Pobierz dokument

Transkrypt

Pobierz dokument

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
27.03.2007 07712963.3
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
1999152
T3
Int.Cl.
C07K 16/28 (2006.01)
A61K 39/395 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
19.09.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/38
EP 1999152 B1
Tytuł wynalazku:
Element wiążący receptor GM-CSF
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
27.03.2006 US 786569 P
Zgłoszenie ogłoszono:
10.12.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/50
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
31.05.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/05
(73)
Uprawniony z patentu:
MEDIMMUNE LIMITED, Cambridge, GB
Zenyth Operations PTY. Ltd., Parkville, AU
PL/EP 1999152 T3
(72)
Twórca(y) wynalazku:
EMMA SUZANNE COHEN, Cambridge, GB
RALPH RAYMOND MINTER, Cambridge, GB
PAULA ROSAMUND HARRISON, Cambridge, GB
MATTHEW ALEXANDER SLEEMAN, Cambridge, GB
ANDREW DONALD NASH, Richmond, AU
LOUIS JERRY FABRI, Richmond, AU
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Tadeusz Rejman
KANCELARIA PATENTOWA REJMAN S.C.
ul. Hubska 96/100 lok. 205
50-502 Wrocław
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 1 999 152B1
Opis
[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy elementów wiążących łańcuch alfa
Receptora
Czynnika
Stymulującego
Tworzenie
Kolonii
Granulocytów/Makrofagów (GM-CSFRα), szczególnie cząsteczek przeciwciał
anty-GMCSFRα. Dotyczy również stosowania tych elementów wiążących w
leczeniu chorób zapalnych, układu oddechowego i autoimmunologicznych
związanych z GMCSFRα, w tym reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekła
obturacyjna choroba płuc i stwardnienie rozsiane.
[0002] GM-CSF jest cytokiną prozapalną typu I, która poprawia przeżycie,
proliferację
i/lub
różnicowanie
szerokiego
zakresu
typów
komórek
krwiotwórczych, w tym neutrofili, eozynofili, makrofagów i ich komórek
progenitorowych. Receptor GM-CSF jest członkiem nadrodziny receptora
erytropoetyny. Jest heterodimeryczny, składający się z podjednostki alfa i beta.
Podjednostka alfa jest wysoce specyficzna względem GM-CSF, podczas gdy
podjednostka beta jest dzielona z innymi receptorami cytokin, w tym IL3 i IL5.
Odzwierciedla się to szerszą dystrybucją tkankową podjednostki beta receptora.
Podjednostka alfa, GM-CSFRα, jest głównie ekspresjonowana na komórkach
mieloidalnych i komórkach innych niż krwiotwórcze takich, jak neutrofile,
maktofagi, eozynofile, komórki dendrytyczne, komórki śródbłonka i komórki
nabłonka
dróg
oddechowych.
GM-CSFRα
pełnej
długości
jest
400-
aminokwasową glikoproteiną błonową typu I, która należy do rodziny
receptorów cytokin typu I i składa się z 22-aminokwasowego peptydu
sygnałowego
(pozycje
1-22),
298-aminokwasowej
domeny
zewnątrzkomórkowej (pozycje 23-320), domeny transbłonowej od pozycji 321345 i krótkiej 55-aminokwasowej domeny wewnątrzkomórkowej. Peptyd
sygnałowy jest rozcinany, aby zapewnić dojrzałą formę GM-CSFRα, jako 378aminokwasowe białko. Klony cDNA ludzkiego i mysiego GM-CSFRα są
dostępne i, na poziomie białka, podjednostki receptora mają 36% identyczność.
GM-CSFR jest zdolny do wiązania ze stosunkowo niskim powinowactwem do
samej podjednostki α (Kd 1-5 nM) lecz w ogóle nie do samej podjednostki β.
Jednakże, obecność obu podjednostek α i β skutkuje wyższym powinowactwem
kompleksu ligand-receptor (Kd ≈ 100pM). Przekazywanie sygnału GM-CSF
1
EP 1 999 152B1
następuje poprzez jego początkowe wiązanie do łańcucha GM-CSFα i
następnie usieciowanie większą podjednostką wspólnym łańcuchem β, aby
utworzyć oddziaływanie o wysokim powinowactwie, które fosforyluje szlak JAKSTAT. Wiązanie GM-CSFR do GMCSF omówiono w odnośniku
[0003] [1]. To oddziaływanie jest również zdolne do przekazywania sygnału
poprzez fosforylację tyrozyny i aktywację szlaku kinazy MAP.
[0004] Patologicznie, jak zostało wykazane GM-CSF odgrywa rolę w
pogłębiającym
się
zapaleniu,
chorobach
dróg
oddechowych
i
autoimmunologicznych. Zobojętnienie wiązania GM-CSF do GM-CSFRα jest
zatem podejściem terapeutycznym w leczeniu chorób i stanów zależnych od
GM-CSFR.
[0005] Nicola et al. [2] opisali mysie przeciwciało przeciw ludzkiemu GMCSFRα, oznaczone 2B7-17-A lub "2B7", donosząc, że ma względnie wysokie
powinowactwo do ludzkiego GM-CSFRα i jest silnym inhibitorem biologicznego
działania
ludzkiego
GM-CSF
w
kilku
różnych
testach
biologicznych.
Przeciwciało 2B7 jest dostępne w sprzedaży w Chemicon jako MAB1037 i Karta
Danych Produktu dla MAB1037 zwraca uwagę, że jest on silnym inhibitorem
biologicznego działania GM-CSF. 2B7 ujawniono również w WO94/09149.
[0006] Poprzez zastosowanie kombinacji wyborów naiwnych bibliotek fagowych
scFv, losowej mutagenezy i odpowiednio zaprojektowanych biochemicznych i
biologicznych testów (patrz Część Doświadczalna poniżej), zidentyfikowaliśmy
bardzo silne cząsteczki przeciwciała, które wiążą się do ludzkiego GM-CSFRα i
hamują działanie ludzkiego GM-CSF na jego receptor. Wyniki zaprezentowane
niniejszym wskazują, że nasze przeciwciała wiążą inny region lub epitop GMCSFRα w porównaniu do znanego przeciwciała anty-GM-CSFRα 2B7 i
zaskakująco są nawet silniejsze niż 2B7, jak wykazano w różnych testach
biologicznych.
[0007] Odpowiednio, wynalazek ten dotyczy wiązania elementów zawierających
cząsteczki przeciwciała, które wiążą ludzki GM-CSFRα i hamują wiązanie
ludzkiego GM-CSF do GM-CSFRα. Elementy wiążące według wynalazku mogą
być antagonistami GM-CSFR. Elementy wiążące mogą być odwracalnymi
inhibitorami kompetycyjnymi przekazywania sygnału GM-CSF przez GM-CSFR.
2
EP 1 999 152B1
[0008] Przeciwciała według wynalazku mają szczególną wartość w wiązaniu i
zobojętnianiu GM-CSFRα i zatem stosuje się je w leczeniu chorób zależnych od
GM-CSFRα, w tym chorób zapalnych i autoimmunologicznych, jak wykazano
przez doświadczenia zawarte niniejszym i ponadto wspierającą literaturę
techniczną. Na przykład, wykazaliśmy w testach opartych na komórkach, że
przeciwciała według wynalazku są zdolne do hamowania uwalniania cytokin
(np. IL-6 i TNFα) indukowanych wiązaniem natywnym GM-CSF do jego
receptora.
Jak
wyjaśniono
bardziej
szczegółowo
poniżej,
hamowanie
aktywności GM-CSF poprzez blokowanie wiązania do GM-CSFRα jest
podejściem terapeutycznym do leczenia takich chorób, jak reumatoidalne
zapalenie stawów (RA), astma, zapalenia dróg oddechowych indukowane
dymem, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), odpowiedź alergiczna,
stwardnienie rozsiane (MS), białaczka szpikowa i miażdżyca.
[0009]
Elementy
wiążące
według
wynalazku
ogólnie
wiążą
domenę
zewnątrzkomórkową GM-CSFRα. W jednym z aspektów według wynalazku,
element wiążący wiąże się do sekwencji Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln (YLDFQ), SEQ
ID NR: 201, w pozycjach 226 do 230 dojrzałego ludzkiego GM-CSFRα (SEQ ID
NR: 206). Element wiążący może wiązać co najmniej jedną resztę w sekwencji
YLDFQ ludzkiego GM-CSFRα, np. może wiązać jedną, dwie, trzy lub cztery
reszty sekwencji YLDFQ. Zatem, element wiążący może rozpoznawać jedną
lub większą liczbę reszt w obrębie tej sekwencji i opcjonalnie może również
wiązać dodatkowe reszty flankujące lub reszty strukturalnie sąsiadujące w
domenie zewnątrzkomórkowej GM-CSFRα.
[0010] Wiązanie można określić jakimkolwiek odpowiednim sposobem, na
przykład można zastosować skanowanie wiązania peptydu takie, jak test
immunoenzymatyczny oparty na PEPSCAN (ang. PEPSCAN-based enzyme
linked immuno assay (ELISA), jak niniejszym opisano szczegółowo w innym
miejscu. W skanowaniu wiązania peptydu takim, jak rodzaj zapewniony przez
PEPSCAN Systems, krótkie nakładające się peptydy pochodzące od antygenu
systematycznie poddaje się badaniu przesiewowemu pod względem wiązania
do elementu wiążącego. Peptydy mogą być połączone kowalencyjnie do
powierzchni nośnej, aby utworzyć macierz peptydów. W skrócie, skanowanie
3
EP 1 999 152B1
wiązania peptydu (np. "PEPSCAN") zawiera identyfikację (np. z zastosowaniem
ELISA) zestawu peptydów, do których wiąże się element wiążący, przy czym
peptydy mają sekwencje aminokwasowe odpowiadające fragmentom SEQ ID
NR: 206 (np. peptydy o około 15 sąsiadujących resztach SEQ ID NR: 206) oraz
wyrównanie peptydów, aby określić wykres pokrycia reszt związanych przez
element wiążący, gdzie wykres pokrycia zawiera reszty wspólne dla
nakładających
się
peptydów.
Według
wynalazku,
wykres
pokrycia
zidentyfikowany przez skanowanie wiązania peptydu lub PEPSCAN może
obejmować co najmniej jedną resztę z YLDFQ odpowiadającą pozycjom 226 do
230 SEQ-ID NR: 206. Wykres pokrycia może obejmować jedną, dwie, trzy,
cztery lub wszystkie reszty YLDFQ. Element wiążący według wynalazku może
wiązać fragment peptydu (np. 15 reszt) o SEQ ID NR: 206 zawierającej jedną
lub większą liczbę, korzystnie wszystkie, reszty YLDFQ odpowiadające
pozycjom 226 do 230 SEQ ID NR: 206, np. jak określono skanowaniem
wiązania peptydu lub sposobem PEPSCAN opisanym niniejszym. Zatem,
element wiążący według wynalazku może wiązać peptyd posiadający
sekwencję aminokwasową o 15 sąsiadujących resztach SEQ ID NO: 206, przy
czym sekwencja 15 reszt zawiera co najmniej jedną resztę lub częściowo
pokrywa się z YLDFQ w pozycjach 226 do 230 SEQ ID NR: 206. Szczegóły
odpowiedniego sposobu skanowania wiązania peptydu do wyznaczenia
wiązania określono szczegółowo niniejszym w innym miejscu. Inne sposoby,
które są dobrze znane w dziedzinie można zastosować do wyznaczenia reszt
związanych przez przeciwciało i/lub do potwierdzenia wyników skanowania
wiązania peptydu (np. PEPSCAN), zawierają mutagenezę ukierunkowaną,
wymianę wodór deuter, spektrometrię mas, NMR i krystalografię promieni X.
[0011] Odpowiednio, element wiążący według wynalazku korzystnie zobojętnia
GM-CSFRα. Zobojętnianie oznacza zmniejszenie lub hamowanie aktywności
biologicznej GM-CSFRα, np. zmniejszenie lub hamowanie wiązania GM-CSF
do GM-CSFRα lub przekazywania sygnału przez GM-CSFRα, np. jak
zmierzono poprzez odpowiedzi zależne do GM-CSFRα. Zmniejszenie lub
hamowanie aktywności biologicznej może być częściowe lub całkowite. Stopień
do jakiego przeciwciało zobojętnia GM-CSFRα nazywa się siłą zobojętniania.
4
EP 1 999 152B1
Siłę można wyznaczyć lub zmierzyć stosując jeden lub większą liczbę testów
znanych znawcom i/lub jak niniejszym opisano lub odniesiono się. Na przykład,
element wiążący może posiadać aktywność zobojętniającą w jednym lub
większej liczbie następujących testów:
•
Biochemiczny test wiązania liganda
•
Test proliferacji TF-1
•
Test zmiany kształtu ludzkich granulocytów
•
Test zmiany kształtu granulocytów cynomolgus, naczelnego innego niż
człowiek
•
Test uwalniania TNFα przez monocyty
•
Test przeżywalności granulocytów
•
Test tworzenia kolonii (hamowanie różnicowania progenitorowych
komórek krwi zależnego od GM-CSF in vitro)
•
Hamowanie bioaktywności GM-CSF in vivo, np. w chimerycznych
myszach z transgenicznym szpikiem kostnym ekspresjonującym ludzki
GM-CSFR.
•
Test uwalniania cytokin przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej
[0012] Siłę normalnie wyraża się jako wartość IC50, w pM o ile nie stwierdzono
inaczej. W testach funkcjonalnych, IC50 jest stężeniem, które zmniejsza
maksymalną odpowiedź biologiczną o 50 %. W badaniach wiązania liganda,
IC50 jest stężeniem, które zmniejsza wiązanie receptora o 50 % maksymalnego
poziomu specyficznego wiązania. IC50 można obliczyć przez sporządzenie
wykresu % maksymalnej odpowiedzi biologicznej (reprezentowanej np. przez
proliferację komórek, którą można mierzyć jako włączenie 3H tymidyny w cpm,
w teście proliferacji, przez zmianę kształtu w teście zmiany kształtu, przez
uwalnianie TNFα w teście uwalniania TNFα, przez przeżywalność w teście
przeżywalności, przez liczbę kolonii w teście tworzenia kolonii lub przez wzrost
wagi śledziony lub obniżenie liczby krążących monocytów w chimerycznych
myszach z transgenicznym szpikiem kostnym ekspresjonującym ludzkie GMCSFR w teście bioaktywności) lub % specyficznego wiązania receptora, jako
funkcję log stężenia elementu wiążącego i stosując oprogramowanie takie, jak
5
EP 1 999 152B1
Prism (GraphPad), aby dopasować funkcję sigmoidalną do danych, aby
utworzyć wartości IC50.
[0013] Wartość IC50 może reprezentować średnią z wielu pomiarów. Zatem, na
przykład wartości IC50 można otrzymać z wyników doświadczeń w trzech
powtórzeniach i można następnie obliczyć średnią wartość IC50.
[0014] W teście proliferacji TF-1, elementy wiążące według wynalazku
normalnie mają IC50 mniejsze niż 1500 pM. Na przykład IC50 może być < 300,
< 60, < 10, lub < 1,5 pM np. około 1,0 pM. Normalnie IC50 wynosi co najmniej
0,5 do 1,0 nM. Znane mysie przeciwciało 2B7 w tym teście ma IC50 około 1600
pM. Test proliferacji TF-1 zastosowany niniejszym miał końcowe stężenie
ludzkich GM-CSF wynoszące 7pM. Zatem, siła zobojętniania IC50 w teście
proliferacji TF-1 reprezentuje zdolność elementu wiążącego do hamowania
proliferacji komórek TF-1 indukowaną przez 7 pM ludzkich GM-CSF. Po więcej
szczegółów patrz rozdział Metody i Materiały Testu.
[0015] Element wiążący według wynalazku może mieć pA 2 bardziej ujemne niż
-6, -7, -8, -9, -10, -10,5 lub -11 w teście proliferacji TF-1. Na przykład, pA 2 może
wynosić
około
-10,5
lub
-11.
Obliczenie
i
znaczenie
wartości
pA 2
przedyskutowano szczegółowo w Części Doświadczalnej w Metodach i
Materiałach Testu.
[0016] W teście zmiany kształtu ludzkich granulocytów, elementy wiążące
według wynalazku mają normalnie IC50 mniejsze niż 100 pM, np. mniejsze niż
50 pM lub mniejsze niż 30, 25, 20, 15 lub 10 pM. Normalnie IC50 wynosi co
najmniej 5, 6 lub 7 pM. Znane przeciwciało mysie 2B7 z kolei ma mniejszą siłę
o zmierzonej wartości IC50 wynoszącej w tym teście 477 pM. Test zmiany
kształtu ludzkich granulocytów zastosowany niniejszym miał końcowe stężenie
ludzkich GM-CSF wynoszące 7pM. Zatem, siła zobojętniania IC50 w teście
zmiany kształtu ludzkich granulocytów reprezentuje zdolność elementu
wiążącego do hamowania zmiany kształtu ludzkich granulocytów indukowaną
przez 7 pM ludzkich GM-CSF. Po więcej szczegółów patrz rozdział Metody i
Materiały Testu.
[0017] W teście zmiany kształtu granulocytów cynomolgus, elementy wiążące
według wynalazku normalnie mają IC50 mniejsze niż 20 pM, typowo mniejsze
6
EP 1 999 152B1
niż 10, 5 lub 2,5 pM. IC50 może wynosić co najmniej 0,5, 1 lub 1,5 pM. Znane
mysie przeciwciało 2B7 testowane w tym teście ma IC50 wynoszące 26 pM.
Test zmiany kształtu granulocytów cynomolgus zastosowany niniejszym miał
końcowe stężenie ludzkich GM-CSF wynoszące 7pM. Zatem, siła zobojętniania
IC50 w teście zmiany kształtu granulocytów cynomolgus reprezentuje zdolność
elementu wiążącego do hamowania zmiany kształtu granulocytów cynomolgus
indukowaną przez 7 pM ludzkich GM-CSF. Po więcej szczegółów patrz rozdział
Metody i Materiały Testu.
[0018] Element wiążący według wynalazku może mieć pA 2 bardziej ujemne niż
-6, -7, -8, -9, -10, -10,5 lub -11 w teście zmiany kształtu ludzkim i/lub
cynomolgus. Korzystnie, pA2 wynosi około -10 lub -11.
[0019] W teście uwalniania TNFα przez monocyty, elementy wiążące według
wynalazku normalnie mają IC50 mniejsze niż 150 pM, typowo mniejsze niż 110,
np. mniejsze niż 100 pM. IC50 może wynosić co najmniej 30 lub 40 pM. Test
uwalniania TNFα przez monocyty zastosowany niniejszym miał końcowe
stężenie ludzkich GM-CSF wynoszące 1 nM. Zatem, siła zobojętniania IC50 w
teście uwalniania TNFα przez monocyty reprezentuje zdolność elementu
wiążącego do hamowania uwalniania TNFα z ludzkich monocytów stymulowaną
przez 1 nM ludzkich GM-CSF. Po więcej szczegółów patrz rozdział Metody i
Materiały Testu.
[0020] W teście przeżywalności granulocytów, elementy wiążące według
wynalazku normalnie mają IC50 mniejsze niż 1000 pM, typowo mniejsze niż
850 pM. IC50 może wynosić mniej niż 500, 250, 150, 100, 50, 30, 20 lub 10 pM.
IC50 może wynosić co najmniej 5 pM. Znane przeciwciało mysie 2B7 jest
nieaktywne w tym teście aż do stężenia 83 nM. Test przeżywalności
granulocytów zastosowany niniejszym miał końcowe stężenie ludzkich GM-CSF
wynoszące 7pM. Zatem, siła zobojętniania IC50 w teście przeżywalności
granulocytów reprezentuje zdolność elementu wiążącego do hamowania
przeżywalności ludzkich granulocytów indukowaną przez 7 pM ludzkich GMCSF. Po więcej szczegółów patrz rozdział Metody i Materiały Testu.
[0021] W teście tworzenia kolonii, elementy wiążące według wynalazku mogą
mieć IC50 mniejsze niż 5, mniejsze niż 2,5, mniejsze niż 1 lub mniejsze niż 0,3
7
EP 1 999 152B1
µg/ml. Korzystnie I50 wynosi 0,25 µg/ml lub mniej, np mniej niż 0,1 µg/ml. IC50
może wynosić co najmniej 0,05 µg/ml. Znane przeciwciało mysie 2B7 ma małą,
o ile w ogóle, aktywność w tym teście aż do stężenia 10µg/ml (67nM). Test
tworzenia kolonii zastosowany niniejszym miał końcowe stężenie ludzkich GMCSF wynoszące 10 ng/ml. Zatem, siła zobojętniania IC50 w teście tworzenia
kolonii reprezentuje zdolność elementu wiążącego do hamowania tworzenia
kolonii indukowaną przez 10 ng/ml ludzkich GM-CSF. Po więcej szczegółów
patrz rozdział Metody i Materiały Testu.
[0022] Element wiążący według wynalazku może wykazywać zależną od dawki
zdolność do hamowania wzrostu wagi śledziony i/lub do hamowania
indukowanego
GM-CSF
obniżenia
liczby
krążących
monocytów
w
chimerycznych myszach z transgenicznym szpikiem kostnym ekspresjonującym
ludzkie GM-CSF, które potraktowano ludzkimi GM-CSF. Do hamowania wzrostu
wagi śledziony IC50 może być mniejsze niż 5, mniejsze niż 2,5 mniejsze niż 2,
mniejsze niż 1 lub mniejsze niż 0,75 mg/kg. W niektórych przykładach
wykonania IC50 może wynosić co najmniej 0,5 mg/kg.
[0023] Dodatkowo, kinetyka wiązania i powinowactwo elementów wiążących do
ludzkich
GM-CSFRα
może
być
określona,
na
przykład
za
pomocą
powierzchniowego rezonansu plazmonowego, np. stosując BIAcore. Elementy
wiążące według wynalazku normalnie mają KD mniejszą niż 4 nM i korzystniej
mniejszą niż 3, 2 lub 1 nM. Korzystnie, KD jest mniejsza niż 0,9, 0,8, 0,7, 0,6,
0,5, 0,4, 0,3, 0,2 lub 0,15 nM.
[0024] Elementy wiążące według wynalazku normalnie wiążą GM-CSFRα
innego niż ludzie naczelnego, np. GM-CSFRα cynomolgus oprócz ludzkich GMCSFRα. Ponieważ istnieje niska homologia między ludzkim i mysim receptorem
GM-CSF (w przybliżeniu 36 %), elementy wiążące według wynalazku
zazwyczaj nie będą wiązały się lub krzyżowo reagowały z receptorem mysim.
[0025] Element wiążący według wynalazku zawiera cząsteczkę przeciwciała,
np. całe przeciwciało lub fragment przeciwciała, jak omówiono szczegółowo
poniżej. Korzystnie, cząsteczka przeciwciała według wynalazku jest cząsteczką
ludzkiego przeciwciała.
8
EP 1 999 152B1
[0026] Element wiążący według wynalazku normalnie zawiera domenę VH i/lub
VL przeciwciała. W obrębie każdej z domen VH oraz VL są obszary
determinujące komplementarność (CDR, ang. complementarity determining
regions) i regiony zrębu (FR, ang. framework regions). Domena VH zawiera
zestaw HCDR i domena VL zawiera zestaw LCDR. Cząsteczka przeciwciała
typowo zawiera domenę VH przeciwciała zawierającą CDR1, CDR2 oraz CDR3
VH i zrąb. Może ona alternatywnie lub ponadto zawierać domenę VL
przeciwciała zawierającą CDR1, CDR2 oraz CDR3 VL i zrąb. Zrąb domeny VH
lub VL zawiera cztery regiony zrębu FR1, FR2, FR3 oraz FR4, poprzedzielane
CDR w następującym układzie:
[0027] Przykłady domen VH i VL przeciwciała, PR i CDR według niniejszego
wynalazku wymieniono w dołączonym wykazie sekwencji, który stanowi część
niniejszego ujawnienia. Wszystkie sekwencje VH i VL, sekwencje CDR,
zestawy CDR i zestawy HCDR i zestawy LCDR ujawnione niniejszym
reprezentują aspekty i przykłady wykonania wynalazku. Zatem, aspektem
wynalazku jest domena VH elementu wiążącego według wynalazku. "Zestaw
CDR" zawiera CDR1, CDR2 oraz CDR3. Zatem, zestaw HCDR oznacza
HCDR1, HCDR2 oraz HCDR3, a zestaw LCDR oznacza LCDR1, LCDR2 oraz
LCDR3. O ile nie stwierdzono inaczej, "zestaw CDR" zawiera HCDR i LCDR.
Typowo
elementy
wiążące
według
wynalazku
są
przeciwciałami
Części
Doświadczalnej,
monoklonalnymi (mAb).
[0028]
Jak
opisano
bardziej
szczegółowo
w
zidentyfikowaliśmy szereg cząsteczek przeciwciał, które wiążą GM-CSFRα.
Zidentyfikowaliśmy również pewne reszty w obrębie obszarów determinujących
komplementarność (CDR) domen VH oraz VL, które są szczególnie ważne dla
wiązania receptora i siły zobojętniania. Ponieważ CDR są pierwotnie
odpowiedzialne za determinację wiązania i specyficzność elementu wiążącego,
jedną lub większą liczbę CDR, posiadających odpowiednie reszty, jak
zdefiniowano niniejszym, można zastosować i włączyć do odpowiedniego
zrębu, na przykład zrębu domen VH i/lub VL przeciwciała lub szkieletu białka
innego niż przeciwciało, jak niniejszym opisano bardziej szczegółowo w innym
9
EP 1 999 152B1
miejscu. Na przykład, jeden lub większa liczba CDR lub zestaw CDR
przeciwciała można przeszczepić do zrębu (np. ludzkiego zrębu), aby zapewnić
cząsteczkę przeciwciała lub różne cząsteczki przeciwciała. Na przykład,
cząsteczka przeciwciała może obejmować CDRy, jak ujawniono niniejszym i
regiony zrębu sekwencji segmentu genu ludzkiej linii komórek rozrodczych.
Przeciwciało można zapewnić z zestawem CDR w obrębie zrębu, które może
podlegać humanizacji, gdzie jedną lub większą liczbę reszt w obrębie zrębu
zmieniono, aby dopasować do reszt w równoważnej pozycji w najbardziej
podobnym zrębie ludzkiej linii komórek rozrodczych. Zatem, regiony zrębu
przeciwciała są korzystnie z linii komórek rozrodczych i/lub ludzi.
[0029]
Przeprowadziliśmy
dochodzenie,
które
z
reszt
potencjalnego
przeciwciała były ważne dla rozpoznawania antygenu, stosując sposób
określony w rozdziale doświadczalnym i następnie przeprowadziliśmy analizę
sekwencji 160 klonów wykazujących siłę co najmniej 5-razy wyższą niż klon
macierzystego
przeciwciała
w
teście
biologicznym.
Wyniki
wskazały
następujące pozycje mające udział w wiązaniu antygenu: Reszty Kabat'a w
domenie VL 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 i 96 oraz reszty Kabat'a w
domenie VH 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 i 100B.
[0030] W korzystnych przykładach wykonania wynalazku, jedna lub większa
liczba tych reszt Kabat'a jest resztą Kabat'a obecną w pozycji dla jednego lub
większej liczby klonów przeciwciała ponumerowanych 1, 2 i 4-20, których
sekwencje ujawniono w załączonym wykazie sekwencji. W różnych przykładach
wykonania reszta może być taka sama lub może być różna od reszty obecnej w
tej pozycji w przeciwciele 3.
[0031] Nasza analiza wskazała 4 pozycje reszt w CDR, które mają szczególnie
silny wpływ na wiązanie receptora: H97, H100B, L90 oraz L92 (numerowanie
Kabat). Korzystnie, H97 z VH CDR3 oznacza S. Resztę seryny w tej pozycji
obserwowano we wszystkich 160 klonach i zatem reprezentuje ważną resztę w
rozpoznawaniu antygenu.
[0032] Korzystnie, VH CDR3 zawiera jedną lub większą liczbę następujących
reszt:
V, N, A lub L w reszcie Kabat'a H95, najkorzystniej V;
10
EP 1 999 152B1
S, F, H, P, T lub W w reszcie Kabat'a H99, najkorzystniej S;
A, T, P, S, V lub H w reszcie Kabat'a H100B, najkorzystniej A lub T.
[0033] Korzystnie, reszta Kabat'a H34 w VH CDR1 oznacza I. Korzystnie, VH
CDR2 zawiera E w reszcie Kabat'a H54 i/lub I w reszcie Kabat'a H57.
[0034] Gdy element wiążący zawiera domenę VH przeciwciała, resztą Kabat'a
H17 w szkielecie domeny VH korzystnie jest S. Resztą Kabat'a H94 korzystnie
jest I lub jego konserwatywne podstawienie (np. L, V, A lub M). Normalnie H94
oznacza I.
[0035] Korzystnie, VL CDR3 zawiera jedną lub większą liczbę następujących
reszt:
S, T lub M w reszcie Kabat'a L90, najkorzystniej S lub T;
D, E, Q, S, M lub T w reszcie Kabat'a L92, najkorzystniej D lub E;
A, P, S, T, I, L, M lub V w reszcie Kabat'a L96, najkorzystniej S, P, I lub V,
szczególnie S.
