Ekspresja genów w raku plaskonablonkowym krtani in vivo na

Ekspresja genów w raku plaskonablonkowym krtani in vivo na

*HQHH[SUHVVLRQSURğOHLQODU\QJHDOFDQFHU in vivo
E\KLJKGHQVLW\ROLJRQXFOHRWLGHPLFURDUUD\VDQDO\VLV
-DURVïDZ0DUNRZVNL
6WUHV]F]HQLHUR]SUDZ\QDVWRSLHñGRNWRUDKDELOLWRZDQHJRQDXNPHG\F]
Q\FKQDGDQHJRSU]H]5DGÚ:\G]LDïX/HNDUVNLHJR¥OÈVNLHJR8QLZHUV\WHWX
0HG\F]QHJRZ.DWRZLFDFKZGQLXU
ŅE\3ROVNLH7RZDU]\VWZR2WRU\QRODU\QJRORJöZ
ļ&KLUXUJöZ*ïRZ\L6]\L
35$&$=*’26=21$'2'58.8
35=(=(/(.7521,&=1<6<67(0ļ((6
.DWHGUDL.OLQLND/DU\QJRORJLL¥OÈVNLHJR
8QLZHUV\WHWX0HG\F]QHJRZ.DWRZLFDFK
.LHURZQLNSURIGUKDEQPHG7DWLDQD*LHUHN
$GUHVGRNRUHVSRQGHQFML/
$GGUHVVIRUFRUUHVSRQGHQFH
LPLÚLQD]ZLVNR-DURVïDZ0DUNRZVNL
.DWHGUDL.OLQLND/DU\QJRORJLL
XO)UDQFXVND
ļ.DWRZLFH
tel. fax e-mail MPDUNRZ#SRF]WDRQHWSO
-d
istr
5HFHQ]HQFL
SURIGUKDEQPHG/XF\QD3RĂSLHFK
SURIGUKDEQPHG'DULXV]-XUNLHZLF]
SURIGUKDEQPHG-DFHN6NïDG]LHñ
SURIGUKDEQPHG5DIDï6XZLñVNL
+DVïD LQGHNVRZH UDN SïDVNRQDEïRQNRZ\ NUWDQL PLNURPDFLHU]H ROLJRQXNOHRW\-
nly
GRZHHNVSUHVMDJHQöZ
.H\ZRUGVVTXDPRXVFHOOFDUFLQRPDRIWKHODU\Q[ROLJRQXFOHRWLGHPLFURDUUD\V
eo
JHQHH[SUHVVLRQSURğOH
is c
op
y is
for
pe
rs
on
al
us
Choroba nowotworowa jest chorobą o podłożu genetycznym, wynikającą w większości przypadków z nabytych
mutacji oraz ze zmian genetycznych, które wpływają
na ekspresję genów. W jej rozwoju istotną rolę odgrywa
również wpływ czynników środowiskowych. Zgodnie
z tą tezą, największą obecnie rolę w badaniach nad
biologią molekularną nowotworów odgrywa identyfikacja markerów genetycznych, jakich można użyć do
precyzyjnego ustalenia rozpoznania, a następnie możliwości prognozowania przebiegu choroby na podstawie
ustalonego profilu genów. Rak krtani jest wciąż słabo
zdefiniowanym nowotworem z punktu widzenia biologii molekularnej i genetyki. Wielu autorów sugeruje, iż
stosując globalne modele ekspresji genowej, można zaklasyfikować chorych na raka krtani do poszczególnych
podgrup, różniących się przebiegiem klinicznym choroby.
Kompleksowy profil ekspresji genów, mający wartość prognostyczną lub identyfikacyjną jako markerów
guza, podlegających ekspresji wyłącznie w tkankach
HNSCC, nadal pozostaje nieznany.
Od kilku lat w Stanach Zjednoczonych jest wdrażany program CGAP (Cancer Genome Anatomy Project), który ma na celu utworzenie rejestru wszystkich
genów odpowiedzialnych za procesy nowotworowe.
