieskomplikowana procedura pozwala na jednoczesną analizę duŜej ilości prób. Metodę moŜna
stosować do izolacji DNA z komórek większości roślin.
5
MATERIAŁY I METODY
Odczynniki:
A, Homogenizacja tkanki
Bufor do homogenizacji (BH): 50 mM bufor Tris-HCl pH 7,5 zawierający 0,3 M sacharozę,
5mM MgCl2 i 3 mM CaCl2
Bufor do ekstrakcji (BE): 100 mM Tris-HCl pH 8.0 zawierający 50 mM EDTA i 500 mM NaCl
B, Denaturacja białek
20% SDS (siarczan dodecylu sodu)
5 M octan potasu
C, Wytrącanie DNA
Bufor (B1): 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 zawierający 10 mM EDTA
3 M octan sodu
Izopropanol
D, Oczyszczanie DNA
Bufor (B2): 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 zawierający 1 mM EDTA
Materiał:
Siewki pszenicy rosnące 5 dni na podłoŜu z trocin w temperaturze 25-27oC w całkowitej ciemności.
WYKONANIE
A, Homogenizacja tkanki i izolacja jąder komórkowych
5g świeŜo ściętych etiolowanych siewek pszenicy homogenizować ręcznie w wychłodzonym
moździerzu wyłoŜonym nylonem i gęstą nylonową siatką z 30 ml roztworu homogenizacyjnego o
następującym składzie: 50 mM bufor Tris-HCl pH 7,5, 0,3 M sacharoza, 3 mM CaCl2 i 5 mM
MgCl2 (6 ml roztworu na 1 g tkanki). Po przesączeniu homogenatu przez cztery warstwy gazy,
całą objętość rozlać do dwóch probówek wirówkowych, które następnie naleŜy dokładnie zrównowaŜyć. ZrównowaŜone probówki umieścić w wirówce MPW-350 i wirować 10 minut przy
700 x g (2200 obr/min). W tych warunkach w osadzie otrzymamy „surową” frakcję jądrową
wzbogaconą w jądra komórkowe. Uzyskaną frakcje jąder komórkowych moŜemy dalej oczyszczać
na drodze wirowania przez skokowy gradient gęstości zgodnie z procedurą opisaną poniŜej.
6
UWAGA! Wykonywane ćwiczenie nie obejmuje oczyszczania jąder
Oczyszczanie jąder z„surowej” frakcji jądrowej
Osad uzyskany po wirowaniu przy 700 g zawiesza się w niewielkiej objętości (1 ml) buforu homogenizacyjnego, a następnie wolno nawarstwia na umieszczony w probówkach wirówkowych roztwór 0,3 M sacharozy i 40% glicerolu przygotowany w 10 mM buforze Tris-HCl, pH 7,5 zawierający dodatkowo 10 mM KCl, 10 mM MgCl2 i 10 mM 2-merkaptoetanol. Wirowanie „surowej”
frakcji jądrowej przez skokowy gradient gęstości umoŜliwia usunięcie większości „zanieczyszczeń”, które pozostają w nadsączu i osadzenie frakcji jąder komórkowych o stosunkowo wysokiej
„czystości” . Po ostroŜnym zebraniu nadsączu, osad jąder zawiesza się w odpowiednim środowisku, którego skład zaleŜy od tego do jakich celów będą wykorzystane wyizolowane jądra. Ryc. 4
przedstawia zdjęcie z mikroskopu świetlnego i mikroskopu fluorescencyjnego frakcji jąder uzyskanych z etiolowanych koleoptyli owsa.