[0036] Resztą Kabat'a L95A w VL CDR3 korzystnie jest S.
reszt:
S w reszcie Kabat'a 27A;
N w reszcie Kabat'a 27B;
I w reszcie Kabat'a 27C;
D w reszcie Kabat'a 32;
reszt:
N w reszcie Kabat'a 51;
K w reszcie Kabat'a 53.
[0039] W korzystnym przykładzie wykonania, element wiążący według
wynalazku zawiera jeden lub większą liczbę CDR wybranych z CDR VH i VL, tj.
VH CDR1, 2 i-lub 3 i-lub VL CDR1, 2 i-lub 3 któregokolwiek z przeciwciał 1, 2
lub 4 do 20 jak pokazano w wykazie sekwencji. W korzystnym przykładzie
wykonania element wiążący według wynalazku zawiera VH CDR3 którejkolwiek
z następujących cząsteczek przeciwciał: Przeciwciało 1 (SEQ ID NR 5);
11
EP 1 999 152B1
Przeciwciało 2 (SEQ ID NR 15) ; Przeciwciało 4 (SEQ ID NR 35); Przeciwciało
5 (SEQ ID NR 45); Przeciwciało 6 (SEQ ID NR 55); Przeciwciało 7 (SEQ ID NR
65); Przeciwciało 8 (SEQ ID NR 75); Przeciwciało 9 (SEQ ID NR 85);
Przeciwciało 10 (SEQ ID NR 95) ; Przeciwciało 11 (SEQ ID NR 105);
Przeciwciało 12 (SEQ ID NR 115); Przeciwciało 13 (SEQ ID NR 125);
Przeciwciało16 (SEQ ID NR 155); Przeciwciało 17 (SEQ ID NR 165);
Przeciwciało 20 (SEQ ID NR 195). Korzystnie, element wiążący dodatkowo
zawiera VH CDR1 o SEQ ID NR: 3 lub o SEQ ID NR: 173 i/lub VH CDR2 o
SEQ ID NR: 4. Korzystnie, element wiążący dodatkowo zawiera VH CDR3 o
SEQ ID NR: 175 zawiera VH CDR2 o SEQ ID NR: 173, lecz może alternatywnie
zawierać VH CDR2 o SEQ ID NR: 3.
[0040] Korzystnie element wiążący zawiera zestaw VH CDR jednego z
następujących przeciwciał: Przeciwciało 1 (Seq ID 3-5); Przeciwciało 2 (SEQ ID
13-15); Przeciwciało 4 (SEQ ID 33-35); Przeciwciało 5 (SEQ ID 43-45);
Przeciwciało 6 (SEQ ID 53-55); Przeciwciało 7 (SEQ ID 63-65); Przeciwciało 8
(SEQ ID 73-75); Przeciwciało 9 (SEQ ID 83-85); Przeciwciało 10 (SEQ ID 9395); Przeciwciało 11 (SEQ ID 103-105); Przeciwciało 12 (SEQ ID 113-115);
Przeciwciało 13 (SEQ ID 123-125); Przeciwciało 14 (SEQ ID 133-135);
Przeciwciało 19 (SEQ ID 183-185); Przeciwciało 20 (SEQ ID 193-195).
Opcjonalnie może również obejmować zestaw VL CDR jednego z tych
przeciwciał i VL CDR może być z tego samego lub innego przeciwciała, jako VH
CDR. Zwykle, domena VH jest sparowana z domeną VL, aby zapewnić
przeciwciało z miejscem wiązania antygenu, chociaż w niektórych przykładach
wykonania pojedyncza domena VH lub VL również może wiązać antygen.
Pomieszanie łańcuchów lekkich jest dobrze znane w stanie techniki i zatem
domena VH i VL nie musi być z tego samego klonu, jak ujawniono niniejszym.
[0041] Element wiążący może obejmować zestaw H i/lub L CDR któregokolwiek
z przeciwciał 1 do 20 z jednym lub większą liczbą podstawień, na przykład
12
EP 1 999 152B1
dziesięć lub mniej, np. jeden, dwa, trzy, cztery lub pięć, podstawień w obrębie
ujawnionego zestawu H lub L CDR. Korzystne podstawienia są w resztach
Kabat'a innych niż reszty Kabat'a 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 i 96 w
domenie VL oraz reszty Kabat'a 34, 54, 57, 95, 97, 99 i 100B w domenie VH.
Gdy dokonano podstawień w tych pozycjach, podstawienie jest korzystne w
reszcie wskazanej niniejszym, jako korzystna reszta w tej pozycji.
[0042] W korzystnym przykładzie wykonania, elementem wiążącym według
wynalazku jest izolowana cząsteczka ludzkiego przeciwciała posiadająca
domenę VH zawierającą zestaw HCDR w zrębie ludzkiej linii komórek
rozrodczych, np. zrąb ludzkiej linii komórek rozrodczych z łańcucha ciężkiego
rodziny VH1 lub VH3. W korzystnym przykładzie wykonania, izolowana
cząsteczka ludzkiego przeciwciała posiada domenę VH zawierającą zestaw
HCDR w zrębie ludzkiej linii komórek rozrodczych VH1 DP5 lub VH3 DP47.
Zatem, regiony zrębu domeny VH mogą zawierać regiony zrębu segmentu
genu ludzkiej linii komórek rozrodczych VH1 DP5 lub VH3 DP47. Sekwencją
aminokwasową VH FR1 może być SEQ ID NR: 251. Sekwencją aminokwasową
VH FR2 może być SEQ ID NR: 252. Sekwencją aminokwasową VH FR3 może
być SEQ ID NR: 253. Sekwencją aminokwasową VH FR4 może być SEQ ID
NR: 254.
[0043] Normalnie element wiążący ma również domenę VL zawierającą zestaw
LCDR, korzystnie w zrębie ludzkiej linii komórek rozrodczych, np. zrąb ludzkiej
linii komórek rozrodczych z lekkiego łańcucha rodziny Vlambda 1 lub Vlambda
6. W korzystnym przykładzie wykonania, izolowana cząsteczka ludzkiego
przeciwciała posiada domenę VL zawierającą zestaw LCDR w zrębie ludzkiej
linii komórek rozrodczych VLambda 1 DPL8 lub VLambda 1 DPL3 lub VLambda
6_6a. Zatem, zrąb domeny VL może zawierać regiony zrębu segmentu genu
ludzkiej linii komórek rozrodczych VLambda 1 DPL8, VLambda 1 DPL3 lub
VLambda 6_6a. Domena VL FR4 może zawierać region zrębu segmentu genu
ludzkiej linii komórek rozrodczych JL2. Sekwencją aminokwasową VH FR1
może być SEQ ID NR: 255. Sekwencją aminokwasową VH FR2 może być SEQ
ID NR: 256. Sekwencją aminokwasową VH FR3 może być 257. Sekwencją
aminokwasową VH FR4 może być SEQ ID NR: 258.
13
EP 1 999 152B1
[0044] Przeciwciała inne niż z linii komórek rozrodczych mają takie same CDR,
lecz różne zręby w porównaniu do przeciwciał z linii komórek rozrodczych.
[0045] Element wiążący według wynalazku może konkurować o wiązanie do
GM-CSFRα z jakimkolwiek elementem wiążącym ujawnionym niniejszym, np.
przeciwciało 3 lub którekolwiek z przeciwciał 1, 2 lub 4-20. Zatem element
wiążący może konkurować o wiązanie z GM-CSFRα z cząsteczką przeciwciała
zawierającą domenę VH i domenę VL któregokolwiek z przeciwciał 1, 2 lub 420. Konkurencję między elementami wiążącymi można łatwo przetestować in
vitro na przykład przez dołączenie cząsteczki reporterowej do elementu
wiążącego, który można wykryć w obecności jednego lub większej liczby innych
nieoznakowanych
elementów
wiążących,
aby
umożliwić
identyfikację
elementów wiążących, które wiążą ten sam epitop lub epitop nakładający się.
[0046] Konkurencję można określić na przykład z zastosowaniem ELISA, w
którym np. domena zewnątrzkomórkowa GM-CSFRα lub peptyd domeny
zewnątrzkomórkowej jest unieruchomiony na płytce i do płytki dodaje się
pierwszy oznakowany element wiążący razem z jednym lub większą liczbą
innych nieoznakowanych elementów wiążących. Obecność nieoznakowanego
elementu wiążącego, który konkuruje z oznakowanym elementem wiążącym
obserwuje się poprzez obniżenie sygnału emitowanego przez oznakowany
element wiążący. Podobnie, test powierzchniowego rezonansu plazmonowego
można zastosować do określenia konkurencji między elementami wiążącymi.
[0047] W testowaniu konkurencji można zastosować fragment peptydu
antygenu, szczególnie peptyd zawierający lub składający się zasadniczo z
pożądanego epitopu lub regionu wiążącego. Można zastosować peptyd
posiadający epitop lub sekwencję docelową plus jeden lub większą liczbę
aminokwasów na którymkolwiek końcu. Elementy wiążące według niniejszego
wynalazku mogą być takie, że ich wiązanie antygenu jest hamowane przez
peptyd z lub zawierający daną sekwencję.
[0048] Elementy wiążące, które wiążą peptyd można izolować na przykład z
biblioteki prezentacji fagowej poprzez płukanie z peptydem(peptydami).
[0049] Element wiążący, jak powyżej, można zastosować do mierzenia
poziomów antygenu w teście konkurencji, to znaczy który jest sposobem
14
EP 1 999 152B1
mierzenia poziomu antygenu w próbce przez zastosowanie elementu
wiążącego, jak zapewniono w niniejszym wynalazku, w teście konkurencji.
Może to być tam gdzie fizyczne oddzielenie antygenu związanego od
niezwiązanego nie jest wymagane. Połączenie cząsteczki reporterowej do
elementu wiążącego tak, że w wiązaniu występuje zmiana fizyczna lub
optyczna jest jedną możliwością. Cząsteczka reporterowa może wytwarzać
bezpośrednio lub pośrednio wykrywalne i korzystnie dające się zmierzyć
sygnały. Połączenie cząsteczek reporterowych może być bezpośrednie lub
pośrednie, kowalencyjne, np. przez wiązanie peptydowe lub niekowalencyjne.
Połączenie
przez
wiązanie
peptydowe
może
być
wynikiem
ekspresji
rekombinacyjnej fuzji genowej kodującej przeciwciało i cząsteczkę reporterową.
[0050] Poziomy antygenów można również mierzyć bezpośrednio poprzez
zastosowanie elementu wiążącego według wynalazku na przykład w systemie
czujnika biologicznego.
[0051] Wiązanie elementu wiążącego, jak zapewniono niniejszym, do GMCSFRα może mieć miejsce in vivo, np. po podaniu elementu wiążącego lub
kwasu nukleinowego kodującego element wiążący, lub może mieć miejsce in
vitro, na przykład w ELISA, analizie Western blot, immunocytochemii,
immunoprecypitacji, chromatografii powinowactwa lub testach w oparciu o
komórki takich, jak test TF-1.
[0052] Można określić ilość wiązania elementu wiążącego do GM-CSFRα.
Określenie ilościowe może być związane z ilością antygenu w próbce testowej,
która może być interesująca ze względu diagnostycznego lub prognostycznego.
[0053] Zestaw zawierający element wiążący lub cząsteczkę przeciwciała
według któregokolwiek aspektu lub przykładu wykonania niniejszego wynalazku
również opisano. W zestawie, element wiążący lub cząsteczka przeciwciała
może być znakowana, aby umożliwić określenie jej reaktywności w próbce, np.
jak opisano dalej poniżej. Składniki zestawu są zwykle sterylne i w szczelnie
zamkniętych fiolkach lub innych pojemnikach. Zestawy można stosować w
analizie
diagnostycznej
lub
innych
sposobach,
w
których
cząsteczki
przeciwciała są użyteczne. Zestaw może zawierać instrukcje do zastosowania
składników w sposobie. Materiały pomocnicze do wspierania lub umożliwiania
15
EP 1 999 152B1
przeprowadzenia takiego sposobu mogą być zawarte wewnątrz zestawu
według wynalazku.
[0054] Reaktywności przeciwciał w próbce można określić za pomocą
odpowiednich środków. Jedną możliwością jest Test Radioimmunologiczny
(RIA). Antygen znakowany radioaktywnie miesza się z nieznakowanym
antygenem (próbka testowa) i pozwala na wiązanie do przeciwciała. Związany
antygen fizycznie oddziela się od niezwiązanego antygenu i określa się ilość
radioaktywnego antygenu związanego do przeciwciała. Im więcej jest tam
antygenu tym mniej radioaktywnego antygenu zwiąże się do przeciwciała. Test
konkurencji
wiązania
można
również
zastosować
z
nieradioaktywnym
antygenem, stosując antygen lub analog połączony z cząsteczką reporterową.
Cząsteczka reporterowa może być fluorochromem, fosforem lub laserem
barwnikowym z cechami izolowanych widm absorpcji lub emisji. Odpowiednie
fluorochromy obejmują fluoresceinę, rodaminę, fikoerytrynę i Czerwień Texas.
Odpowiednie barwniki chromogenowe obejmują diaminobenzydynę. Inne
reportery obejmują wielkocząsteczkowe cząstki koloidalne lub materiał
cząstkowy
taki,
jak
barwione
kulki
lateksowe,
magnetyczne
lub
paramagnetyczne oraz czynniki biologicznie lub chemicznie aktywne, które
bezpośrednio lub pośrednio wywołują wykrywalne sygnały do obserwacji
wizualnej, wykrywania elektronicznego lub innego sposobu rejestracji. Tymi
cząsteczkami mogą być enzymy, które katalizują reakcje, które wywołują lub
zmieniają kolory lub powodują zmiany na przykład we właściwościach
elektrycznych. Mogą być one cząsteczkowo pobudliwe tak, że przejścia
elektronowe między stanami energii skutkują charakterystycznymi widmami
absorpcji lub emisji. Mogą one obejmować jednostki chemiczne zastosowane w
połączeniu z czujnikami biologicznymi. Można zastosować systemy wykrywania
biotyna/awidyna lub biotyna/streptawidyna oraz fosfatazę alkaliczną.
[0055] Sygnały wytwarzane przez pojedyncze połączenia przeciwciało-reporter
można zastosować do
wyprowadzenia ilościowych bezwzględnych
lub
względnych danych wiązania stosownego przeciwciała w próbkach (normalna i
testowa).
16
EP 1 999 152B1
[0056]
W
kolejnych
aspektach,
wynalazek
zapewnia
izolowany kwas
nukleinowy, który zawiera sekwencję kodującą element wiążący według
niniejszego wynalazku. Kwas nukleinowy może obejmować DNA i/lub RNA i
może być całkowicie lub częściowo syntetyczny. Odniesienie do sekwencji
nukleotydowej, jak niniejszym określono, obejmuje cząsteczkę DNA o
określonej sekwencji i obejmuje cząsteczkę RNA o określonej sekwencji, w
której U jest podstawione za T, o ile kontekst nie wymaga inaczej. W
korzystnym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia kwas nukleinowy, który
koduje CDR lub zestaw CDR lub domenę VH lub domenę VL lub miejsce
wiązania antygenu przeciwciała lub cząsteczkę przeciwciała, np. scFv lub IgG1
lub IgG4 według wynalazku jak zdefiniowano niniejszym. Niniejszy wynalazek
zapewnia
również
konstrukty
w
postaci
plazmidów,
wektorów,
kaset
transkrypcyjnych lub ekspresyjnych, które zawierają co najmniej jeden
polinukleotyd, jak powyżej.
[0057] Kolejnym aspektem wynalazku jest komórka gospodarza in vitro
zawierająca kwas nukleinowy według wynalazku. Taka komórka gospodarza
może być w hodowli.
[0058] Taki kwas nukleinowy można wprowadzić do komórki gospodarza. Do
wprowadzenia można zastosować jakąkolwiek dostępną technikę. Dla komórek
eukariotycznych,
odpowiednie
techniki
mogą
obejmować
transfekcję
fosforanem wapnia, DEAE-Dekstran, elektroporację, transfekcją liposomową i
transdukcję z zastosowaniem retrowirusa lub innego wirusa, np. krowianki, lub
dla komórek owadzich, bakulowirusa. Do wprowadzania kwasu nukleinowego
do komórki gospodarza, w szczególności komórki eukariotycznej można
zastosować system wirusowy lub oparty na plazmidzie. System plazmidowy
można utrzymać episomalnie lub można wprowadzić do komórki gospodarza
lub do sztucznego chromosomu. Wprowadzenie może być albo poprzez losową
albo ukierunkowaną integrację jednej lub większej liczby kopii do pojedynczego
lub wielu loci. Dla komórek bakteryjnych, odpowiednie techniki obejmują
transformację chlorkiem wapnia, elektroporację i transfekcję z zastosowaniem
bakteriofaga.
17
EP 1 999 152B1
[0059] Po wprowadzeniu może nastąpić wywołanie lub umożliwienie ekspresji
kwasu nukleinowego, np. poprzez hodowanie komórek gospodarza w
warunkach dla ekspresji genu.
[0060] W jednym z przykładów wykonania, kwas nukleinowy według wynalazku
integruje się do genomu (np. chromosomu) komórki gospodarza. Integracja
może być promowana przez włączenie sekwencji, które promują rekombinację
z genomem, zgodnie ze standardowymi technikami.
[0061]
Niniejszy wynalazek
zapewnia
również
sposób,
który zawiera
zastosowanie konstruktu jak określono powyżej w systemie ekspresyjnym, aby
ekspresjonować element wiążący lub polipeptyd jak powyżej. Zatem, sposoby
przygotowania elementu wiążącego według wynalazku są kolejnymi aspektami
wynalazku. Sposób może obejmować ekspresję wspomnianego kwasu
nukleinowego
w
warunkach,
w
celu
doprowadzenia
do
wytwarzania
wspomnianego elementu wiążącego, domeny VH i/lub domeny VL i odzyskania
go. Taki sposób może zawierać hodowanie komórek gospodarza w warunkach,
w celu wytwarzania wspomnianego elementu wiążącego lub domeny
przeciwciała.
[0062] Sposób wytwarzania może obejmować etap izolacji i/lub oczyszczania
produktu. Sposób wytwarzania może obejmować formułowanie produktu do
kompozycji obejmującej co najmniej jeden dodatkowy komponent taki, jak
farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą.
[0063] Systemy do klonowania i ekspresji polipeptydu w wielu różnych
komórkach gospodarza są dobrze znane. Odpowiednie komórki gospodarza
obejmują bakterie, komórki ssacze, komórki roślinne, drożdże oraz systemy
bakulowirusowe i transgeniczne rośliny i zwierzęta. Ekspresja przeciwciał i
fragmentów przeciwciała w komórkach prokariotycznych jest dobrze znana w
stanie techniki [3]. Powszechnym, korzystnym gospodarzem bakteryjnym jest
E. coli.
[0064] Ekspresja w komórkach eukariotycznych w hodowli jest również
dostępna dla znawców z dziedziny jako opcja do wytwarzania elementu
wiążącego [4,5,6]. Linie komórek ssaków dostępne w stanie techniki w celu
ekspresji heterologicznego polipeptydu obejmują komórki jajnika chińskiego
18
EP 1 999 152B1
chomika (CHO, ang. chinese hamster ovary), komórki HeLa, komórki nerki
młodego chomika, NSO komórki mysie szpiczaka, YB2/0 komórki szczurze
szpiczaka, ludzkie zarodkowe komórki nerki, ludzkie zarodkowe komórki
siatkówki i wiele innych.
[0065] Odpowiednie wektory można wybrać lub skonstruować, zawierające
odpowiednie sekwencje regulatorowe, w tym sekwencje promotora, sekwencje
terminatora,
sekwencje
poliadenylacji,
sekwencje
wzmacniające,
geny
markerowe i inne sekwencje, jako właściwe. Wektorami mogą być plazmidy, np.
fagmid lub wirusowy, np. "fag", jako właściwe [7]. Wiele znanych technik i
protokołów
do
przygotowaniu
manipulowania
kwasem
konstruktów
kwasu
nukleinowym,
na
nukleinowego,
przykład
w
mutagenezy,
sekwencjonowania, wprowadzenia DNA do komórek i ekspresji genu oraz
analizy białek, jest opisanych szczegółowo w Ausubel et al. [8].
[0066] Jeden lub większą liczbę elementów wiążących zdolnych do wiązania
antygenu można otrzymać sposobem obejmującym doprowadzenie do kontaktu
biblioteki elementów wiążących według wynalazku i wspomnianego antygenu
oraz wybranie jednego lub większej liczby elementów wiążących z biblioteki
zdolnych do wiązania wspomnianego antygenu.
[0067] Bibliotekę można przedstawiać na cząstkach lub kompleksach
molekularnych, np. replikowalne pakiety genetyczne takie, jak drożdże, cząstki
bakteryjne lub bakteriofagowe (np. T7) lub kowalencyjne, rybosomalne lub inne
systemy prezentacji in vitro, każda cząstka lub kompleks molekularny
zawierający kwas nukleinowy kodujący domenę zmienną VH przeciwciała
prezentowaną na nim i opcjonalnie również prezentowaną domenę VL, jeśli
obecna. Po wybraniu elementów wiążących zdolnych do wiązania antygenu i
prezentowanych na bakteriofagu lub innych cząstkach lub kompleksach
molekularnych biblioteki, kwas nukleinowy może być pobrany z bakteriofaga lub
innej cząstki lub kompleksu molekularnego prezentujacego wspomniany
element wiążący. Taki kwas nukleinowy może być zastosowany w późniejszym
wytwarzaniu elementu wiążącego lub domeny zmiennej przeciwciała VH lub VL
poprzez ekspresję z kwasu nukleinowego z sekwencją kwasu nukleinowego
19
EP 1 999 152B1
pobraną z bakteriofaga lub innej cząstki lub kompleksu molekularnego
prezentującego wspomniany wybrany element wiążący.
[0068] Domenę zmienną VH przeciwciała z sekwencją aminokwasową domeny
zmiennej VH przeciwciała wspomnianego wybranego elementu wiążącego
można zapewnić w postaci wyizolowanej, jak może element wiążący
zawierający taką domenę VH.
[0069] Domenę zmienną VL przeciwciała z sekwencją aminokwasową domeny
zmiennej VL przeciwciała wspomnianego wybranego elementu wiążącego
można zapewnić w postaci wyizolowanej, jak może element wiążący
zawierający taką domenę VL.
[0070] Zdolność do wiązania GM-CSFRα można dalej testować, również
zdolność do konkurowania z jakimkolwiek przeciwciałem 1 do 20 (np. w
formacie scFv i/lub formacie IgG, np. IgG1 lub IgG4) o wiązanie do GM-CSFRα.
Można testować zdolność do zobojętniania GM-CSFRα.
[0071] Warianty domen VH i VL oraz CDR według niniejszego wynalazku,
włączając w to te, dla których sekwencje aminokwasowe określono niniejszym
można otrzymać za pomocą sposobów zmiany sekwencji lub mutacji i
przesiewu i można zastosować w elementach wiążących dla GM-CSFRα.
Podążając za chemią obliczeniową w zastosowaniu technik analizy danych
wielowymiarowych do związków struktury/własności-aktywności [9] ilościowe
związki aktywności-własności przeciwciał można wyprowadzić stosując dobrze
znane techniki matematyczne takie, jak regresja statystyczna, rozpoznawanie
wzorców i klasyfikacja [10,11,12,13,14,15]. Właściwości przeciwciał można
wyprowadzić z modeli empirycznych i teoretycznych (na przykład analiza
prawdopodobnego kontaktu reszt lub obliczona własność fizykochemiczna)
sekwencji przeciwciała, struktur funkcjonalnych i trójwymiarowych i te własności
można rozpatrywać pojedynczo lub w kombinacji.
[0072] Miejsce przeciwciała wiążące antygen złożone z domeny VH i domeny
VL jest utworzone przez sześć pętli polipeptydu: trzy ze zmiennej domeny
łańcucha lekkiego (VL) i trzy ze zmiennej domeny łańcucha ciężkiego (VH).
Analiza przeciwciał o znanej strukturze atomowej wyjaśnia związki między
sekwencją i strukturą trójwymiarową miejsc wiązania przeciwciała [16,17]. Te
20
EP 1 999 152B1
związki sugerują, że oprócz trzeciego regionu (pętli) w domenach VH, pętle z
miejscami wiązania mają jedną z małej liczby konformacji łańcucha głównego:
struktury kanoniczne. Wykazano, że struktura kanoniczna utworzona w
poszczególnej pętli jest określona przez jej rozmiar i obecność pewnych reszt w
kluczowych miejscach w obu pętlach i regionach zrębu [16,17].
[0073] To badanie związku sekwencja-struktura można zastosować do
przewidywania tych reszt w przeciwciele o znanej sekwencji lecz i nieznanej
strukturze
trójwymiarowej,
które
są
ważne
w
utrzymaniu
struktury
trójwymiarowej pętli CDR i stąd utrzymują wiązanie. Te przewidywania mogą
być poparte poprzez porównanie przewidywań do wydajności z prowadzenia
doświadczeń optymalizacyjnych. W podejściu strukturalnym, można utworzyć
model cząsteczki przeciwciała [18] stosując jakikolwiek swobodnie dostępny lub
dostępny w sprzedaży pakiet taki, jak WAM [19]. Wizualizację białka i pakiet
oprogramowania do analizy taki, jak Insight II (Accelerys, Inc.) lub Deep View
[20] można następnie zastosować do oceny możliwych podstawień w każdej
pozycji w CDR. Tę informację można następnie zastosować do tworzenia
podstawień posiadających prawdopodobnie minimalny lub korzystny wpływ na
aktywność.
[0074] Techniki wymagane do dokonania podstawień w obrębie sekwencji
aminokwasowej CDR, domen VH lub VL przeciwciała i elementów wiążących są
powszechnie dostępne w stanie techniki. Warianty sekwencji można utworzyć
poprzez podstawienia, które mogą mieć przewidziane lub nie posiadanie
minimalnego lub korzystnego wpływu na aktywność i przetestowane pod
względem zdolności do wiązania i/lub zobojętniania GM-CSFRα i/lub
jakiejkolwiek innej pożądanej własności.
[0075] Warianty sekwencji aminokwasowej domeny zmiennej którejkolwiek z
domen VH i VL, których sekwencje szczególnie ujawniono niniejszym, można
zastosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jak omówiono. Poszczególne
warianty obejmują jedną lub większą liczbę zmian sekwencji aminokwasowej
(addycja, delecja, substytucja i/lub insercja reszty aminokwasowej), może to
być mniej niż 20 zmian, mniej niż 15 zmian, mniej niż 10 zmian lub mniej niż 5
21
EP 1 999 152B1
zmian, być może 5, 4, 3, 2 lub 1. Zmian można dokonać w jednym lub większej
liczbie regionów zrębu i/lub jednym lub większej liczbie CDR.
[0076] Korzystne zmiany nie skutkują w utracie funkcji, więc element wiążący
zawierający w ten sposób zmienioną sekwencję aminokwasową korzystnie
zachowuje zdolność do wiązania i/lub zobojętniania GM-CSFRα. Korzystniej,
zachowuje on taką samą ilościowo zdolność wiązania i/lub zobojętniania, jako
element wiążący, w którym nie dokonano zmian, np. jak zmierzono w teście
opisanym
niniejszym.
Najkorzystniej, element
wiążący zawierający tak
zmienioną sekwencję aminokwasową posiada poprawioną zdolność do
wiązania lub zobojętniania GM-CSFRα w porównaniu z elementem wiążącym,
w którym nie dokonano zmiany, np. jak zmierzono w teście opisanym
niniejszym.
[0077] Zmiana może obejmować zamianę jednej lub większej liczby reszt
aminokwasowych
aminokwasem,
z
nienaturalnie
modyfikowanie
występującym
jednej
lub
lub
większej
niestandardowym
liczby
reszt
aminokwasowych do nienaturalnie występującej lub niestandardowej formy lub
wprowadzenie jednego lub większej liczby nienaturalnie występujących lub
niestandardowych aminokwasów do sekwencji. Korzystne liczby i lokalizacje
zmian w sekwencjach według wynalazku opisano niniejszym w innym miejscu.
Naturalnie
występujące
aminokwasy
obejmują
20
"standardowych"
L-
aminokwasów zidentyfikowanych jako G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C,
K, R, H, D, E poprzez ich standardowe kody jednoliterowe. Niestandardowe
aminokwasy obejmują jakiekolwiek inne reszty, które można wbudować do
szkieletu polipeptydowego lub są efektem modyfikacji istniejącej reszty
aminokwasowej.
Niestandardowe
aminokwasy
mogą
być
naturalnie
występującymi lub nienaturalnie występującymi. Kilka naturalnie występujących
niestandardowych aminokwasów jest znanych w stanie techniki takich, jak 4hydroksyprolina, 5-hydroksylizyna, 3-metylohistydyna, N-acetyloseryna, itd.