Jednocześnie w latach 90. XX w. została opracowana
tzw. technika mikromacierzy (mikrosiatek) oligonukleotydowych lub cDNA (microarray DNA), która umożliwia identyfikację genów zmieniających swą ekspresję
w trakcie onkogenezy. Mikromacierze oligonukleotydowe są urządzeniami, które przy obecnym stanie wiedzy
pozwolą na znacznie dokładniejsze badania z zakre-
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
ibu
tio
np
roh
ibit
(NVSUHVMDJHQöZZUDNXSïDVNRQDEïRQNRZ\PNUWDQLLQYLYR
QDSRGVWDZLHDQDOL]\PLNURPDFLHU]\ROLJRQXNOHRW\GRZ\FK
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
2WRODU\QJRO3RO
DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES
ed
.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
400
su molekularnych zaburzeń komórki. Mikromacierze
oligonukleotydowe w powiązaniu z zaawansowanym
oprogramowaniem komputerowym stwarzają możliwość znaczącego postępu w molekularnych badaniach
genetycznych. Pozwalają bowiem na analizę tysięcy
genów i ocenę ich ekspresji w niezwykle krótkim czasie,
w trakcie jednego doświadczenia.
Ocena profilu ekspresji genów pozwoli na wdrożenie
metod biologii molekularnej w diagnostyce, a także
w prognozowaniu przebiegu choroby, ułatwiając podjęcie optymalnych decyzji, dotyczących metod leczenia,
zakresu operacji czy konieczności uzupełniającej radioterapii. Prowadzone badania z zakresu biologii molekularnej mają na celu zwiększenie precyzji rozpoznania
chorób nowotworowych (z uwzględnieniem podtypów
molekularnych nowotworów), prognozowanie przebiegu
poszczególnych typów nowotworów oraz wprowadzenie indywidualizacji leczenia chorób nowotworowych
opartej na zasadzie terapii genowej. Do chwili obecnej
nie stworzono klasyfikacji molekularnej raka krtani,
co jest dodatkowo utrudnione faktem, iż rak krtani
ma najpewniej podłoże poligenowe. Badania przeprowadzono w ramach projektu badawczego Ministerstwa
Nauki i Informatyzacji nr. 3 PO5B 112 25.
&HOHSUDF\
1. Wytypowanie genów charakterystycznych dla raka
płaskonabłonkowego krtani, a w przypadku ich
wzmożonej ekspresji ustalenie, czy mogą być one
markerami raka krtani.
2 WROD U \QJRORJLD3ROVNDWRP QU OLV WRSDGJU XG]LHñ
-
ed
.
genów różnicujących dotyczą cyklu komórkowego i jego
regulacji. Na podstawie analiz profilów ekspresji komórek nowotworowych i nietransformowanych (zdrowych)
krtani metodą Limma (linear models for microarrays,
Smyth i wsp.) został przeprowadzony wybór genów –
potencjalnych nowych markerów raka krtani. W celu
sprawdzenia ekspresji tych genów przeprowadzono
badanie ilościową reakcją PCR w czasie rzeczywistym.
0DWHULDïLbPHWRG\
:\QLNL
us
eo
nly
-d
istr
Do analizy wybrano 8 genów, wśród których cztery,
dotychczas nie badane pod tym kątem w raku krtani,
okazały się dobrymi markerami tego nowotworu. Należą
do nich: metaloproteinaza ADAM12, cyklinozależna
kinaza 2 – CDK2, kinezyna 14 – KIF14, supresor 1
punktu kontrolnego – CHES1. Dla pozostałych genów
badanych przez nas: ATP6V1C1, RERG, ISG20L oraz
C18orf21 nie udało się poprzez Q-PCR potwierdzić
różnic w ich ekspresji między rakiem płaskonabłonkowym a niezmienioną nowotworowo tkanką krtani.
W trzech genach potwierdzono znamienne statystycznie
zwiększenie ekspresji w raku płaskonabłonkowym
krtani w porównaniu do normalnej krtani (ADAM12,
CDK2, KIF14), a w jednym obserwowano znamienną
statystycznie zmniejszoną ekspresję (CHES1).
