badania podstawowe na rzecz postępu biologicznego w produkcji

Transkrypt

BADANIA PODSTAWOWE NA RZECZ POSTĘPU BIOLOGICZNEGO
W PRODUKCJI ROŚLINNEJ.
Wyniki badań uzyskane w 2014 roku w zadaniach szczegółowych wg
Załącznika nr 9 Rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia
18 maja 2010r. (Dz.U. Nr 91 poz. 595 i Nr 259 poz. 1772; z 2011r. Nr 121 poz.
69; z 2012r. Nr 53 poz. 27; z 2013r. poz. 752 oraz z 2014r.poz. 796)
Lp. w zał. do Rozporządzenia MRiRW: 4.
Tytuł zadania: Mapowanie asocjacyjne genów odporności na rdzę brunatną (Puccinia
triticina) i septoriozę paskowaną liści (Septoria tritici) w pszenicy.
Kierownik zadania: dr hab. P. Czembor prof. IHAR-PIB
Celem badań było postulowanie genów odporności na septoriozę paskowaną i rdzę brunatną
w europejskich odmianach pszenicy w tym w odmianach znajdujących się na liście odmian wpisanych
do krajowego rejestru w Polsce. Typowanie genów odporności zostało wsparte wykorzystaniem
markerów molekularnych zarówno blisko sprzężonych ze znanymi genami jak i umożliwiających
profilowanie całego genomu na potrzeby mapowania asocjacyjnego.
Temat badawczy 1: Ocena porażenia odmian/linii pszenicy ozimej przez izolaty Puccinia triticina.
Celem tego tematu było określenie reakcji fenotypowej (odporny/podatny) 200 odmian/linii pszenicy
ozimej na zakażenie sześcioma izolatami P. triticina o zróżnicowanej patogeniczności.
Materiały i metody:
Materiał roślinny. Do badań w stadium siewki wykorzystano zestaw 200 odmian/linii:
 38 linii bliskoizogenicznych odmiany Thatcher (ang. Thatcher Near Isogenic Lines, TcNILs)
 83 odmiany pszenicy ozimej z krajowej listy opisowej odmian COBORU (2013)
 79 odmian pszenicy ozimej zarejestrowanych w innych krajach europejskich
Zestaw TcNILs zawiera znane geny odporności na P. triticina (pominięto linie z genami
warunkującymi odporność w stadium rośliny dorosłej) i jest obecnie obowiązującym zestawem
w badaniach międzynarodowych.
Testy fitopatologiczne. Opisany wyżej zestaw odmian/linii (3-5 ziarniaków danego obiektu) został
wysiany do dwóch palet ogrodniczych. W warunkach kontrolowanych komory klimatycznej, siewki
w stadium drugiego liścia zakażano pojedynczym izolatem P. triticina (100mg uredinospor/100ml
wody) i pozostawiono do następnego dnia w warunkach całkowitej ciemności, w temperaturze 22°C
i wilgotności 95%. Następnie siewki utrzymywano w warunkach 16 godzin światła/22°C oraz
8 godzin ciemności/18°C. Po 12-dniowej inkubacji, porażone siewki oceniano wg skali 0–4, gdzie typ
infekcji 0–2 wskazuje na odporność, a typ infekcji 3–4 wrażliwość. Do inokulacji wykorzystano sześć
izolatów P. triticina z własnej kolekcji, charakteryzujących się zróżnicowanym spektrum wirulencji
(dane niepublikowane): NIAB 06-23, NIAB 06-94, NIAB 06-98, Pt1002, Pt2902 i Pt1602.
Wyniki:
W wyniku inokulacji 83 odmian pszenicy ozimej pochodzącej z krajowej listy odmian COBORU
sześcioma izolatami o zróżnicowanej wirulencji zidentyfikowano 6 odmian (Belenus, Elipsa, Kredo,
KWS Magic, Pengar, Speedway) odpornych na co najmniej 5 izolatów oraz 9 odmian (Astoria, Bagou,
Bystra, Forum, Markiza, Meteor, Mikula, Rapsodia, Satyna) wykazujących odporność na jeden
z testowanych izolatów P. triticina. Pozostałe polskie odmiany były podatne na wszystkie testowane
izolaty. Spośród 79 odmian pszenicy pochodzących z różnych krajów europejskich, 27 wykazało
odporność na 4-6 testowanych izolatów P. triticina. Natomiast 23 odmiany były odporne na co
najmniej jeden spośród sześciu badanych izolatów.
Wszystkie badane izolaty były wirulentne w stosunku do genów Lr10, Lr11, Lr14a, Lr14b, Lr18,
Lr27+Lr31, Lr33, Lr36, Lr44 oraz awirulentne w stosunku do Lr9, Lr19, Lr24 i Lr52. Dla pozostałych
linii zestawu różnicującego przynajmniej jeden izolat dla danej linii wykazywał odmienną reakcję
fenotypową w porównaniu do pozostałych izolatów. Dla kilku kombinacji izolat/obiekt
zaobserwowano mieszaną reakcję fenotypową: Pt2902/Eriwan, NIAB06-23/Smuga; Pt1602/Grapeli;
NIAB06-94/Mikula, Smuga; Pt1002/Eriwan, Elipsa.
Dyskusja:
Liczba izolatów wykorzystana w niniejszej pracy nie pozwoliła jak dotąd na zróżnicowanie reakcji
fenotypowej wszystkich linii zestawu TcNILs. Docelowo zostanie przetestowanych co najmniej 18
izolatów P. triticina, co z pewnością wyłoni szersze spektrum wirulencji pozwalające zróżnicować
fenotypowo wszystkie, a przynajmniej większość linii bliskoizogenicznych odmiany Thatcher.
Wnioski:
1. Stwierdzono małe zróżnicowanie genetyczne odmian z krajowego rejestru (większość posiada
prawdopodobnie kilka mało efektywnych genów odporności).
2. Zaobserwowano większe zróżnicowanie genetyczne odmian zagranicznych i więcej efektywnych
genów odporności.
3. Spektrum wirulencji testowanych izolatów pozwoliło na zróżnicowanie reakcji fenotypowej
większości linii zestawu TcNILs.
Temat badawczy 2: Testowanie specyficznych markerów PCR dla wybranych genów Lr.
Celem tego tematu było określenie występowania markerów molekularnych blisko sprzężonych
z wybranymi genami Lr w zestawie odmian/linii pszenicy ozimej badanych w temacie badawczym 1.
Z grupy odmian/linii badanych w temacie 1 do analiz molekularnych w ramach tematu 2, wybrano
zestaw 188 genotypów pszenicy (w tym linie różnicujące TcNILs). Liczba planowanych obiektów do
badań wynikała z narzuconych warunków technicznych analiz: 2 płytki, każda po 96 próbek (w tym
2 próbki kontrolne). Siewki wybranych odmian/linii posłużyły do wyizolowania DNA jedną z dwóch
metod: DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH,140724 Hilden, Niemcy) lub Nucleo Mag 96
(Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, 52355 Düren, Niemcy) wspomaganą zautomatyzowaną stacją
roboczą Freedom Evo (Tecan Group Ltd., Seestrasse 103, CH-8708 Männedorf, Szwajcaria).
Wyizolowane DNA zostało wykorzystane do określenia występowania markerów molekularnych
blisko sprzężonych z sześcioma genami odporności: Lr1, Lr9, Lr10, Lr19, Lr20 i Lr21. Specyficzne
markery molekularne amplifikowano w reakcji PCR zgodnie z warunkami podanymi w publikacjach
źródłowych z niewielkimi modyfikacjami: całkowita objętość reakcji 10µl, 60ng DNA, 1U Taq
polimerazy (Fermentas GmbH, Niemcy), 1×PCR bufor z domieszką (NH4)2SO4 (Fermentas), 2,5 mM
MgCl2 (Fermentas), 200μM każdego z deoksynukleotydów (Fermentas) oraz po 0,5 μM każdego
z pary starterów. Produkty PCR rozdzielano na żelach agarozowych 1,5–2,0%/250V/4 godziny. Żele
po wybarwieniu bromkiem etydyny dokumentowano w świetle UV przy użyciu systemu Gel Logic
200 (Eastman Kodak Company, USA). W przypadku produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie
do rozdziału i detekcji wykorzystano analizator DNA ABI377XL (Applied Biosystems, Foster City,
USA) wspomagany oprogramowaniem GeneScan 3.1 (Applied Biosystems), stosując 4.5%
denaturujący żel poliakrylamidowy (Long Ranger, Cambrex Bio Science, USA). Do nanoszenia
mieszaniny poreakcyjnej na żel poliakrylamidowy zastosowano grzebienie membranowe (100 zębów)
zgodnie z zaleceniem producenta (Web Scientific Ltd., W. Brytania).
Wyniki:
Na podstawie analiz molekularnych określono występowanie markerów blisko sprzężonych
z wybranymi genami Lr w analizowanym zestawie odmian/linii. Linie bliskoizogeniczne TcNILs
zawierające znane geny odporności Lr, posłużyły jako wzorce do porównań dla badanych odmian
krajowych i zagranicznych. Gen Lr1 identyfikowano na podstawie obecności specyficznych
produktów amplifikacji dwóch markerów molekularnych pTAG621 i WR001. Spośród testowanych
odmian pszenicy, 29 odmian polskich i 7 europejskich posiadało wspomniany gen. Również w linii
bliskoizogenicznej LrB (PI) wykazano obecność tego genu. W przypadku genu Lr9 jego obecność
została zidentyfikowana jedynie w liniach TcNILs Lr9 i Lr25. Przy pomocy markera STSLrk10-6
zidentyfikowano gen Lr10 w 19 odmianach pszenicy ozimej z krajowej listy odmian COBORU i u 26
odmian pszenicy ozimej zarejestrowanych w innych krajach europejskich. Wykazano również
obecność tego genu w linii TcNIL Lr27+Lr31. W celu identyfikacji genu Lr19 wykorzystano marker
SSR wmc221, który wykazał brak obecności tego genu u którejkolwiek z odmian oprócz TcNIL Lr19.
Natomiast gen Lr20 zidentyfikowano u jednej europejskiej odmiany KWS Cashel. Marker
LR21_SCAR generował w reakcji PCR cztery specyficzne haplotypy (G1-G4), każdy o innym
2
zestawie trzech produktów PCR. Tylko haplotyp G1 wskazywał na obecność genu Lr21 i poza linią
TcNIL Lr21 został on zidentyfikowany w linii TcNIL Lr3ka.
Dyskusja:
Markery molekularne mogą pomóc w szybkiej detekcji genów odporności w odmianach roślin
uprawnych. W pracy wykorzystano 7 markerów umożliwiających identyfikację sześciu genów
odporności Lr na P. triticina. Otrzymane wyniki wskazują, że STS marker pTAG621 jest
niespecyficzny i nieodpowiedni do identyfikacji genu Lr1, ponieważ obecność jego produktu
zaobserwowano nie tylko u linii Tc+Lr1, ale również u innych linii zestawu TcNILs, łącznie z podatną
odmianą Thatcher. W związku z tym wykorzystano specyficzny marker SSR WR001, który został
zaprojektowany z sekwencji RGAs (resistance gene analogs) zlokalizowanej w locus genu Lr1.
Jednakże obecność produktu amplifikacji została zaobserwowana również w linii bliskoizogenicznej
LrB (PI).