[21]. Te reszty aminokwasowe, które są wyprowadzone w ich pozycji N-alfa
będą zlokalizowane jedynie na N-końcu sekwencji aminokwasowej. Normalnie
w niniejszym wynalazku aminokwas jest L-aminokwasem, lecz w niektórych
przykładach wykonania może być D-aminokwasem. Zmiana może zatem
22
EP 1 999 152B1
zawierać modyfikowanie L-aminokwasu do, lub zamianę na, D-aminokwas.
Metylowane, acetylowane i/lub fosforylowane formy aminokwasów są również
znane i aminokwasy w niniejszym wynalazku mogą być poddane takiej
modyfikacji.
[0078] Sekwencje aminokwasowe w domenach przeciwciała i elementach
wiążących według wynalazku mogą zawierać nienaturalne lub niestandardowe
aminokwasy
opisane
powyżej.
W
niektórych
przykładach
wykonania,
niestandardowe aminokwasy (np. D-aminokwasy) można wbudować do
sekwencji aminokwasowej podczas syntezy, podczas gdy w innych przykładach
wykonania
niestandardowe
aminokwasy
można
wprowadzić
poprzez
modyfikację lub zastąpienie "oryginalnego" standardowego aminokwasu po
syntezie sekwencji aminokwasowej.
[0079] Zastosowania niestandardowych i/lub nienaturalnie występujących
aminokwasów zwiększa różnorodność strukturalną i funkcjonalną i może zatem
zwiększać potencjał osiągania pożądanego wiązania GM-CSFRα i właściwości
zobojętniania elementu wiążącego według wynalazku. Dodatkowo wykazano,
że D-aminokwasy i analogi posiadają lepsze profile farmakokinetyczne w
porównaniu do standardowych L-aminokwasów, z powodu degradacji in vivo
polipeptydów posiadających L-aminokwasy po podaniu zwierzęciu.
[0080] Jak zauważono powyżej, sekwencję aminokwasową CDR istotnie, jak
przedstawiono niniejszym, przenosi się jako CDR w domenie zmiennej
ludzkiego przeciwciała lub w znacznej jej części. Sekwencje HCDR3 istotnie,
jak przedstawiono niniejszym, reprezentują korzystne przykłady wykonania
według niniejszego wynalazku i jest korzystne, że każda z nich jest
przenoszona jako HCDR3 w domenie zmiennej ludzkiego łańcucha ciężkiego
lub w jej znacznej części.
[0081] Domeny zmienne zastosowane w wynalazku można otrzymać lub
wyprowadzić z jakiejkolwiek linii komórek rozrodczych lub zmienionej ludzkiej
domeny zmiennej lub mogą być syntetyczną domeną zmienną opartą na
sekwencjach uwspólnionych lub rzeczywistych znanych ludzkich domen
zmiennych. Sekwencję CDR według wynalazku (np. CDR3) można wprowadzić
23
EP 1 999 152B1
do repertuaru zmiennych domen z brakującym CDR (np. CDR3), stosując
technologię rekombinacji DNA.
[0082] Na przykład, Marks et al. (1992) [22] opisuje sposoby wytwarzania
repertuaru domen zmiennych przeciwciała, w których uwspólnione startery
skierowane na, lub na sąsiadujący do końca 5' domeny zmiennej obszar
zastosowano w połączeniu ze starterami uwspólnionymi do trzeciego regionu
zrębu ludzkich genów VH, aby zapewnić repertuar domen zmiennych VH nie
posiadających CDR3. Marks et al. ponadto opisują jak ten repertuar można
połączyć z CDR3 konkretnego przeciwciała. Stosując analogiczne techniki,
sekwencje wyprowadzone z CDR3 według niniejszego wynalazku można
przetasować z repertuarami domen VH lub VL nie posiadających CDR3 oraz
przetasowane całkowite domeny VH lub VL połączone z pokrewną domeną VL
lub VH, aby zapewnić elementy wiążące według wynalazku. Repertuar może
być następnie prezentowany w odpowiednim systemie gospodarza takim, jak
system prezentacji fagowej według WO92/01047 lub jakiegokolwiek z kolejnej
obszernej literatury, w tym odn. [23], tak że można wybrać odpowiednie
elementy wiążące. Repertuar może składać się z któregokolwiek z ponad 10 4
poszczególnych elementów, na przykład z 10 6 do 108 lub 1010 elementów. Inne
odpowiednie
systemy
gospodarza
obejmują
prezentację
drożdżową,
prezentację bakteryjną, prezentację T7, prezentację wirusową, prezentację
komórkową, prezentację rybosomową i prezentację kowalencyjną. Analogiczne
techniki przetasowania lub kombinatoryczne również są ujawnione przez
Stemmer (1994) [24], który opisuje technikę w odniesieniu do genu βlaktamazy, lecz obserwuje, że podejście można zastosować do wytwarzania
przeciwciał.
[0083] Kolejną alternatywą jest wytwarzanie nowych regionów VH lub VL
niosących
sekwencje
pochodne
od
CDR
według
wynalazku
stosując
mutagenezę losową jednego lub większej liczby wybranych genów VH i/lub VL,
aby utworzyć mutacje w obrębie całej domeny zmiennej. Taka technika jest
opisana przez Gram et al. (1992) [25], który zastosował podatny na błędy PCR.
W
korzystnych
przykładach
wykonania,
jedno
lub
dwa
podstawienia
aminokwasowe są utworzone w obrębie zestawu HCDR i/lub LCDR. Innym
24
EP 1 999 152B1
sposobem, który można zastosować jest ukierunkowanie mutagenezy na
regiony CDR genów VH lub VL [26, 27].
[0084] Miejsce wiązania antygenu przeciwciała dla antygenu GM-CSFRα
można otrzymać sposobem zawierającym dostarczenie, na drodze addycji,
delecji, substytucji lub insercji jednego lub większej liczby aminokwasów do
sekwencji aminokwasowej domeny VH przedstawionej niniejszym domeny VH,
która jest wariantem sekwencji aminokwasowej domeny VH, opcjonalnie
połączeniem domeny VH tak zapewnionej z jedną lub większą liczbą domen VL
oraz testowanie domeny VH lub kombinacji VH/VL lub kombinacji, aby
zidentyfikować element wiążący lub miejsce wiązania antygenu przeciwciała dla
antygenu GM-CSFRα i opcjonalnie z jedną lub większą liczbą korzystnych
własności, korzystnie zdolnością do zobojętniania aktywności GM-CSFRα.
Wspomniana domena VL może posiadać sekwencję aminokwasową, którą
zasadniczo przedstawiono niniejszym.
[0085] Można zastosować analogiczny sposób, w którym jeden lub większa
liczba wariantów sekwencji domeny VL ujawnionej niniejszym jest połączona z
jedną lub większa liczbą domen VH.
[0086] Element wiążący dla antygenu GM-CSFRα, który można otrzymać
sposobem zawiera:
(a) zapewnienie początkowego repertuaru kwasów nukleinowych
kodujących domenę VH, która albo obejmuje CDR3 do zastąpienia lub
nie posiada regionu kodującego CDR3;
(b) połączenie wspomnianego repertuaru z donorowym kwasem
nukleinowym kodującym sekwencję aminokwasową, istotnie jak
przedstawiono niniejszym, dla VH CDR3 tak że wspomniany donorowy
kwas nukleinowy jest wprowadzany do regionu CDR3 w repertuarze, po
to, aby zapewnić produkt-repertuar kwasów nukleinowych kodujących
domenę VH;
(c) ekspresję kwasów nukleinowych wspomnianego produktu-repertuaru;
(d) wybranie elementu wiążącego dla GM-CSFRα; oraz
(e) odzyskanie wspomnianego elementu wiążącego lub kodującego go
kwasu nukleinowego.
25
EP 1 999 152B1
[0087] Ponownie, można zastosować analogiczny sposób, w którym VL CDR3
według wynalazku połączono z repertuarem kwasów nukleinowych kodujących
domenę VL, która albo obejmuje CDR3 do zastąpienia albo nie posiada regionu
kodującego CDR3.
[0088] Podobnie, jeden lub większa liczba lub wszystkie trzy CDR można
przeszczepić do repertuaru domen VH lub VL, które przesiewa się pod kątem
elementu wiążącego lub elementów wiążących dla GM-CSFRα.
[0089] W korzystnym przykładzie wykonania, można zastosować jeden lub
większą liczbę HCDR1, HCDR2 oraz HCDR3, np. zestaw HCDR Przeciwciała 1
(SEQ ID NR: 3-5); Przeciwciała 2 (SEQ ID NR: 13-15); Przeciwciała 4 (SEQ ID
NR: 33-35); Przeciwciała 5 (SEQ ID NR: 43-45); Przeciwciała 6 (SEQ ID NR:
53-55); Przeciwciała 7 (SEQ ID NR: 63-65); Przeciwciała 8 (SEQ ID NR: 73-75);
Przeciwciała 9 (SEQ ID NR: 83-85); Przeciwciała 10 (SEQ ID NR: 93-95);
Przeciwciała 19 (SEQ ID NR: 183-185) lub Przeciwciała 20 (SEQ ID NR: 193195) lub opcjonalnie Przeciwciała 3 (SEQ ID NR: 23-25) i/lub można
zastosować jeden lub większą liczbę LCDR1, LCDR2 oraz LCDR3, np. zestaw
LCDR Przeciwciała 1 (SEQ ID NR: 8-10); Przeciwciała 2 (SEQ ID NR: 18-20);
Przeciwciała 18 (SEQ ID NR: 178-180); Przeciwciała 19 (SEQ ID NR: 188-190)
lub Przeciwciała 20 (SEQ ID NR: 198-200) lub opcjonalnie Przeciwciała 3 (SEQ
ID NR: 28-30).
26
EP 1 999 152B1
[0090] Istotna część domeny zmiennej immunoglobuliny będzie zawierać co
najmniej trzy regiony CDR, razem z regionami zrębu pomiędzy nimi. Korzystnie,
ta część również będzie obejmowała co najmniej 50% jednego lub obu z
pierwszego i czwartego regionu zrębu, które to 50% jest C-końcowymi 50%
pierwszego regionu zrębu i N-końcowymi 50% czwartego regionu zrębu.
Dodatkowymi resztami na N-końcu lub C-końcu znacznej części domeny
zmiennej mogą być te normalnie niezwiązane z naturalnie występującymi
regionami domeny zmiennej. Na przykład, konstrukcja elementów wiążących
według niniejszego wynalazku dokonana za pomocą technik rekombinacji DNA
może skutkować wprowadzeniem N- lub C-końcowych reszt kodowanych przez
łączniki wprowadzone do ułatwienia klonowania lub innych etapów manipulacji.
Inne etapy manipulacji obejmują wprowadzenie łączników, aby połączyć
domeny zmienne według wynalazku do kolejnych sekwencji białka, w tym
regionów stałych przeciwciała, innych domen zmiennych (na przykład przy
wytwarzaniu
diaciał)
lub
wykrywalnych/funkcjonalnych
znaczników,
jak
niniejszym omówiono bardziej szczegółowo w innym miejscu.
[0091] Chociaż w korzystnym aspekcie według wynalazku korzystne są
elementy wiążące zawierające parę domen VH lub VL, pojedyncze domeny
wiążące na bazie sekwencji albo domeny VH lub VL formują kolejne aspekty
według wynalazku. Wiadomo, że pojedyncze domeny immunoglobuliny,
szczególnie domeny VH, są zdolne do wiązania docelowych antygenów. Na
przykład, patrz omówienie dAb niniejszym w innym miejscu.
[0092] W przypadku każdej z pojedynczych domen wiążących, domeny te
można zastosować do przesiewu domen komplementarnych zdolnych do
tworzenia dwu-domenowego elementu wiążącego zdolnego do wiązania GMCSFRα. Można to osiągnąć sposobami przesiewu prezentacji fagowej stosując
tak zwane podejście hierarchiczne podwójnie kombinatoryczne, jak ujawniono
w WO92/01047, w którym pojedynczą kolonię zawierającą albo klon łańcucha H
albo L zastosowano do zakażenia całkowitej biblioteki klonów kodujących inny
łańcuch (L lub H) i otrzymany dwułańcuchowy element wiążący wybrano według
technik prezentacji fagowej takich, jak te opisane w tym odnośniku oraz [22].
27
EP 1 999 152B1
[0093] Kolejne aspekty według niniejszego wynalazku zapewniają kompozycje
zawierające elementy wiążące według wynalazku i co najmniej jeden
dodatkowy
składnik,
np.
kompozycja
zawierajaca
element
wiążący
i
farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą. Takie kompozycje
można zastosować w sposobach hamowania lub zobojętniania GM-CSFRα, w
tym sposobach leczenia ludzkiego lub zwierzęcego ciała poprzez terapię.
[0094] Wynalazek zapewnia heterogenne preparaty zawierające cząsteczki
przeciwciała anty-GM-CSFRα. Na przykład, takie preparaty mogą być
mieszaninami przeciwciał o pełnej długości łańcuchach ciężkich i łańcuchach
ciężkich pozbawionych C-końcowej lizyny, o różnych stopniach glikozylacji i/lub
z pochodnymi aminokwasami takimi, jak cyklizacja N-końcowego kwasu
glutaminowego w celu utworzenia reszty kwasu piroglutaminowego.
[0095] Niniejszym opisano sposoby leczenia obejmujące podawanie elementu
wiążącego jak zapewniono, kompozycji farmaceutycznych zawierających taki
element wiążący i zastosowanie takiego elementu wiążącego w wytwarzaniu
leku, na przykład w sposobie wytwarzania leku lub kompozycji farmaceutycznej
zawierającego
formułowanie
elementu
wiążącego
z
farmaceutycznie
dopuszczalną substancją pomocniczą.
[0096] Leczenie anty-GM-CSFRα można podawać doustnie (na przykład
nanociała),
poprzez
wstrzyknięcie
(na
przykład
podskórnie,
dożylnie,
dotętniczo, dostawowo, dootrzewnowo lub domięśniowo), wziewnie, drogą
dopęcherzykową (wkraplanie do pęcherza moczowego) lub miejscowo (na
przykład wewnątrzgałkowo, donosowo, doodbytniczo, do ran, na skórę).
Leczenie można podawać poprzez infuzję pulsacyjną, szczególnie z malejącymi
dawkami elementu wiążącego. Drogę podawania można określić poprzez
fizykochemiczną charakterystykę leczenia, poprzez szczególne rozważania
dotyczące choroby lub poprzez wymóg optymalizacji wydajności lub w celu
zminimalizowania skutków ubocznych. Przewiduje się, że leczenie anty-GMCSFRα nie będzie ograniczone do zastosowania jedynie w klinice. Zatem
korzystne jest również wstrzyknięcie podskórne z zastosowaniem urządzenia
bez igły.
28
EP 1 999 152B1
[0097] Kompozycję można podawać pojedynczo lub w kombinacji z innym
leczeniem, albo równocześnie albo po kolei w zależności od stanu, który ma
być leczony. Leczenia kombinacyjne można zastosować, aby zapewnić
znaczące skutki synergistyczne, szczególnie w kombinacji elementu wiążącego
anty-GM-CSFRα z jednym lub większą liczbą innych leków. Element wiążący
według niniejszego wynalazku można zapewnić w kombinacji lub dodatkowo do
jednego lub większej liczby z następujących: NSAID (np. inhibitory cox takie, jak
Celekoksyb i inne podobne inhibitory cox2), kortykosteroidy (np. prednizon)
oraz leki przeciwreumatyczne modyfikujące przebieg choroby (DMARD), np.
Humira (adalimumab), metotreksat, Arava, Enbrel (Etanercept), Remicade
(Infliksymab), Kineret (Anakinra), Rituxan (Rituksymab), Orencia (abatacept),
sole złota, leki przeciwmalaryczne, sulfasalazyna, d-penicylamina, cyklosporyna
A, diklofenak, cyklofosfamid oraz azatiopryna.
[0098] Według niniejszego wynalazku, zapewnioną kompozycję można
podawać osobnikom. Podawanie jest korzystnie w "terapeutycznie skutecznej
ilości", która jest wystarczająca, aby wykazywać korzyści dla pacjenta. Taką
korzyścią może być co najmniej złagodzenie co najmniej jednego objawu.
Faktyczna podawana ilość oraz tempo i przebieg w czasie podawania będą
zależały od natury i ostrości tego, co jest leczone. Zarządzenie leczenia, np.
decyzje dotyczące dawkowania itd, jest w zakresie kompetencji lekarzy
ogólnych i innych lekarzy medycyny, i może zależeć od ostrości objawów i/lub
postępu leczonej choroby. Odpowiednie dawki przeciwciała są dobrze znane w
stanie techniki [28, 29]. Można zastosować specyficzne dawkowanie wskazane
niniejszym lub w Physician's Desk Reference (2003) jako odpowiednie do typu
podawanego leku. Terapeutycznie skuteczną ilość lub odpowiednią dawkę
elementu wiążącego według wynalazku można określić poprzez porównanie
jego aktywności in vitro i aktywności in vivo w modelu zwierzęcym. Znane są
sposoby ekstrapolacji skutecznego dawkowania u myszy i innych testowych
zwierząt do ludzi. Dokładna dawka zależy od licznych czynników, w tym czy
przeciwciało służy do diagnozy czy do leczenia, rozmiaru i położenia leczonego
obszaru, dokładnej natury przeciwciała (np. całe przeciwciało, fragment lub
diaciało) oraz natury jakiegokolwiek wykrywalnego znacznika lub innej
29
EP 1 999 152B1
cząsteczki przyłączonej do przeciwciała. Typowa dawka przeciwciała jest w
zakresie 100µg do 1g do systemicznego podawania oraz 1µg do 1mg do
podawania miejscowego. Typowo, przeciwciało będzie całym przeciwciałem,
korzystnie IgG1, IgG2 lub korzystniej IgG4. Jest to dawka do pojedynczego
leczenia dorosłego pacjenta, która może być proporcjonalnie dopasowana do
dzieci i niemowląt i również dopasowana do innych formatów przeciwciała
proporcjonalnie do masy cząsteczkowej. Leczenie może być powtarzane w
odstępach dziennych, dwa razy w tygodniu, tygodniowych lub miesięcznych
według zaleceń lekarza. W korzystnych przykładach wykonania według
niniejszego wynalazku, leczenie jest okresowe i okres między podawaniem
wynosi około dwa tygodnie lub więcej, korzystnie około trzy tygodnie lub więcej,
korzystniej około cztery tygodnie lub więcej lub około jeden raz na miesiąc. W
innych korzystnych przykładach wykonania według wynalazku, leczenie można
podać przez i/lub po operacji i korzystniej, można podać lub zastosować
bezpośrednio na anatomiczne miejsce leczone chirurgicznie.
[0099] Elementy wiążące według niniejszego wynalazku będą zazwyczaj
podawane w formie kompozycji farmaceutycznej, która może obejmować co
najmniej jeden składnik dodatkowy do elementu wiążącego. Zatem kompozycje
farmaceutyczne według niniejszego wynalazku i do zastosowania zgodnie z
niniejszym wynalazkiem mogą zawierać, jako dodatek do składnika aktywnego,
farmaceutycznie
dopuszczalną
substancję
pomocniczą,
nośnik,
bufor,
stabilizator lub inne materiały dobrze znane znawcom z dziedziny. Takie
materiały powinny być nietoksyczne i nie powinny zakłócać skuteczności
składnika aktywnego. Dokładna natura nośnika lub innego materiału będzie
zależała od drogi podawania, która może być doustna lub poprzez
wstrzyknięcie, np. dożylne. Kompozycje farmaceutyczne do podawania
doustnego mogą być w tabletkach, kapsułkach, proszku, płynie lub formie półstałej. Tabletka może zawierać stały nośnik taki, jak żelatyna lub adiuwant.
Ciekłe kompozycje farmaceutyczne zazwyczaj obejmują ciekły nośnik taki, jak
woda, ropa naftowa, oleje zwierzęce lub roślinne, olej mineralny lub olej
syntetyczny. Można włączyć roztwór soli fizjologicznej, dekstrozy lub inny
roztwór sacharydu lub glikoli takich, jak glikol etylenu, glikol propylenu lub glikol
30
EP 1 999 152B1
polietylenu. W celu wstrzyknięcia dożylnego lub wstrzyknięcia w miejscu
dolegliwości, składnik aktywny będzie w formie pozajelitowo dopuszczalnego
roztworu wodnego, który jest wolny od pirogenu i ma odpowiednie pH,
izotoniczność i trwałość. Znawcy z dziedziny są zdolni do przygotowania
odpowiednich roztworów stosując, na przykład, nośniki izotoniczne takie, jak
Chlorek Sodu do Iniekcji, Roztwór Ringera do Iniekcji, Roztwór Ringera z
Mleczanem do Iniekcji. Konserwanty, stabilizatory, bufory, przeciwutleniacze
i/lub inne substancje dodatkowe można dodać, jeśli potrzeba. Elementy
wiążące według niniejszego wynalazku można formułować w formach ciekłych,
pół-stałych lub stałych w zależności od własności fizykochemicznych cząsteczki
i drogi dostarczania. Formulacje mogą obejmować substancje pomocnicze lub
kombinacje substancji pomocniczych, na przykład cukry, aminokwasy i środki
powierzchniowo czynne. Formulacje ciekłe mogą obejmować szeroki zakres
stężeń przeciwciała i pH. Formulacje stałe można tworzyć poprzez liofilizację,
suszenie rozpryskowe lub suszenie poprzez technologię płynu nadkrytycznego.
Formulacje anty-GM-CSFRα będą zależeć od zamierzonej drogi dostarczania:
na przykład formulacje do dostarczania płucnego mogą składać się z cząstek o
własnościach fizycznych, które zapewniają penetrację głęboko do płuca za
pomocą inhalacji; miejscowe formulacje mogą obejmować środki modyfikujące
lepkość, które przedłużają czas, w którym lek przebywa w miejscu działania. W
szczególnych przykładach wykonania element wiążący można przygotowywać
z nośnikami, które będą chroniły element wiążący przed szybkim uwalnianiem,
takimi jak formulacje do kontrolowanego uwalniania, włącznie z implantami,
plastrami przezskórnymi i mikrokapsułkowanymi systemami dostarczania.
Można stosować biodegradowalne, biokompatybilne polimery, takie jak
etylenowy octan, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i
kwas polimlekowy. Wiele sposobów otrzymywania takich formulacji jest ogólnie
znanych znawcom z dziedziny. Patrz np. Robinson, 1978 [30].
[0100] Elementy wiążące według wynalazku można zastosować w sposobie
leczenia lub diagnozy ciała ludzkiego lub zwierzęcego takie, jak sposób
leczenia (który może obejmować leczenie zapobiegawcze) choroby lub
zaburzenia u ludzkiego pacjenta, który zawiera podawanie wspomnianemu
31
EP 1 999 152B1
pacjentowi skutecznej ilości elementu wiążącego według wynalazku. Stany
leczone według niniejszego wynalazku obejmują jakiekolwiek, w których rolę
odgrywa GM-CSFRα. Opublikowana literatura techniczna wskazuje rolę GMCSF w kilku chorobach i stanach, jak podsumowano poniżej. Ponieważ GMCSF wiąże się specyficznie do GM-CSFRα, skutkom patologicznym i/lub
objawowym GM-CSF można przeciwdziałać poprzez hamowanie wiązania GMCSF do GM-CSFRα. Zatem, opublikowany dowód, w dodatku do danych
farmakologicznych in vivo oraz in vitro prezentowanych dla cząsteczek
przeciwciała opisanych niniejszym w Części Doświadczalnej, wskazuje, że
elementy wiążące według wynalazku można zastosować do leczenia stanów
autoimmunologicznych i/lub zapalnych, chorób i zaburzeń, na przykład
reumatoidalnego zapalenia stawów, astmy, reakcji alergicznej, stwardnienia
rozsianego, białaczki szpikowej i miażdżycy. Opublikowany dowód na te stany
podsumowano poniżej:
Astma i Reakcje Alergiczne
[0101] Astma oskrzelowa jest powszechnym uporczywym zaburzeniem
zapalnym płuc charakteryzującym się hiperreaktywnością dróg oddechowych,
nadprodukcją
śluzu,
Hiperreaktywność
zwłóknieniem
dróg
i
oddechowych
podwyższonym
(AHR,
ang.
poziomem
airways
IgE.
hyper-
responsiveness) jest przesadnie dużym zwężaniem dróg oddechowych w
odpowiedzi na niespecyficzne bodźce. Zarówno AHR i nadprodukcję śluzu
uważa się za odpowiedzialne za zmienną niedrożność dróg oddechowych,
która prowadzi do skrócenia oddechu charakterystycznego dla ataków astmy
(nasilenia choroby), i która jest odpowiedzialna za śmiertelność związaną z tą
chorobą (około 2000 zgonów/rok w Zjednoczonym Królestwie).
[0102] Ostatnie badania wykazały, że GM-CSF i jego receptor są stymulowane
zarówno przez poziom białka i mRNA w astmie. Ponadto, poziomy ekspresji
korelują z ciężkością choroby. Wzmożoną produkcję GM-CSF zmierzono w
popłuczynach
pęcherzykowo-oskrzelikowych
(BAL,
ang.
bronchioalveolar
lavage fluid), komórkach BAL, ślinie, komórkach nabłonka oskrzelików i
stymulowanych antygenem komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej od
pacjentów z astmą w porównaniu do osobników nie-astmatycznych [31, 32].
32
EP 1 999 152B1
Ponadto wykazano, że poziom ekspresji GM-CSF w drogach oddechowych w
następstwie ekspozycji na alergen koreluje ze stopniem eozynofilii tkankowej i
ciężkości późnej fazy odpowiedzi astmatycznej [33]. Późniejsze badania
powiązały stymulowaną ekspresję GM-CSFR z astmą wrodzoną lub nieatopową, korelujące poziomy ekspresji z danymi czynności płuc [34]. W modelu
mysim uczulenia i ekspozycja na owalbuminę, zobojętnienie aktywności GMCSF kozim przeciwciałem poliklonalnym, poprzez podawanie donosowe przed
ekspozycją na owalbuminę, zapobiegło hiperreaktywności dróg oddechowych i
zmniejszyło zarówno naciekanie eozynofili i wydzielanie śluzu do dróg
oddechowych [35]. Podobnie w modelu mysim choroby alergicznej dróg
oddechowych inicjowanej przez donosowe podawanie wysokoprężnych cząstek
wydechowych, zobojętnienie GM-CSF znowu poprzez donosowe podawania
koziego
przeciwciała
poliklonalnego
zapobiegło
hiperreaktywności
dróg
oddechowych na metacholinę, obniżonej liczbie eozynofili BAL i również
zmniejszyło ekspresję produkujących śluz komórek kubkowych na nabłonku
dróg oddechowych [36].
[0103] Dalej badano rolę GM-CSF w odpowiedziach alergicznych w modelach
mysich o zaindukowanej tolerancji. Myszy wystawione na powtarzające się
codzienne dawki nebulizowanej owalbuminy bez wcześniejszego uczulenia
rozwijały tolerancję na owalbuminę i nie wywoływały eozynofilowego zapalenia
dróg
oddechowych.
Płucna
ekspresja
GM-CSF
poprzez
konstrukt
adenowirusowy zmienia odpowiedzi tych zwierząt i faworyzuje dopływ eozynofili
do BAL, wytwarzanie fenotypowo alergicznej histologii i związanej hiperplazji
komórek kubkowych. To wytwarzanie typowej odpowiedzi Th2 jest dalej
udowodnione przez zwiększone stężenia surowicze i BAL IL-5 i surowicze IL-4.
Dalsza praca na tym modelu wykorzystująca mysz MHC II KO wskazuje, że
GM-CSF moduluje oddziaływania między komórkami prezentującymi antygen i
komórkami T w drogach oddechowych, tym samym ułatwiając odpowiedzi za
pośrednictwem komórek T na owalbuminę [37]. Istotnie, aktywność GM-CSF,
jako silny aktywator odpowiedzi Th2 może również być przedstawiona w
myszach pozbawionych IL-13 i/lub IL-4, wskazując, że zobojętnianie aktywności
33
EP 1 999 152B1
GM-CSF prezentuje alternatywną ścieżkę terapeutyczną różną od aktywności
tych cytokin.
[0104] Podobnych obserwacji dokonano w innym modelu mysim, w którym
powtarzana ekspozycja donosowa na ambrozję skutkuje uczuleniem typu Th2 i
łagodnym zapaleniem dróg oddechowych na ponowną ekspozycję na antygen
[38].
Podawanie
przeciwciał
anty-GM-CSF
w
połączeniu
z
ambrozją
zmniejszyło związaną z Th2 produkcję cytokin, przypuszczalnie przez
hamowanie endogennego GM-CSF. W przeciwieństwie, dostarczenie ambrozji
do mikrośrodowiska dróg oddechowych wzbogaconego GM-CSF, albo poprzez
wielokrotne łączne podawanie rekombinowanego GM-CSF lub pojedyncze
dostarczenie wektora adenowirusowego niosącego transgen GM-CSF, skutkuje
znacznie wzmocnionym eozynofilowym zapaleniem dróg oddechowych i
odpowiedziami Th2 pamięci specyficznymi względem ambrozji.