Gen ADAM koduje białko o cechach dysintegryn
i metaloproteinaz. Są to białka strukturalne zakotwiczone w błonie komórkowej, związane z różnorodnymi
procesami biologicznymi obejmującymi interakcje komórka–komórka i komórka–macierz, takie jak zapłodnienie, rozwój mięśni i neurogeneza. Uczestniczy też
w procesach adhezji komórek. Główną funkcją białka
ADAM12 jest proteoliza oraz oddziaływania z integrynami i syndekanami. Procesy te są kluczowe dla adhezji
komórek. Wzrost ekspresji tej metaloproteinazy wpływa
na rozluźnienie oddziaływań między komórkami i odgrywa znaczącą rolę w zwiększeniu agresywności guza
poprzez wzrost inwazyjności, skrócenie czasu progresji
nowotworu z fazy in situ do tworzenia przerzutów, we
wzroście potencjału rozsiewu komórek guza oraz w stopniu złośliwości histologicznej. Niespodziewanie, nadekspresja genu ADAM12 wywołuje zwiększoną apoptozę
komórek zrębu, co wraz ze zmniejszeniem potencjału
apoptotycznego komórek raka sprzyja progresji guza.
Gen KIF14 służy jako marker nowotworów wysoko
proliferujących, a nadekspresja tego genu może prowadzić do niestabilności genetycznej, zaburzenia cytokinezy i powstawania komórek aneuploidalnych. Białko
kodowane przez gen KIF14 należy do superrodziny
kinezyn, białek motorycznych, które wpływają na wiele
procesów komórkowych poprzez połączenie hydrolizy
ATP do regulacji i ukierunkowania ruchu wzdłuż włókien mikrotubul. Kinezyny biorą udział w transporcie
pęcherzykowym, tworzeniu wrzeciona podziałowego,
segregacji chromosomów i zakończeniu cytokinezy.
is c
op
y is
for
pe
rs
on
al
Badaniami objęto grupę 43 chorych (38 mężczyzn i 5
kobiet) na raka płaskonabłonkowego krtani, diagnozowanych i leczonych operacyjnie w latach 2004–2007
w Katedrze i Klinice Laryngologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Izolację RNA przeprowadzono z zamrożonych fragmentów tkanki z wykorzystaniem kolumn Rneasy Midi i Mini Kit (Qiagen). Do badań
profilu ekspresji genów zastosowano mikromacierze
oligonukleotydowe wysokiej gęstości firmy Affymetrix
(U 133 2.0 PLUS) zawierające ponad 54 tysiące sond
dla ponad 47 tysięcy transkryptów. Przed badaniem
mikromacierzowym próbki poddano ponownej ocenie
histopatologicznej.
Dane uzyskane metodą mikromacierzy DNA zostały
poddane przetwarzaniu wstępnemu dwoma metodami:
RMA i GC-RMA. Geny, wyselekcjonowane na podstawie
analizy mikromacierzowej jako potencjalne markery
molekularne pomocne w diagnozowaniu raka krtani,
poddano walidacji metodą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (QPCR). Analizę Q-PCR prowadzono
na analizatorze ABI 7900HT z wykorzystaniem sond
fluorescencyjnych (LNA, Universal Probe Library, Roche) i reakcji 5’-nukleazy. Dane analizowano w odniesieniu do próbki referencyjnej (Stratagene Reference
Total RNA), uwzględniając wydajność reakcji.
W pierwszym etapie przeprowadzono nienadzorowaną analizę metodą analizy głównych składowych
(Principal Component Analysis, PCA), a następnie
dokonano analizy metodami nadzorowanymi w celu
selekcji genów różnicujących. Wykonano analizę wariancji ANOVA z zastosowaniem poprawki Benjamini-Hochberg, przy kryterium odsetka wyników fałszywie
dodatnich FDR<10%. Wyselekcjonowano grupę 398 oraz
621 genów różnicujących próbki pochodzące z utkania
nowotworowego (rak płaskonabłonkowy) z niezmienioną
makroskopowo krtanią w zależności od zastosowanej
metody normalizacji (odpowiednio RMA lub GC-RMA).
Wśród różnicujących genów w obu listach znalazły się
geny: MMP1, MMP12 i HIF-1A. Wykonana hierarchiczna klasteryzacja wszystkich analizowanych próbek
na podstawie 621 wyselekcjonowanych transkryptów
wykazała, że wybrany zbiór dobrze rozróżnia grupy
tkanek. Dla różnicujących genów wykonano również
analizę ich ontologii. Stwierdzono, że 30% genów bierze
udział w komunikacji komórkowej, natomiast prawie
6% uczestniczy w adhezji komórkowej. Najbardziej
znamienne nadreprezentowane klasy ontologii dla
2 WROD U \QJRORJLD3ROVNDWRP QU OLV WRSDGJU XG]LHñ
ibu
tio
np
roh
ibit
2. Identyfikacja wzorów ekspresji genowej pozwalająca
odróżnić raka płaskonabłonkowego krtani od tkanki
zdrowej krtani, a także sprawdzenie, czy za pomocą
mikrosiatek można zidentyfikować geny, których
ekspresja różni się pomiędzy tkanką nowotworową
a zdrową.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES
401
2.
nly
3.