Marker SCAR SCS5550 specyficzny dla genu odporności na P. triticina Lr9 został amplifikowany
w TcNIL Lr9. Żadna z polskich i europejskich odmian pszenicy nie posiadała genu Lr9. Uzyskane
wyniki wskazują na obecność tego produktu dodatkowo u linii TcNIL Lr25. W celu detekcji genu
Lr10 w odmianach pszenicy wykorzystano wysoce specyficzny marker STSLrk10-6, który został
przetestowany na materiale roślinnym różnego pochodzenia. Dodatkowo zaobserwowano obecność
produktu amplifikacji w linii TcNIL Lr27 + Lr31. Pomimo zastosowania wysoce specyficznego
markera, u żadnej z polskich i europejskich odmian pszenicy nie zidentyfikowano genu Lr19. Gen
Lr20 został zidentyfikowany u jednej europejskiej odmiany KWS Cashel. Zastosowany w tym
przypadku marker był wysoce specyficzny w stosunku do linii posiadających tylko ten gen
odporności. W 2010 został zaprojektowany nowy marker SCAR Lr21 w celu identyfikacji grup
haplotypów związanych z genem Lr21 odporności na rdzę brunatną. Przeprowadzone analizy
wykazały obecność specyficznego haplotypu u linii TcNIL Lr21 oraz TcNIL Lr3ka.
W przypadku markerów opracowanych dla genów Lr1, Lr9, Lr10 i Lr21 uzyskane wyniki nie były
w pełni zadowalające ze względu na ich obecność również w innych liniach zestawu TcNILs.
W związku z tym należy się zastanowić nad ich dalszym wykorzystaniem w badaniach.
Wnioski:
1. Potwierdzono przydatność markerów molekularnych w identyfikacji genów odporności Lr19
i Lr20.
2. Wyniki identyfikacji genów odporności Lr1, Lr9, Lr10 i Lr21 są niejednoznaczne.
Temat badawczy 3: Ocena porażenia odmian/linii pszenicy ozimej przez izolaty Septoria tritici
Celem tego tematu było określenie reakcji fenotypowej (odporny/podatny) 200 odmian/linii pszenicy
ozimej na zakażenie izolatem S. tritici. Cel został zrealizowany w zakresie przewidywanym do
realizacji na obecny rok.
Na potrzeby realizacji tematu, jesienią bieżącego roku założono doświadczenie w układzie dwóch
losowanych bloków (dwa powtórzenia). Każda linia w danym powtórzeniu została wysiana w rządku
1m. Do badań wykorzystano zestaw 200 odmian/linii:
 83 odmiany pszenicy ozimej z krajowej listy opisowej odmian COBORU (2013)
 92 odmiany zarejestrowane w innych krajach europejskich
 25 odmian/linii różnicujących reakcję odpornościową na zakażanie S. tritici
Wyniki:
Wyniki oceny reakcji fenotypowej zostaną uzyskane w przyszłym roku kalendarzowym.
Tytuł zadania: Identyfikacja zmienności genetycznej pszenicy korelującej z potencjałem
plonotwórczym i wybranymi cechami systemu korzeniowego.
Kierownik zadania: prof. dr hab. A. Nadolska-Orczyk
Celem zadania w roku 2014 było przygotowanie technik i materiału badawczego, które umożliwią
w kolejnych latach weryfikację założonej na podstawie wcześniejszych badań hipotezy badawczej.
3
Zakłada ona, że ekspresja genów z rodziny TaCKX występująca w rozwijających się kłosach i/lub
systemie korzeniowym wskazuje na potencjał plonotwórczy i/lub masę systemu korzeniowego.
W ramach przygotowania technik opracowano i wybrano najlepsze techniki genotypowania
poszczególnych genów TaCKX. Przygotowanie materiału badawczego polegało na wyborze i kolekcji
różnych populacji blisko spokrewnionych genotypów pszenicy o zróżnicowanym plonowaniu.
Analizie bioinformatycznej poddano 32 sekwencje genów TaCKX zidentyfikowanych w bazie
sekwencji NCBI Nukleotide. Sekwencje zostały porównane wzajemnie przy pomocy algorytmu
BLAST oraz ClustalW. W oparciu o sekwencje o numerach akcesyjnych JN128583 i JN128584
zidentyfikowanych jako TaCKX1 i TaCKX2, zaprojektowano specyficzne startery amplifikujące
produkty o długości 188 i 182 nukleotydów.
W oparciu o dane literaturowe wytypowano do badań 4 geny referencyjne. Materiałem badawczym
były trzy polskie odmiany pszenicy zwyczajnej: Ostka Smolicka, Torka i Brawura. Rośliny rosły
w kontrolowanych stabilnych warunkach w komorze fitotronowej.
RNA izolowano z korzeni 5-dniowej siewki, młodego w pełni rozwiniętego liścia, niedojrzałych
kwiatostanów w dwóch stadiach rozwojowych i rozwijających się kłosów: w dniu zapylenia, oraz po
7 i 14 dniach od zapylenia (DAP). Każdą odmianę reprezentowały trzy powtórzenia biologiczne.
Wstępny półilościowy PCR wykonano dla wszystkich zaprojektowanych par starterów. Jako matrycy
używano cDNA zsyntetyzowanego na matrycy RNA wyizolowanego z korzenia, liścia i kłosa 7 DAP.
Analizę ilościowego RT-PCR (qRT-PCR) wszystkich badanych materiałów prowadzono w obecności
barwnika EvaGreen. Względny poziom ekspresji genów TaCKX1 i TaCKX2 określano przy pomocy
metody ΔΔCt w stosunku do wybranego genu referencyjnego.
Wykonano sekwencjonowanie fragmentu genu TaCKX2 i otrzymane wyniki poddano analizie
bioinformatycznej w celu sprawdzenia ich poprawności i stopnia podobieństwa z sekwencjami
zdeponowanymi w bazie NCBI.
Na podstawie danych literaturowych i konsultacji z hodowcami, do dalszych badań wytypowano
i pozyskano linie z dwóch populacji mapujących oraz linie hodowlane z dwóch polskich hodowli
(Hodowla Roślin Strzelce Sp. z o.o. Grupa IHAR i Hodowla Roślin Danko, Sp. z o.o.).
Wyniki i dyskusja:
W bazach sekwencji nukleotydowych NCBI Nukleotide zidentyfikowano łącznie 32 rekordy
zawierające pełną lub częściową sekwencję genów CKX. Były to zarówno sekwencje genomowe jak
i mRNA. Siedem z nich opisano, jako TaCKX1 a 11 jako TaCKX2. Poszczególne sekwencje
porównane zostały przy pomocy algorytmu megaBLAST. Sekwencje dwóch analizowanych genów
wyraźnie różnią się od siebie poza podobieństwem domeny wiążącej kofaktor FAD.
Do ilościowej analizy ekspresji badanych genów konieczne było wytypowanie genu referencyjnego.
Został on wybrany spośród czterech genów referencyjnych wytypowanych na podstawie literatury
i przetestowanych na naszym materiale badawczym. Ilościową analizę ekspresji genów TaCKX
poprzedziły testowe reakcje półilościowe, które miały za zadanie zweryfikować poprawność
zaprojektowanych starterów i wytypować tkanki, w których zachodzi najwyższa ekspresja badanych
genów. Ilościowa analiza ekspresji badanych genów w różnych organach i tkankach rosnących roślin
pszenicy wykazała, że profile ekspresji tych genów są bardzo podobne. Wysoką ekspresję
obserwowano w czasie rozwoju kłosa, niską w korzeniu i praktycznie brak ekspresji w pozostałych
tkankach. Taki profil ekspresji, zgodnie z naszą hipotezą może sugerować, że obydwa geny odgrywają
istotną rolę w produktywności pszenicy. Poziom ekspresji genu TaCKX2 był o 102 wyższy niż
TaCKX1, co może wpływać na skalę oddziaływania na kontrolowaną cechę.
W ramach realizacji zadania zgromadzono również kolekcję 116 genotypów pszenicy. W skład
kolekcji wchodzą wybrane linie z dwóch populacji mapujących oraz materiały wytypowane przez
polskich hodowców. Zgromadzone materiały są blisko spokrewnione ale różnią się produktywnością.
Profile ekspresji wybranych do badań genów TaCKX wskazują, że mogą one być użyte do weryfikacji
postawionej przez nas hipotezy. Następny etap badań będzie wymagał określenia czy istnieje korelacja
pomiędzy poziomem transkrypcji genów ulegających wysokiej ekspresji w rozwijających się
ziarniakach i produktywnością. Do realizacji tego zadania zgromadzono populacje genotypów
o zbliżonym tle genetycznym ale różniące się produktywnością.
4
Wnioski:
1. Sekwencje genów TaCKX1 i TaCKX2 nie wykazują homologii poza regionem zawierającym
domenę wiążącą kofaktor FAD. Analiza bioinformatyczna umożliwiła wybór specyficznych
starterów do analiz ekspresji tych genów.
2. Spośród czterech testowanych genów referencyjnych tylko jeden ulegał ekspresji we wszystkich
analizowanych tkankach i został wybrany do dalszych badań.
3. Reakcje półilościowe ekspresji genów TaCKX umożliwiły zweryfikowanie poprawności
zaprojektowanych starterów i wytypowanie tkanek, w których zachodzi najwyższa ekspresja
badanych genów.
4. Pomiar względnego poziomu ekspresji w określonych tkankach był możliwy jedynie za pomocą
ilościowego RT-PCR (qRT-PCR).
5. Ekspresja genów TaCKX1 i TaCKX2 wzrastała w czasie rozwoju kłosa między 0 a 14 DAP,
w związku z tym mogą one brać udział w regulacji stężenia cytokinin w rozwijających się
ziarniakach.
6. Zgodnie z założoną hipotezą wyznaczony wzór ekspresji genów TaCKX1 i TaCKX2 w różnych
organach i tkankach rozwijających się roślin pszenicy może wskazywać na ich rolę
w produktywności.
7. Bardzo duże różnice w poziomie ekspresji genów TaCKX2 i TaCKX1 w rozwijających się
ziarniakach mogą wpływać na istotność zmian związanych z produktywnością.
8. Zgromadzone populacje umożliwią wyznaczenie korelacji pomiędzy poziomem ekspresji genów
TaCKX a produktywnością i masą korzenia.
Tytuł zadania: Poszukiwanie oraz wykorzystanie markerów fenotypowych,
metabolicznych i molekularnych do badania typów odporności na fuzariozę kłosów
u form pszenicy o zróżnicowanej podatności.
Kierownik zadania: dr T. Góral
Temat badawczy 1: Fenotypowanie porażenia kłosów pszenicy fuzariozą kłosów (badanie odporności
typu I i II)
Cel
Ocena stopnia porażenia kłosów przez Fusarium celem wyboru form odpornych pod względem
odporności typu I i II. Tworzenie mieszańców z genotypami odpornymi. Cel tematu został w pełni
zrealizowany.
Materiały i metody
Odporność na fuzariozę kłosów około 200 genotypów pszenicy testowana była w warunkach
polowych w IHAR-PIB Radzików oraz w IGR PAN w Poznaniu (pole doświadczalne Cerekwica).
Doświadczenia polowe zostały założone w układzie losowanych bloków. Pszenica wysiana została na
poletkach o powierzchni 0,5-1m2 w trzech powtórzeniach oraz w kombinacji kontrolnej. Do produkcji
inokulum zastosowane były 3 izolaty Fusarium culmorum, wytwarzające deoksyniwalenol oraz
zearalenon. Izolaty te zostały przetestowane pod względem agresywności wobec pszenicy i pszenżyta
i były używane do oceny odporności w warunkach polowych. Izolaty były inkubowane na
autoklawowanym ziarnie pszenicy w szklanych kolbach przez około 4 tygodni a następnie naświetlane
ciągłym światłem UV przez 4 do 7 dni w temperaturze 18oC. Ziarno skolonizowane przez
F. culmorum było następnie suszone i przechowywane w lodówce w temperaturze 4oC do momentu
użycia. W dniu, kiedy wykonywana była inokulacja, ziarno z grzybnią i zarodnikami F. culmorum
było namaczane w wodzie przez około 2 godziny i następnie filtrowane w celu uzyskania zawiesiny
zarodników. Zawiesiny ze wszystkich izolatów były mieszane i stężenie zarodników ustalono na
około 5 x 105 zar./ml za pomocą hematokrytu. Zastosowana została technika inokulacji przez
opryskiwanie. Inokulacja przez opryskiwanie pozwoliła na określenie połączonych typów odporności
I i II (odporność na infekcję oraz na rozprzestrzenianie się patogena w tkankach). Technika ta
w pewnym stopniu symuluje naturalne warunki infekcji kłosa przez Fusarium.