Reumatoidalne Zapalenie Stawów (RA, ang. Rheumatoid Arthritis)
[0105] RA jest przewlekłą zapalną i niszczącą stawy chorobą, która atakuje w
przybliżeniu 1 % populacji krajów uprzemysłowionych. RA charakteryzuje się
hiperplazją i zapaleniem błony maziowej, zapaleniem wewnątrz płynu
maziowego oraz postępującym niszczeniem otaczającej kości i chrząstki, które
powszechnie prowadzą do znacznej niepełnosprawności.
[0106] Podczas gdy przyczyna RA pozostaje nieznana, gromadzą się dowody
na rolę GM-CSF w postępie RA. Uważa się, że RA zapoczątkowuje i napędza
specyficzny względem antygenu proces za pośrednictwem komórek T. W
skrócie uważa się, że obecność niezidentyfikowanego antygenu w podatnym
gospodarzu inicjuje odpowiedź komórek T, która prowadzi do produkcji cytokin
komórek T z następującą rekrutacją komórek zapalnych, włączając neutrofilie,
makrofagi i komórki B.
[0107] Wiele pro- i przeciw-zapalnych cytokin wytwarza się w reumatoidalnym
zapaleniu stawów. Ponadto, postęp choroby, reaktywacja i wyciszanie
zachodzą za pośrednictwem dynamicznych zmian w produkcji cytokin w
obrębie stawu. W szczególności, rozważa się, że TNF-α oraz IL-1 odgrywają
zasadniczą rolę w patogenezie RA i wielu nowszych rozwiniętych terapiach lub
34
EP 1 999 152B1
w rozwoju, dla wyglądu choroby w celu hamowania aktywności tych dwóch
prozapalnych cytokin.
[0108] Ostatnie badania w modelach gryzoni sugerują centralną i niezbędną
rolę
GM-CSF
w
rozwoju
i
postępie
RA.
Podawanie
egzogennego
rekombinowanego GM-CSF wzmacnia patologię w dwóch różnych modelach
mysich RA, zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA, ang. collageninduced arthritis) [39] i modelu zapalenia jednostawowego [40]. Dodatkowo
wykazano, że GM-CSF (GM-CSF-/-) myszy knockout są odporne na rozwój CIA
oraz poziomy IL-1 i czynnika martwicy nowotworu (TNFα) znalezione w mazi
stawowej były obniżone w porównaniu do myszy typu dzikiego [41, 42].
Podobnie, indukowanie zapalenia jednostawowego stosując wstrzyknięcie
dostawowe metylowanej albuminy surowicy bydlęcej oraz IL-1 w myszach GMCSF-/-, skutkuje obniżeniem ciężkości choroby w porównaniu do myszy typu
dzikiego [43].
[0109] Ponadto, podawanie mysiego mAb anty-GM-CSF znacząco łagodzi
ciężkość choroby w CIA i modelach zapalenia jednostawowego. W modelu CIA,
leczenie mAb było skuteczne w leczeniu postępu powstałej choroby,
histopatologii i znaczącego obniżenia stawowych poziomów IL-1 oraz TNF-α.
Dodatkowo, leczenie mAb przed początkiem zapalenia stawów osłabia ciężkość
choroby CIA [44, 43].
[0110] Wiele badań przedstawia poziomy cytokin i receptorów obecnych w
próbkach stawowego płynu maziowego i biopsji błony z tkanki ludzkiej. Krążące
komórki jednojądrzaste u 27 pacjentów RA, 13 zdrowych ochotnikach i 14
pacjentach z osteoporozą oceniono pod względem poziomów GM-CSFR
stosując GM-CSF znakowane PE [45]. W tym badaniu wykazano, że dwa razy
więcej komórek pozytywnych pod względem obecności receptora wykryto u
pacjentów RA (53%) w porównaniu do zdrowych kontroli (20%) i pacjentów
przechodzących badania pod kątem osteoporozy (25%), sugerując zatem, że
monocyty mogą być pierwszymi, aby odpowiedzieć na lokalnie produkowane
GM-CSF. Ekspresja genów cytokin u pacjentów RA [46] z zastosowaniem
hybrydyzacji in situ komórek SF wykazała podwyższone poziomy GM-CSF, IL1, TNF-α oraz IL-6. Ponadto, wyizolowane i hodowane wyprowadzone z
35
EP 1 999 152B1
fibroblastów synowiocyty od normalnych ochotników wykazały podwyższone
poziomy białka GM-CSF w odpowiedzi na IL-1α, IL-1β, TNF-α oraz TNF-β [47].
Ilościowe oznaczenie GM-CSF w surowicy u pacjentów RA [48] wykazało, że
poziomy białka wzrosły u pacjentów z ciężkim (366 pg/ml, n=26) i
umiarkowanym (376 pg/ml, n=58) RA w porównaniu do grupy kontrolnej (174
pg/ml, n=43), ponadto wykazało ono również, że GM-CSF było znacznie
podwyższone w SF pacjentów z RA (1300 pg/ml).
[0111] Poprzednio obserwowano, że podawanie rekombinowanego GM-CS
pacjentom leczonym na neutropenię może powodować zaostrzenie RA [49].
Podobnych obserwacji dokonano u pacjentów z zespołem Felty-ego po leczeniu
rekombinowanym GM-CSF [50].
Przewlekła Obturacyjna Choroba Płuc (POChP)
[0112] Przewlekłą Obturacyjną Chorobę Płuc (POChP) zdefiniowano jako stan
chorobowy charakteryzujący się ograniczonym przepływem powietrza, który nie
jest całkowicie odwracalny. Przewlekłe ograniczenie przepływu powietrza
zazwyczaj jest zarówno postępujące i związane z nieprawidłową odpowiedzią
zapalną płuc na szkodliwe cząstki lub gazy. To ograniczenie przepływu
powietrza
jest
powodowane
mieszaniną
nieznacznej
choroby
dróg
oddechowych (obturacyjne zapalenie oskrzeli) i destrukcji miąższu (rozedma),
których odpowiedni udział różni się w zależności od osoby. Wynikającymi
charakterystycznymi objawami POChP są kaszel, produkcja plwocin i duszność
po wysiłku. POChP jest głównym problemem zdrowia publicznego i czwartą
główną przyczyną przewlekłej zachorowalności i śmiertelności w USA. Chorobę
obecnie leczy się lekami oryginalnie opracowanymi dla astmy takimi, jak
kortykosteroidy doustne lub wziewne z lub bez leków rozszerzających oskrzela
w tym agonistów β. Jednakże, żaden z tych leków nie wykazał spowolnienia
postępu POChP [51]. Na przykład kortykosteroidy, które znacznie tłumią
zapalenie eozynofilowe w astmie nie wydają się mieć żadnego wpływu na
zapalenie obserwowane w POChP, które jest głównie zależne od neutrofili [52].
Zatem, istnieje potrzeba opracowania nowego leczenia POChP, które jest
szczególnie
ukierunkowane
na
procesy zapalne
stanowiące
podstawę
36
EP 1 999 152B1
patofizjologii tej choroby. GM-CSF, poprzez jego rolę w funkcjonowaniu
neutrofili i makrofagów może odgrywać istotną rolę w patogenezie POChP.
[0113] W badaniu stosującym ilościową PCR wykazano, że liczba kopii GMCSF
dopasowanych wiekowo POChP plwocin w porównaniu do niezahamowanych
plwocin palacza była znacznie podwyższona [53]. Ponadto w modelu gryzoni
zapalenia płuc indukowanego dymem papierosowym, zwierzęta traktowane
donosowo przeciwciałem do GM-CSF 2 dni, 4 godz. i 1 godz. przed ekspozycją
na dym wykazywały znaczne zmniejszenie poziomów neutrofili, makrofagów i
MMP-9 z BAL w porównaniu do kontroli izotypowej przeciwciała 5 dni po
ekspozycji [54]. Te badania wspierają również nasze własne obserwacje
badające poziomy GM-CSF w indukowanych plwocinach u pacjentów w
zakresie ciężkości POChP. W tych badaniach pokazaliśmy, że GM-CSF był
podwyższony w plwocinach w przybliżeniu o 40% u pacjentów POChP
testowanych bez względu na ciężkość choroby, z poziomami GMCSF
osiągającymi w niektórych przypadkach 500pg/ml. GMSCF nie wydawał się być
podwyższony u niepalących i palących dopasowanych pacjentach kontrolnych.
Dane te sugerują, że GM-CSF może być jednym z kluczowych mediatorów w
zapaleniu dróg oddechowych indukowanym dymem oraz POChP.
Stwardnienie Rozsiane (MS, ang. Multiple Sclerosis)
[0114]
GM-CSF
jest
zaangażowany
w
autoimmunologiczną
chorobę
stwardnienie rozsiane. Przez podawanie antygenu glikoproteiny mieliny
oligodendrocytów (MOG, ang. myelin oligodendrocyte glycoprotein) gryzoniom
model ludzkiego stwardnienia rozsianego można zaindukować, co przedstawia
wiele fenotypów MS takich, jak zapalenie ośrodkowego układu nerwowego i
demielinizacja, które mogą skutkować MS, jak porażenie. W GM-CSF myszy
null MOG, były niezdolne do zaindukowania fenotypu EAE [55]. Ponadto
wykazano, że te myszy wykazywały obniżoną proliferację komórek T na
antygen MOG i obniżoną produkcję cytokin IL-6 i IFN-γ przez Th1. Podawanie
przeciwciał zobojętniających GM-CSF w tym samym czasie co poddanie
działaniu antygenu zapobiegło zapoczątkowaniu choroby na 10 dni po
traktowaniu z udowodnionymi zmniejszonymi zmianami. Jeśli podaje się je na
37
EP 1 999 152B1
początku choroby myszy powróciły do całkowitego zdrowia w ciągu 20 dni
leczenia [55].
Białaczka
[0115] GM-CSF zaangażowano również w białaczce szpikowej, młodzieńczej
przewlekłej białaczce szpikowej (JCML, ang. juvenile chronic myeloid
leukaemia). Stan ten jest zaburzeniem mieloproliferacyjnym, który pierwotnie
atakuje pacjentów młodszych niż 4 lata. In vitro JCML granulocyty krwi
obwodowej - prekursory makrofagów (CFU-GM) wykazują spontaniczną
proliferację przy niskiej gęstości komórek, której to obserwacji nie opisano
wcześniej dla innych zaburzeń mieloproliferacyjnych. Ponadto, wyczerpanie
monocytów w tych kulturach znosi tę proliferację. Następnie wykazano, że ta
spontaniczna
prekursorów
proliferacja
JCML na
zachodzi
cytokinę
za
pośrednictwem
GM-CSF
wyprowadzoną
nadwrażliwości
z
monocytu
[56,57,58,59,60,61]. Nadwrażliwość prekursorów JCML raczej niż nadprodukcja
lub podwyższone poziomy GM-CSF u pacjentów JCML, wydaje się zachodzić
przez ścieżkę przekazywania sygnału indukowaną Ras deregulowaną GM-CSF
[62]. Ostatnie badania analoga GM-CSF (E21R), który antagonizuje działanie
GM-CSF zarówno w badaniach wiązania i testach funkcjonalnych wykazały, że
poprzez hamowanie działania GM-CSF można znacznie obniżyć ładunek
komórkowy JCML w modelu JCML heteroprzeszczepu myszy cukrzycowych
nieotyłych w połączeniu z ciężkim niedoborem odporności (SCID/NOD) [63].
Zapobiegawcze systemy dawkowania E21R w czasie przeszczepu zapobiegły
ustanowieniu prekursorów JCML w szpiku kostnym i dawkowanie E21R 4
tygodnie po przeszczepie indukowało remisję JCML z obniżeniem ładunku
komórkowego. Ponadto, podawanie E21R myszom SCID/NOD przeszczepione
razem z normalnym ludzkim szpikiem kostnym i szpikiem kostnym JCML
powodowało zmniejszenie ładunku JCML jednak komórki normalnego szpiku
kostnego pozostały nienaruszone.
Miażdżyca
[0116] Choroba niedokrwienna serca jest najczęstszą przyczyną śmierci na
świecie. W ciągu ostatnich lat koncepcja, że zapalenie odgrywa znaczącą rolę
38
EP 1 999 152B1
w
patogenezie
miażdżycy wzrosła,
z akumulacją
komórek zapalnych
występujących w parze z akumulacją lipidów w ścianach tętnic.
[0117] Po tym jak raz komórki zapalne przebywają w ścianach tętnic takie, jak
monocyty i makrofagi, uczestniczą i utrwalają lokalną odpowiedź zapalną. Te
makrofagi również ekspresjonują receptory zmiatające dla szeregu lipoprotein i
zatem przyczyniają się do różnicowania komórek do "komórek piankowatych".
To śmierć tych "komórek piankowatych" przyczynia się do rozwoju rdzenia
lipidowego, klasycznej cechy tych zmian. Podczas gdy zapalenie trwa w
obrębie tych blaszek miażdżycowych te aktywowane komórki zapalne uwalniają
mediatory fibrogeniczne i czynniki wzrostu, które sprzyjają proliferacji komórek
mięśni gładkich (SMC) i zwłóknieniu blaszki. Oprócz sprzyjania włóknieniu,
komórki te również uwalniają enzymy proteolityczne, takie jak metaloproteinazy
macierzy (MMP), które przyczyniają się do osłabiania zwłókniałych blaszek,
zatem czynią je podatnymi na uszkodzenia. Blaszki te, gdy pękną uwalniają
szczątki komórek i czynniki krzepnięcia takie, jak czynnik tkankowy do naczynia
stymulującego kaskadę koagulacji i rozwój zakrzepów. Wynikła zakrzepica
tętnicza może następnie prowadzić do niedokrwienia mięśnia sercowego lub
zawału.
[0118] Ostatnio wskazano, że GM-CSF ma wpływ w wielu aspektach na postęp
choroby w miażdżycy. W zmianach miażdżycowych królików karmionych
cholesterolem uznano, że GM-CSF lokalizuje się razem z makrofagami i w
mniejszym stopniu komórkami śródbłonka i SMC [64]. Ponadto, wykazano, że
ekspresja GM-CSF jest zwiększona w ludzkich naczyniach miażdżycowych w
miejscach akumulacji makrofagów i wewnątrz środkowych SMC i komórek
śródbłonka
[65].
przypisywane
To
zwiększenie
bezpośredniemu
poziomów
GM-CSF
kontaktowi
jest
częściowo
komórka-komórka
monocytów/makrofagów i komórek śródbłonkowych podczas tworzenia się i
patogenezy zmian miażdżycowych [66]. Innym kluczowym elementem w
zmianach miażdżycowych jest „komórka piankowata", którą są makrofagi, które
pobrały utlenione lipoproteiny o małej gęstości (LDL) poprzez receptory
zmiatające na powierzchni. Pobieranie Utl-LDL in vitro może dalej stymulować
makrofagi do proliferacji poprzez mechanizm zależny od GM-CSF [67].
39
EP 1 999 152B1
[0119] Ponieważ miażdżyca jest przewlekłym procesem zapalnym, badano
czynniki
przeciwzapalne
przeciwzapalny
takie,
glukokortykoid,
jak
tłumi
glukokortykoidy.
rozwój
Deksametazon,
miażdżycy
w
różnych
doświadczalnych modelach zwierzęcych [68,69,70,71]. Skuteczność została
przypisana hamowaniu migracji SMC [72] i proliferacji [73] oraz zmniejszeniu
chemotaksji krążących monocytów i leukocytów [74]. Ostatnie badania
wykazały, że utl.-LDL może indukować uwalnianie GM-CSF z mysich
makrofagów otrzewnowych [75]. Ponadto, po traktowaniu deksametazonem to
uwalnianie GM-CSF było hamowane zależnie od dawki, sugerując, że
przeciwzapalny wpływ deksametazonu jest zależny od hamowania produkcji
GM-CSF indukowanej utl.-LDL. Podczas gdy GM-CSF wydaje się odgrywać
czołową rolę w miażdżycy, alternatywą dla glukokortykoidów może być
hamowanie aktywności GM-CSF w tym oznaczeniu.
Terminologia
[0120] "I/lub" jak zastosowano niniejszym należy traktować jako specyficzne
ujawnienie każdej z dwóch określonych cech lub składników z lub bez drugiego.
Na przykład "A i/lub B" należy traktować jako specyficzne ujawnienie każdego z
(i) A, (ii) B oraz (iii) A i B tak, jakby każdy z nich był indywidualnie przedstawiony
niniejszym.
GN-CSFRα oraz GM-CSF
[0121] GM-CSFRα jest łańcuchem alfa receptora dla czynnika stymulującego
kolonię granulocytów makrofagów. Pełnej długości sekwencja ludzkiego GMCSFRα jest złożona pod Numerem Dostępu S06945 (gi:106355) [76] i
przedstawioną niniejszym jako SEQ ID NR: 202. Dojrzałą formę ludzkiego GMCSFRα, tj. z odciętym peptydem sygnałowym, przedstawiono niniejszym jako
SEQ ID NR: 206. O ile nie wskazano inaczej niniejszym przez kontekst,
odnośniki do GM-CSFRα odnoszą się do ludzkich lub innych niż ludzie
naczelnych (np. cynomolgus) GM-CSFRα, normalnie ludzkich. GM-CSFRα
może być naturalnie występującym GM-CSFRα lub rekombinowanym GMCSFRα.
[0122] 298 aminokwasowa zewnątrzkomórkowa domena ludzkiego receptora
GM-CSF ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NR: 205.
40
EP 1 999 152B1
[0123] O ile nie wskazano inaczej niniejszym przez kontekst, odnośniki do GMCSF odnoszą się do ludzkich lub innych niż ludzie naczelnych (np. cynomolgus)
GM-CSF, normalnie ludzkich.
[0124] GM-CSF normalnie wiąże się do domeny zewnątrzkomórkowej (SEQ ID
NR: 205) dojrzałego łańcucha alfa receptora GM-CSF (SEQ ID NR: 206). Jak
opisano niniejszym w innym miejscu, to wiązanie jest hamowane przez
elementy wiążące według wynalazku.
[0125] Zidentyfikowano naturalnie występujące warianty splicingowe GMCSFRα - patrz na przykład odnośniki [77 i 78]. Domena zewnątrzkomórkowa
jest konserwatywna w tych wariantach splicingowych. Elementy wiążące
według wynalazku mogą lub nie wiązać się do jednego lub większej liczby
wariantów splicingowych GM-CSFRα i mogą lub nie hamować wiązanie GMCSF do jednego lub większej liczby wariantów splicingowych GM-CSFRα.
Element wiążący
[0126] Opisuje to element pary cząsteczek, które wiążą się do siebie. Elementy
wiążącej pary mogą być pochodzenia naturalnego lub całkowicie lub częściowo
syntetycznie wytworzone. Jeden element z pary cząsteczek posiada obszar na
swojej powierzchni lub wgłębienie, które wiąże się i jest zatem komplementarne
do konkretnej przestrzennej i polarnej grupy innego elementu pary cząstek
drugiego elementu z pary cząsteczek. Przykładami typów wiążących par są
antygen-przeciwciało, biotyna-awidyna, hormon-receptor hormonu, receptorligand, enzym-substrat. Niniejszy wynalazek dotyczy reakcji typu antygenprzeciwciało.
[0127] Element wiążący według wynalazku zawiera cząsteczkę przeciwciała,
która zawiera miejsce wiązania antygenu.
[0128] Oprócz sekwencji przeciwciała i/lub miejsca wiązania antygenu, element
wiążący według wynalazku może zawierać inne aminokwasy, np. tworzące
peptyd lub polipeptyd taki, jak sfałdowana domena lub nadają cząsteczce inne
funkcjonalne cechy oprócz zdolności wiązania antygenu. Elementy wiążące
według wynalazku mogą nieść wykrywalny znacznik lub mogą być połączone z
toksyną lub częścią docelową lub enzymem (np. przez wiązanie peptydylowe
lub łącznik). Na przykład, element wiążący może obejmować miejsce
41
EP 1 999 152B1
katalityczne (np. w domenie enzymu) jak również miejsce wiązania antygenu,
przy czym miejsce wiązania antygenu wiąże antygen i zatem kieruje miejsce
katalityczne do antygenu. Miejsce katalityczne może hamować funkcję
biologiczną antygenu, np. poprzez rozszczepienie.
[0129] Pomimo, jak zauważono, CDR mogą być niesione przez szkielet taki, jak
fibronektyna lub cytochrom B [80, 81, 82], struktura do niesienia CDR lub
zestawu CDR według wynalazku będą zwykle sekwencją łańcucha ciężkiego
lub lekkiego przeciwciała lub znaczną jej częścią, w której CDR lub zestaw CDR
jest zlokalizowany w miejscu odpowiadającym CDR lub zestawu CDR
naturalnie występujących domen zmiennych VH i VL przeciwciała kodowanych
przez zmienione geny immunoglobulin. Struktury i lokalizacje domen zmiennych
immunoglobulin można określić poprzez odniesienie do (Kabat, et al., 1987
[98], i uaktualnień, dostępne obecnie w Internecie (http://immuno.bme.nwu.edu
lub znajdując "Kabat" z zastosowaniem jakiejkolwiek wyszukiwarki).
[0130] Elementy wiążące według niniejszego wynalazku mogą zawierać
regiony stałe przeciwciała lub ich części, korzystnie regiony stałe ludzkiego
przeciwciała lub ich części. Na przykład, domena VL może być dołączona na Ckońcu do stałych domen lekkiego łańcucha przeciwciała w tym ludzkie łańcuchy
Cκ lub Cλ, korzystnie łańcuchy Cλ. Podobnie, element wiążący bazujący na
domenie VH może być dołączony na jego C-końcu do całości lub części (np.
domeny
CH1)
łańcucha
ciężkiego
immunoglobuliny
wyprowadzonej
z
jakiegokolwiek izotypu przeciwciała, np. IgG, IgA, IgE i IgM oraz z jakichkolwiek
podklas izotypu, w szczególności IgGl, IgG2 i IgG4. Korzystne są IgG1, IgG2
lub IgG4. IgG4 jest korzystna, ponieważ nie wiąże dopełniacza i nie tworzy
funkcji efektorowych. Jakikolwiek syntetyczny lub inny wariant regionu stałego,
który posiada te własności i stabilizuje regiony zmienne jest również korzystny
do zastosowania w przykładach wynalazku niniejszego wynalazku.
[0131]
Elementy
wiążące
według
wynalazku
mogą
być
znakowane
wykrywalnym lub funkcjonalnym znacznikiem. Wykrywalne znaczniki zawierają
znaczniki radioaktywne, takie jak
131
I lub
99
Tc, które mogą się dołączać do
przeciwciał według wynalazku z zastosowaniem konwencjonalnej chemii znanej
w stanie techniki obrazowania przeciwciała. Znaczniki obejmują również
42
EP 1 999 152B1
znaczniki enzymatyczne takie, jak peroksydaza chrzanowa. Znaczniki dalej
zawierają cząstki chemiczne takie, jak biotyna, którą można wykryć poprzez
wiązanie specyficznej pokrewnej wykrywalnej cząstki, np. znakowanej awidyny.
Zatem, element wiążący lub cząsteczka przeciwciała według niniejszego
wynalazku może być w formie sprzężonej zawierającej element wiążący i
znacznik, opcjonalnie połączony łącznikiem takim, jak peptyd. Element wiążący
może być sprzężony na przykład z enzymami (np. peroksydazą, fosfatazą
alkaliczną)
lub
znacznikiem
fluorescencyjnym
zawierającym
w
sposób
nieograniczający biotynę, fluorochrom, zielone białko fluorescencyjne. Dalej,
znacznik może zawierać cząstkę toksyny taką, jak cząstka toksyny wybrana z
grupy egzotoksyn Pseudomonas (PE lub fragment cytotoksyczny lub jego
mutant), toksyny błonicy (fragment cytotoksyczny lub jego mutant), toksyny
botulinowej A do F, rycyny lub jej cytotoksycznego fragmentu, abryny lub jej
cytotoksycznego fragmentu, saporyny lub jej cytotoksycznego fragmentu,
przeciwwirusowej toksyny szarłatki lub jej fragmentu cytotoksycznego i briodyny
1 lub jej cytotoksycznego fragmentu. Gdzie element wiążący zawiera
cząsteczkę przeciwciała, znakowany element przeciwciała może być określany
jako immunokoniugat.
Cząsteczka przeciwciała
[0132] Opisuje to immunoglobulinę czy też naturalną lub częściowo lub
całkowicie syntetycznie wyprodukowaną. Termin również pokrywa jakikolwiek
polipeptyd lub białko zawierające miejsce wiązania antygenu przeciwciała.
Fragmenty
przeciwciała,
które
zawierają
miejsce
wiązania
antygenu
przeciwciała są cząsteczkami takimi, jak Fab, F(ab')2, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv,
dAb, Fd; i diaciała.
[0133] Jest możliwe zastosowanie monoklonalnych i innych przeciwciał i
zastosowanie technik rekombinacji DNA, aby wyprodukować inne przeciwciała
lub cząsteczki chimeryczne, które utrzymują specyficzność pierwotnego
przeciwciała. Takie techniki mogą obejmować wprowadzenie DNA kodującego
region zmienny immunoglobuliny lub CDR przeciwciała do regionów stałych lub
regionów stałych plus regionów zrębu innej immunoglobuliny. Patrz na przykład
EP-A-184187, GB 2188638A lub EP-A-239400 oraz dalszą obszerną literaturę.
43
EP 1 999 152B1
Hybrydoma lub inna komórka produkująca przeciwciało może być poddana
mutacji genetycznej lub innym zmianom, które mogą lub nie zmieniać cel
wiązania produkowanych przeciwciał.
[0134] Ponieważ przeciwciała można modyfikować wieloma sposobami, termin
"cząsteczka przeciwciała" należy interpretować jako jakikolwiek element
wiążący lub substancję posiadającą miejsce wiązania antygenu przeciwciała.
Zatem, ten termin zawiera fragmenty przeciwciała i pochodne, w tym jakikolwiek
polipeptyd zawierający miejsce wiązania antygenu przeciwciała, czy też
naturalnego czy też całkowicie lub częściowo syntetycznego. Cząsteczki
chimeryczne
zawierające
miejsce
wiązania
antygenu
przeciwciała
lub
równoważnik połączony z innym polipeptydem są zatem zawarte. Klonowanie i
ekspresja chimerycznych przeciwciał opisano w EP-A-0120694 oraz EP-A0125023 i dalszej obszernej literaturze.
[0135] Kolejne techniki inżynierii przeciwciał dostępne w stanie techniki
umożliwiły izolowanie ludzkich i humanizowanych przeciwciał. Przeciwciała
ludzkie i humanizowane są korzystnymi przykładami wykonania wynalazku i
mogą być produkowane z zastosowaniem odpowiednich sposobów. Na
przykład można utworzyć ludzkie hybrydomy [83]. Prezentacja fagowa, inne
ustanowione techniki wytwarzania elementów wiążących opisano szczegółowo
w wielu publikacjach takich, jak odnośnik [83] oraz WO92/01047 (omówione
dalej poniżej). W celu izolowania ludzkich przeciwciał można zastosować
transgeniczne myszy, w których mysie geny przeciwciał są inaktywowane i
funkcjonalnie
zastąpione
nienaruszone
inne
genami
składniki
ludzkich
mysiego
układu
przeciwciał
pozostawiając
immunologicznego
[84].
Przeciwciała humanizowane można produkować stosując techniki znane w
stanie techniki takie, jak ujawnione na przykład w WO91/09967, US 5,585,089,
EP592106, US 565,332 oraz WO93/17105. Dalej, WO2004/006955 opisuje
sposoby humanizowania przeciwciał w oparciu o wybór sekwencji zmiennego
regionu zrębu z genów ludzkich przeciwciał poprzez porównanie kanonicznych
typów struktury CDR dla sekwencji CDR regionu zmiennego przeciwciała
innego niż ludzkie do kanonicznych typów struktury CDR dla odpowiadających
CDR z biblioteki sekwencji ludzkich przeciwciał, np. segmentów genu
44
EP 1 999 152B1
przeciwciała
linii
komórek
rozrodczych.
Regiony
zmienne
ludzkiego
przeciwciała posiadające podobne kanoniczne typy struktury CDR do innych niż
ludzkie CDR tworzą podzbiór sekwencji elementu ludzkiego przeciwciała, z
których wybrano ludzkie sekwencje zrębu. Podzbiór elementów można dalej
uszeregować względem podobieństwa aminokwasowego między ludzkimi i
innymi niż ludzkie sekwencjami CDR. W sposobie według WO2004/006955,
ludzkie sekwencje na wysokiej pozycji wybrano, aby zapewnić sekwencje zrębu
do skonstruowania chimerycznego przeciwciała, które funkcjonalnie zastępuje
ludzkie sekwencje CDR innymi niż ludzkie CDR odpowiednikami stosując
wybrany podzbiór elementu ludzkich zrębów, zapewniając w ten sposób
przeciwciało
humanizowane
immunogenności
o
wysokim
bez potrzeby porównywania
powinowactwie
sekwencji
i
niskiej
zrębu
między
przeciwciałami innymi niż ludzkie i ludzkimi. Przeciwciała chimeryczne
utworzone według sposobu są również ujawnione.
[0136] Syntetyczne cząsteczki przeciwciała można utworzyć poprzez ekspresję
z genów utworzonych za pomocą oligonukleotydów syntetyzowanych i
połączonych w odpowiednich wektorach ekspresyjnych [85, 86].