4.
us
al
for
pe
rs
on
Na podstawie profilu ekspresji możliwe jest odróżnienie tkanek raka krtani od tkanek krtani
niezmienionych nowotworowo. Znaczna liczba
transkryptów różnicujących te dwie klasy próbek
umożliwia skonstruowanie molekularnego klasyfikatora rozróżniającego obie grupy.
Walidacja wybranych genów różnicujących raka
krtani od krtani niezmienionej nowotworowo pozwala na wyselekcjonowanie nowych potencjalnych markerów raka krtani (ADAM12, CDK2,
KIF14, CHES1). Największe różnice w ekspresji
(prawie 7-krotne zwiększenie) obserwowano dla
genu ADAM12.
Zaobserwowane przypadki nieprawidłowej klasyfikacji próbek w badaniu profilu ekspresji wskazują
na konieczność zastosowania dodatkowych metod
w selekcji markerów molekularnych w raku krtani.
Uniknięcie wpływu mikroognisk nowotworu
w zdrowej krtani na wynik badania mikromacierzowego będzie możliwe dzięki zastosowaniu
analizy materiału poddanego mikrodyssekcji.
Identyfikacja zjawisk molekularnych, takich jak
hipoksja czy martwica, zachodzących w niezmienionej nowotworowo tkance narządu w okolicach
guza pozwoli na wyodrębnienie markerów molekularnych niewrażliwych na te artefakty.
-d
istr
1.
ibu
tio
np
roh
ibit
:QLRVNL
y is
op
is c
Th
-
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
W wyniku tego następuje zmniejszenie wrażliwości
na uszkodzenia DNA, co pozwala na postęp cyklu
i podział komórki.
eo
W przypadku genu CDK2 również zaobserwowano
wzrost ekspresji w raku płaskonabłonkowym krtani
w porównaniu do krtani niezmienionej nowotworowo. Białko CDK2 współdziałając z cykliną-E, umożliwia przejście cyklu komórkowego fazy G1 do fazy
S. Nadekspresja cyklin oraz kinaz cyklinozależnych
w odpowiedzi na sygnały mitogenne prowadzi do niekontrolowanej proliferacji komórek nowotworowych.
Wykazano, że nadekspresja genu CDK2 znacząco koreluje z rozmiarem guza, jego umiejscowieniem, stopniem
zaawansowania oraz cechami złośliwości biologicznej
guza (przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych
i narządów odległych).
Cyklinozależna kinaza 2 (CDK2, cyclin-dependent
kinase 2) to białko należące do rodziny kinaz serynowo-treoninowych. Jego aktywność katalityczna ogranicza
się do fazy G1/S i jest niezbędna do przejścia cyklu
komórkowego z fazy G1 do fazy S. Białko CDK2 przyłącza się do podjednostki regulatorowej kompleksu
składającego się z cykliny A lub E, inhibitora CDK
p21Cip1 (CDKN1A) i p27Kip1 (CDKN1B), a jego aktywność podlega regulacji przez fosforyzację.
Supresor 1. punktu kontrolnego CHES1 (checkpoint suppressor 1) koduje białko należące do rodziny
czynników transkrypcyjnych ( forkhead/winged helix
transcription factor family). Produkt genu CHES1 –
białko CHES1 – bierze udział w regulacji punktu
kontrolnego G2/M. W odpowiedzi na uszkodzenia DNA
następuje zatrzymanie cyklu komórkowego w celu
dokonania napraw przed syntezą DNA i mitozą. W
badaniach własnych zaobserwowano spadek ekspresji genu CHES1, co jest zgodne z oczekiwaniami.
ed
.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES
-
402
2 WROD U \QJRORJLD3ROVNDWRP QU OLV WRSDGJU XG]LHñ