5
Kłosy pszenicy w fazie kwitnienia były opryskiwane zawiesiną zarodników w ilości około 100 ml
zawiesiny na 1 m2. Inokulacja przeprowadzona została oddzielnie na każdym poletku na początku
kwitnienia i powtórzona została około 3 dni później w fazie pełni kwitnienia. W fazie tej pszenica jest
najbardziej wrażliwa na infekcję kłosa przez Fusarium. Inokulacje prowadzone były w godzinach
wieczornych, kiedy wzrastała względna wilgotność powietrza. Ocenę porażenia rozpoczęto około 10
dni po ostatniej inokulacji. Zostały przeprowadzone 2 oceny w odstępach 7-dniowych. Nasilenie
fuzariozy kłosów zostało określone na podstawie proporcji porażonych kłosków w kłosie (tylko
w kłosach z objawami choroby) oraz proporcji kłosów prażonych na poletku. Z tych wartości
wyliczony został indeks fuzariozy kłosów.
Przebadano odporność typu I (odporność na infekcję) i II (odporność na rozprzestrzenianie się
Fusarium w kłosie) 74 genotypów pszenicy ozimej oraz 9 odmian/linii wzorcowych. Doświadczenie
prowadzono w warunkach częściowo kontrolowanych w tunelu foliowym z instalacją zraszającą.
Zastosowana została metoda inokulacji punktowej kłosów. Metoda ta jest używana do szacowania
odporności typu II i pozwala na precyzyjne śledzenie rozprzestrzeniania się patogena w kłosie. Kłosy
inkulowane były w fazie pełni kwitnienia poprzez umieszczanie kropli (ok. 50 µl) zawiesiny
zarodników Fusarium w środkowym kwiatku wybranych kłosów za pomocą samo napełniającej się
strzykawki. Stężenie zawiesiny wynosiło 50 x 103 zar./ml. Inokulowanych było po 10 kłosów danego
genotypu. Po inokulacji w tunelu utrzymywana była wysoka wilgotność powietrza stymulująca rozwój
choroby. Nasilenie fuzariozy kłosów oceniano poprzez określanie liczby kłosków z objawami
choroby. Ocena przeprowadzona została 21 dni po inokulacji.
W celu określenia odporności typu I kłosy pszenicy opryskiwane były zawiesiną zarodników
Fusarium o stężeniu 105 zar./ml. Po 7-10 dniach od inokulacji oceniano liczbę punktów infekcji. Po 21
dniach po inokulacji przeprowadzono dodatkowo ocenę indeksu fuzariozy.
W ramach usługi badawczej prowadzone były doświadczenia infekcyjne w 5 punktach
doświadczalnych. Do inokulacji zastosowane zostały te same izolaty F. culmorum, co w IHAR-PIB
Radzików i IGR PAN. Metodyka doświadczenia była podobna.
Wyniki i dyskusja
W doświadczeniach infekcyjnych w Radzikowie i Cerekwicy przebadano odporność na fuzariozę
kłosów 224 genotypów oraz 10 odmian/linii wzorcowych pszenicy ozimej. Genotypy te pochodziły
z krzyżowań prowadzonych w spółkach hodowli roślin (153 genotypy - DW 2014) oraz z kolekcji
utworzonej w wyniku badań nad odpornością na fuzariozę kłosów w latach 2008-2013 (72 genotypy –
„odporne”). Wzorce stanowiły odmiany wysokoplonujące – KWS Ozon, Patars, Tonacja; linie
o wysokiej odporności na fuzariozę kłosów - A40-19-1-2, UNG 136.6.1.1, Arina, 20828; genotypy
pszenicy o wysokiej podatności na porażenie kłosa - SMH 8694, SMH 8816, NAD 10079.
Średnie nasilenie fuzariozy kłosów wyniosło w Cerekwicy IFK = 23,9%, natomiast w Radzikowie
IFK = 23,5%. Nie było istotnych statystycznie różnic pomiędzy indeksami fuzariozy kłosów w obu
miejscowościach. Współczynnik korelacji pomiędzy IFK w Cerekwicy i IFK w Radzikowie był
istotny.
Zakres IFK mieścił się w granicach: Cerekwica – 5,9% (STH 1144) -72,5% (KBP_09_38), Radzików
– 0,5% (UNG 136.6.1.1) – 54,7% (KBP 11 21). Dla genotypów z grupy DW2104 IFK wyniósł: 28,2%
w Cerekwicy i 26,8% w Radzikowie, natomiast dla genotypów z grupy „odporne” było to: 15,1%
w Cerekwicy i 16,4% w Radzikowie.
Wysokość roślin pszenicy w Cerekwicy była znacznie mniejsza niż w Radzikowie i wynosiła
odpowiednio 75,0 cm (52,0–102,0 cm) i 105,4 cm (81,7-136,3 cm). Jedynie 3 genotypy w Cerekwicy
miały powyżej 100 cm, natomiast w Radzikowie było to 2/3 genotypów. Jeżeli chodzi o obie badane
grupy to grupa odpornych genotypów miała większą średnią wysokość roślin (94,2 cm) w porównaniu
do grupy genotypów DW2014 (88,5 cm). W obu lokalizacjach zależności między grupami były takie
same.
Wysokość roślin istotnie, lecz słabo korelowała z IFK w Cerekwicy, natomiast w Radzikowie
współczynnik korelacji był wysoko istotny. Średnio wysokość roślin miała istotny negatywny wpływ
na nasilenie fuzariozy kłosów. Współczynniki korelacji wysokości roślin z IFK były negatywne, co
wskazuje na wolniejszy rozwój choroby na kłosach wyższych genotypów. Niższe porażenie wysokich
genotypów jest głównie wynikiem morfologii i różnic w mikroklimacie na poziomie kłosa. Jednak
większą podatność niskich odmian może wynikać z obecności genu karłowatości Rht-D1b (Rht2).
6
Genotypy w grupie „odporne” były istotnie słabiej porażane fuzariozą kłosów. W grupie DW2014
zidentyfikowano również genotypy wykazujące odporność np. STH 1144, POB 0513, STH 2041,
NAD 11017. Większość tych genotypów charakteryzowała się jednakże wysokością powyżej 90 cm.
Genotypy niskie (poniżej 80 cm) miały indeksy FK przeważnie powyżej 25%. Wyjątek stanowiły
genotypy DD 137/10-4 NAD 10041, STH 1124, DL 414/10, DL 414/10/6/3 z grupy DW2014 oraz
CHD 6651/06 z grupy odpornych.
W badaniach typów odporności I i II uzyskano zróżnicowanie reakcji genotypów pszenicy w zakresie
1–4 punkty infekcji (PI) dla typu I oraz 1,1–3,8 kłosków porażonych dla typu II. Jeżeli chodzi o typ
I odporności to 17 genotypów na 83 badane (20%) miało liczbę punktów infekcji równą 1, natomiast
8 (10%) powyżej 3. Najniższą odporność typu I zanotowano u genotypu KBP10 3,4-4,0 PI.
W przypadku odporności typu II, najwyższą (1,1 kłosków porażonych) charakteryzowały się dwa
wzorce odporności - A40-19-1-2 (R) i UNG 136.6.1.1 (VR) oraz MOB ZB 301206. Najniższą
odporność typu 2 posiadały genotypy STH 1129, NAD 10046 i DD 64/09 (3,7-3,8 kłoska
porażonego).
Najwyższą średnią odporność obu typów zanotowano u genotypów: A40-19-1-2 (R), KBP 10 58,
DED 316/06, MOB WB 612006, SZD 1604/06 oraz POB 0211. Najniższa była odporność genotypów:
SMH 8816 (S), NAD 10079 (S) oraz STH 1129.
Brak było zależności między odpornością obu typów. Odporności obu typów oddzielnie korelowały
z indeksami fuzariozy kłosów uzyskanymi w tunelu oraz w doświadczeniach polowych w Cerekwicy
i w Radzikowie. Wyższe jednakże były współczynniki korelacji średniej odporności typu I i II
z indeksami fuzariozy kłosów.
Analiza składowych głównych pozwoliła zidentyfikować genotypy łączące oba typy odporności oraz
odporność „polową”. Były to: wzorce odporne - A40-19-1-2 (R), UNG 136.6.1.1 (VR), Arina (MR)
i 20828 (R) oraz genotypy KBP 10 58, POB 0111, SMH 8553, MOB 5578/06, AND 1055/02, POB
170/04, AND 400/05, POB 0211.
W doświadczeniach w 6 lokalizacjach badano odporność 153 genotypów i 3 odmian wzorcowych na
fuzariozę kłosów. Zidentyfikowano genotypy wykazujące odporność na porażenie kłosa we
wszystkich środowiskach (włączając Cerekwicę i Radzików). Były to np.: KOH 275, C 3779/10, STH
1144, STH 2170, NAD 11017, STH 188, POB 1013, NAD 11053. Znaleziono również genotypy
podatne we wszystkich środowiskach. Były to np.: C 3634/10, KBP_11_45, KBP_10_4, DM 3404/12,
C 489/10, STH 0179, SMH 8644, NAD 10085.
Uzyskane uszeregowanie genotypów pod względem indeksu fuzariozy kłosów w poszczególnych
lokalizacjach podlegało silnym wpływom środowiska. Najbardziej odbiegały od pozostałych wyniki
uzyskane w Nagradowicach, niskie były również współczynniki korelacji IFK w Dębinie
i Polanowicach z pozostałymi. Największa była zgodność średnich wyników uzyskanych
w Cerekwicy i Radzikowie z wynikami ze Smolic i Kobierzyc. Mimo tych rozbieżności współczynnik
korelacji średniego IFK w Cerekwicy i Radzikowie ze średnim IFK z 6 lokalizacji był wysoki
i wynosił r = 0,665. Rozbieżności rezultatów uzyskanych w różnych lokalizacjach mogły wynikać
w dużym stopniu ze zróżnicowania warunków pogodowych. Szczególnie dotyczy to odpadów
w okresie inokulacji kłosów pszenicy – pierwsza dekada czerwca oraz w początkowym okresie
rozwoju choroby (czerwiec). Istotny wpływ warunków pogodowych na rozwój fuzariozy kłosów
wskazuje na konieczność przeprowadzania doświadczeń infekcyjnych, w co najmniej kilku
środowiskach (lokalizacje, lata).
Analiza składowych głównych, w której zmiennymi były indeksy FK z 7 lokalizacji (z wyłączeniem
Nagradowic) pozwoliła na identyfikację genotypów o stabilnej reakcji w różnych środowiskach,
zarówno podatnych jak i odpornych na fuzariozę kłosów.
W doświadczeniu infekcyjnym w Cerekwicy analizowano odporność na fuzariozę kłosów linii
pszenicy ozimej uzyskanych z krzyżowania pszenicy ozimej Turnia z odmianą jarą Sumai3
zawierającą gen odporności Fhb1. Odporność linii porównano z odpornością odmian wzorcowych
oraz najodporniejszych linii pszenicy z populacji badanej w 2014. Linie TOF6-oz wykazały wysoką
odporność na fuzariozę kłosów. Była ona wyższa niż odporność wzorca UNG 136.6.1.1 zawierającego
gen Fhb1. Dwie linie pszenicy ozimej - C 3779/10, LAD 463/05 wykazały wysoką odporność,
zbliżoną do linii TOF6-oz.