[0137] Wykazano, że fragmenty całego przeciwciała mogą pełnić funkcję
wiązania antygenów. Przykładami wiążących fragmentów są (i) fragment Fab
składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment Fd składający się z
domen VH i CH1; (iii) fragment Fv składający się z domen VL i VH
pojedynczego przeciwciała; (iv) fragment dAb [87, 88, 89], który składa się z
domeny VH lub VL; (v) wyizolowane regiony CDR; (vi) fragmenty F(ab')2,
fragment dwuwartościowy zawierający dwa połączone fragmenty Fab; (vii)
pojedynczy łańcuch cząsteczek Fv (scFv), w którym domena VH i domena VL
są połączone łącznikiem, który pozwala na połączenie dwóch domen w celu
utworzenia miejsca wiązania antygenu [90, 91]; (viii) dimery pojedynczych
łańcuchów Fv o podwójnym działaniu (PCT/US92/09965) oraz (ix) "diaciała"
wielowartościowe lub wielospecyficzne fragmenty utworzone przez fuzję genów
(WO94/13804; [92]). Fv, scFv lub cząsteczki diaciała mogą być utrwalane
poprzez wbudowanie mostków disiarczkowych łączących domeny VH i VL [93].
45
EP 1 999 152B1
Można również utworzyć miniciała zawierające scFv połączone z domeną CH3
[94].
[0138] dAb (domeną przeciwciała) jest mały monomeryczny fragment
przeciwciała wiążący antygen, mianowicie region zmienny łańcucha ciężkiego
lub lekkiego przeciwciała [89]. VH dAb występuje naturalnie u wielbłądowatych
(np. wielbłąd, lama) i można ją produkować poprzez immunizowanie
wielbłądowatych docelowym antygenem, izolowanie komórek B specyficznych
względem antygenu i bezpośrednie klonowanie genów dAb z pojedynczych
komórek B. dAb można również produkować w hodowlach komórkowych. Ich
mały rozmiar, dobra rozpuszczalność i trwałość temperaturowa czyni je
szczególnie fizjologicznie użytecznymi i odpowiednimi do wyboru i dojrzewania
powinowactwa. Element wiążący według niniejszego wynalazku może być dAb
zawierającym domenę VH lub VL zasadniczo jak przedstawiono niniejszym lub
domenę VH lub VL zawierającą zestaw CDR zasadniczo jak przedstawiono
niniejszym. Poprzez "zasadniczo jak przedstawiono niniejszym" należy
rozumieć, że stosowna domena CDR lub VH lub VL według wynalazku będzie
albo identyczna albo wysoce podobna do określonych regionów, których
sekwencję niniejszym przedstawiono. Poprzez "wysoce podobna" uważa się, że
od 1 do 5, korzystnie od 1 do 4 tak, jak 1 do 3 lub 1 do 2 lub 3 lub 4 podstawień
aminokwasowych można dokonać w CDR i/lub domenie VH lub VL.
[0139] Gdy stosuje się przeciwciała o podwójnym działaniu, mogą być one
konwencjonalnymi przeciwciałami o podwójnym działaniu, które można
wytwarzać różnymi sposobami [95], np. otrzymywać chemicznie lub z hybryd
hybrydom lub mogą być jakimikolwiek fragmentami przeciwciała o podwójnym
działaniu wspomnianymi powyżej. Przykłady przeciwciał o podwójnym działaniu
obejmują te z technologii BiTE, w których domeny wiążące dwóch przeciwciał o
różnej specyficzności można zastosować i bezpośrednio połączyć przez krótkie
elastyczne peptydy. Łączy on dwa przeciwciała na krótkim pojedynczym
łańcuchu polipeptydowym. Diaciała i scFv można utworzyć bez regionu Fc,
stosując jedynie domeny zmienne, potencjalnie zmniejszające skutki reakcji
anty-idiotypowej.
46
EP 1 999 152B1
[0140] Diaciała o podwójnym działaniu, w przeciwieństwie do całych przeciwciał
o podwójnym działaniu, mogą również być szczególnie użyteczne, ponieważ
mogą być łatwo utworzone i ekspresjonowane w E. coli. Diaciała (i wiele innych
polipeptydów, jak fragmenty przeciwciała) o odpowiednich cechach wiązania
można łatwo wybrać stosując prezentację fagową (WO94/13804) z bibliotek.
Jeśli jedno ramię diaciała pozostaje stałe, na przykład, bezpośrednio przeciwko
GM-CSFRα, wtedy bibliotekę można utworzyć, gdy drugie ramię jest zmienne i
wybrano przeciwciało wiążące odpowiedni cel. Całe przeciwciała o podwójnym
działaniu można utworzyć poprzez technikę klucz-do-zamka [96].
Miejsce wiązania antygenu
[0141] Opisano tu część cząsteczki, która wiąże się do i jest komplementarna
do całego lub części docelowego antygenu. W cząsteczce przeciwciała nazywa
się ją potem miejscem wiązania antygenu przeciwciała i obejmuje część
przeciwciała, która wiąże się i jest komplementarna do całego lub części
docelowego antygenu. Gdy antygen jest duży, przeciwciało może wiązać
jedynie poszczególną część antygenu, którą to część nazywa się epitopem.
Miejsce wiązania antygenu przeciwciała można zapewnić poprzez jedną lub
większą liczbę domen zmiennych przeciwciała. Korzystnie, miejsce wiązania
antygenu przeciwciała obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała
(VL) i region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała (VH).
Numerowanie Kabat'a
[0142] Reszty sekwencji przeciwciała niniejszym ogólnie odnoszą się do
zastosowania numerowania Kabat'a, jak zdefiniowano w Kabat et al., 1971 [97].
Patrz również odnośniki [98, 99].
Izolowany
[0143] Odnosi się to do stanu, w którym elementy wiążące według wynalazku
lub kwas nukleinowy kodujący takie elementy wiążące, ogólnie są zgodne z
niniejszym wynalazkiem. Izolowane elementy i izolowany kwas nukleinowy
będą wolne lub zasadniczo wolne od materiału, z którym są naturalnie
związane takim, jak inne polipeptydy lub kwasy nukleinowe, z którymi je
znaleziono w ich naturalnym środowisku lub w środowisku, w którym je
47
EP 1 999 152B1
otrzymano (np. hodowla komórkowa), gdy takie otrzymywanie jest na drodze
technologii rekombinacji DNA stosowanej w praktyce in vitro lub in vivo.
[0144] Elementy i kwasy nukleinowe można formułować z rozcieńczalnikami lub
adiuwantami i nadal izolować w celach praktycznych - na przykład elementy
normalnie miesza się z żelatyną lub innymi nośnikami, jeśli stosuje się do
powlekania płytek do mikromiareczkowania do zastosowania w testach
immunologicznych lub miesza się z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami
lub rozcieńczalnikami, jeśli stosuje się w diagnostyce lub leczeniu. Elementy
wiążące mogą być glikozylowane, albo naturalnie albo za pomocą systemów
heterologicznych komórek eukariotycznych (np. CHO lub NS0 (ECACC
85110503)) komórki lub mogą być (na przykład jeśli są produkowane przez
ekspresję w komórkach prokariotycznych) nieglikozylowane.
Krótki Opis Rysunków
[0145]
Figura 1: Analiza pA2 dwóch przeciwciał anty-GM-CSFRα w teście proliferacji
TF-1. Proliferację komórek TF-1 zaindukowano wzrastającymi stężeniami GMCSF w obecności wzrastających stężeń dwóch optymalizowanych IgG4,
Przeciwciało 6 (Figura 1A) i Przeciwciało 1 (Figura 1B), odpowiednio. Dla
danych przedstawionych na wykresie 1A i wykresie 1B mierzono wbudowanie
mianowanej tymidyny i obliczono EC50 GM-CSF w każdym stężeniu
przeciwciała. Dla danych przedstawionych na wykresie 1C i wykresie 1D
stosunki dawek obliczono i zanalizowano poprzez regresję Schilda w celu
otrzymania wartości pA2.
Figura 2. Analiza pA2 przeciwciała anty-GM-CSFRα, Przeciwciała 6 w testach
zmiany kształtu granulocytów. Granulocyty ludzkie (wykres 2A i 2C) lub
cynomolgus (2B i 2D) traktowano zwiększającymi się stężeniami GM-CSF w
obecności zwiększających się stężeń IgG4. Zmianę kształtu granulocytów
mierzono stosując cytometrię przepływową i obliczono EC50 GM-CSF w
każdym stężeniu przeciwciała (wykres 2A i wykres 2B). Stosunki dawek
obliczono następnie i zanalizowano poprzez regresję Schilda w celu otrzymania
wartości pA2 (wykres 2C i wykres 2D).
48
EP 1 999 152B1
Figura 3. Antagonistyczna siła dwóch przeciwciał, Przeciwciała 1 oraz 6,
odpowiednio, jak IgG4 w teście pomiaru proliferacji komórek TF-1 indukowanej
przez 7pM ludzkich GM-CSF. Również przedstawiono dane dla pozytywnej
kontroli IgG4 2B7 i dla izotypu kontrolnej IgG4. Dane reprezentują średnią ze
słupkami standardowego odchylenia trzykrotnych powtórzeń w obrębie tego
samego doświadczenia.
odpowiednio, jak IgG4 w teście pomiaru zmiany kształtu ludzkich granulocytów
indukowanej przez 7pM ludzkich GM-CSF. Również przedstawiono dane dla
pozytywnej kontroli IgG4 2B7 i dla izotypu kontrolnej IgG4. Dane reprezentują
średnią ze słupkami standardowego odchylenia trzykrotnych powtórzeń w
obrębie tego samego doświadczenia.
odpowiednio, jak IgG4 w teście pomiaru uwalniania TNFα z ludzkich
monocytów stymulowanego 1nM ludzkich GM-CSF. Również przedstawiono
dane dla przeciwciała kontrolnego 2B7 i dla izotypu kontrolnej IgG4. Dane
reprezentują średnią ze słupkami standardowego odchylenia trzykrotnych
powtórzeń w obrębie tego samego doświadczenia.
odpowiednio, jak IgG4 w teście pomiaru przeżycia ludzkich granulocytów
indukowanego przez 7pM ludzkich GM-CSF. Również przedstawiono dane dla
przeciwciała kontrolnego 2B7 i dla izotypu kontrolnej IgG4. Dane reprezentują
średnią ze słupkami standardowego odchylenia trzykrotnych powtórzeń w
obrębie tego samego doświadczenia.
Figura 7. Powinowactwo dojrzałych mAb Przeciwciała 1 i Przeciwciała 6, lecz
nie macierzystych ludzkich mAb 28G5 (Przeciwciało 3) lub znanego mysiego
przeciwciała
2B7,
hamuje
różnicowanie
napędzane
GM-CSF
ludzkich
prekursorów hemopoetycznych. 5x10 4 rozmrożonych komórek jednojądrzastych
z próbki aferezy hodowano w pół-stałym agarze w obecności 10 ng/ml GM-CSF
i wskazanym stężeniu mAb. Kolonie policzono w 14 dniu. Wykres przedstawia
liczbę kolonii o stężeniu mAb w µg/ml.
49
EP 1 999 152B1
Figura 8. Analiza odpowiedzi na dawkę skuteczności powinowactwa dojrzałych
mAb w chimerycznych myszach huGM-CSFR Tg. Grupy 5 Tg chimerycznych
myszy traktowano 500 ng huGM-CSF (lub PBS) podskórnie dwa razy dziennie
przez 4 dni (D.1 - D.4) oraz albo kontrolą (CAT001) albo testowym mAb
(Przeciwciało 6) we wskazanych stężeniach w D.0. Masę śledziony oceniono w
D.5.
Figura 9. Analiza odpowiedzi na dawkę skuteczności Przeciwciała 6 w teście
uwalniania endogennych cytokin z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi
obwodowej. 1x106 komórek hodowano przez 72 godz. w obecności lub
nieobecności przeciwciała oraz IL-6 i TNFa ELISA przeprowadzono na
supernatantach. Dane reprezentują średnią ze słupkami standardowego
odchylenia dwukrotnych powtórzeń w obrębie tego samego doświadczenia.
Część doświadczalna
Tło
[0146] Fragmenty ludzkiego przeciwciała można wybrać in vitro z repertuaru
prezentowanego na powierzchni nitkowatych bakteriofagów. Sposób ten jest
znany jako prezentacja fagowa i zapewnia środki do wyprowadzania
fragmentów ludzkich przeciwciał. Sposób ten można używać do izolacji ludzkiej
przeciw-ludzkiej swoistości i może być dostosowany do wyprowadzenia
przeciwciał o szczególnej charakterystyce powinowactwa.
[0147] Fragmenty przeciwciała składające się jedynie z domen zmiennych
łańcucha ciężkiego (VH) i zmiennych łańcucha lekkiego (VL) połączone razem
krótkim peptydowym łącznikiem zawierają wszystkie informacje potrzebne do
określenia wiązania antygenu. Takie fragmenty są znane jako pojedyncze
łańcuchy Fv (scFv). Gdy zaprezentowano je na powierzchni faga, scFv
wykazały zarówno prawidłowe fałdowanie i wiązanie do antygenu. Duże
repertuary ludzkich scFv utworzono w ten sposób i zapewniono źródło, z
którego można izolować pojedyncze klony do rozwoju jako kandydatów na leki.
Kandydat scFv jest później ponownie formowany jako całe cząsteczki IgG
(typowo ludzkie IgG) do zastosowań terapeutycznych.
Streszczenie
50
EP 1 999 152B1
[0148] Wybory przeprowadzono na bibliotece prezentacji fagowej scFv
wyprowadzonej z ludzkich limfocytów śledziony w celu osiągnięcia populacji
faga, która wiąże ludzkie GM-CSFRα. Wyizolowaliśmy scFv przeciwciała
posiadające wybrane cechy i przekształcono te scFv do IgG4. Stosując różne
testy, wyizolowano panel przeciwciał, zoptymalizowano i przeprowadzono w
linię komórek rozrodczych, aby wyprodukować IgG4 o odpowiednich cechach
dla przeciwciała terapeutycznego.
[0149] 19 klonów przeciwciała, których sekwencje przedstawiono jako
przeciwciała 1, 2 i 4-20 w wykazie sekwencji, wyprowadzono z macierzystego
przeciwciała. Macierzyste przedstawiono jako przeciwciało 3 w wykazie
sekwencji i również jest nazywane niniejszym, jako 28G5. Wybrano 19 klonów,
jako wykazujące szczególnie dobre własności w zakresie testów biologicznych,
jak opisano w Części Doświadczalnej i nadano im numery przeciwciał 1, 2 i 4
do 20.
[0150] Testy biologiczne zaprojektowano do odzwierciedlenia natury zapalnej
chorób takich, jak reumatoidalne zapalenie stawów. Na przykład, zmiana
kształtu neutrofili potrzebna do ich rekrutacji do miejsca działania, uwolnienie
czynników prozapalnych przez monocyty i wzrost przeżywalności typów
komórek zapalnych w odpowiedzi na poszczególne sygnały. Przeciwciała
wykazują silną aktywność zobojętniania w tych testach.
[0151] Szczegółowe protokoły zastosowanych sposobów testu są dostarczone
poniżej w rozdziale zatytułowanym "Testowe Materiały i Sposoby".
Przeprowadzenie izolacji przeciwciała
[0152] Bibliotekę ludzkiego przeciwciała dużego pojedynczego łańcucha FV
(scFv) zastosowano do wyborów. Wyprowadzono ją z limfocytów śledziony od
20 zdrowych dawców i wklonowano do wektora fagmidowego. ScFv, które
rozpoznają GM-CSFRα wyizolowano z biblioteki prezentacji fagowej w serii
powtarzanych cykli wybierania na oczyszczone GMCSF-Rα wyprowadzone z
nadekspresji
oznakowanej
do
oczyszczania,
rozpuszczalnej,
zewnątrzkomórkowej domeny receptora komórek HEK293T. Osiągnięto to
zasadniczo jak opisano w Vaughan et al [102]. W skrócie, po ekspozycji
biotynylowanego receptora na bibliotekę fagową, białko związane z fagiem
51
EP 1 999 152B1
wychwycono na kulki magnetyczne powleczone streptawidyną. Niezwiązane
fagi wypłukano. Związane fagi odzyskano jak opisano przez Vaughan et al i
proces selekcji powtórzono. Przeprowadzono trzy rundy selekcji przy
zmniejszających się stężeniach antygenu. Reprezentatywne proporcje scFv z
wyjściowych rund selekcji poddano sekwencjonowaniu DNA.
[0153] Po tych początkowych wyborach z biblioteki prezentacji fagowej,
zidentyfikowano panel unikatowych scFv w teście wiązania liganda, które
zaprojektowano do identyfikacji fagów ekspresjonujących przeciwciała scFv,
które są zdolne do hamowania wiązania GM-CSF do oczyszczonej domeny
zewnątrzkomórkowej GM-CSFRα. Siła zobojętniania tych scFv w teście
wiązania liganda była w zakresie od 0,65 do 3,3 nM.
[0154] Przeciwciała, które były aktywne w biochemicznym teście wiązania
liganda oceniono pod względem aktywności biologicznej w teście proliferacji
TF-1, który mierzy siłę zobojętniania poprzez określenie zdolności przeciwciał
do hamowania proliferacji komórek TF-1 stymulowanych GM-CSF. TF-1 jest
ludzką komórką premieloidalną uzyskaną od pacjenta z erytroleukemią. Ta linia
komórkowa jest zależna od czynnika przeżycia i proliferacji i jest rutynowo
utrzymywana w ludzkich GM-CSF. Hamowanie proliferacji zależnej od GM-CSF
określono poprzez pomiar zmniejszonego wbudowywania mianowanej tymidyny
do nowo syntetyzowanego DNA dzielących się komórek. Wszystkie scFv miały
mierzalną siłę w tym teście z wartościami IC50 w zakresie od około 180 do
12,00 nM.
[0155] Najsilniejsze klony scFv przekształcono ponownie do ludzkich
cząsteczek przeciwciała IgG4 w ludzką domeną stałą łańcucha ciężkiego
gamma 4 i ludzką domenę stałą łańcucha lekkiego lambda. Wektory utworzono
dla najsilniejszych klonów scFv w celu umożliwienia ekspresji przeciwciał jako
całego przeciwciała IgG4, jak opisano w Persic et al. [100] z kilkoma
modyfikacjami. Fragment oriP włączono do wektorów, aby ułatwić stosowanie
komórek HEK-EBNA 293 i aby umożliwić replikację episomalną. Domenę
zmienną VH wklonowano do polilinkera między sekwencją liderową wydzielania
i ludzką domeną stałą gamma 4 wektora ekspresyjnego pEU8.1(+). Domenę
zmienną VL wklonowano do polilinkera między sekwencją liderową wydzielania
52
EP 1 999 152B1
i ludzką domeną stałą lambda wektora ekspresyjnego pEU4.1(-). Komórki HEKEBNA 293 kotransfekowano konstruktem ekspresyjnym ciężkiego i lekkiego
łańcucha i całe przeciwciało oczyszczono z uzdatnionego podłoża stosując
chromatografię powinowactwa białka A. Preparaty oczyszczonego przeciwciała
sterylnie przefiltrowano i przechowywano przed oceną w 4°C w soli
fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Stężenie białka określono
mierząc absorbancję przy 280 nm z zastosowaniem sposobu BCA (Pierce).
[0156] Ponownie
przekształcone IgG porównano do znanych
mysich
przeciwciał 2B7 w teście proliferacji TF-1. IgG4 zachowały lub uzyskały
aktywność w tym teście z wartościami IC50 w zakresie od 6 do około 1600 nM.
[0157] W chorobie zapalnej, zmiana kształtu neutrofili jest konieczna do ich
rekrutacji do miejsca działania. Test zmiany kształtu ludzkich granulocytów
zaprojektowano, aby naśladować tę odpowiedź biologiczną stosując sortowanie
komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), aby zmierzyć zmianę kształtu
granulocytów izolowanych z krwi po ich ekspozycji na GM-CSF. Oceniono
zdolność przeciwciał anty-GM-CSFRα IgG4 do hamowania odpowiedzi zmiany
kształtu neutrofili na GM-CSF i wartości IC50 wybranych klonów były w zakresie
od około 15 do 350 nM. Reprezentatywne przeciwciało 28G5 neutralizowało
GMCSF-R cynomolgus w teście zmiany kształtu granulocytów cynomolgus w
IC50 o około 5 nM. Znane mysie przeciwciało 2B7 również było zdolne do
neutralizacji odpowiedzi
biologicznej skutkując wiązaniem GM-CSF do
receptora cynomolgus.
[0158] Powinowactwo wiązania przeciwciał przez receptor zmierzono następnie
stosując BIAcore, z obliczonymi wartościami K D w zakresie od 32 do 377 nM.
Optymalizacja
[0159]
W
staraniach
o
poprawę
siły
28G5
zainicjowano
program
optymalizacyjny. Utworzono biblioteki przeciwciał, w których przeprowadzono
mutagenezę losową CDR3 VH lub VL. Każdy CDR3 randomizowano w dwóch
odcinkach 6-aminokwasowych, aby pokryć cały CDR, tworząc biblioteki H1 (Nkońcowy odcinek 6 aa VH CDR3), H2 (C-końcowy odcinek 6 aa w VH CDR3),
L1 (N-końcowy odcinek 6 aa w VL CDR3) i L2 (C-końcowy odcinek 6 aa w VL
CDR3). Uzyskane biblioteki poddawano powtarzanym cyklom selekcji dla
53
EP 1 999 152B1
wiązania
ludzkiego
GM-CSFRα.
Klony
wyizolowane
w
tym
procesie
selekcyjnym zastosowano następnie do konstruowania łączonej biblioteki
prezentacji fagowej, zawierającej scFv ze zmutowanymi CDR3 łańcucha
ciężkiego i zmutowanymi CDR3 łańcucha lekkiego. Biblioteki te również
poddano tej samej procedurze selekcyjnej.
[0160] Na każdym etapie procesu optymalizacji, scFv zdolne hamować
wiązanie 28G5 IgG4 do receptora GM-CSF identyfikowano z zastosowaniem
testu kompetycyjnego epitopu z 28G5 i receptorem, a następnie oceniano w
teście proliferacji TF-1, jak opisano poniżej.
[0161] Po losowej mutagenezie sekwencji CDR3 łańcucha ciężkiego 28G5,
zidentyfikowano panel scFv z mierzalną siłą zobojętniania w teście TF-1.
Większość poprawy siły uzyskano, gdy randomizowany był koniec 3' V H CDR3.
[0162] Po losowej mutagenezie sekwencji CDR3 łańcucha lekkiego 28G5,
zidentyfikowano panel scFv z mierzalną siłą zobojętniania w teście TF-1.
Wszystkie poprawy siły uzyskano, gdy randomizowany był koniec 3' V L CDR3.
[0163] Po połączeniu bibliotek losowej mutagenezy CDR3 łańcucha ciężkiego i
lekkiego zidentyfikowano panel scFv o poprawionej sile w teście proliferacji TF1 w stosunku do macierzystego scFv 28G5. Wyizolowano scFv z poprawą siły
>60000 razy w stosunku do macierzystego 28G5. Wszystkie połączenia
bibliotek skutkowały poprawionym scFv, tj. H1/L1, H1/L2, H2/L1, H2/L2. Ma to
szczególne znaczenie, ponieważ z biblioteki L1 nie wyizolowano poprawionych
scFv.
[0164] Panel 19 scFv, zidentyfikowanych podczas optymalizacji 28G5,
przeformatowano i ekspresjonowano jako IgG4, stosując sposoby opisane
powyżej. Panel składał się z klonów przeciwciał 1, 2 i od 4 do 20. Niektóre z
najsilniejszych
klonów
w
tym
panelu
uzyskano
z
połączonych
zmutagenizowanych bibliotek H i L CDR3. Przeciwciała IgG4 w tym panelu
oceniano pod kątem ich aktywności w teście proliferacji TF-1 i porównywano ze
znanym przeciwciałem mysim, 2B7. Wszystkie zoptymalizowane IgG4 były w
tym teście silniejsze niż 2B7. W tym przypadku 2B7 miało obliczone IC50
wynoszące 1,6 nM, podczas gdy klony miały obliczone wartości IC50
54
EP 1 999 152B1
mieszczące się w zakresie od około 1 pm do około 1100 pM. Dane
przedstawiono w Tabeli 1 poniżej i podsumowano następująco:
IC50 <1500 pM
Przeciwciała 1, 2 i od 4 do 20
IC50 <300 pM
Przeciwciała 1, 2, 4-12 i 14-20
IC50 <60 pM
Przeciwciała 1, 2, 4-6, 8-11, 14 i 16-20
IC50 <10 pM
Przeciwciała 1, 5, 6, 11 i 20.
[0165] Figura 3 ilustruje siłę antagonistyczną dwóch reprezentatywnych
przeciwciał według wynalazku, Przeciwciała 1 i Przeciwciała 6, w porównaniu
ze znanym przeciwciałem 2B7 w teście proliferacji TF-1.
[0166] BIAcore 2000 System (Pharmacia Biosensor) zastosowano do oceny
parametrów
kinetycznych
oddziaływań
niektórych
spośród
wiodąco-
zoptymalizowanych IgG4 z rekombinowaną, znakowaną do oczyszczenia,
zewnątrzkomórkową domeną receptora GM-CSF. Powinowactwo przeciwciał
było znacznie poprawione, z obliczonymi wartościami K D wynoszącymi od 0,127
nM do około 5 nM. Dane przedstawiono w Tabeli 2. Poprawy uzyskano w
szybkościach przyłączania (ang. on-rates) i szybkościach uwalniania (ang. offrates).
Korelacja
między
powinowactwem
IgG4
wobec
rozpuszczalnej
zewnątrzkomórkowej domeny GM-CSFR α i ich wynikami w teście TF-1 była
bardzo dobra, ze współczynnikiem Pearsona wynoszącym 0,85 (p<0,0001).
Poprzez porównanie, KD 2B7 obliczono oddzielnie i przedstawiono jako
wynoszącą około 7 nM.
[0167] Przeciwciała IgG4, zidentyfikowane podczas optymalizacji 28G5,
oceniono w teście zmiany kształtu ludzkich granulocytów i porównano do
znanego przeciwciała mysiego, 2B7. Wszystkie spośród przeciwciał ocenionych
w tym teście (przeciwciała 1, 2, 5, 6, 9-11, 16 i 20) były bardzo silne, z IC50
mieszczącymi się w zakresie od 7,8 do 90 pM.
[0168] Spośród tych przeciwciał 1, 2, 5, 6, 9, 16 i 20 miały IC50 niższe niż 50
pM, a przeciwciała 1, 2, 6, 16 i 20 miały IC50 niższe niż 25 pM. Nasze
przeciwciała były silniejsze niż 2B7, które miało IC50 wynoszące 477pM. Dane
przedstawiono w Tabeli 3. Figura 4 ilustruje siłę antagonistyczną dwóch
reprezentatywnych przeciwciał według wynalazku, Przeciwciała 1 i Przeciwciała
55
EP 1 999 152B1
6, w porównaniu ze znanym przeciwciałem 2B7 w teście zmiany kształtu
ludzkich granulocytów.
[0169] Przeciwciała IgG4, zidentyfikowane podczas optymalizacji 28G5,
oceniano w teście zmiany kształtu granulocytów cynomolgus. Wszystkie
przeciwciała były zdolne do zobojętniania aktywności GM-CSF na receptorze
cynomolgus, jak również na receptorze ludzkim i wszystkie przeciwciała były
silniejsze niż 2B7. 2B7 miało IC50 wynoszące 26 pM, podczas gdy
reprezentatywne przeciwciała (Przeciwciało 6, Przeciwciało 1 i Przeciwciało 2) z
panelu miały wartości IC50 wynoszące 1,73, 2,03 i 3,2 pM, odpowiednio.
[0170] Panel IgG4, zidentyfikowanych podczas optymalizacji 28G5, oceniano
pod kątem ich siły zobojętniania w teście uwalniania TNFα przez monocyty. Ten
test bada zdolność hamowania uwalniania czynnika prozapalnego, TNFα, z
ludzkich monocytów, gdy są one poddane działaniu GM-CSF. Testowano
przeciwciała 1, 2, 5, 6, 9 i 10 i wszystkie były w tym teście aktywne i zdolne do
pełnego zobojętniania działania GM-CSF na jego receptor (IC50 mieszczące
się w zakresie od około 43 do 139), podczas gdy w stężeniu 333nM 2B7 mogło
osiągnąć jedynie 50% hamowanie uwalniania TNFα indukowanego przez GMCSF wskazując, że to przeciwciało jest w tym teście jedynie częściowym
inhibitorem. Figura 5 ilustruje siłę antagonistyczną dwóch reprezentatywnych
przeciwciał według wynalazku, w porównaniu ze znanym przeciwciałem 2B7 w
teście uwalniania TNFα przez monocyty. Dane przedstawiono w Tabeli 4 poniżej
i podsumowano następująco:
<150 pM
Przeciwciała nr. 1, 2, 5, 6, 9 i 10
<110 pM
Przeciwciała nr. 1, 2, 5, 6 i 9
<100 pM
Przeciwciała nr. 1, 5, 6 i 9
[0171]Oznaką choroby zapalnej jest zwiększona przeżywalność typów komórek
zapalnych w odpowiedzi na poszczególne sygnały. Granulocyty mogą przeżyć
dłużej w obecności GM-CSF, a więc zdolność przeciwciał IgG4 izolowanych
podczas optymalizacji 28G5 do hamowania tej odpowiedzi została oceniana w
teście przeżywalności granulocytów. Wszystkie z IgG4 anty-GM-CSFRα IgG4 z
prowadzonej optymalizacji były aktywne w tym teście, a reprezentatywne siły
56
EP 1 999 152B1
zobojętniania (IC50) wynosiły od 7,0 do 843,7pM. Jest to w przeciwieństwie do
znanego przeciwciała mysiego 2B7, które pozostało całkowicie nieaktywne aż
do
stężenia
83nM.