Ryc. 4. Jądra komórkowe izolowane z etiolowanych siewek owsa. A, – obraz z mikroskopu świetlnego, B,
– obraz z mikroskopu fluorescencyjnego (Hetmann - Praca doktorska 2005)
B, Preparatyka DNA z izolowanych jąder komórkowych
Wytrącanie białek z ekstraktu jądrowego
a, Osad „surowej” frakcji jąder uzyskany po wirowaniu przy 700 x g zawiesić w 5 ml buforu ekstrakcyjnego (BE) o następującym składzie: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA i 500 mM
NaCl. Po dokładnym rozprowadzeniu osadu, uzyskaną zawiesinę jąder podzielić na 5 porcji o objętości 1 ml (kaŜda para ćwiczeniowa pobiera po 1ml zawiesiny do probówki Eppendorfa).
b, Do 1 ml zawiesiny dodać 70 µl 20% roztworu SDS, dobrze wytrząsnąć i umieścić na 10 min w
łaźni wodnej o temp. 650 C
7
c, Do próby dodać 300 µl 5 M roztworu octanu potasu, dokładnie wytrząsnąć, a następnie probówkę umieścić na 10 min w lodzie
d, Zdenaturowane białka oddzielić wirując próbę 10 min przy 17 500 x g (15 000 obr/min)
Wytrącanie DNA
a, Supernatant uzyskany po odwirowaniu zdenaturowanych białek przenieść do suchej probówki
Eppendorfa, a następnie dodać 600 µl wychłodzonego do –20oC izopropanolu
b, Probówkę dokładnie wytrząsnąć, a następnie umieścić na 10 min w zamraŜarce w temperaturze
–20oC. Strącający się w tych warunkach DNA osadzić wirując próbę 10 min przy 17 500 x g (15
000 obr/min)
c, pipetą ściągnąć ostroŜnie supernatant znajdujący się nad osadem DNA (UWAGA! Proszę to
robić bardzo uwaŜnie, tak Ŝeby nie poruszyć osadu DNA). W tym celu najpierw dokładnie
obejrzeć dno probówki, znaleźć osad DNA, a następnie koniec pipety włoŜyć na dno probówki
obok osadu DNA.
d, Resztki supernatantu usunąć pozostawiając na jakiś czas probówkę z osadem DNA na bibule
filtracyjnej odwróconą do góry dnem. (UWAGA! Nie wytrząsać resztek roztworu, gdyŜ moŜna
odkleić osad DNA od ścianki probówki)
Oczyszczanie DNA
a, osad DNA rozpuścić w 0.7 ml roztworu B1 zawierającego: 50 mM bufor Tris-HCl, pH 8,0 i 10
mM EDTA
b, nierozpuszczony materiał odwirować w mikrowirówce (wirować 3 min)
c, ściągnąć ostroŜnie pipetą supernatant i przenieść go do suchej probówki Eppendorfa, a następnie dodać 75 µl octanu sodu i 500 µl izopropanolu schłodzonego do –20oC. Probówkę starannie wytrząsnąć, a następnie strącający się DNA odwirować na mikrowirówce (wirować 5
min)
8
d, uzyskany osad DNA rozpuścić w 100 µl roztworu B2 (10 mM bufor Tris-HCl, pH 8,0 zawierający 1 mM EDTA)
Sprawdzanie czystości uzyskanego preparatu DNA
a, do suchej probówki Eppendorfa pobrać 50 µl otrzymanego roztworu DNA i dodać 950 µl roztworu B2 (10 mM bufor Tris-HCl, pH 8,0 zawierający 1 mM EDTA) (roztwór DNA zostanie
rozcieńczony 20-krotnie)
b, w spektrofotometrze Schimadzu UV-160A wyznaczyć widmo absorpcyjne w zakresie 240 350 nm, a następnie mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm wyznaczyć współczynnik
KA(A260 nm /A280 nm ). Jako próby odniesienia uŜywać roztworu B2 (10 mM bufor Tris-HCl, pH
8.0 zawierający 1 mM EDTA) Wartość współczynnika KA określa czystość preparatu DNA.
DNA o wysokiej czystości charakteryzuje się wartością KA zbliŜoną do 2.
Zagadnienia do przygotowania:
- budowa chemiczna i struktura DNA i RNA
- genomy jądrowe i organellarne
-budowa chromatyny organizmów eukariotycznych
Piśmiennictwo:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Genomy – TA Brown PWN, Warszawa 2001
Biochemistry & Molecular Biology of Plants – BB Buchanan, W Gruissem, RL Jones, American
Society of Plant Physiologist, Rockville,Maryland, 2000
9