W ramach usług badawczych wykonano krzyżowania z przekazanymi z IHAR-PIB 6 liniami
odpornymi. W 5 z tych linii w ramach prac w temacie badawczym 4 zidentyfikowano obecność lub
7
brak genu odporności Fhb1. Linia A 40-19-1-2 nie zawiera genu Fhb1, ponieważ została uzyskana
z krzyżowania z linią odporną SVP 72017-17-5-10-1 nie mającą w rodowodzie pozaeuropejskich
źródeł odporności. Do krzyżowań wykorzystano również genotypy, które w doświadczeniach
prowadzonych w roku 2013 wykazały odporność na fuzariozę kłosów i akumulację mikotoksyn
w ziarnie (DC 185/09-2, DC 332/09, DC 21/09-4).
Wnioski
1. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące odporność na fuzariozę kłosów warunkach
polowych (typ odporności I + II).
2. Potwierdzono odporność większości genotypów z kolekcji from odpornych.
3. Stwierdzono istotny wpływ wysokości roślin na wartość indeksu fuzariozy kłosów.
4. Genotypy odporne miały w większości (ok. 75%) wysokość powyżej średniej dla badanej
populacji.
5. Nie było istotnej zależności pomiędzy odpornością typu I i typu II.
6. Odporności typu I i II korelowały z indeksami fuzariozy kłosów z doświadczeń polowych,
jednakże wyższe były współczynniki korelacji IFK ze średnią odpornością obu typów.
7. Doświadczenia infekcyjne prowadzone w 6 lokalizacjach pokazały silny wpływ środowiska na
nasilenie fuzariozy kłosów, jednakże zidentyfikowano genotypy o stabilnej reakcji (odporne,
podatne) w różnych środowiskach.
Temat badawczy 2: Analiza zebranego materiału pod kątem oceny odporności na zasiedlanie
ziarniaków (typ III) i elementów struktury plonu (typ V odporności) w formach inokulowanych
i kontrolnych
Cel
Ocena odporności na uszkodzenie ziarna przez Fusarium oraz tolerancji genotypów pszenicy na
fuzariozę kłosów celem wyboru form odpornych.
Materiały i metody
W czasie żniw zebranych zostało ręcznie po 20-30 kłosów z poletka w doświadczeniach polowych –
dla 120 wybranych, wykazujących odporność na fuzariozę kłosów, genotypów z 3 poletek
inokulowanych i z poletka kontrolnego. Kłosy młócone były ręcznie lub laboratoryjną młocarnią
o słabym nawiewie dla zapobieżenia utraty lekkich porażonych ziarniaków. Proporcja ziarniaków
uszkodzonych przez Fusarium (typ odporności III) była określana wizualnie poprzez podział próby
ziarniaków na ziarniaki zdrowe i ziarniaki z objawami porażenia przez Fusarium. Określona została
redukcja komponentów plonu ziarna w odniesieniu do prób kontrolnych. Oznaczone zostały
następujące komponenty: masa ziarna z kłosa, liczba ziarniaków w kłosie, masa tysiąca ziarniaków.
Wyniki i dyskusja
Średnie uszkodzenie ziarniaków 140 genotypów pszenicy w Cerekwicy wyniosło 57,8% wagowo oraz
67,2% liczbowo. Zakres reakcji wyniósł od 14,7% (C 3779/10) do 91,5% (SMH 8817) wagowo oraz
od 19,1% (UNG 136.6.1.1, C 3779/10) do 97,0% (SMH 8644) liczbowo.
Najniższe uszkodzenie ziarniaków zanotowano dla genotypów: UNG 136.6.1.1 (VR), C 3779/10,
LAD 463/05, STH 9059, A 40-19-1-2 (R), 20828 (R), STH 1144, KOH 275 oraz KBP 1058.
Najwyższe dla genotypów: KWS Ozon, SMH 8585, MOB WB 612006, KBH 1131, SMH 8816 (S),
NAD 10046, NAD 10079 (S), SMH 8851, SMH 8817 oraz SMH 8644.
Redukcje masy ziarna z kłosa, liczby ziarniaków w kłosie oraz masy 1000 ziarniaków wyniosły
odpowiednio 70,7%; 54,2% oraz 39,0%. Zakres reakcji: RMZK – 8,0–95,8%; RLZK – 0-93,7%;
RMTZ – 4,0–68,3%
Najniższą redukcję MZK odnotowano dla genotypów Arina, NAD 11017, C 3779/10, LAD 463/05,
AND 143/10 oraz NAD 11100. Najniższą redukcję LZK odnotowano dla genotypów: Arina, AND
143/10, NAD 11100, NAD 11017, DM 2566/11, C 3779/10 oraz AND 446/10. Najniższą redukcję
MTZ odnotowano dla genotypów: LAD 463/05, KBP 05.271, POB 1013/10, 20828 (R), SMH 8819,
UNG 136.6.1.1 (VR) oraz A 40-19-1-2 (R).
Badane zmienne korelowały ze sobą istotnie statystycznie. Najwyższe współczynniki odnotowano dla
korelacji IFK C oraz FDK C z redukcją MZK. Najniższe były współczynniki korelacji IFK C
z redukcją masy 1000 ziarniaków oraz FDK z redukcją liczby ziarniaków w kłosie. Wysoki był
współczynnik korelacji pomiędzy średnim indeksem fuzariozy z Cerekwicy i Radzikowa (odp. typu
I + II) (przekształconym logarytmicznie) oraz uszkodzeniem ziarniaków FDK (odp. typu III)
8
(wyrażonym liczbowo). Współczynnik wynosił r = 0,656. Istotność powyższych korelacji wskazuje,
że w przypadku pszenicy podwyższona odporność na porażenie kłosa w dużym stopniu determinuje
niskie uszkodzenie ziarniaków i niską redukcje plonu ziarna.
Wnioski
1. Badane genotypy wykazały zróżnicowanie odporność typu III oraz typu V.
2. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące niskie uszkodzenie ziarniaków przez Fusarium.
3. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące niską redukcję komponentów plonu.
4. Korelacje pomiędzy indeksem fuzariozy kłosów, uszkodzeniem ziarniaków i redukcją plonu ziarna
z kłosa były istotne.
Temat badawczy 3: Analiza kumulacji/degradacji toksyn fuzaryjnych (typ IV odporności)
Cel
Celem planowanych badań jest określenie zawartości ergosterolu (wskaźnik zawartości grzybni) oraz
toksyn fuzaryjnych – deoksyniwalenolu i pochodnych, niwalenolu i zearalenonu w ziarnie wybranych
genotypów pszenicy wykazujących podwyższoną odporność na porażenie kłosa i uszkodzenie
ziarniaków przez Fusarium.
Materiały i metody
Ziarno z form o najwyższej odporności i niewielkiej obniżce parametrów plonotwórczych
analizowane było pod względem zawartości ergosterolu oraz toksyn fuzaryjnych – deoksyniwalenolu,
niwalenolu, zearalenonu (typ IV odporności, poszukiwane markery metaboliczne).
Na podstawie indeksu fuzariozy kłosów w Radzikowie i w Poznaniu wybrane zostały najlepsze
genotypy (około 35), których ziarno było analizowane na zawartość mikotoksyn wytwarzanych przez
F. culmorum. Próby ziarna pochodziły z doświadczeń polowych w Radzikowie i Cerekwicy (razem
około 70 prób). Próby ziarna z 3 powtórzeń z każdej lokalizacji zostały zmieszane.
Zawartość ergosterolu określona była metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Ergosterol
został wyekstrahowany roztworem metanolu w środowisku alkalicznym przy jednoczesnym
zmydlaniu z użyciem promieniowania mikrofalowego. Po neutralizacji roztworu, ergosterol został
wyekstrahowany do fazy organicznej za pomocą pentanu. Po wysuszeniu w strumieniu azotu
ergosterol był rozpuszczany w metanolu i rozdzielany chromatograficznie techniką HPLC na
kolumnie krzemionkowej za pomocą metanolu. Detekcja prowadzona była na detektorze UV.
Identyfikacja ergosterolu nastąpiła na podstawie czasu retencji. Ilość ergosterolu została określona na
podstawie krzywej kalibracyjnej czystego wzorca (metoda wzorca zewnętrznego).
Zawartość trichotecen z grupy B w ziarnie (deoksyniwalenol [DON], niwalenol [NIV]) była
analizowana przy wykorzystaniu techniki chromatografii gazowej. Mikotoksyny były ekstrahowane
z 5g zmielonego ziarna za pomocą 25 ml wodnego roztworu acetonitrylu (acetonitryl:woda 84:16)
poprzez wytrząsanie na wytrząsarce przez noc. Próba została odwirowana (3000 obr*min -1, 5 min.),
ekstrakt oczyszczony na kolumience Trich 227+ (RomerLabs). Do 4 ml oczyszczonego ekstraktu
dodano 1 µg wzorca wewnętrznego (chloraloza) i odparowano do sucha w strumieniu powietrza.
Mikotoksyny były przeprowadzone w pochodne trimetylosilylowe za pomocą mieszaniny silylującej
Sylon BTZ (BSA+TMCS+TMSI, 3:2:3, Supelco). Po rozpuszczeniu upochodnionej próby
w izooktanie nadmiar odczynnika silylującego został rozłożony i usunięty za pomocą wody. Warstwa
organiczna była przeniesiona do wialki autosamplera i poddana analizie chromatograficznej na
chromatografie SRI 8610C, wyposażonym w kolumnę BGB-5MS, o długości 30m. i średnicy
wewnętrznej 0,25mm. Gazem nośnym był wodór. Elucję prowadzona była w gradiencie temperatury.
Detekcję mikotoksyn przeprowadzono za pomocą detektora wychwytu elektronów (ECD).
Identyfikacja poszczególnych związków została wykonana przez porównanie czasów retencji czystych
wzorców mikotoksyn. Stężenie mikotoksyn było określone na podstawie krzywej kalibracji,
z zastosowaniem chloralozy, jako wzorca wewnętrznego.
Dla porównania przeprowadzone zostały analizy czystych związków (standardy), prób ziarna
nieporażonego oraz próby wzorcowe ziarna ze znaną zawartością mikotoksyn.
Zawartość zearalenonu (ZEA) oznaczana była za pomocą ilościowego testu immunoenzymatycznego
(ELISA) AgraQuant® ZON 40/1000 (LOD 10 ppb) (Romer Laboratories) zgodnie z procedurą podaną
przez producenta.
Wyniki i dyskusja
Średnia zawartość DON w ziarnie pszenicy ozimej wynosiła 38,7 ppm (mg/kg). Zakres zwartości
DON wynosił od 15,6 ppm (STH 9059) do 115,6 ppm (NAD 11100). Współczynnik zmienności
9
przyjmował wartość 42,4%. Najniższą zwartością DON charakteryzowały się genotypy: STH 9059,
KBP 1040, LAD 463/05, NAD 11017, MOB 5578/06, POB 0212. Najwięcej DON stwierdzono
w ziarnie genotypów POB 0211, AND 1055/02, POB 0911, NAD 11100. Genotyp AND 1055/02
charakteryzował się słabym porażeniem kłosa oraz średnim uszkodzeniem ziarniaków. W ziarnie
pszenicy nie stwierdzono obecności pochodnej DON – 3AcDON oraz niewielkie ilości 15AcDON
oraz niwalenolu.
Zawartość DON korelowała istotnie z indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy oraz z uszkodzeniem
ziarniaków. Ten drugi współczynnik przyjmował wyższą wartość. Wysoka była wartość
współczynnika korelacji ze średnim indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy i Radzikowie.
Średnia zawartość zearalenonu w ziarnie pszenicy ozimej wynosiła 932 ppb (mcg/kg). Zakres
zwartości ZEA mieścił się w granicach od 48 ppb (STH 1144) do 6450 ppb (NAD 10079 S).
Współczynnik zmienności wynosił 129,2%. Najniższą zwartością ZEA charakteryzowały się
genotypy: STH 1144, C 4573/10, NAD 11017, C 1/10, STH 008, KBP 1013, STH 9059 i C 3779/10.