Figura
6
ilustruje
antagonistyczną
siłę
dwóch
reprezentatywnych przeciwciał według wynalazku, Przeciwciało 1 i Przeciwciało
6, w porównaniu ze znanym przeciwciałem 2B7 w teście przeżywalności
granulocytów.
[0172] Niniejsze dane, jak to zilustrowano na Figurach 3 do 6, wskazują, że
przeciwciała mają znacząco różne właściwości w porównaniu ze znanym
przeciwciałem mysim 2B7. Na przykład, przeciwciała reprezentatywne według
wynalazku hamowały przeżywalność granulocytu oraz proliferację TF1
stymulowaną odpowiednio 7 pM GM-CSF w przeżywalności granulocytu oraz w
teście proliferacji TF1, podczas gdy 2B7 nie hamowało przeżywalności
granulocytu, ale hamowało proliferację TF1 (choć w mniejszym stopniu, niż
nasze przeciwciała). Dane wskazują, że elementy wiążące według wynalazku
mają większe powinowactwo i lepszą zdolność do hamowania różnych efektów
biologicznych przenoszonych przez GM-CSF-R w porównaniu ze znanymi
przeciwciałami anty-GM-CSFRα.
[0173] Wyprowadzona sekwencja aminokwasowa 28G5 i jej pochodne zostały
wyrównane ze znanymi sekwencji ludzkiej linii komórek rozrodczych w bazie
danych VBASE i najbliższą linią komórek rozrodczych zidentyfikowano poprzez
podobieństwo sekwencji. Najbliższa linia komórek rozrodczych dla domeny VH
28G5 i jej pochodnych została określona jako VH1 DP5. 28G5 VH posiada 14
różnic w stosunku do linii komórek rozrodczych VH 1-24 (DP5) w regionach
zrębowych. Najbliższą linią komórek rozrodczych dla domeny V L jest VLambdal
VL 1-e (DPL8), która posiada jedynie 5 różnic w stosunku do linii komórek
rozrodczych w regionach zrębowych. Regiony zrębowe 28G5 i jej pochodnych
zostały wprowadzone ponownie do linii komórek rozrodczych w wyniku
mutagenezy ukierunkowanej w celu identycznego dopasowania natywnych
przeciwciał ludzkich. Wszystkie za wyjątkiem jednego aminokwasu mogą być
przekształcone w linię komórek rozrodczych jedynie z niewielkimi zmianami w
sile przeciwciała. Aminokwas izoleucyna w pozycji 94 ciężkiego łańcucha
(stosując numerację Kabat'a, Kabat et al. 1971) nie mógł być zmieniony w
57
EP 1 999 152B1
treoninę wyprowadzoną z linii komórek rozrodczych bez całkowitej utraty
aktywności. Ta pojedyncza różnica w stosunku do linii komórek rozrodczych
została tym samym utrzymana w rejonie zrębowym przeciwciała.
[0174] Pełna analiza pA2 dwóch z przeciwciał anty-GM-CSFRα, Przeciwciała 6 i
Przeciwciała 1, została przeprowadzona w teście proliferacji TF-1. Dane
potwierdzają, że niniejsze przeciwciała są antagonistami o wysokiej sile w tym
systemie z obliczonymi wartościami pA 2 równymi odpowiednio -11,3±0,2 i
-11,0±0,2 (Figura 1).
[0175] Pełna analiza pA2 jednego z przeciwciał anty-GM-CSFRα, Przeciwciała
6, została przeprowadzona w testach zmiany kształtu granulocytu ludzkiego i
cynomolgus. Dane potwierdzają, że niniejsze przeciwciała są antagonistami o
wysokiej sile w tych systemach z obliczonymi wartościami pA 2 równymi
odpowiednio -10,58 i -10,78 w testach ludzi i cynomolgus (Figura 2).
[0176]
GM-CSF
stymuluje
różnicowanie
krwiotwórczych
komórek
progenitorowych w kolonie granulocytów i makrofagów w testach agaru
półpłynnego. Przeciwciała 6 i Przeciwciała 1 o dojrzałym powinowactwie,
macierzyste Przeciwciało mAb 3 (28G5) oraz kontrola negatywna (CAT001)
zostały dlatego ocenione pod kątem zdolności antagonizowania takiej
konkretnej
aktywności
pochodzących
z
krwi
GM-CSF
przy użyciu
obwodowej,
w
komórek
teście
progenitorowych
tworzenia
kolonii.
Dane
przedstawione na Figurze 7 pokazują, że obydwa reprezentatywne mAb o
dojrzałym powinowactwie były in vitro silnymi inhibitorami tworzenia kolonii
krwiotwórczej pośredniczonego przez ludzki GM-CSF.
[0177] Przybliżone wartości IC50 wynosiły 0,08 µg/ml (Przeciwciało 6) i 0,25
µg/ml (Przeciwciało1) dla mAb o dojrzałym powinowactwie. Co ciekawe, znane
przeciwciało mysie 2B7 wykazało niewielką lub żadną aktywność hamującą w
niniejszym teście, aż do stężenia 66nM.
[0178] W kontrolnych doświadczeniach mAb o dojrzałym powinowactwie nie
miały wpływu na tworzenie kolonii zależnej od kombinacji SCF + IL-3 + G-CSF,
jak
oczekiwano
oraz
w
nieobecności
cytokin
tworzenie
kolonii
było
zaniedbywalne (< 4 kolonie/hodowla).
58
EP 1 999 152B1
[0179] Do analizy in vivo mAb specyficznego względem huGM-CSFRα
antagonistycznej aktywności, przeszczepienie szpiku kostnego z myszy Tg
ekspresjonujących oba łańcuchy α i β ludzkiego GM-CSF do myszy typu
dzikiego można zastosować do wytworzenia zwierząt chimerycznych tak, że
ekspresja transgenicznego huGM-CSFR jest ograniczona do szpiku kostnego
pochodzącego z komórek hematopoetycznych i zatem bardziej przypomina
profil ekspresji endogennego receptora. W tych Tg chimerycznych myszach
podawanie huGM-CSF prowadzi do wzrostu masy śledziony i marginalizacji
obiegu monocytów krwi. Przeciwciało 6 o dojrzałym powinowactwie a
negatywną kontrolę mAb, CAT001 oceniono pod względem ich zdolności do
antagonizowania odpowiedzi zależnych od GM-CSF. Do analizy dawkaodpowiedź 6 grup po 5 Tg chimerycznych myszy traktowano 500 ng huGM-CSF
podskórnie dwa razy dziennie przez 4 dni (dzień 1-4) a siódma grupa kontrolna
składająca się z pięciu zwierząt otrzymała jedynie PBS. Cztery z 6 grup
zwierząt traktowanych huGM-CSF otrzymały testowe mAb (Przeciwciało 6) w
ilości 16 mg/kg, 5,3 mg/kg, 1,78 mg/kg lub 0,59 mg/kg w D.0, podczas gdy
grupa piąta zwierząt traktowanych huGM-CSF otrzymała kontrolne CAT001 w
ilości 16 mg/kg w D.0. Wyniki przedstawione na Figurze 8 pokazują, że w
porównaniu do kontrolnego PBS, traktowanie huGM-CSF indukowało znaczny
wzrost masy śledziony i obniżenie liczby krążących monocytów krwi. Jak
oczekiwano, traktowanie 16 mg/kg kontrolnego CAT001 nie miało wpływu ani
na wzrost masy śledziony ani na obniżenie liczby krążących monocytów krwi.
Przeciwnie, był wyraźny efekt dawka-odpowiedź po traktowaniu testowym mAb
Przeciwciałem 6, ponieważ przy 16 mg/kg przeciwciało zniosło wzrost masy
śledziony i jednocześnie widoczny wpływ był znacznie obniżony przy 0,59
mg/kg mAb. IC50 wydaje się być gdzieś pomiędzy 0,59 mg/kg i 1,78 mg/kg.
Podobny wynik zaobserwowano dla indukowanego GM-CSF obniżenia liczby
krążących monocytów - traktowanie testowym mAb Przeciwciałem 6 w ilości 16
mg/kg zniosło obniżenie, podczas gdy mAb w ilości 0,59 mg/kg ma jedynie
niewielki wpływ na tę odpowiedź. Te dane pokazują, że przeciwciało anty-GMCSFRα jest antagonistą ludzkiego GM-CSFRα in vivo.
59
EP 1 999 152B1
[0180] W celu dalszego badania własności przeciw-zapalnych przeciwciał antyGM-CSFRα, Przeciwciało 6 oszacowano w teście uwalniania cytokin przez
komórki jednojądrzaste krwi obwodowej. W tym teście TNFα i IL-6 mogą być
uwalniane endogennie w zależności od dawcy. W tym teście GM-CSF jest
również produkowany endogennie przez komórki, raczej niż dodawany
egzogennie i zatem wyniki obserwowane w tym teście reprezentują hamowanie
biologicznego wpływu natywnego endogennego wiązania GM-CSF do jego
receptora.
[0181] Po podawaniu przeciwciała 6 obie cytokiny były hamowane zależnie od
dawki, jak zilustrowano na figurze 9. Dane te wskazują, że te przeciwciała mogą
hamować
aktywność
przekazywania
sygnału
natywnego
GM-CSF
GM-CSF
można
i
że
hamować
poprzez
hamowanie
kluczowe
cytokiny
prozapalne takie, jak IL-6 i TNFa, z których obie są zaangażowane w wiele
chorób zapalnych takich jak reumatoidalne zapalenie stawów.
[0182] Ponadto, w oparciu o ten wynik dla Przeciwciała 6, można oczekiwać, że
każde z przeciwciał 1 do 20 będzie wykazywało hamowanie w tym teście,
ponieważ uważa się, że wszystkie przeciwciała 1 do 20 wiążą ten sam region
GM-CSFRa.
Mapowanie Reszt Istotnych w Rozpoznawaniu Antygenu, oraz Analiza
Sekwencji
[0183] Ustaliliśmy zmienność reszt na pozycjach w sekwencji Przeciwciała 6
scFv wprowadzonej do linii komórek rozrodczych w celu określenia pozycji,
które są w normalnych warunkach zachowywane do wiązania ligandu i pozycji,
które są zmienne w przeciwciele, które wciąż zachowuje aktywność wiązania
ligandu.
[0184] Pozycjami, które biorą udział w wiązaniu antygenu okazały się reszty
Kabat'a 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 oraz 96 w domenie VL oraz
reszty Kabat'a 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 i 100B w domenie VH.
[0185] Określono siedem pozycji, które wydają się ważne dla wiązania
antygenu: H95, H97, H99, H100B, L90, L92 i L96. Zanalizowaliśmy następnie
reszty w tych pozycjach w sekwencjach 160 wariantów wyizolowanych podczas
60
EP 1 999 152B1
procesu optymalizacji przeciwciał 28G5, z których wszystkie wykazały minimum
5-krotny wzrost siły w teście proliferacyjnym TF-1.
[0186] Dane w Tabeli 5 poniżej obejmują różne aminokwasy (z 20 możliwych),
które stwierdzono w każdej z tych pozycji, oraz w L95A. Gdzie pozycje są silnie
zachowywane w stosunku do aminokwasów obecnych w 28G5 i/lub
Przeciwciele 6, są dobrym dowodem na to, że te aminokwasy są kluczowe w
wiązaniu antygenu. Na przykład, reszty na następujących pozycjach są silnie
zachowywane: H97, H100B, L90, L92.
Sposób
[0187]
Sekwencja
powinowactwie
i
DNA
kodująca
wprowadzone
Przeciwciało
do
linii
6
komórek
scFv
o
dojrzałym
rozrodczych
została
przekształcona do formatu prezentacji rybosomów, zasadniczo w sposób
opisany w ref. [101]. Na sekwencji Przeciwciała 6 wykonano PCR podatny na
błędy, w warunkach wysoce mutagennych (7,2 mutacji na 1,000 bp) według
protokołu producenta (BD Bioscience), w celu utworzenia biblioteki wariantów
sekwencji 574D04 zawierających losowe mutacje punktowe. Bibliotekę
poddano ekspresji na rybosomach i inkubowano z GM-CSFRα znaczonym do
oczyszczania by umożliwić wiązanie. Warianty, które mogą wiązać się ze
znaczonym GM-CSFRα zostały wychwycone i usunięte przy użyciu kulek
paramagnetycznych pokrytych białkiem G (Dynal). Niezwiązane warianty
pozostające w populacji dodano do puli czterech biotynylowanych przeciwciał
anty-idiotypowych, które zostały wcześnie pozyskane z dużej fagowej biblioteki
prezentowanych ludzkich przeciwciał, opisanych w odn. [102] i znanych z
wiązania się do Przeciwciała 6 scFv. Warianty związane przez biotynylowane
przeciwciała
anty-idiotypowe
zostały
wychwycone,
przy
pomocy
kulek
streptoawidynowych a niezwiązane warianty zostały wypłukane. Proces ten
powtórzono w dwóch kolejnych cyklach selekcji prezentacji rybosomalnej,
stosując ogólną metodologię z odn. [101]
[0188] Warianty w odpowiednich proporcjach z uzysków selekcyjnych zostały
wklonowane do wektora fagmidowego a warianty scFv poddano ekspresji przy
użyciu faga do testów ELISA, przy użyciu tego samego sposobu jak opisano
przez Edwards BM et al (2003) Journal of Molecular Biology Vol 334:103. Te
61
EP 1 999 152B1
warianty,
które
nie
wykazują
wiązania
z
GM-CSFRα znaczonym
do
oczyszczania zostały sprawdzone pod kątem wiązania z pulą czterech antyidiotypowych przeciwciał, których używa się w selekcji. Warianty, które w antyidiotypowym teście wiązania, wykazywały wiązanie równe lub większe niż
Przeciwciało 6 scFv zostały sekwencjonowane, a sekwencje zanalizowano w
celu odszukania pozycji, w których występowała wysoka częstotliwość mutacji.
[0189] Na podstawie 486 sekwencji łańcucha VH i 451 łańcucha VL
stwierdzono, że średnia częstość mutacji wariantów populacji wynosi 3,05
aminokwasu na VH lub VL. Analizowano je pod kątem gorących punktów
mutacji sporządzając wykres zależności częstości mutacji od ich pozycji na
scFv. Analiza skupiła się na klonach z co najmniej jedną mutacją CDR na VH i
VL i mniej niż 4 mutacjami na VH i VL. Z panelu zawierającego 123 sekwencji
VH and 148 VL określono gorące punkty jako te, które miały częstość mutacji
5% lub więcej.
[0190] Przy użyciu sposobu negatywnej selekcji prezentacji rybosomalnej
określono siedem prawdopodobnych pozycji w obrębie VHCDR3 i VLCDR3
Przeciwciała 6 ważnych dla wiązania antygenu. Wykonano następnie analizę
na 160 wariantach sekwencji wyizolowanych w trakcie procesu optymalizacji
przeciwciał 28G5, w której całe sekwencje VHCDR3 i VLCDR3 randomizowano
i wyselekcjonowano pod kątem wyższego powinowactwa. Wszystkie sekwencje
(włączając Przeciwciało 6) są wariantami 28G5, które wykazały minimum 5krotny wzrost siły w teście proliferacyjnym TF-1.
Ustalenie Epitopu Liniowego
[0191] Przy użyciu sposobu PEPSCAN, przebadaliśmy Przeciwciało 6 i znane
przeciwciało 2B7 przeciwko 2442 peptydom, z których każdy reprezentuje
krótkie obszary sekwencji aminokwasowej z zewnątrzkomórkowej części GMCSFR-α. Sygnały wiązania dla każdego z przeciwciał przeciwko wszystkim
peptydom zostały uśrednione w celu ustalenia uśrednionego sygnału tła i dla
każdego peptydu obliczono stosunek sygnału/tła. Zarówno dla Przeciwciała 6 i
2B7 stosunek sygnału/tła cztery lub większy był liczony jako specyficzny,
dodatni sygnał. Sekwencje peptydów dające specyficzny dodatni sygnał były
analizowane dla konserwowanych motywów wiążących i stwierdzono, że
62
EP 1 999 152B1
Przeciwciało 6 wiązało się preferencyjnie z motywem YLDFQ odpowiadającym
resztom 226 do 230 dojrzałego ludzkiego GM-CSFRα, a przeciwciało 2B7
wiązało się preferencyjnie z motywem DVRI odpowiadającym resztom 278 do
281 dojrzałego ludzkiego GM-CSFRα. Numeracja sekwencji aminokwasowej
dojrzałego receptora jest przestawiona w SEQ ID NO: 206.
Sposób PEPSCAN (test wiązania peptydów)
[0192] Nakładające się 15-merowe syntetyczne peptydy o sekwencjach
pozyskanych z GMCSF zostały zsyntetyzowane i poddane testowi przy użyciu
kart mini-PEPSCAN w formacie kart kredytowej (płytka 455-dołkowa z dołkami
3 ul) jak to opisane wcześniej [103]. Wiązanie przeciwciał do każdego z
peptydów było testowane przy użyciu immunoenzymatycznego testu opartego o
PEPSCAN. Karty o 455 studzienkach w formacie kart kredytowych, zawierające
kowalencyjnie połączone peptydy, inkubowano z próbką (na przykład 10 ug/ml
przeciwciała lub serum rozcieńczonego 1/1000 roztworem PBS, zawierającym
5% serum końskiego (o/o) i 5% owalbuminy jaja kurzego (c/o)) oraz 1%
Tween80 a w przypadku łagodnego blokowania, w roztworze PBS z 4%
końskiego serum (o/o) i 1% Tween80 (4°C, przez noc). Po płukaniu, peptydy
inkubowano z przeciwciałem przeciwko peroksydazie (rozcieńczenie 1/1000,
na przykład królicze przeciwciało przeciwko
mysiej peroksydazie, Dako) (1
godz, 25°C), a następnie po płukaniu dodano substrat peroksydazy sulfonian
2,2'-azyno-di-3-etylobenotiazoliny i 2 ul/ml 3% H2O2. Po 1 godz. zmierzono
wywoływanie koloru. Wywoływanie koloru testu ELISA zostało określone przy
użyciu kamery CCD i systemu przetwarzającego obraz. Układ składa się z
kamery CCD i 55 mm soczewek (kamera wideo Sony CCD XC-77RR, Nikon
micro-nikkor 55 mm f/soczewka 2,8), adaptera kamery (adaptery Kamery Sony
DC-77RR) oraz zestaw Oprogramowania do Przetwarzania Obrazów Optimas,
wersja 6,5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, USA) Optimas działa
w systemie komputerowym pentium.
Testowe Materiały i Sposoby
Biochemiczny test wiązania liganda
[0193] Oczyszczone preparaty scFv otrzymywano jak opisano w Przykładzie 3
z W001/66754 [104]. Stężenia białek z oczyszczonych preparatów scFv
63
EP 1 999 152B1
określano
stosując
sposób
BCA
[105].
96-dołkowe
płytki
do
mikromiareczkowania Fluoronunc™ powlekano przez noc w 4°C 50µl/dołek
anty-ludzkiego IgG4, rozcieńczonego do 2,5µg/ml w PBS. Płytki przemywano 3
razy 300µl/dołek PBS/0,1% Tween-20 przed blokowaniem przez 1 godzinę w
temperaturze pokojowej za pomocą 300µl/dołek 3% BSA w PBS. Płytki
ponownie przemywano 3 razy 300µl/dołek PBS/0,1% Tween-20, a następnie do
każdego dołka dodawano 50µl ludzkiego GM-CSFRα, rozcieńczonego do
62,5ng/ml w 1% BSA/PBS, a płytki inkubowano przez 1 godzinę w
temperaturze pokojowej. Po przemywaniu 3 razy, jak opisano powyżej, do
każdego dołka dodawano 25µl próbki materiału, po czym 25µl biotynylowanego
GM-CSF, rozcieńczonego do 2nM w 1% BSA/PBS. Aby określić łączne
wiązanie, jako próbkę materiału stosowano jedynie bufor. Aby określić wiązanie
niespecyficzne, jako próbkę materiału stosowano nieoznakowany GM-CSF,
rozcieńczony do 100nM w 1% BSA. Płytki inkubowano przez 1 godzinę w
temperaturze pokojowej przed przemywaniem 3 razy, jak opisano powyżej. Do
każdego dołka płytki dodawano 50µl streptawidyny znakowanej europem
(PerkinElmer), rozcieńczonej do 100ng/ml w buforze testowym DELFIA™ i
inkubowano przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej przed przemywaniem
7 razy buforem płuczącym DELFIA ™. Do płytek dodawano 50µl/dołek roztworu
wzmacniającego DELFIA™ i próbki odczytywano na czytniku płytek przy 615nm.
Test proliferacji TF-1
[0194] Komórki TF-1, uzyskane od R&D Systems i stale utrzymywane w RPMI
1640, 10% FBS, 1mM pirogronian sodu i 4ng/ml GM-CSF, głodzono przez
przemywanie 3 razy w pożywce testowej (RPMI 1640, 5% FBS, 1mM
pirogronian sodu), zawieszano w pożywce testowej i inkubowano przez 7-24
godzin w 37°C w 5% CO 2. Następnie komórki zawieszano do 1x10 5/ml w
pożywce testowej i do każdego dołka 96-dołkowej płytki płaskodennej do
hodowli tkankowych dodawano 100µl. Próbki testowe otrzymywano przez
sterylne filtrowanie próbki podstawowej przed rozcieńczaniem w pożywce
testowej. Następnie 50µl materiału testowego dodawano do każdego dołka z
komórkami i inkubowano je przez 45-60 min. w 37°C w 5% CO 2. Następnie do
każdego dołka dodawano 50µl GM-CSF, rozcieńczonego do wartości EC 80 w
64
EP 1 999 152B1
pożywce testowej (lub 0.4ng/ml dla niektórych partii GM-CSF) i inkubowano
płytki przez 16 godzin w 37°C w 5% CO 2 w nawilżonej komorze. To stanowi
końcowe stężenie wynoszące 7 pM GM-CSF. W celu zmierzenia proliferacji
komórek, do każdego dołka płytki dodawano 20µl 3H-tymidyny, rozcieńczonej
do 5,0µCi/ml w pożywce testowej i płytki inkubowano przez 4 godziny ± 30 min.
w 37°C w 5% CO2. Następnie komórki zbierano na 96 dołkowe płytki GF/C
Unifilter™, stosując urządzenie do zbierania z płytek, i przemywano. Po dodaniu
50µl MicroScint 20™ do każdego dołka płytki filtracyjnej, płytki uszczelniano i
zliczano na czytniku płytek TopCount.
Test zmiany kształtu ludzkich granulocytów
[0195] Ludzkie kożuszki leukocytarne (paczkę ludzkiej krwi ze służby Blood
Transfusion) mieszano w równej objętości 3% Dextranu T-500 w 0,9% NaCl.
Następnie mieszaninę inkubowano w pozycji odwróconej do czasu utworzenia
granicy faz. Warstwę górną zbierano i układano w postaci warstwy na wierzchu
gradientu gęstości histopaque 1,077, który następnie wirowano przy 400g przez
40 minut i pozwalano na zatrzymanie bez hamowania. Górne warstwy tego
gradientu usuwano, pozostawiając osad z granulocytów. Jakiekolwiek erytrocyty
pozostające w osadzie poddano lizie przez zawieszanie komórek w 20ml
lodowato zimnej wody przez 30 sek., po czym natychmiast dodawano
lodowatego, 1,8% chlorku sodu. Następnie komórki granulowano przy 1200rpm
i zawieszano w pożywce testowej (RPMI1640, 10% FBS, 100u/ml Penicylina,
100µg/ml streptomycyna, 25 mM HEPES) do ilości 1x10 6/ml. Następnie, 100µl
komórek dodawano do każdego dołka 96-dołkowej, płaskodennej płytki do
hodowli tkankowych. Próbki testowe otrzymywano przez sterylne filtrowanie
próbek podstawowych i odpowiednie rozcieńczanie w pożywce testowej.
[0196] Dla wstępnej izolacji, 50µl próbki testowej dodawano następnie do
komórek i płytki inkubowano przez 45-60 min. w 37°C w 5% CO 2. To stanowi
końcowe stężenie wynoszące 7 pM GM-CSF. Po tym następowało dodawanie
do każdego dołka 50µl GM-CSF rozcieńczonego do 0,4ng/ml w pożywce
testowej i 4 godziny inkubacji w 37°C w 5% CO 2 w nawilżonej komorze.
[0197] Dla wstępnej optymalizacji mieszano przefiltrowane IgG4, rozcieńczone
w pożywce testowej, z równą objętością GM-CSF w 0,4ng/ml w pożywce
65
EP 1 999 152B1
testowej. To stanowi końcowe stężenie wynoszące 7 pM GM-CSF. Następnie,
do każdego dołka dodawano 100µl mieszaniny przeciwciało/GM-CSF. Po tym
następowała 3 godzinna inkubacja w 37°C w 5% CO 2 w nawilżonej komorze.
[0198] Dodawano zimnego formaldehydu do końcowego stężenia 1,25%, a
komórki utrwalano przez noc w 4°C. Za pomocą cytometrii przepływowej
analizowano 2000-5000 zdarzeń na dołek. Następnie, z zastosowaniem
CellQuest,
dla
każdej
próbki
wyprowadzano
średnią
geometryczną
z
przedniego detektora światła rozproszonego (FSC). Podczas zliczania średniej
geometrycznej komórki bramkowano, aby wykluczyć nieistotne populacje (np.
komórki martwe/szczątki).
Test zmiany kształtu granulocytów cynomolgus
[0199] Przeciwciała oceniano w teście mierzącym zmiany kształtu granulocytów
cynomolgus po stymulacji przez GM-CSF. Granulocyty oczyszczano z całej krwi
cynomolgus, a test przeprowadzano zasadniczo jak opisano dla testu zmiany
kształtu ludzkich granulocytów.
Dane z powinowactwa wiązania z zastosowaniem analizy biosensorycznej
[0200] BIAcore 2000 System (Pharmacia Biosensor) zastosowano do oceny
parametrów kinetycznych oddziaływań między scFv i IgG4 z rekombinowanymi
receptorami. Biosensor stosuje efekty optyczne powierzchniowego rezonansu
plazmonowego do badania zmian w powierzchniowym stężeniu, wynikających z
oddziaływania cząsteczki analitu z cząsteczką liganda, która jest kowalencyjnie
przyłączona do matrycy dekstranowej. Zazwyczaj, cząsteczka analitu w wolnym
roztworze jest przepuszczana nad związanym ligandem, a wiązanie wykrywa
się jako wzrost miejscowego sygnału SPR. Po tym następuje okres
przepłukiwania, podczas którego obserwuje się dysocjację cząsteczek analitu w
postaci spadku sygnału SPR, po którym jakiekolwiek pozostałości analitu
odmywa się od liganda i powtarza procedurę w kilku różnych stężeniach analitu.
Zazwyczaj podczas eksperymentu stosuje się serie kontroli, aby upewnić się,
że nie zmieniła się znacząco ani całkowita zdolność wiązania, ani profil kinetyki
związanego liganda. Jako główny rozcieńczalnik próbek analitu i rozpuszczalnik
fazy dysocjacji stosuje się zazwyczaj własną sól fizjologiczną zbuforowaną
hepes-em (HBS-EP). Dane eksperymentalne rejestruje się w jednostkach
66
EP 1 999 152B1
rezonansu (bezpośrednio odpowiadających sygnałowi SPR) w odniesieniu do
czasu. Jednostki rezonansu są wprost proporcjonalne do rozmiaru i ilości
związanego analitu. Można następnie zastosować pakiet oprogramowania
BIAevaluation, aby ocenić stałą szybkości dla fazy dysocjacji (jednostki
szybkości dysocjacji s-1) i fazy asocjacji (jednostki fazy asocjacji M -1 s-1). Figury
te pozwalają następnie obliczać Stałe Powinowactwa Asocjacji i Dysocjacji.
[0201] Powinowactwo IgG4 szacowano stosując pojedynczy test, w którym
IgG4 było niekowalencyjnie wychwytywane przez aminową powierzchnię białka
A.