Najwięcej ZEA stwierdzono w ziarnie genotypów: POB 0112, NAD 11100, KBP 0936.
Zawartość ZEA korelowała istotnie z indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy oraz z uszkodzeniem
ziarniaków. Ten drugi współczynnik przyjmował wyższą wartość. Wysoka była wartość
współczynnika korelacji ze średnim indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy i Radzikowie.
Zawartości DON i ZEA korelowały istotnie.
Wnioski
1. Badane genotypy wykazały zróżnicowaną odporność typu IV.
2. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące odporność typu IV.
3. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące niską odporność typu IV: niskie wartości IFK
i FDK - wysoka zawartość DON, średnie wartości IFK i FDK, niska redukcja masy ziarna – bardzo
wysoka zawartość DON.
4. Stopień porażenia kłosów (IFK) oraz uszkodzenie ziarniaków (FDK) korelowały istotnie
z zawartością DON i ZEA w ziarnie.
5. Współczynniki korelacji dla ZEA były niższe ze względu na znacznie większą zmienność
zwartości tej toksyny w porównaniu do DON.
Temat badawczy 4: Analiza polimorfizmu DNA w loci markerów selekcyjnych dla potencjalnych
rodziców wypierających i linii Muszelka+Fhb1
Cel
Celem zamierzonych badań było określenie polimorfizmu DNA form rodzicielskich, który pozwoli na
wybór zestawu markerów molekularnych wspomagajacych selekcję osobników pod względem
występowania wprowadzanego genu odporności Fhb1.
Materiały i metody
Do analiz molekularnych wykorzystano zestaw odmian/linii dawców i biorców oraz pierwotne źródło
genu Fhb1 odmianę Sumai3. Dawcami było 10 genotypów pszenicy ozimej pochodzących z Austrii,
Węgier oraz badań prowadzonych w ramach programu Postęp Biologiczny w Produkcji Roślinnej
(MRiRW lata 2008-2013) w tym otrzymanych linii Muszelka+Fhb1 (AIII62 i AIII75). Natomiast
zestaw biorców stanowiło 35 odmian/linii przysłanych przez 5 spółek hodowli roślin.
Analizy molekularne podzielono na dwa etapy: pierwszy, dotyczył analizy homogenności
i występowania w badanych materiałach allelu markera molekularnego UMN10 blisko sprzężonego
z genem Fhb1; drugi, dotyczył analizy polimorfizmu DNA dla 10 markerów flankujacych gen Fhb1:
gwm389, barc238, barc12, gpw7080, gwm493, barc131, wmc754, gpw3248, barc92, cfp1274.
Rozdział i analizę znakowanych produktów PCR prowadzono przy użyciu analizatora DNA
ABI377XL (Applied Biosystems, Foster City, USA).
Wyniki
W wyniku przeprowadzonej analizy locus markera molekularnego UMN10 dla 45 obiektów,
stwierdzono poza jednym wyjątkiem homogenność obiektów (austryjacka linia dawcy Fhb1). Spośród
badanych pozostałych 9 dawców odporności, dwie linie wykazywały allel podatności w locus markera
UMN10. Natomiast u pozostałych siedmiu linii dawców wykryto allel odporności. W przypadku 35
linii biorców, stwierdzono występowanie u jednej linii (STH 124) allelu odporności i w pozostałych
allelu podatności.
W drugim etapie analiz molekularnych poszukiwano polimorfizmu DNA różnicującego 7 linii
dawców (tylko z allelem odporności) i 34 linii biorców (tylko z allelem podatności) w loci markerów
10
flankujących gen Fhb1. Analizowano układ (kolejność na mapie genetycznej) i wielkość produktów
PCR dla poszczególnych loci markerów molekularnych w poszukiwaniu zestawu markerów dla
kombinacji dawca-biorca, który umożliwiałby efektywną selekcję pożądanych alleli w popualcjach
mieszańcowych (potomnych). W związku z tym wybrano zestaw linii do krzyżowań w pięciu
kombinacjach: dawca linia AIII62 oraz pięciu biorców, tj. SMH8527, DL414/10, STH1178,
MIB11262 i NAD 10041.
Dyskusja
W regionie występowania genu Fhb1 na krótkim ramieniu chromosomu 3B zostało
zidentyfikowanych wiele markerów molekularnych (np. UMN10, gwm389, barc131, wmc493
i wmc754), które były wykorzystywane w MAS. Zastosowany w badaniach marker UMN10
potwierdził swoją wartość i jednoznacznie wyróżnił obecność genu Fhb1 w testowanych liniach
dawców, które w większosci przypadków są liniami wyprowadzonymi po krzyżowaniach
z azjatyckimi źródłami odporności na FHB. Natomiast na 35 badanych potencjalnych linii biorców
tylko jedna linia STH124 wykazywała obecność genu Fhb1, co jest zgodne z wynikami analiz
prowadzonych przez innych badaczy, w których wykazano powszechny brak tego genu odporności
w puli genetycznej europejskich pszenic.
Wnioski
1. Marker molekularny UNM10 pozwolił na efektywne genotypowanie odmian/linii posiadających
gen Fhb1.
2. Analiza zestawu markerów flankujacych gen Fhb1 umożliwiła wybranie kombinacji form
rodzicielskich, dla których będzie można przeprowadzić efektywną selekcję pożądanych alleli
w popualcjach mieszańcowych (potomnych).
Temat badawczy 5: Wprowadzanie genu odporności Fhb1 do genotypów pszenicy z linii
Muszelka+Fhb1
Cel
Celem tematu jest wprowadzenie genu odporności Fhb1 do genotypów pszenicy, który warunkuje
zwiększoną odporność kłosów na porażenie przez grzyby z rodzaju Fusarium.
Zakres prac zakładany do realizacji celu w roku sprawozdawczym został w pełni wykonany.
Materiały i metody
Na podstawie wyników otrzymanych w zadaniu poprzednim, do krzyżowań wybrano dawcę
odporności linię AIII62 (pochodząca od Muszelki+Fhb1) oraz pięciu biorców: SMH8527, DL414/10,
STH1178, MIB11262 i NAD10041. Siewki wybranych obiektów jarowizowano (8 tygodni w temp.
4°C), a następnie prowadzono w kontrolowanych warunkach komory klimatycznej: 16 godzin
światła/22°C oraz 8 godzin ciemności/18°C. W odpowiedniej fazie rozwojowej kłosa (przed
kwitnieniem) formy mateczne (5 linii biorców) kastrowano i po upływie 4-6 dni zapylano pyłkiem
formy ojcowskiej AIII62. Po dojrzeniu klosów zebrano nasiona pokolenia F1 z poszczególnych
kombinacji krzyżówkowych.
Wyniki
W poszczególnych kombinacjach krzyżówkowych zebrano od 126 do 262 nasion pokolenia F1.
Dyskusja
W hodowli roślin krzyżowania wsteczne (wypierające) są szeroko stosowaną metodą wprowadzania
jednej lub kilku cech jednocześnie do genotypów o wysokiej wartości użytkowej (biorca), które tych
cech są pozbawione. Wykorzystanie markerów molekularnych w krzyżowaniach wstecznych (ang.
Marker Assisted Backcrosing, MABC) zdecydowanie zwiększyło efektywność selekcji pożądanych
genotypów. W roszczerzonej wersji MABC, poza selekcją roślin w populacji mieszańcowej, które
zawierają marker molekularny sprzężony z wprowadzanym (docelowym) genem (ang. Foreground
Selection, FS), dodatkowo poszukuje się obiektów dla których doszło do rekombinacji pomiędzy
markerem flankującym i wprowadzanym genem, tzw. selekcja rekombinantów (ang. Recombinant
Selection, RS), co ma zapobiec wprowadzeniu do genomu biorcy wielu niepożądanych genów, które
mogą być z nim sprzężone.
W przypadku badań prowadzonych w ramach niniejszego tematu, gen Fhb1 będzie wprowadzany na
drodze dwóch krzyżowań wstecznych. Teoretycznie, aby otrzymać po dwóch krzyżowaniach
wstecznych przynajmniej jednego osobnika heterozygotycznego dla markera centralnego
i homozygotycznego dla flankujących markerów w typie alleli rodziców wypierających (gwm389
i cfp1274) należy w każdym pokoleniu (tj. F1BC1 i F1BC2) przebadać przynajmniej po 62 osobniki
11
przy poziomie prawdopodobieństwa P = 0,99. Uzyskane w bieżącym roku liczebności nasion
pokolenia F1 (126–262) w pełni zabezpieczają liczbę form matecznych, które będą wykorzystane do
krzyżowań wstecznych w kolejnym roku realizacji tematu.
Tytuł zadania: Tolerancja na stresy abiotyczne - genotypowanie pszenicy w oparciu
o strategię genów kandydujących.
Kierownik zadania: prof. dr hab. W. Orczyk
Cel zadania
Celem zadania realizowanego w roku 2014 było zbadanie korelacji wybranych etapów
mikrosporogenezy z fazami rozwojowymi rośliny w warunkach kontrolnych, ustalenie
eksperymentalnych warunków suszy wpływających na mikrosporogenezę, wykonanie oceny
żywotności pyłku i stopnia zawiązywania nasion w roślinach, które rosły w warunkach kontrolnych
lub były poddane stresowi suszy. Kolejnym celem była identyfikacja genów kandydujących przy
wykorzystaniu danych literaturowych i baz sekwencji nukleotydowych oraz zapoczątkowanie
weryfikacji molekularnej genów. Założone cele zostały zrealizowane w całości.
Materiały i metody
Materiałem biologicznym było 36 odmian pszenic pochodzących z różnych regionów klimatycznych
świata. Rośliny uprawiano w kontrolowanych warunkach w szklarni. Wilgotność gleby mierzono
sondą wilgotności (SM150, Geomor Technik), uzupełniając wodą do 30% wg wilgotnościomierza, co
odpowiada 60-70% PPW. Oznaczono pędy główne, które były używane do badania faz rozwojowych
kłosa, żywotności pyłku i liczby zawiązanych ziarniaków. Do określenia fazy rozwojowej kłosa,
w której zachodziły procesy mejozy (proces powstawania młodych mikrospor), użyto parametru AD
(Auricle Distance), wyrażany jest on w cm i odpowiada odległości pomiędzy uszkami liścia
flagowego a przedostatniego liścia.
Stres suszy ustalono na poziomie 10% wilgotności gleby mierzonej wilgotnościomierzem. U roślin
poddanych stresowi AD wynosiło 5cm. Suszę utrzymywano przez 5 dni. Następnie rośliny podlewano
do 20% wilgotności gleby wg odczytów wilgotnościomierza przez 2 tygodnie, a później przywrócono
warunki normalne. Z pędu głównego roślin kontrolnych w fazach rozwojowych 5 liści, początku
krzewienia, AD 5cm i AD 8cm izolowano rozwijający się kłos i określano jego fazę rozwojową.
Z pylników robiono gniecione preparaty, barwione w 3% roztworze acetokarminu. W mikroskopie
świetlnym obserwowano stadia rozwojowe mikrosporogenezy oraz w oceniano żywotność pyłku.
Żywotność pyłku w roślinach kontrolnych oraz poddanych stresowi suszy określano na podstawie
koloru zabarwienia cytoplazmy i obecności komórek plemnikowych.
Liczono nasiona wypełniające kłos oraz liczbę kłosków i kwiatków, które określały możliwą liczbę
nasion w danym kłosie badanej odmiany u roślin kontrolnych i traktowanych stresem suszy. Na
podstawie tych dwóch parametrów obliczano stopień wypełnienia kłosa i wyznaczano współczynnik
WKs /WKk.