Następnie,
kolejno
przepuszczano
nad
IgG4
serie
rozcieńczeń
rekombinowanej, znakowanej do oczyszczenia, zewnątrzkomórkowej domeny
receptora GM-CSF, od 100 do 6,25nM. Molarność receptora obliczano z
zastosowaniem
stężenia
(Bradford)
i
oczekiwanej
masy
dojrzałego,
zmodyfikowanego potranslacyjnie polipeptydu (39,7 kDa). Każdy z dwóch
oddzielnych zestawów danych analizowano w identycznych formatach. Dane
skorygowane o komórkę referencyjną poddano dopasowaniu stosując model
Langimura 1:1 ustawiony na jednoczesne, łączne obliczanie szybkości asocjacji
i dysocjacji, z wartością Rmax ustawioną na łączną. Oceniano poziom IgG4
wychwyconego podczas każdego cyklu, aby upewnić się, że wychwycona ilość
pozostaje stała podczas całego eksperymentu. Dodatkowo, oceniano szybkość
dysocjacji
IgG4,
aby
określić
potrzebę
korekty
dla
przesunięcia
linii
podstawowej. Jednakże oba oddziaływania z białkiem A okazały się
wystarczająco powtarzalne i stabilne. Prawdziwość danych wymuszono
poprzez obliczone chi2 i wartość T (wartość parametru/przesunięcie), które
musiały być <2 i >100, odpowiednio.
[0202] Otrzymywanie znakowanej do oczyszczenia, zewnątrzkomórkowej
domeny
GM-CSFRα:
Wektor
ekspresyjny
pEFBOS
[106],
zawierający
sekwencję kodującą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego receptora α GMCSF (SEQ ID Nr: 205, reprezentująca aminokwasy od 1 do 298 dojrzałego GMCSF R) z mysią sekwencja sygnałową IL-3 i zawierającą N-końcowy znacznik
do
oczyszczania,
zastosowano
do
otrzymania
rekombinowanego,
znakowanego na N-końcu, polipeptydu zewnątrzkomórkowej domeny (ECD)
receptora
GM-CSF.
Znakowany
polipeptyd
ECD
ekspresjonowano
w
67
EP 1 999 152B1
komórkach CHO, stosując wektor pEFBOS, z zastosowaniem standardowych
procedur. Ten
polipeptyd
zewnątrzkomórkową
można
domenę
również
GM-CSFRα
określać
lub
jako
jako
oczyszczoną,
rozpuszczalną
zewnątrzkomórkową domenę GM-CSFRα.
[0203] Zastosować można jakikolwiek odpowiedni znacznik do oczyszczania,
np. peptyd Flag(DYKDDDE - SEQ ID Nr: 204), Fc, biotynę lub znacznik his.
Oczyszczanie można przeprowadzać stosując odpowiednie techniki, np.
polipeptyd ECD wyznakowany Flag (SEQ ID Nr: 203) można oczyszczać na
kolumnie M2 do chromatografii powinowactwa i wymywać peptydem FLAG.
Test uwalniania TNFα przez monocyty
[0204] Oczyszczanie monocytów (Zestaw do Oczyszczania Monocytów Miltenyi Biotec - 130-053-301):
Ludzkie kożuszki leukocytarne (paczkę ludzkiej krwi ze służby Blood
Transfusion) umieszczano w postaci warstwy na wierzchu gradientu gęstości
histopaque 1.077 (Sigma, Cat. Nr 1077-1), a komórki wirowano przy 400xg
przez 40 minut. Podczas zatrzymywania wirowania nie stosowano żadnego
hamowania. Następnie, z powierzchni zbierano komórki PBMC. Komórki
przemywano PBS i granulowano przy 300xg przez 10 min. zanim pozostałe
erytrocyty poddano lizie poprzez zawieszanie w 20ml lodowatej wody przez 15
sek., po czym natychmiast dodawano lodowatego, 1,8% NaCl. Następnie
komórki granulowano przy 1200rpm przez 5 min. i zawieszano w 600µl buforu
MACS (PBS, 2mM EDTA). Do komórek dodawano 200µl odczynnika
blokującego Fc, dostarczanego z zestawem, i mieszano przed dodawaniem
200µl koktajlu Hapten-przeciwciało (również dostarczanego z zestawem) i
mieszaniem. Następnie komórki inkubowano w 4°C przez 15 min. przed ich
dwukrotnym przemywaniem 50ml buforu MACS. Osad komórkowy zawieszano
w 600µl buforu MACS, następnie dodawano 200µl odczynnika blokującego Fc i
mieszano, następnie dodawano 200µl MACS z mikrokuleczkami anty-hapten i
mieszano. Komórki inkubowano przez 45 min. w 4°C przed przemywaniem
50ml buforu MACS i zawieszaniem w 500µl buforu MACS. Pojedynczą kolumnę
(Miltenyi Biotec 130-042-401) przygotowywano poprzez przemywanie 3ml
buforu MACS przed naniesieniem na kolumnę zawiesiny komórkowej. Strumień
68
EP 1 999 152B1
wypływający zbierano jako frakcję wzbogaconą w monocyty. Kolumnę
przemywano 2x3ml buforu MACS i zbierano strumień wypływający. Czystość
monocytów
standardowe
sprawdzano
sposoby
poprzez
cytometrii
barwienie
anty-CD14-PE,
przepływowej.
Ostatecznie,
stosując
komórki
zawieszano w ilości 4 x 106/ml w pożywce testowej (RPMI 1640, 10% FCS,
100U/ml penicyliny, 100µg/ml streptomycyny).
[0205] Stymulacja Monocytów:
50µl komórek dodawano do każdego dołka 96-dołkowej, płaskodennej płytki
Costar do hodowli tkankowych. Do wszystkich dołków dodawano 25µl z
150µg/ml rhIFNγ (R&D systyems). Mieszano przefiltrowane IgG4, rozcieńczone
w pożywce testowej, z równą objętością GM-CSF przy 56ng/ml (4nM) w
pożywce testowej. To stanowi końcowe stężenie wynoszące 1 nM GM-CSF.
Następnie, do każdego dołka dodawano 75µl mieszaniny przeciwciało/GM-CSF.
Kontrolami były dołki jedynie z GM-CSF lub bez GM-CSF i bez przeciwciała.
Następnie płytki inkubowano 18 godzin w 37°C z 5% CO 2 w nawilżonej
komorze. Następnie zbierano supernatant, aby testować pod kątem poziomów
TNF-α za pomocą ELISA.
[0206] TNFα ELISA (R&D Systems ELISA Development System DY210): Płytki
ELISA Fluoronunc Immunosorb pokryto na noc w temperaturze pokojowej 100µl
4µg/ml przeciwciała wiążącego w PBS. Płytki następnie przemyto trzy razy
PBS/0,1% Tween i blokowano 300µl/dołek 3 % Marvel w PBS przez 1 godzinę
w temperaturze pokojowej. Płytki przemyto 3 razy PBS/0,1 % Tween. 100µl
supernatantu z płytek testowych przeniesiono na płytkę ELISA i miano TNF-α
rozcieńczone w testowym podłożu dodano do dołków kontrolnych. Płytki
inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przed przemyciem 4-5
razy pBS/0,1% Tween. 100µl wykrywanego przeciwciała rozcieńczonego do
300 ng/ml w 1% Marvel PBS dodano do każdego dołka na płytce i płytki
inkubowano przez kolejne 2 godziny w temperaturze pokojowej przed
przemyciem 4-5 razy PBS/0,1% Tween. Streptawidynę-Europ (PerkinElmer
1244-360) rozcieńczono 1:1000 w testowym buforze DELFIA (PerkinElmer
4002-0010) i dodano 100µl/dołek przed inkubacją przez 45 minut w
temperaturze pokojowej. Płytki następnie przemyto 7 razy buforem do płukania
69
EP 1 999 152B1
przed dodaniem 100µl/dołek roztworu wzmacniającego (PerkinElmer 40010010) i odczytano przy 615 nm na czytniku płytek.
Test przeżywalności granulocytów
[0207] Komórki oczyszczono z ludzkiego kożuszka leukocytarnego, jak opisano
dla testu aktywacji neutrofili (test zmiany kształtu) przemyto podłożem testowym
(RPMI-1640
Glutamax,
10%
FBS,
100U/ml
penicylina,
100µg/ml
streptomycyna) i zawieszono 1 x 10 6/ml w podłożu testowym. 100µl komórek
dodano do każdego dołka 96-dołkowej płaskodennej płytki do hodowli
tkankowych Costar. Przefiltrowane zasoby przeciwciała rozcieńczono w podłożu
testowym i mieszano z równą objętością 0,4 ng/ml GM-CSF. Reprezentuje to
końcowe stężenie 7 pM GM-CSF. Dołki kontrolne zawierały samo podłoże lub
sam GM-CSF. 100µl testowej próbki/GM-CSF mieszano i następnie dodano do
każdego dołka na płytce i komórki inkubowano przez 68 godzin w 37°C/5% CO 2
w wilgotnej komorze. 20µl AlamarBlue dodano do każdego dołka i płytki
inkubowano przez kolejne 24 godziny w 37°C/5% CO 2 w wilgotnej komorze.
Płytki następnie odczytano przy 560 nm i 590 nm na czytniku płytek.
Analiza pA2 przeciwciał anty-GM-CSFRα w teście proliferacji TF-1 i w teście
zmiany kształtu granulocytów ludzkich i cynomolgus
[0208] Głównym narzędziem farmakologicznym do liczbowego wyrażenia
powinowactwa konkurujących antagonistów jest analiza Schild'a. Stosując to
podejście można określić niezależne od systemu środki do szacowania
antagonistycznego powinowactwa w teście funkcjonalnym. Sposób bazuje na
koncepcji, że stężenie antagonisty i jego powinowactwo określa antagonizm
odpowiedzi antagonisty. Ponieważ antagonizm można wyrazić liczbowo i
stężenie antagonisty jest znane, można określić powinowactwo antagonisty. Ten
antagonizm wyraża się liczbowo poprzez pomiar stosunku stężeń antagonistów
o równej aktywności, mierzony w obecności i nieobecności antagonisty, w
odniesieniu do stosunków dawki (DR).
[0209] Stosunki dawki można obliczyć poprzez stosunek EC50 agonisty
(typowo GM-CSF) w nieobecności elementu wiążącego do EC50 agonisty w
obecności pojedynczego stężenia elementu wiążącego. Stosunki dawki,
wyrażone jako log(DR-1) można następnie zastosować w liniowej regresji na
70
EP 1 999 152B1
log[element wiążący] do utworzenia regresji Schilda. Zatem, dla każdego
stężenia elementu wiążącego będzie odpowiadająca wartość DR; sporządzono
wykres jako regresję log(DR-1) od log[element wiążący]. Jeśli antagonizm jest
konkurencyjny, będzie liniowa zależność między log(DR-1) i log[element
wiążący] według równania Schilda, przy czym równanie jest następujące
[0210] W tych warunkach, wartość zero dla rzędnych da przecięcie osi x, gdzie
log [a] = log KA. Zatem stężenie elementu wiążącego, które tworzy log(DR-1) =
0 będzie równe do log K A, równanie stałej dysocjacji kompleksu element
wiążący-receptor. Jest to wyrażenie liczbowe niezależne od systemu dla
powinowactwa elementu wiążącego, które powinno być dokładne dla każdego
systemu komórkowego obejmującego receptor.
[0211] Ponieważ wartości KA otrzymano z wykresu logarytmicznego, one są log
rozkładu normalnego. Ujemny logarytm tego szczególnego stężenia określono
empirycznie jako pA2, stężenie antagonisty, który produkuje dwukrotne zmiany
krzywej dawka agonisty - odpowiedź. Siłę antagonisty można wyrazić liczbowo
poprzez obliczenie pA2 z pojedynczego stężenia antagonisty produkującego
pojedynczą wartość dla stosunku dawki z równania, w którym
[0212] [a] = stężenie molowe antagonisty, które czyni koniecznym podwojenie
stężenia agonisty do wywołania pierwotnej submaksymalnej odpowiedzi.
[0213] DR = stosunek dawki wyrażony liczbowo poprzez pomiar stosunku
stężeń o równej aktywności agonisty mierzony w obecności i nieobecności
antagonisty.
[0214] pA2 można obliczyć z danych testu dawka-odpowiedź.
Hamowanie różnicowania progenitorowych komórek krwi w kolonii zależnego
od GM-CSF in vitro
[0215]
Jednojądrzaste
komórki
krwi
obwodowej
wzbogacone
hematopoetycznymi komórkami progenitorowymi otrzymano od dawców, którzy
przeszli mobilizację komórek progenitorowych i aferezę, jako część ich
standardowego postępowania klinicznego. Próbki pozbawiono identyfikacji i nie
krioprezerwowano ich przed zastosowaniem. 5x10 4 jednojądrzastych komórek
71
EP 1 999 152B1
hodowano w pół-stałym agarze [017] w obecności ludzkiego GM-CSF o
końcowym stężeniu 10 ng/ml. Testowe ludzkie mAb o dojrzałym powinowactwie
i znane przeciwciało mysie 2B7, dodano do hodowli w agarze o końcowym
stężeniu 10, 5, 1, 0,5, 0,1 lub 0,05 µg/ml. Macierzyste ludzkie mAb 28G5 i
dopasowana izotypowo negatywna kontrola ludzkiego mAb, CAT001, oceniono
w pojedynczym stężeniu 10 µg/ml. W celach kontroli mAb oceniono pod
względem ich zdolności do blokowania tworzenia kolonii stymulowanej
kombinacją SCF, IL-3 oraz G-CSF (Croker et al., 2004) i ich wpływu na
tworzenie kolonii w nieobecności cytokin. Tworzenie kolonii (agregaty >40
komórek) oceniono po 14 dniach inkubacji w 37°C w 10% C02 w powietrzu.
Kolonie unieruchomiono gluteraldehydem i zliczono stosując mikroskop
stereoskopowy przy powiększeniu 35X.
Hamowanie biologicznej aktywności GM-CSF in vivo ludzkich GM-CSFRαβ w
myszach transgenicznych
[0216] Utworzono transgeniczne (Tg) myszy ekspresjonujące zarówno łańcuch
α i następnie β ludzkiego GM-CSFR pod kontrolą promotora MHC klasy I i
opisano odpowiedzi in vivo śledziony i krwinek czerwonych na podawanie
huGM-CSF [108]. Do analizy in vivo mAb specyficznego względem huGMCSFRα antagonistycznej aktywności, przeszczepienie szpiku kostnego z myszy
Tg do myszy typu dzikiego można zastosować do wytworzenia zwierząt
chimerycznych tak, że ekspresja huGM-CSFRαβ jest ograniczona do szpiku
kostnego pochodzącego z komórek hematopoetycznych i zatem bardziej
przypomina profil ekspresji endogennego receptora. W tych huGM-CSFRαβ Tg
chimerycznych myszach podawanie huGM-CSF prowadzi do wzrostu masy
śledziony i marginalizacji liczby krążących monocytów krwi.
[0217] Tworzenie Tg myszy chimerycznych:
Kości udowe i golenie z Tg myszy dawców usunięto i szpik kostny wypłukano
sterylnym PBS plus 3% płodowej surowicy cielęcej (FCS, ang. fetal calf serum).
Wkładki szpiku kostnego sporządzono następnie za pomocą igły 23G, aby
uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, następnie komórki przemyto raz
zimnym PBS + 3% FCS i przepuszczono przez siatkę ze stali nierdzewnej.
Czerwone krwinki następnie usunięto przez lizę w 0,168 M buforze chlorku
72
EP 1 999 152B1
amonu, po czym komórki przemyto dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną
fosforanami (PBS) + 3% FCS przed kolejnym przepuszczeniem przez siatkę ze
stali nierdzewnej. Aby dalej usunąć martwe komórki i szczątki komórek
zawiesinę odwirowano przez podkładkę FCS. Żywotne komórki odzyskano w
osadzie, przemyto raz PBS i zawieszono w PBS w 2.5 x 10 7/ml. 5 do 8
tygodniowe myszy biorcy C57/BL6 napromieniowano śmiertelnie 2 dawkami
550 Radów w odstępie 3 godzin. Myszom biorcom wstrzyknięto dożylnie 0,2 ml
zawiesiny komórkowej (tj. 5 x 10 6 komórek/mysz) i następnie przetrzymywano
przez 3 tygodnie w zamykanych pudełkach z 0,02 M neomycyną w ich wodzie
do picia. Odtworzenie badano po 6 tygodniach poprzez analizę FACS krwi
obwodowej stosując specyficzne mAb względem łańcuchów huGMCSFRα and
β.
[0218] Traktowanie GM-CSF i kolejna analiza Tg myszy chimerycznych:
Tg chimeryczne myszy traktowano dwa razy dziennie drogą podskórną 500 ng
huGM-CSF przez 4 dni. Do analizy przeciwciał o antagonistycznej aktywności
grupom 5 myszy podawano wybrane dawki mAb (patrz poniżej) drogą
dootrzewnową 1 dzień przez zapoczątkowaniem leczenia GM-CSF. Dnia 5,
pobrano
0,2
ml
krwi do analizy populacji krążących
leukocytów,
w
szczególności monocytów krwi, z zastosowaniem Systemu Hematologicznego
ADVIA (Bayer Diagnostics). Zwierzęta następnie uśmiercono i śledziony
usunięto do pomiaru masy.
[0219] Hamowanie endogennie ekspresjonowanych ludzkich TNFa i IL-6 z
ludzkich
komórek
jednojądrzastych
krwi
obwodowej.
Ludzki
kożuszek
leukocytarny (paczkę ludzkiej krwi ze służby Blood Transfusion) na wierzchu
gradientu gęstości histopaque 1,077 (Sigma, Nr Kat. 1077-1) i komórki
odwirowano przy 400xg przez 40 minut. Nie zastosowano hamowania podczas
zatrzymywania wirówki. Komórki PBMC zebrano następnie z powierzchni.
Komórki przemyto PBS i granulowano przy 300xg przez 10 min. przed tym jak
pozostałe krwinki czerwone poddano lizie poprzez zawieszenie w 20 ml
lodowatej wody przez 15 sek, następnie natychmiastowe dodanie lodowatego
1,6% NaCl. Komórki następnie granulowano przy 1200 rpm przez 5 min. i
zawieszono w 10 ml 10% FBS/RPMI i 1% penicyliny streptomycyny. Następnie
73
EP 1 999 152B1
komórki rozcieńczono do 5 x 106/ml. 110µl komórek rozdzielono na dołek (5.5 x
105/dołek i pozwolono komórkom osiadać przez 1 godz. przy 37°C, 5% CO 2.
Następujące odczynniki dodano do pojedynczego końcowego stężenia kontroli;
PHA (5µg/ml), LPS (25µg/ml), GM-CSF (10ng/ml) i kontrola izotypowa
(50µg/ml). Przeciwciało 6 dodano do końcowego stężenia początkowego
50µg/ml z serią pięciokrotnego rozcieńczenia. Płytki następnie inkubowano
przez 72 godz. w 37°C, 5% CO 2. Supernatanty zebrano po 72 godz. i obliczono
poziomy TNFa oraz IL-6 z zastosowaniem następujących zestawów R&D
ELISA (hTNF-a R&D Duoset ELISA development system DY210 oraz hIL-6
R&D Duoset ELISA development system DY206). Test ELISA przeprowadzono
zgodnie z zaleceniami dostawcy.
Tabela 1: Hamowanie proliferacji komórek TF-1 indukowanej GM-CSF przez
przeciwciała IgG4 inne niż z linii komórek rozrodczych wyizolowanych z
optymalizacji 28G5. Proliferację komórek TF-1 zaindukowano pojedynczym
stężeniem GM-CSF w obecności wzrastającego stężenia przeciwciał IgG4.
Zmierzono wbudowanie mianowanej tymidyny i obliczono wartości IC50 dla
przeciwciał. Dane są reprezentatywne dla n≥3. Pokazano SEM (błąd
standardowy ze średniej).
IgG4
2B7
przeciwciało 1
przeciwciało 2
przeciwciało 4
przeciwciało 5
przeciwciało 6
przeciwciało 7
przeciwciało 8
przeciwciało 9
przeciwciało 10
przeciwciało 11
przeciwciało 12
przeciwciało 13
przeciwciało 14
przeciwciało 15
przeciwciało 16
przeciwciało 17
przeciwciało 18
IC50 ± SEM (pM)
1575 ± 490,5
5,3 ± 0,33
15,0 ± 4,71
48,0 ± 8,33
9,3 ± 5,39
0,97 ± 0,033
93,8 ± 24,6
34,5 ± 2,63
40,8 ± 7,15
55,3 ± 3,73
9,0 ± 1,0
246,3 ± 19,8
1106,0 ± 174,9
16,3 ± 4,9
163,8 ± 7,3
12,8 ± 3,3
14,3 ± 2,8
13,3 ± 3,4
74
EP 1 999 152B1
przeciwciało 19
przeciwciało 20
23,8 ± 4,3
9,8 ± 2,8
Tabela 2: Analiza kinetyczna przeciwciał innych niż z linii komórek rozrodczych
anty-GM-CSFRα IgG4 izolowanych podczas optymalizacji 28G5. Przeciwciała
IgG4 unieruchomiono na powierzchni chipa pokrytego białkiem A i
przeprowadzono serię oczyszczania znacznikiem GM-CSF Rα ECD rozszerzeń
do IgG4. Dane były obiektem dopasowania stosując warstwy Langmuira 1:1
jednoczesnego ka kd z poprawką na transport masowy.
IgG4
przeciwciało 1
przeciwciało 2
przeciwciało 4
przeciwciało 5
przeciwciało 6
przeciwciało 7
przeciwciało 8
przeciwciało 10
przeciwciało 12
przeciwciało 14
przeciwciało 15
przeciwciało 16
przeciwciało 17
przeciwciało 19
przeciwciało 20
KD (nM)
0,264
0,376
4,07
0,847
0,139
3,93
0,552
1,50
3,02
0,502
1,03
1,14
0,193
0,388
0,127
[0220] Dane dla przeciwciała 9 i 11 o przebiegu dwufazowym.
Tabela 3: Hamowanie zmiany kształtu ludzkich granulocytów indukowanego
GM-CSF przez przeciwciała IgG4 inne niż z linii komórek rozrodczych
wyizolowanych podczas optymalizacji 28G5. Ludzkie granulocyty potraktowano
pojedynczym stężeniem GM-CSF w obecności wzrastających stężeń
przeciwciał IgG4. Zmianę kształtu granulocytów zmierzono stosując cytometrię
przepływową i obliczono wartości IC50 dla przeciwciał.
IgG4
2B7
przeciwciało 1
przeciwciało 2
przeciwciało 5
przeciwciało 6
przeciwciało 9
IC50 ± SD (pM)
477 ± 491
12,6 ± 8,0
20,7 ± 11,0
30,0
13,3 ± 11,8
44,0
75
EP 1 999 152B1
przeciwciało 10
przeciwciało 11
przeciwciało 16
przeciwciało 20
62,0
90,0
16,0
7,8
Tabela 4: Hamowanie uwalniania TNPα przez monocyty indukowane GM-CSF.
Ludzkie monocyty potraktowano pojedynczym stężeniem GM-CSF w obecności
wzrastających stężeń przeciwciał IgG4 z linii komórek innych niż rozrodcze.
Zmierzono uwalnianie TNPα za pomocą ELISA i obliczono wartości IC50 dla
przeciwciał.
IgG4
przeciwciało 1
przeciwciało 2
przeciwciało 5
przeciwciało 6
przeciwciało 9
przeciwciało 10
IC50 ± SD (pM)
78,8 ± 54,6
103,3 ± 63,1
67,0
43,0 ± 19,7
74,0
139,0
76
EP 1 999 152B1
Tabela 5
RESZTA
Kabat'a
H95
H97
28G5
LIDER
V
V
S
s
Procentowe występowanie reszt
A
N
L
V
1,250
26,875
1,250
70,625
P
S
T
H
F
W
1,250
70,625
0,625
0,625
26,250
0,625
S
100,00
H99
H100B
L90
L92
L95A
L96
s
A
S
D
S
S
s
T
T
E
S
S
A
P
S
T
H
V
63,125
2,500
2,500
28,75
0,625
2,500
S
T
M
90,000
9,375
0,625
S
T
D
Q
E
M
2,500
0,625
91,875
1,875
2,500
0,625
G
P
S
T
N
D
Q
E
R
H
K
I
L
M
V
F
Y
9,375
1,250
45,000
3,125
6,250
6,875
5,625
4,375
3,125
4,375
2,500
1,250
1,875
0,625
0,625
0,625
3,125
A
P
S
T
I
L
M
V
1,250
26,250
43,750
1,250
17,500
0,625
1,250
8,125
EP 1 999 152B1
Klucz do Wykazu Sekwencji
[0221] W załączonym wykazie sekwencji, sekwencje kwasów nukleinowych i
aminokwasowych ("PRT") wymieniono dla 20 klonów przeciwciał, obejmujących
klon macierzysty i 19 klonów ze zoptymalizowanego panelu. Przeciwciała
ponumerowano Ab1
do Ab20.
Klon
macierzysty
jest
przeciwciałem
3,
reprezentowanym przez SEQ ID NR: 21-30 oraz SEQ ID NR: 211-212.
[0222] Następujący wykaz określa poprzez numery SEQ ID NR, w których
przedstawiono sekwencje wskazanych cząsteczek: (nt = sekwencja nukleotydowa;
aa = sekwencja aminokwasowa)
1 Przeciwciało 01 VH nt
2 Przeciwciało 01 VH aa
3 Przeciwciało 01 VH CDR1 aa
6 Przeciwciało 01 VL nt
7 Przeciwciało 01 VL aa
8 Przeciwciało 01 VL CDR1 aa
78
EP 1 999 152B1
79
EP 1 999 152B1
80
EP 1 999 152B1
81
EP 1 999 152B1
82
EP 1 999 152B1
83
EP 1 999 152B1
201 GM-CSFRα liniowa sekwencja reszt
202 sekwencja aminokwasowa pełnej długości ludzkiego GM-CSFRα
203 domena zewnątrzkomórkowa ludzkiego GM-CSFRα znakowana FLAG
204 peptyd FLAG
205 sekwencja aminokwasowa ludzkiej domeny zewnątrzkomórkowej GM-CSFRα
206 Dojrzały GM-CSFRα
84
EP 1 999 152B1
85
EP 1 999 152B1
251 VH FR1 aa
252 VH FR2 aa
253 VH FR3 aa
254 VH FR4 aa
255 VL FR1 aa
256 VL FR2 aa
257 VL FR3 aa
258 VL FR4 aa
[0223] Sekwencje nukleotydowe domeny VL przeciwciał 1 do 20 nie obejmują
kodonu gcg przedstawionego na 3' końcu w SEQ ID NR: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66,
76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186 oraz 196. Odpowiednio,
sekwencje aminokwasowe domeny VL nie obejmują C-końcowej reszty Ala (reszta
113) w SEQ ID NR: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147,
157, 167, 177, 187 oraz 197, odpowiednio. Reszta Ala113 i odpowiadający kodon
gcg nie były ekspresjonowane w Przeciwciałach 1 do 20. Porównanie napisanych
sekwencji z segmentami genu linii komórek rozrodczych, szczególnie JL2
wskazuje, że reszta Ala i odpowiadający kodon gcg nie tworzą części domeny VL.
[0224] Reszta Gly w pozycji 112 była obecna w ekspresjonowanych sekwencjach
ScFv i IgG. Jednakże, ta reszta nie jest obecna w sekwencjach segmentu j
ludzkiej linii komórek rozrodczych, która tworzy region zrębu 4 domeny VL, np.
JL2. Reszty Gly nie uważa się za część domeny VL.
[0225]
Aby
ekspresjonować
łańcuch
lekki
IgG,
zapewniono
sekwencję
nukleotydową kodującą lekki łańcuch przeciwciała, obejmującą pierwszy ekson
kodujący domenę VL, drugi ekson kodujący domenę CL i intron oddzielający
pierwszy ekson i drugi ekson. W normalnych warunkach, intron jest wycinany
przez komórkową maszynerię przetwarzającą mRNA, łącząc koniec 3' pierwszego
eksonu z końcem 5' drugiego eksonu. Zatem, gdy DNA posiadające wspomnianą
sekwencję nukleotydową ekspresjonowano jako RNA, pierwszy i drugi ekson
wycięto razem. Translacja RNA po splicingu tworzy polipeptyd obejmujący
86
EP 1 999 152B1
domenę VL oraz CL. Po splicingu, Gly w pozycji 112 jest kodowana przez ostatnią
zasadę (g) sekwencji zrębu 4 domeny VL i dwie pierwsze zasady (gt) domeny CL.
[0226] Sekwencjami domeny VL Przeciwciał 1 do 20 są SEQ ID NR: 186 do 246,
jak wskazano powyżej. Sekwencje nukleotydowe domeny VL kończą się cta, jako
kodon końcowy i Leu jest końcowym aminokwasem w odpowiadających
sekwencjach aminokwasowych domeny VL.
[0227] Sekwencje domeny VH oraz VL innych niż z linii komórek rozrodczych
Przeciwciała 6 przedstawiono w SEQ ID NR: 247-250, oprócz sekwencji domen
VH i VL z linii komórek rozrodczych przedstawionych w SEQ ID NR: 51, 52, 56,
57, 216 i 217.