Wykorzystując wyniki literaturowe oraz bazy danych, wytypowano grupy procesów metabolicznych,
uczestniczące w nich enzymy oraz kodujące je geny, które mogą odgrywać istotną rolę
w makrosporogenezie oraz zaburzeniach mikrosporogenezy indukowanych stresem.
Wyniki i dyskusja
Obserwacje kolejnych faz rozwojowych rośliny i kłosa pozwoliły na skorelowanie kolejnych etapów
tych dwóch procesów. Wykazano, że w roślinach pszenicy w stadium 5 liści kłos jest w stadium od
rozwoju wzgórków kłoskowych do inicjacji zawiązków plew. W początkowych stadiach krzewienia
kłos jest w stadium inicjacji wzgórków kwiatowych. W dalszym stadium krzewienia roślin, kłos jest
w stadium od inicjacji pręcików do dalszych bardziej dojrzałych etapów rozwoju. Rośliny, w których
wartość AD wynosi 5cm zawierają kłos z pylnikami kwiatów bazalnych w stadium mejozy oraz kłosy
w stadium młodych mikrospor. Młode mikrospory są uwalnianie z tetrad w roślinach, gdy wartość AD
wynosi od 5 do 8cm, zależnie od genotypu. Badano stadia mikrosporogenezy w kwiatkach I, II i IIIrzędowych wypreparowanych z kłoska V roślin AD 5cm. W pylnikach kwiatów I rzędu obserwowano
młode mikrospory, w pylnikach kwiatu II rzędu występowały tetrady mikrospor, natomiast
12
w pylnikach kwiatu III rzędu obecna była jeszcze młoda tkanka sporogenna. Stadium uwalniania
z tetrad młodych mikrospor było obserwowane w roślinach AD od 5 do 8cm w środkowej części
kłosa. Na tej podstawie ustalono, że stres suszy będzie aplikowany w stadium AD 5cm.
Wyniki badania etapów rozwoju wegetatywnego rośliny oraz faz rozwoju kłosa umożliwiają
skorelowanie tych procesów. Pozwala to wystarczająco dokładnie określić fazy rozwojowe kłosa
w tym mikrosporogenezy w oparciu o łatwą do określenia fazę rozwoju wegetatywnego. Do celów
projektu najważniejsze było określenie wczesnych etapów mikrosporogenezy. Zgodnie z tymi
wynikami, w badanych odmianach wczesne fazy mejozy i fazy mikrosporogenezy zachodzą
w roślinach gdy AD wynosi 5-8 cm. Wyniki te dobrze odpowiadają wynikom literaturowym.
W trakcie realizacji zadania zebrano kolekcję 112 genotypów pszenicy pochodzących z różnych
regionów klimatycznych. Do doświadczeń wybrano 36 genotypów, które reprezentują potencjalnie
szeroki zakres reakcji badanej cechy tj. zaburzeń mikrosporogenezy i niepłodności pyłku na stres
suszy. W roślinach testowanych genotypów obserwowano duże zróżnicowanie wypełnienia kłosa
w roślinach, które były poddane stresowi suszy (WKs). Najniższe wartości WKs 8% miała odmiana
Triple Dirk S, a najwyższe ponad 75% odmiany CSDH 143, CSDH 98, Upi-301. Współczynnik
WKs/WKk pozwolił uwzględnić rzeczywiste i potencjalne wypełnienie kłosów, w warunkach
kontrolnych i stresowych. Wartości tego parametru były zróżnicowane i wahały się od 0.37 (Mina), do
ponad 0,9 (Bajka, CSDH 28, CSDH 53 Mironovska 808 i Kite, SQ1, Pinka, CSDH143, Ns-55-25,
Rusalka).
Żywotność pyłku z roślin kontrolnych wynosiła 100% u wszystkich genotypów. Żywotność pyłku
pobranego z roślin poddanych stresowi suszy była zróżnicowana i wahała się od 0% do 100%.
Najniższe wartości (0%) obserwowano u odmian: Ching Chang 6, Linia #20277, Triple Dirk S i Linia
#21134 wartości najwyższe u odmian: Peking 11, Sava, CS, SQ1, Albena, U-1, CSDH 143, CSDH 53,
Vireo S i Linii #22583. Wyniki wskazują na znaczną zgodność współczynnika WKs/WKk
z żywotnością pyłku w stresie suszy.
Na podstawie danych literaturowych oraz zdeponowanych w bazach sekwencji nukleotydowych
wybrano 26 klonów (głównie cDNA), w tym jeden klon genomowy i jedną sekwencję
przypuszczalnego pseudogenu. Wybrane transkrypty reprezentują geny kodujące białka enzymatyczne
/ regulatorowe procesów ważnych w czasie mikrosporogenezy i jednocześnie tych, których zaburzenie
stresem powoduje niepłodność pyłku. Profil ekspresji wytypowanych genów będzie analizowany
w trakcie dalszych etapów realizacji zadania. Pierwszy etap projektowania i weryfikacji starterów do
tej analizy wskazał, że część z nich spełniała kryteria przydatności do qPCR.
Wnioski
1. Stadium rozwoju rośliny AD 5-8cm, odpowiadające fazie rozwojowej kłosów w stadium mejozy
jest odpowiednim etapem rozwoju do aplikowania stresu suszy i badania wpływu tego stresu na
przebieg mikrosporogenezy.
2. Obserwowano duże zróżnicowanie zawiązywania nasion i wypełnienia kłosa w roślinach
wybranych genotypów pszenicy w warunkach normalnych oraz po stresie suszy.
3. Niezaburzona mikrosporogenza w warunkach normalnych warunkowała wysoką żywotność pyłku
we wszystkich badanych genotypach pszenic.
4. Duże zróżnicowanie żywotności pyłku w roślinach tych samych genotypów poddanych stresowi
suszy wskazywało na: i) negatywny efekt stresu na przebieg mikrosporogenezy oraz ii) duże
zróżnicowanie reakcji na ten stres zależne od genotypu.
5. Korelacja współczynnika wypełnienia kłosa (WKs/WKk) oraz żywotności pyłku pozytywnie
weryfikuje jedno z głównych założeń projektu.
6. Wytypowano 26 genów pszenicy, ważnych w procesie mikrosporogenezy i jednocześnie
potencjalnie ulegających zróżnicowanej ekspresji w czasie stresu suszy.
7. Pierwsza część badań molekularnych potwierdziła, że pięć wybranych genów metabolizmu
węglowodanów oraz syntezy i katabolizmu ABA ulega ekspresji w komórkach rozwijającego się
kłosa.
13
Tytuł zadania: Efektywność piramidowania genów odporności na mączniaka
prawdziwego (Blumeria graminis f.sp. tritici) i rdzę brunatną (Puccinia triticina)
w pszenicy ozimej.
Kierownik zadania: prof. dr hab. J.H. Czembor
Cel zadania:
Temat badawczy 1. Piramidowanie efektywnych genów odporności.
 Przeprowadzenie krzyżowań zbieżnych, wstecznych, selekcja fenotypowa oraz molekularna.
 Wyprowadzenie F1 populacji mapującej(ych).
Temat badawczy 2. Poszukiwanie nowych źródeł odporności.
 Poszukiwanie efektywnych genów odporności na rdzę brunatną i mączniaka prawdziwego.
Temat badawczy 3. Ocena linii w różnych warunkach środowiskowych.
 Selekcjonowanie materiału roślinnego, odpornego na rdzę brunatną, mączniaka prawdziwego oraz
o korzystnych cechach gospodarczych.
Temt badawczy 1. Materiał badawczy stanowiło 11 populacji mieszańcowych BIO, o różnym profliu
genetycznym (uzyskane we wcześniejszych badaniach prowadzonych w latach 2008-2013). Materiał
roślinny stanowiły również populacje mapujące, do których został wprowadzony efektywny gen
odporności na rdzę brunatną, gen Lr55. W badaniach jako źródła odporności na rdzę brunatną oraz
mączniaka prawdziwego wykorzystano następujące linie: Lr41, Lr47 oraz Lr55 (źródła odporności na
rdzę brunatną), linie Pm21 i Pm37 (źródła odporności na mączniaka prawdziwego). W krzyżowaniach
wypierających (wstecznych), w zależności od kombinacji krzyżówkowej, zostały wykorzystane
odmiany pszenic ozimych (Nadobna, Bogatka, Lexus, RAH979, Meteor) o wysokiej wartości
gospodarczej, ale podatne na populację rdzy brunatnej i mączniaka prawdziwego występujące
w Polsce. W zależności od etapu przeprowadzanych badań, materiał roślinny, uprawiany był
w warunkach kontrolowanych (szkalrnia oraz fitotron) oraz w warunkach polowych – poletka
doświadczalne w Radzikowie.
Ocena fenotypowa stopnia odporności populacji mieszańcowych na P. recondita f.sp. triticina oraz
B. graminis f.sp. tritici (Selekcja fenotypowa)
Do oceny fenotypowej stopnia odporności form rodzicielskich i populacji mieszańcowych na
porażenie przez P. recondita f.sp. triticina oraz B. graminis f.sp. tritici zostały wykorzystane
jednozarodnikowe izolaty: odpowiednio Pt 2902 (P. recondita f.sp. triticina) oraz Bgt Kadett
(B. graminis f.sp. tritici). Izolaty pochodziły z kolekcji Pracowni Genetyki Stosowanej IHAR-PIB
Radzików. Doświadczenia fitopatologiczne prowadzone były w warunkach kontrolowanych, przy
fotoperiodzie 16 godz. światła i 8 godz. ciemności oraz w temperaturze w zakresie 16-22ºC.
Testowane rośliny zakażane były zawiesiną zarodników P. recondita, a nastepnie po upływie 3-4 dni
przeprowadzono inokulację roślin izolatami B. graminis. Po upływie 8-10 dni została oceniona
reakcja roślin wykorzystując do tego celu pięciostopniową skalę, wg. Levine o Cherewick dla rdzy
brunatnej oraz wg. Mainsa i Daetza dla mączniaka prawdziwego.
Analiza molekularna, selekcja materiału roślinnego
W zależności do rodzaju przeprowadzanej selekcji (wyboru systemu markerowego), DNA materiału
roślinnego izolowane było dwoma różnymi metodami. Pierwsza metoda ekstrakcji DNA
przeprowadzana była za pomocą buforu TPS, i była wykorzystana podczas selekcji materiału
roślinnego pod kątem obecności genów Pm21 oraz Lr47. Druga metoda, przeprowadzana była przy
użyciu gotowego zestawu DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Genomowe DNA, wyizolowane tą
metodą, wykorzstane było dla markerów molekularnych, wykorzystywanych podczas selekcji genów
Lr41 oraz Pm37.
Reakcja łańcuchowej polimeryzacji DNA, przeprowadzana była przy wykorzystaniu
niskoprofilowanych cienkościennych próbówek lub przy użyciu płytek – bloków 96-ścio dołkowych.
Powielanie fragmentów odbywało się w termocyklerze Mastercycler ep. W zależności od układu
markerowego, reakcja powielania została przeprowadzona w objętości 8-25µl. Skład komponentów
reakcji PCR został ustalony na podstawie wcześniejszych badań. W zależności od identyfikacji
genów, liczba wykorzystanych markerów na jeden gen wynosiła od 1 do 5 markera(ów):
14
• Gen Lr41: Gdm35, Gwm210, Barc124, Gwm261, Gwm296;
• Gen Lr47: (PSAPSR+PS10L+PS10L2), Gwm60;
• Gen Pm21: NAU/xibao;
• Gen Pm37: Gwm332; Wmc790; STSBE406627.
W zależności od układu markerowego, rozdział produktów amplifikacji PCR, odpowiednio dla
genów: Lr41, Lr47 oraz Pm37, przeprowadzany był na sekwenatorze DNA ABI 377 XL na 4,75%
denaturującym żelu polyakrylomidowym (Long Ranger Gel Solution, Rockland, USA). Dla
produktów amplifikacji dla genu Pm21(NAU/xibao) oraz genu Lr47 (PSAPSR+PS10L+PS10L2),
detekcja produktów została przeprowadzona na 1,5% żelu agarozowym przy napięciu 240 V, przez
4 godz. w buforze 0,5 x TBE. Analiza uzyskanych obrazów detekcji, dla dwóch systemów
elektorforetycznych, oceniana była wizulanie. W celu wyodrębnienia roślin o korzystnej kombinacji
genów odporności, zostały wykorzystane wzorce – uzyskany produkt dawcy odporności.
Temat badawczy 2. Materiałem roślinny stanowił zestaw 30 odmian i linii różnicujących o znanych
genach odporności, w tym linie Pm38(Lr34) i Pm39(Lr46), oraz wrzorzec – odmiana podatna –
Nimbus. Linie/źródła posiadające znane geny odporności Pm38(Lr34) oraz Pm39(Lr46).
Ocena fenotypowa stopnia odporności na Blumeria graminis f.sp. tritici
W badaniach wykorzystano populację 52 jednozarodnikowych izolatów Blumeria graminis f.sp.
tritici, wyizolowanych z porażonych liści pszenicy, zebranych w różnych rejonach Polski w 2014
roku. Nasiona odmian i linii zestawu różnicującego wysiewano do doniczek z ziemią ogrodową (po 10
– 15 ziarniaków na doniczkę). Siewki rosły w izolacji przestrzennej w warunkach szklarniowych,
z dodatkowym, sztucznym doświetlaniem przy długości dnia 16 h oraz temperaturze w zakresie
16-22˚C. Dziesięć dni po wysiewie, gdy rośliny były w stadium w pełni rozwiniętego drugiego liścia,
prowadzono zakażenia sztuczne każdym izolatem osobno. Zarodniki namnożone na roślinach
odmiany podatnej Nimbus, były równomierne strząsane nad roślinami odmian i linii zestawu
różnicującego. Do izolacji przestrzennej wykorzystano namioty foliowe. Ocenę fenotypową stopnia
porażenia odmian i linii poszczególnymi izolatami grzyba B. graminis przeprowadzano po ok.
8 dniach wykorzystując pięciostopniową skalę (0-4) w której: 0 = brak widocznych objawów
porażenia; 1 = niewielkie nekrozy; 2 = powiększające się nekrozy wraz ze skąpym zarodnikowaniem;
3 = chlorozy, grzybnia rozwinięta, lecz słabo zarodnikująca; 4 = dobrze rozwinięta i zarodnikująca
grzybnia. Odmiany/linie o reakcji 0-2, tworzyły grupę odpornych natomiast rośliny o reakcji 3-4 grupę
podatnych.
Temat badawczy 3. W 2014 roku doświadczenie przeprowadzno na poletku doświadczalnym
w Radzikowie. Materiał roślinny, stanowiły populacje mieszańcowe BIO: bio_4b, BIO5_b, BIO7_b,
BIO8_b w liczbie 260 roślin, 100 linii pochodzacych z krzyżówek z genem odporności na rdzę
brunatną – genem Lr55 oraz 20 linii pochodzących z krzyżówek z genem odporności na rdzę brunatną
– genem Lr47. Ocena materiału roślinnego dokonywana była w tygodniowych odstępach czasu
i w odniesieniu do dwóch odmian wzorcowych: Muszelka oraz Patras. Ocena materiału roślinnego
polegała na ocenie stopnia porażenia pod kątem podatności/odporności na rdzę brunatną oraz żółtą,
mączniaka prawdziwego, septoriozę, oraz przezimowanie, kłosznie, wysokość, plon.
Wyniki i dyskusja:
Temat badawczy 1. W bieżącym roku sprawozdawczym łącznie wysiano 695 roślin, z czego
analizowano 617, a 78 roślin wypadło z analizy. Na podstawie testów odporności (selekcja
fenotypowa), do badań molekularnych, spośród wszystkich analizowanych populacji mieszańcowych,
wyselekcjonowano 313 roślin. Były to rośliny wg. oceny fenotypowej, odporne na oba patogeny. Za
pomocą marekrów molekularnych, wyselekcjonowane rośliny, przebadano pod kątem obecności
wprowadzonych genów: Lr41, Lr47, Pm21 oraz Pm37. Do dalszych badań wyselekcjonowano 86
roślin, charakteryzujących się różnym profilem genetycznym.
W dostępnej literaturze naukowej, brak jest doniesień na temat piramidyzowania takich schematów
odpornościowych, jakie zostały zaproponowane przez wykonawców projektu. Kumulacja
efektywnych genów odporności w niniejszym projekcie jest procesem niezwykle pracochłonnym
i długotrwałym, jednak pozwoli na uzyskanie genotypów o trwalszej odporności na mączniaka
prawdziwego i rdzę brunatną. Uzyskane genotypy będą stanowiły cenny materiał roślinny.
Zaproponowane rozwiązanie nie było wcześniej stosowane w pszenicy ozimej oraz stanowi
rozwiązanie oryginalne w genetyce odpornościowej tego zboża. Ponadto, obecność wielu efektywnych
15
genów odporności, w nowych odmianach pszenicy znacząco zwiększa trwałość ich odporności na
choroby, w tym na rdzę brunatną oraz mączniaka prawdziwego (Parks, 2008; Pietrusińska 2009).
Literatura do tematu badawczego 1:
Parks R., Carbone I., Murphy P. J., Marshall D., Cowger C. 2008. Virulence structure of the eastern U.S. wheat
powdery mildew population. Plant Disease 92: 1074-1082.
Pietrusińska, A. 2009. Wprowadzanie do pszenicy ozimej genów odporności Lr41 na rdzę brunatną (Puccinia
recondita f.sp. tritici) i Pm21 na mączniaka prawdziwego (Blumeria graminis f.sp. tritici). Konferencja
naukowa: Nauka dla Hodowli Roślin Uprawnych, Zakopane, str. 55.
Temat badawczy 2. Uzyskane wyniki wykazały, że izolaty B. graminis charakteryzowały się
zróżnicowanym stopniem wirulencji w stosunku do genów odporności obecnych w zestawie odmian
i linii różnicujących. Wszystkie izolaty były awirulentne w stosunku do genów odporności Pm29,
Pm21, Pm36 oraz Pm37 (stopień odporności linii z tymi genami oceniono w zakresie 0-2).
W odniesieniu do genów Pm3d+4b (odmiana Kadett) wirulentne były tylko dwa izolaty. Pozostałe
źródła odporności były podatne na większość izolatów i charakteryzowały się mniejszą odpornością
na populację B. graminis lub były całkowicie przez nią porażane, jak np. Avalon Pm2, Kormoran
Pm5, Pm6, Transec Pm7, Maris Pm2+6, Boxer Pm4b+5 – odmiany całkowicie porażane przez 52
izolaty, w tym również nowe źródła odporności: linia Pm38(Lr34) oraz linia Pm39(Lr46). Mniejszą
odpornością charakteryzowały się odmiany/linie tj.: Chul Pm3b – porażana przez 11 izolatów, linia
Pm34 – porażana przez 7 izolatów, oraz linia Pm35 – porażana przez 27 izolaty B. graminis.
Podsumowując, można stwierdzić, że populacja Blumeria graminis f. sp. tritici występująca na
pszenicy w Polsce, charakteryzuje się szerokim spektrum patogeniczności. Większość izolatów
reprezentujących tą populację w Polsce jest wirulentnych w stosunku do większości genów/źródeł
odporności, powszechnie wykorzystywanych w genetyce odpornościowej. Dlatego, konieczne jest
poszukiwanie nowych źródeł odporności, których źródłem mogą być formy oddalone, lub też nawet
dzikie. Nowe kombinacje genów odporności, wprowadzane do najlepszych odmian i rodów
hodowlanych na drodze krzyżowań, mogą przyczynić się do spowolnienia procesu przełamywania
odporności odmian na porażenie grzybem Blumeria graminis f. sp. tritici (McDonald i Linde 2002;
Pietrusińska i in. 2011, 2013).
Literatura do tematu badawczego 2:
Mains E. B., Dietz S. M. 1930. Physiologic forms of barley mildew, Erysiphe graminis hordei Marchal.
Phytopathol. 20: 229-239.
Czembor, H.J. 2008. Odporność na mączniaka prawdziwego (Blumeria graminis f.sp. hordei) odmian
jęczmienia włączonych do badań rejestrowych w Polsce w latach 2004-2006. Biuletyn Instytutu Hodowli
i Aklimatyzacji Roślin 248: 33-42.
McDonald B., Linde C. 2002. Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance.
Annual Review of Phytopathology 40: 349-379.
Pietrusińska A., Czembor J.H., Czembor P.Cz. 2011. Pyramiding of two resistance genes for leaf rust and
powdery mildew resistance in common wheat. Cereal Research Communications. 39(4): 577-588.
Pietrusińska A., Czembor P.Cz., Czembor J.H. 2013. Lr39 + Pm21: a new effective combination of resistance
genes for leaf rust and powdery mildew in wheat. Czech J. Genet. Plant Breed. 49: 109-115.
Temat badawczy 3. Na podstawie przeprowadzonych badań, wyselekcjonowano linie pszenic
o wysokiej odporności na mączniaka prawdziwego, rdzę i inne choroby oraz o korzystnych cechach
agronomicznych. Łącznie obserwowano 380 roślin z populacji mieszańcowych BIO, z czego
wyselekcjonowano do dalszych badań 94 linii.
Ponadto, jesienią 2014 roku, zostały założone dwa doświadczenia, wykonywane przez dwie stacje
hodowlane: Hodowlę Roślin Smolice oraz Hodowlę Roślin Strzelce.
Podsumowując, można stwierdzić, że poszukiwanie źródeł odporności na rdzę brunatną oraz na
mączniaka prawdziwego w oparciu o markery molekularne oraz o oceny fenotypowe w warunkach
kontrolowanych jest efektywne i pozwala uzyskać postęp genetyczny dla tych cech. Uzyskane
materiały powinny być charakteryzowane wielośrodowiskowo, ze względu na złożoność interakcji
pomiędzy patogenem a gospodarzem. Jest to konieczne m. in. ze względu, na występowanie różnych
ras populacji B. graminis oraz P. recondita.
16
Wnioski:
Temat badawczy 1

Na podstawie przeprowadzonych badań, wyselekcjonowano rośliny o różnym tle genetycznym
(różni rodzice wypierający) oraz o odmiennych profilach (segmentach) odpornościowych, tj.:
(Lr41+Pm21+Lr47+Lr47),(Lr41+Pm21+Pm37+Pm37+Pm37), (Lr41+Pm21+Pm37+Pm37+Lr47).
Temat badawczy 2.

Popualcja Blumeria graminis f. sp. tritici występująca na pszenicy w Polsce charakteryzuje się
szerokim spektrum patogeniczności i większość izolatów było wirulentnych w stosunku do
znanych genów/źródeł odporności.

Wszystkie izolaty Blumeria graminis f.sp. tritici były awirulentne w stosunku do genów
odporności Pm21, Pm29, Pm36, Pm37. Geny te powinny być wprowadzane do odmian
współcześnie uprawianych, lub być wykorzystywane w nowych programach hodowlanych.

Nowe źródła odporności: Pm38(Lr34) oraz linia Pm39(Lr46) były podatne w stosunku do
izolatów B. graminis występujących na terenie Polski.
Temat badawczy 3.

Uzyskano postęp genetyczny dla stopnia odporności na rdzę brunatną i mączniaka prawdziwego
(do dalszych badań, wyselekcjonowano łącznie 94 linii).

Na podstawie kilkuletnich obserwacji, zostanie wyselekcjonowany materiał roślinny
o spiramidyzowanym profilu genetycznym pod względem stopnia odporności na rdzę brunatną
i mączniaka prawdziwego, co potwierdza ważność selekcji opartej o markery molekularne.