Odnośniki
[0228]
1 Haman et al., Journal of Biological Chemistry 274(48) :34155-34163 1999
2 Nicola NA; Wycherley A; Boyd AW; Layton JE; Cary D; Metcalf D Blood, 82(6)
p1724-31 (1993)
3 Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)
4 Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188194
5 Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117
6 Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411418
7 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition,
2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press
8 Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of
Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th
edition 1999
9 Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics
and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company,
Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)
10 Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition
(April 1998) ISBN: 0471170828
87
EP 1 999 152B1
11 Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster
Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847
12 Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective
(Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press;
(December 2000), ISBN: 0198507089
13 Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools
and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11,
1999), ISBN: 1558605525
14 Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K.
15 Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N.. Combinatorial Library Design
and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery.
ISBN: 0-8247-0487-8
16 Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817
17 Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948
18 Chothia, et al. Science, 223,755-758 (1986)
19 Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824
20 Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723
21 Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995.
22 Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779-783
23 Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and
Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press.
24 Stemmer, Nature, 1994, 370:389-391
25 Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580
26 Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813
27 Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567
28 Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664
29
Bagshawe
K.D.
et
al.
(1991)
Antibody,
Immunoconjugates
and
Radiopharmaceuticals 4: 915-922
30 Robinson, J. R. ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,
Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
31 Ritz, S. A., M. J. Cundall, et al. (2002). Am J Respir Cell Mol Biol 27(4): 428-35.
32 Ritz, S. A., M. R. Stampfli, et al. (2002). Trends Immunol 23 (8) : 396-402.
88
EP 1 999 152B1
33 WOOLLEY, K.L., et al. (1995). Am J Respir Crit Care Med, 151, 1915-24.
34 Kotsimbos, A. T., M. Humbert, et al. (1997). J Allergy Clin Immunol 99(5): 66672.
35 Yamashita N. et al., Cell. Immunol 2002 oct; 219(2); 92-97
36 Ohta K., et al. J Allergy Clin Immunol. 1999 Nov; 104(5): 1024-30
37 Stampfli, M. R., R. E. Wiley, et al. (1998). J Clin Invest 102(9): 1704-14.
38 Cates, E. C., B. U. Gajewska, et al. (2003). J Allergy Clin Immunol 111 (5) :
1076-86.
39 CAMPBELL, I.K., et al. (1997) Annal Res Dis, 56, 364-368.
40 BISCHOF, R.J. , D. ZAFIROPOULOS, J.A. HAMILTON AND I.K. CAMPBELL
(2000) Clin Exp Immunol, 119, 361-367.
41 Campbell, I. K., M. J. Rich, et al. (1998). J Immunol 161(7): 3639-44.
42 Hamilton, J. A. (2002). Trends Immunol 23(8): 403-8.
43 YANG, Y.H. AND J.A. HAMILTON (2001) Arthritis Rheumatol, 44, 111-119
44 Cook, A. D., E. L. Braine, et al. (2001). Arthritis Res 3 (5) : 293-8.
45 Field, M. and L. Clinton (1993). The Lancet 342: 1244.
46 Firestein GS, Alvaro-Gracia JM, Maki R. 1990 J. Immunol may 1; 144(9): 334753
47 Leizer T, et al. 1990 Blood 1990 Nov 15; 76(10): 1989-96
48 Fiehn C, et al., Z Rheumatol 1992 May-Jun; 51 (3): 1221-126
49 de Vries, E.G., et al. (1991) Lancet, 338, 517-518.
50 Hazenberg BP, et al. Blood 1989 Dec; 74(8): 2769-70
51 Barnes and Hansel (2004). Lancet, 364:985-96.
52 Barnes, P.J. (2000). Chest, 117:10S-14S
53 McManus, T. E., et al (2005) American Thoracic Society Meeting, May 2005.
54 Vlahos, R., et al. (2005). "GM-CSF is a key pathogenic mediator in
experimental COPD." European Respiratory Society Meeting, Sept 2005
55 McQualter JL, et al. (2001) J Exp Med. 194: 873-82
56 Bagby GC Jr, et al. 1998 J. Clin Invest. 4: 1430-6.
57 Estrov Z, et al. (1986) Cancer Res. 46: 6456-61.
58 Barak Y, et al. 1981 Am J Hematol. 10: 269-75.
59 Gualtieri RJ, et al. 1988 Exp Hematol. 16:613-9.
89
EP 1 999 152B1
60 Suda T, et al. 1982 Leuk Res. 6: 43-53.
61 Gualtieri RJ, et al. 1989 Blood. 74: 2360-7
62 Largaespada DA, et al. (1996) Nat. Genet. 12: 137-43
63 Iversen, P. O., et al. (1997). Blood 90(12): 4910-7.
64 Wang et al., 1994 Exp mol Pathol
65 Plenz et al., Art. Thrombosis and Vascular biology 1997
66 Takashi et al., 1996 Circulation 93, 1185-1193
67 Biwa T et al., JBC 1998 273: 28305-28313
68 Makheja et al., Atherosclerosis 1989, 76 155-661
69 Naito et al., 1992 J Nutri sci Vitamin 38: 255-264
70 Hayashi et al., Atherosclerosis 1991 91: 107-116
71 Villa et al 1994 J Clin Invest 93: 1243
72 Van Put DJ et al., 1995 Eur J Pharmacol 294: 753-761
73 Voisard et al., 1994 Int J Cardiol 43: 257-267
74 Yamada et al., 1993: Artery 20: 253-267
75 Sakai et al., 1999 Arterioscler Thromb vasc biol 19: 1726-1733
76 Gearing, et al. EMBO J. 8 (12): 3667-3676 (1989)
77 Crosier, K. et al. PNAS 88:7744-7748 1991
78 ravines, M. et al. PNAS 88:8203-8207 1991
79 Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7,
2004
80 Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6
81 Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151.
82 Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469
83 Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York,
LLC; 2001, ISBN: 3540413545
84 Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156
85 Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86
86 Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84
87 Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)
88 McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554
89 Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490
90
EP 1 999 152B1
90 Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988;
91 Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988
92 Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993
93 Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996
94 Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996.
95 Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449 1993
96 Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996
97 Ann N Y Acad Sci. 1971 Dec 31;190:382-93.
98 Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition.
US Department of Health and Human Services. 1987
99 Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th
Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH,
Washington.
100 Persic et al 1997 Gene 187; 9-18
101 Hanes J et al (2000) Methods in Enzymology, Vol 328:24.
102 Vaughan TJ et al (1996) Nature Biotechnology Vol 14:309
103 Slootstra-JW; Puijk-WC; Ligtvoet-GJ; Langeveld-JP; Meloen-RH (1996). MolDivers. 1: 87-96
104 W001/66754 Cambridge Antibody Technology Limited; Vaughan; Wilton;
Smith; Main
105 P.K. Smith, et al., Anal. Biochem. 150 (1985), pp. 76-85
106 S. Mizushima and S. Nagata Nucleic Acids Research, Vol 18; No 17 1990 pp
5322
107 Clin Haematol. 1979 Jun; 8(2):263-85. Metcalf D.
108 Nishijima, I., T. Nakahata, et al. (1997). Blood 90(3): 1031-8.
91
EP 1 999 152B1
<110> CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY LTD and ZENYTH OPERATIONS
PTY LTD Cohen, Emma Suzanne Minter, Ralph Raymond Harrison, Paula Rosamund
Sleeman, Matthew Alexander Nash, Andrew Donald Fabri, Louis Jerry
<120> ELEMENT WIĄŻĄCY RECEPTOR GM-CSF
<130> HMK/CP6442578; 057
<150> US 60/786569
<151> 2006-03-27
<160> 258
<170> Cambridge Antibody Technology patent software version 1.0
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 1
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 2
92
EP 1 999 152B1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 3
Glu Leu Ser Ile His 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 4
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 5
<210> 6
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 6
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
93
EP 1 999 152B1
<400> 7
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 8
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 10
<210> 11
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 11
94
EP 1 999 152B1
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 12
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 13
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 14
<210> 15
<211> 11
95
EP 1 999 152B1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 15
<210> 16
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 16
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 17
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
96
EP 1 999 152B1
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 19
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 20
<210> 21
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 21
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 22
97
EP 1 999 152B1
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 23
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 24
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 25
<210> 26
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
98
EP 1 999 152B1
<400> 26
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 27
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 29
99
EP 1 999 152B1
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 30
<210> 31
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 31
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 32
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
100
EP 1 999 152B1
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 33
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 34
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 35
<210> 36
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 36
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
101
EP 1 999 152B1
<400> 37
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 38
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 39
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 40
<210> 41
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
102
EP 1 999 152B1
<400> 41
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 42
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 43
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 44
103
EP 1 999 152B1
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 45
<210> 46
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 46
<210> 47
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 47
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
104
EP 1 999 152B1
<400> 48
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 49
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 50
<210> 51
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 51
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
105
EP 1 999 152B1
<400> 52
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 53
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 54
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 55
<210> 56
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
106
EP 1 999 152B1
<400> 56
<210> 57
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 57
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 59
<210> 60
<211> 11
107
EP 1 999 152B1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 10
<210> 61
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 61
<210> 62
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 62
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
108
EP 1 999 152B1
<400> 63
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 64
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 65
<210> 66
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 66
<210> 67
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
109
EP 1 999 152B1
<400> 67
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 68
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 69
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 70
<210> 71
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
110
EP 1 999 152B1
<400> 71
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 72
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 73
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 74
111
EP 1 999 152B1
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 75
<210> 76
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 76
<210> 77
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 77
<210> 78
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
112
EP 1 999 152B1
<400> 78
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 79
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 80
<210> 81
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 81
<210> 82
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 82
113
EP 1 999 152B1
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 83
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 84
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 85
<210> 86
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
114
EP 1 999 152B1
<400> 86
<210> 87
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 87
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 88
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 89
<210> 90
<211> 11
115
EP 1 999 152B1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 90
<210> 91
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 91
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 92
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
116
EP 1 999 152B1
<400> 93
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 94
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 95
<210> 96
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 96
<210> 97
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
117
EP 1 999 152B1
<400> 97
<210> 98
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 98
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 99
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 100
<210> 101
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
118
EP 1 999 152B1
<400> 101
<210> 102
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 102
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 103
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 104
119
EP 1 999 152B1
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 105
<210> 106
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 106
<210> 107
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 107
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
120
EP 1 999 152B1
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 108
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 109
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 110
<210> 111
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 111
<210> 112
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
121
EP 1 999 152B1
<400> 112
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 113
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 114
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 115
<210> 116
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
122
EP 1 999 152B1
<400> 116
<210> 117
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 117
<210> 118
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 118
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 119
123
EP 1 999 152B1
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 120
<210> 121
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 121
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 122
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
124
EP 1 999 152B1
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 123
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 124
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 125
<210> 126
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 126
<210> 127
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
125
EP 1 999 152B1
<400> 127
<210> 128
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 128
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 129
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 130
<210> 131
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
126
EP 1 999 152B1
<400> 131
<210> 132
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 132
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 133
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 134
127
EP 1 999 152B1
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 135
<210> 136
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 136
<210> 137
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 137
<210> 138
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
128
EP 1 999 152B1
<400> 138
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 139
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 140
<210> 141
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 141
<210> 142
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 142
129
EP 1 999 152B1
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 143
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 144
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 145
<210> 146
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
130
EP 1 999 152B1
<400> 146
<210> 147
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 147
<210> 148
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 148
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 149
<210> 150
<211> 11
131
EP 1 999 152B1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 150
<210> 151
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 151
<210> 152
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Abl6
<400> 152
<210> 153
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
132
EP 1 999 152B1
<400> 153
<210> 154
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 154
<210> 155
<211> 11
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 155
<210> 156
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 156
<210> 157
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
133
EP 1 999 152B1
<400> 157
<210> 158
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 158
<210> 159
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 159
<210> 160
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 160
<210> 161
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
134
EP 1 999 152B1
<400> 161
<210> 162
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 162
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 163
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
135
EP 1 999 152B1
<400> 164
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 165
<210> 166
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 166
<210> 167
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 167
136
EP 1 999 152B1
<210> 168
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 168
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 169
<210> 170
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 170
<210> 171
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 171
<210> 172
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
137
EP 1 999 152B1
<400> 172
<210> 173
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 173
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 174
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 175
<210> 176
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
138
EP 1 999 152B1
<400> 176
<210> 177
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 177
<210> 178
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 178
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 179
139
EP 1 999 152B1
<210> 180
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 180
<210> 181
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 181
<210> 182
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 182
<210> 183
<211> 5
<212> PRT
140
EP 1 999 152B1
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 183
<210> 184
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 184
<210> 185
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 185
<210> 186
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 186
<210> 187
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
141
EP 1 999 152B1
<400> 187
<210> 188
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 188
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 189
<210> 190
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 190
<210> 191
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
142
EP 1 999 152B1
<400> 191
<210> 192
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 192
<210> 193
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 193
<210> 194
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 194
143
EP 1 999 152B1
<210> 195
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 195
<210> 196
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 196
<210> 197
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 197
<210> 198
<211> 14
<212> PRT
144
EP 1 999 152B1
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 198
<210> 199
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 199
<210> 200
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 200
<210> 201
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 201
<210> 202
<211> 385
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 202
145
EP 1 999 152B1
<210> 203
<211> 316
146
EP 1 999 152B1
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220> Ludzka sekwencja ze znacznikiem FLAG
<400> 203
<210> 204
<211> 8
147
EP 1 999 152B1
<212> PRT
<213> Sztuczny
<220> Peptyd syntetyczny
<223> peptyd FLAG
<400> 204
<210> 205
<211> 298
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 205
148
EP 1 999 152B1
<210> 206
<211> 378
<212> PRT
<213> Homo sapiens
149
EP 1 999 152B1
<400> 206
150
EP 1 999 152B1
<210> 207
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Abl
<400> 207
<210> 208
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab1
<400> 208
151
EP 1 999 152B1
<210> 209
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 209
<210> 210
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab2
<400> 210
152
EP 1 999 152B1
<210> 211
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens <223> Ab3
<400> 211
<210> 212
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab3
<400> 212
153
EP 1 999 152B1
<210> 213
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 213
<210> 214
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab4
<400> 214
<210> 215
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
154
EP 1 999 152B1
<400> 215
<210> 216
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab5
<400> 216
<210> 217
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
<400> 217
<210> 218
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab6
155
EP 1 999 152B1
<400> 218
<210> 219
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 219
<210> 220
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab7
<400> 220
156
EP 1 999 152B1
<210> 221
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> AbB
<400> 221
<210> 222
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab8
<400> 222
<210> 223
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
157
EP 1 999 152B1
<400> 223
<210> 224
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab9
<400> 224
<210> 225
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
<400> 225
<210> 226
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab10
158
EP 1 999 152B1
<400> 226
<210> 227
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
<400> 227
<210> 228
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab11
159
EP 1 999 152B1
<400> 228
<210> 229
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
<400> 229
<210> 230
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab12
160
EP 1 999 152B1
<400> 230
<210> 231
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
<400> 231
<210> 232
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab13
161
EP 1 999 152B1
<400> 232
<210> 233
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
<400> 233
<210> 234
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab14
162
EP 1 999 152B1
<400> 234
<210> 235
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
<400> 235
<210> 236
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab15
163
EP 1 999 152B1
<400> 236
<210> 237
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
<400> 237
<210> 238
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab16
164
EP 1 999 152B1
<400> 238
<210> 239
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 239
<210> 240
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab17
<400> 240
165
EP 1 999 152B1
<210> 241
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 241
<210> 242
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab18
<400> 242
<210> 243
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 243
166
EP 1 999 152B1
<210> 244
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab19
<400> 244
<210> 245
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
<400> 245
<210> 246
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab20
167
EP 1 999 152B1
<400> 246
<210> 247
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6 - Non Germlined
<400> 247
<210> 248
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6- Non Germlined
168
EP 1 999 152B1
<400> 248
<210> 249
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<223> Przeciwciało 6- Non Germlined
<400> 249
<210> 250
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6- Non Germlined
169
EP 1 999 152B1
<400> 250
<210> 251
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6
<400> 251
<210> 252
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6
<400> 252
<210> 253
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6
<400> 253
170
EP 1 999 152B1
<210> 254
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6
<400> 254
<210> 255
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6
<400> 255
<210> 256
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6
<400> 256
<210> 257
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Ab 6
<400> 257
<210> 258
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223 Ab 6
<400> 258
171
EP 1 999 152B1
Zastrzeżenia
1. Izolowany element wiążący dla ludzkiego GM-CSFRα, w którym element
wiążący zawiera cząsteczkę przeciwciała, która hamuje wiązanie GM-CSF do
GM-CSFRα, i w którym element wiążący wiąże się do sekwencji Tyr-Leu-AspPhe-Gln w pozycjach 226 do 230 ludzkiego GM-CSFRα, jak przedstawiono w
SEQ ID NR: 206, i w którym element wiążący wiąże się do ludzkiej domeny
zewnątrzkomórkowej GM-CSFRα z powinowactwem (KD) mniejszym niż 4 nM
w teście powierzchniowego rezonansu plazmonowego.
2. Element wiążący według zastrzeżenia 1, który wiąże pokrycie reszt
obejmujących Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln odpowiadających pozycjom 226 do 230
SEQ ID NR: 206, jak określono za pomocą skanu wiązania peptydu.
3. Element wiążący według zastrzeżenia 2, zawierający domenę VH
przeciwciała zawierającą zestaw obszarów determinujących komplementarność
CDR1, CDR2 i CDR3 i region zrębu, przy czym zestaw obszarów
determinujących
komplementarność
zawiera
CDR1
o
sekwencji
aminokwasowej SEQ ID NR: 3 lub SEQ ID NO: 173, CDR2 o sekwencji
aminokwasowej SEQ ID NR: 4 oraz CDR3 o sekwencji aminokwasowej
wybranej z grupy składającej się z SEQ ID NR: 5; SEQ ID NR: 15; SEQ ID NR:
35; SEQ ID NR: 45; SEQ ID NR: 55; SEQ ID NR: 65; SEQ ID NR: 75; SEQ ID
NR: 85; SEQ ID NR: 95; SEQ ID NR: 105; SEQ ID NR: 115; SEQ ID NR: 125;
SEQ ID NR: 135; SEQ ID NR: 145; SEQ ID NR: 155; SEQ ID NR: 165; SEQ ID
NR: 175; SEQ ID NR: 185; i SEQ ID NR: 195; lub zawiera ten zestaw sekwencji
CDR z jednym lub dwoma podstawieniami aminokwasów.
4. Element wiążący według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, zawierający
domenę
VH
przeciwciała
zawierającą
obszary
determinujące
komplementarność CDR1, CDR2 i CDR3 i region zrębu i przy czym reszta
Kabat'a H97 w VH CDR3 oznacza S.
5. Element wiążący według zastrzeżenia 4, w którym VH CDR3 dalej zawiera
jedną lub większą liczbę następujących reszt:
V, N, A lub L w reszcie Kabat'a H95;
S, F, H, P, T lub W w reszcie Kabat'a H99;
A, T, P, S, V lub H w reszcie Kabat'a H100B.
1
EP 1 999 152B1
6. Element wiążący według zastrzeżenia 5, w którym reszta Kabat'a H95
oznacza V.
7. Element wiążący według zastrzeżenia 5 lub zastrzeżenia 6, w którym reszta
Kabat'a H99 oznacza S.
8. Element wiążący według któregokolwiek z zastrzeżeń 5 do 7, w którym
reszta Kabat'a H100B oznacza A lub T.
9. Element wiążący według zastrzeżenia 5, w którym VH CDR3 ma sekwencję
aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR:
15, SEQ ID NR: 35, SEQ ID NR: 45, SEQ ID NR: 55, SEQ ID NR: 65, SEQ ID
NR: 75, SEQ ID NR: 85, SEQ ID NR: 95, SEQ ID NR: 105, SEQ ID NR: 115,
SEQ ID NR: 125, SEQ ID NR: 135, SEQ ID NR: 145, SEQ ID NR: 155, SEQ ID
NR: 165, SEQ ID NR: 175, SEQ ID NR: 185; i SEQ ID NR: 195.
reszta Kabat'a H34 w Vh CDR1 oznacza I.
11. Element wiążący według któregokolwiek z zastrzeżeń 4 do 10, w którym VH
CDR1 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NR: 3.
CDR2 zawiera E w reszcie Kabat'a H54 i/lub I w reszcie Kabat'a H57.
CDR2 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NR: 4.
reszta Kabat'a H17 w regionie zrębu domen VH oznacza S.
domenę VL przeciwciała zawierającą obszary determinujące komplementarność
CDR1, CDR2 i CDR3 i region zrębu.
16. Element wiążący według zastrzeżenia 15, w którym VH CDR3 zawiera
jedną lub większą liczbę następujących reszt:
S, T lub M na reszcie Kabat'a L90;
D, E, Q, S, M lub T w reszcie Kabat'a L92;
S, P, I lub V w reszcie Kabat'a L96.
17. Element wiążący według zastrzeżenia 16, w którym reszta Kabat'a H95
oznacza S.
2
EP 1 999 152B1
18. Element wiążący według zastrzeżenia 16 lub zastrzeżenia 17, w którym
reszta Kabat'a L92 oznacza D lub E.
reszta Kabat'a L95A oznacza S.
reszta Kabat'a L96 oznacza S.
21. Element wiążący według któregokolwiek z zastrzeżeń 15 lub 16, w którym
VL CDR3 ma sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z
SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 20, SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR:
60, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 100, SEQ ID
NR: 110, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 140, SEQ ID NR: 150,
SEQ ID NR: 160, SEQ ID NR: 170, SEQ ID NR: 180, SEQ ID NR: 190; i SEQ
ID NR: 200.
VL CDR1 zawiera jedną lub większą liczbę następujących reszt:
S w reszcie Kabat'a 27A;
N w reszcie Kabat'a 27B;
I w reszcie Kabat'a 27C;
D w reszcie Kabat'a 32;
VL CDR1 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NR: 8.
VL CDR2 zawiera jedną lub większą liczbę następujących reszt:
K w reszcie Kabat'a 53.
VL CDR2 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NR: 9.
domenę VH przeciwciała, w której reszta Kabat'a H94 oznacza I.
3
EP 1 999 152B1
27. Element wiążący według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 26, który wiąże
domenę zewnątrzkomórkową ludzkiego GM-CSFRα z powinowactwem (KD) 1
nM lub mniejszym w teście powierzchniowego rezonansu plazmonowego.
28.
Element
wiążący
według
zastrzeżenia
27,
który
wiąże
domenę
zewnątrzkomórkową ludzkiego GM-CSFRα z powinowactwem (KD) 0,5 nM lub
mniejszym w teście powierzchniowego rezonansu plazmonowego.
29. Element wiążący według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, który
ma siłę zobojętniania IC50 60 pM lub mniejszą w teście proliferacji komórek TF1 z 7 pM ludzkich GM-CSF.
30. Element wiążący według zastrzeżenia 29, który ma siłę zobojętniania IC50
10 pM lub mniejszą w teście proliferacji komórek TF-1 z 7 pM ludzkich GM-CSF.
ma siłę zobojętniania IC50 50 pM lub mniejszą w teście zmiany kształtu
ludzkich granulocytów z 7 pM ludzkich GM-CSF.
32. Element wiążący według zastrzeżenia 31, który ma siłę zobojętniania IC50
25 pM lub mniejszą w teście zmiany kształtu ludzkich granulocytów z 7 pM
ludzkich GM-CSF.
ma siłę zobojętniania IC50 100 pM lub mniejszą w teście uwalniania TNFα
przez monocyty z 1 nM ludzkich GM-CSF.
34. Izolowany element wiążący dla ludzkiego GM-CSFRα, w którym element
wiążący zawiera cząsteczkę przeciwciała zawierającą zestaw obszarów
determinujących komplementarność HCDR1, HCDR2 i HCDR3, LCDR1,
LCDR2 i LCDR3, przy czym:
HCDR1 oznacza SEQ ID NR: 3, HCDR2 oznacza SEQ ID NR: 4, HCDR3
oznacza SEQ ID NR: 5, LCDR1 oznacza SEQ ID NR: 8, LCDR2 oznacza
SEQ ID NR: 9 i LCDR3 oznacza SEQ ID NR: 10;
HCDR1 oznacza SEQ ID NR: 13, HCDR2 oznacza SEQ ID NR: 14,
HCDR3 oznacza SEQ ID NR: 15, LCDR1 oznacza SEQ ID NR: 18,
LCDR2 oznacza SEQ ID NR: 19 i LCDR3 oznacza SEQ ID NR: 20;
4
EP 1 999 152B1
LCDR2 oznacza SEQ ID NR: 109 i LCDR3 oznacza SEQ ID NR: 110 ;
HCDR3 oznacza SEQ ID NR: 115, LCDR1 oznacza SEQ ID NR:118,
HCDR3 oznacza SEQ ID NR: 125, LCDR1 oznacza SEQ ID NR:128,
5
EP 1 999 152B1
LCDR2 oznacza SEQ ID NR: 189 i LCDR3 oznacza SEQ ID NR: 190; lub
LCDR2 oznacza SEQ ID NR: 199 i LCDR3 oznacza SEQ ID NR: 200.
35. Element wiążący według zastrzeżenia 34, w którym:
HCDR1 jest sekwencją aminokwasową SEQ ID NR: 53;
LCDR1 jest sekwencją aminokwasową SEQ ID NR: 58;
LCDR2 jest sekwencją aminokwasową SEQ ID NR: 59; a
LCDR3 jest sekwencją aminokwasową SEQ ID NR: 60.
36. Element wiążący według zastrzeżenia 35, w którym element wiążący jest
cząsteczką przeciwciała zawierającą sekwencję aminokwasową domeny VH
przeciwciała SEQ ID NR: 52 i sekwencję aminokwasową domeny VL
przeciwciała SEQ ID NR: 57.
6
EP 1 999 152B1
cząsteczka
przeciwciała
jest
ludzką
lub
humanizowaną
cząsteczką
przeciwciała.
38. Element wiążący według zastrzeżenia 37, w którym zrąb domeny VH jest
VH1 DP5 ludzkiej linii komórek rozrodczych lub zrębem VH3 DP47.
39. Element wiążący według zastrzeżenia 37 lub zastrzeżenia 38, zawierający
domenę VL, przy czym zrąb domeny VL jest VLambda 1 DPL8, VLambda 1
DPL3 lub zrębem VLambda 6_6a ludzkiej linii komórek rozrodczych.
40. Izolowana cząsteczka przeciwciała dla ludzkiego GM-CSFRα, która hamuje
wiązanie GM-CSF do GM-CSFRα, przy czym element wiążący wiąże domenę
zewnątrzkomórkową ludzkiego GM-CSFRα z powinowactwem (K o) mniejszym
niż 1 nM w teście powierzchniowego rezonansu plazmonowego i przy czym
element wiążący zawiera
domenę VH z sekwencją aminokwasową domeny VH przedstawioną w SEQ ID
NR: 52 lub jej wariantem z jedną lub dwiema zmianami aminokwasów oraz
domenę VL z sekwencją aminokwasową domeny VL przedstawioną w SEQ ID
NR: 57 lub jej wariantem z jedną lub dwiema zmianami aminokwasów; przy
czym zmiany aminokwasów wybrano z grupy składającej się z podstawień,
insercji i delecji.
41. Cząsteczka przeciwciała według zastrzeżenia 40, w której sekwencja
aminokwasowa domeny VH jest SEQ ID NR: 52 i sekwencja aminokwasowa
domeny VL jest SEQ ID NR: 218.
42. Element wiążący według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 39 lub
cząsteczka przeciwciała według zastrzeżenia 40 lub zastrzeżenia 41, przy czym
cząsteczką przeciwciała jest IgG4.
43. Cząsteczka izolowanego kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję
kwasu nukleinowego kodującego element wiążący lub cząsteczkę przeciwciała
według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 39.
44. Komórka gospodarza zawierająca in vitro cząsteczkę kwasu nukleinowego
według zastrzeżenia 43.
7
EP 1 999 152B1
45. Sposób wytwarzania elementu wiążącego lub cząsteczki przeciwciała
według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 41, zawierający hodowanie komórek
gospodarza według zastrzeżenia 44.
46. Sposób według zastrzeżenia 45, dalej zawierający oczyszczanie elementu
wiążącego.
47. Zastosowanie elementu wiążącego lub cząsteczki przeciwciała według
któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 41 w wytwarzaniu leku do leczenia
reumatoidalnego zapalenia stawów, astmy, przewlekłej obturacyjnej choroby
płuc lub białaczki szpikowej.
48. Element wiążący lub cząsteczka przeciwciała według któregokolwiek z
zastrzeżeń 1 do 41 do zastosowania w leczeniu reumatoidalnego zapalenia
stawów, astmy, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc lub białaczki szpikowej.
8
EP 1 999 152B1
1
EP 1 999 152B1
2
EP 1 999 152B1
3
EP 1 999 152B1
4
EP 1 999 152B1
5
EP 1 999 152B1
6
EP 1 999 152B1
7
EP 1 999 152B1
8
EP 1 999 152B1
9

Pobierz dokument

Transkrypt

Podobne dokumenty

4-P-2016 - zawiadomienie o unieważnieniu postępowania

karta konkursowa dla grupy wiekowej iii