Tytuł zadania: Toksyny białkowe Stagonospora nodorum i ich związek z patogenicznością
oraz odpornością pszenżyta i pszenicy na septoriozę liści i plew.
Kierownik zadania: prof. dr hab. E. Arseniuk
Cele zadania:
 Opracowanie procedury testowania materiałów roślinnych na obecność genów warunkujących
odporność na białkowe toksyny S. nodorum,
 Zbadanie zdolności poszczególnych toksyn do indukcji nekrozy na próbie krajowych odmian
z KRO i linii pszenżyta i pszenicy
 Zbadanie związku korelacyjnego między obecnością genów niewrażliwości na toksyny
a odpornością na S. nodorum w warunkach fitotronowych (siewki) oraz polowych (rośliny dorosłe)
 Opracowanie procedury testowania izolatów S. nodorum pod względem zdolności do produkcji
toksyn
 Identyfikacja źródeł odporności na S. nodorum niezwiązanych z odpornością na toksyny
 Hodowla izolatów w celu pozyskania grzybni i płynów pohodowlanych na pożywce Frie: 5g
winianu amonu, 1g azotan amonu, 0,5g siarczan magnezu (7H2O), 3,9g fosforan potasu
jednozasadowy, 30g sacharoza, 1g ekstrakt drożdżowy na 1000ml H2O. pH 5,7.
 Izolacja DNA z homogenizowanej w ciekłym azocie grzybni: Kit Omni prep (G-Biosciences) lub
szybką metodą izolacji [González-Mendoza i inni 2010]. Genet Mol Res. 2010 2;9:162-6
 Startery: ToxA1 CGTCCGGCTACCTAGCAATA, ToxA2 TTGTGCTCCTCCTTCTCGA, Tox3
8981cF ATGCATTTTACAAAGTTCCT, 8981cR CTACTCCCCTCGTGGGATTGCCCCAT,
8981g1F TTCGACAGCCTTCACACGTA, 8981g1R ACAACGAGATTTGGCTTTGC, Tox11F
TTCCGGTGATCAATGCTGCT,
Tox11R
AGGGTTGCAGTCAATCCCAG,
Tox12F
CTGCCGAGCAAGTATTTCCG, Tox12R AGAGCAGCAGAGTTCGTGAG.
 Procedura przygotowywania ekstraktów toksyn: Hodowla izolatów na pożywce płynnej,
odfiltrowywanie grzybni na bibule filtracyjnej, oczyszczanie filtratu przy użyciu bibuły Whatman 6,
ultrafiltracja przy użyciu filtrów membranowych 0,45µm, dializa na membranie 8,5 kDa, wytrącanie
acetonem, zawieszanie białek w buforze MOPS pH 7,5.
17
 Testowanie odporności obiektów na ekstrakty: Drugi liść infiltrowany ekstraktem przy użyciu
strzykawki bez igły, wynik po 3-4 dniach.
 Testowanie odporności obiektów na S.nodorum w warunkach fitotronowych: Siewki hodowane
w multiplatach w 2 powtórzeniach zakażanych, inokulowanych po pełnym rozwinięciu drugiego
liścia, przy pomocy inokulum zarodników pyknidialnych o stężeniu 2mln/ml. Ocena 7-14 dni. Wynik:
Średnia z powierzchni porażonego liścia dla 2 serii po 8 liści każda.
 Testowanie odporności obiektów na S.nodorum w warunkach polowych: Poletka 1m2,
3 powtórzenia zakażane trzykrotnie w ciągu sezonu. Oceny w odstępach tygodniowych od pierwszych
objawów do zaschnięcia roślin.
 Hodowla linii różnicujących w warunkach szklarniowo fito tronowych.
Wyniki i dyskusja:
 Na podstawie wyników PCR DNA izolatów można stwierdzić, że geny kodujące toksyny wykryto
w większości z nich. Dotychczas dostępne są sekwencję DNA trzech z sześciu opisanych toksyn. Nie
można jednak wykluczyć, że izolaty S. nodorum, u których nie wykryto badanych genów posiadają
także inne geny kodujące toksyny białkowe. Obecność ToxA stwierdzono w 9,5%, Tox1 w 82,1%
i Tox3 w 83,3% przebadanych izolatów. Procentowy udział poszczególnych klas izolatów oraz
procenty występowania poszczególnych toksyn są zgodne z danymi o europejskiej populacji
S. nodorum przedstawionych w publikacji McDonald i inni (2013).
 Friesen i Faris (2012) dowodzą, że płyn pohodowlany z trzytygodniowej kultury izolatów
S.nodorum może powodować nekrozy u podatnych obiektów pszenicy. W przeprowadzanych
badaniach tylko dla jednego izolatu uzyskano zdolność do wywoływania nekrozy dla
niezagęszczonego płynu pohodowlanego. Oznacza to konieczność poszukiwania odpowiednich
izolatów patogena zdolnych do produkcji dużych ilości toksyn oraz optymalizacji warunków ich
hodowli.
 Według dostępnych w literaturze procedur oczyszczania toksyn, na końcu procesu znajdują się one
w buforze o niskim pH 4,4–5,2 (Abeysekara i inni 2009, Friesen i inni 2007, Friesen i inni 2008, Liu
i inni 2004). Podczas prób wstępnego oczyszczania z wykorzystaniem buforów o składzie i pH
podanych w publikacjach napotykano problemy w kwestii braku różnic między oczyszczaną próbką
i kontrolą. Opierając się na opisie z publikacji Friesen i inni (2008) opisano warunki przeprowadzania
kontroli z proteinazą w których frakcja białkowa znajdowała się w buforze MOPS o pH 7,5. Również
w obecnie prowadzonych badaniach bufor MOPS pH 7,5 okazał się nietoksyczny w stosunku do
tkanki liścia. Przeprowadzono testy z 20mM octanem sodu w różnych pH: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0.
Właściwości toksyczne wykazały tylko próbki buforu o pH 4,5 i 5,0. W razie konieczności
rozdzielania toksyn za pomocą chromatografii jonowymiennej stwarza to potrzebę wymiany buforu na
bardziej odpowiedni [np. MOPS pH 7,5] bądź jego zobojętnianie przed wykonywaniem testów na
liściach siewek.
 Przygotowano zagęszczone 50x ekstrakty izolatów w buforze MOPS pH 7,5 wykazujące
aktywność nekrotyczną na niektórych odmianach pszenicy oraz pszenżyta.
 W dotychczasowych badaniach zmierzających do uzyskania próbek toksyn umożliwiających
testowanie odporności siewek odmian ozimej pszenicy i ozimego pszenżyta sporym utrudnieniem
okazał się brak linii różnicujących, które umożliwiałyby identyfikację toksyn w próbce. W tej sytuacji
wykorzystywano dwa izolaty 13-1-1 (Tox3) i 13-2-2 (Tox1), które według wyników testu
z wykorzystaniem reakcji PCR posiadają pojedyncze, możliwe do wykrycia tą metodą toksyny.
W przetestowanym zestawie odmian wykryto obiekty podatne oraz odporne na ekstrakty ww.
izolatów. W celu otrzymania lepiej oczyszczanych białek zidentyfikowane podatne i odporne obiekty
mogą być wykorzystane do wyszukiwania frakcji aktywnych w eluacie z kolumn
chromatograficznych. Do rozdzielenia za pomocą metod chromatograficznych ekstraktu z izolatu
5-5/11 na toksyny ToxA i Tox3 pomocne jest posiadanie linii odpornej na pierwszą toksynę oraz
podatnej na drugą. Warunek ten może spełniać linia rekombinacyjna Danko13 odporna na ekstrakt
zawierający Tox3 oraz podatna na ekstrakt zawierający ToxA i Tox3. Przy jej pomocy możliwe
będzie zidentyfikowanie w eluacie z kolumny chromatograficznej frakcji zawierającej ToxA. W tym
kierunku prowadzone są dalsze prace badawcze.
 Przedstawione w niniejszym sprawozdaniu wyniki odporności na ekstrakty obiektów pszenicy
i pszenżyta nie mogą być jeszcze uznane za docelową bonitację odporności na poszczególne toksyny.
18
Testowanie obiektów badanych zbóż rozpocznie się dopiero po dalszym oczyszczeniu ekstraktów
toksyn oraz ich zweryfikowaniu na liniach różnicujących.
 Dotychczasowe badania nad udziałem toksyn S. nodorum w wywoływaniu objawów
nekrotycznych prowadzono na genotypach pszenicy. Wyniki obecnie prowadzonych badań ujawniły,
że na toksyny ww. patogena podatne są także genotypy pszenżyta.
Wnioski:
 Wyniki przeprowadzonej w okresie sprawozdawczym pracy badawczej ujawniły obecność toksyn
białkowych w filtratach pohodowlanych większości izolatów S. nodorum.
 Toksyny te są zdolne do wywołania nekrozy liści siewek ozimych odmian pszenicy i pszenżyta.
 Wykonywanie oceny genotypów badanych zbóż pod względem odporności na poszczególne
toksyny wymaga jednakże dalszej pracy nad oczyszczaniem i koncentracją toksyn, a także
zweryfikowania ich aktywności fitotoksycznej na obecnie namnażanych różnicujących toksyny
genotypach pszenicy.
Tytuł zadania: Analiza zmienności somaklonalnej indukowanej w kulturach in vitro
u roślin zbożowych.
Kierownik zadania: dr hab. P. Bednarek prof. IHAR-PIB
Cel tematu badawczego 1
Uzyskanie roślin donorowych dla kilku gatunków zbóż (jęczmień, pszenica, pszenżyto), będących
materiałem wyjściowym do kultur in vitro.
Materiały i metody
Wszystkie regeneranty, z których otrzymano rośliny donorowe (DH) wyprowadzono na drodze
androgenezy w kulturze pylników. Do założenia kultur wykorzystano rośliny wyjściowe pochodzące
z ziarniaków trzech gatunków zbóż:
- jęczmienia jarego - genotypy: 19dh/4 i 2dh/8
- pszenicy jarej - genotypy: P2/9 i P2/14
- pszenżyta ozimego - 28/2 i 32/1 i 47/4
Wyniki i dyskusja
W wyniku regeneracji na drodze kultur pylnikowych uzyskano regeneranty z roślin jęczmienia,
pszenżyta i pszenicy po 24 szt dla każdego gatunku, będące podwojonymi haploidami. Rośliny te
doprowadzono do dojrzałości a następnie zebrano nasiona. Uzyskane podwojone haploidy miały
fenotyp identyczny z roślinami będącymi źródłem tkanek do regeneracji. Wyjątkiem była frakcja
roślin albinotycznych, które w dużej ilości obserwowano u wszystkich gatunków. Mimo problemów
związanych z albinizmem zastosowane metody regeneracji dla jęczmienia, pszenicy i pszenżyta
pozwoliły na uzyskanie planowanej ilości regenerantów na drodze androgenezy.
Haploidyzacja roślin w warunkach kultur tkankowych jest od wielu lat stosowana w badaniach
podstawowych oraz na szerszą skalę w pracach hodowlanych. Z jednej strony wprowadzanie do
procesów hodowlanych form całkowicie homozygotycznych skraca czas otrzymywania nowych
odmian, z drugiej strony formy takie są wykorzystywane w badaniach podstawowych np. do
mutagenezy lub w pracach opartych na technikach markerów molekularnych.
U zbóż powszechną drogą uzyskiwania podwojonych haploidów są kultury pylnikowe lub kultury
izolowanych mikrospor. Techniki te, wykorzystujące proces androgenezy, są zależne od genotypu,
ponadto problemem jest także obecność regenerantów albinotycznych, które są efektem
nieprawidłowości wynikających z wadliwej budowy plastydów. W prezentowanym zadaniu także
zetknięto się z obecnością roślin albinotycznych, jednakże wyjściowa pula kłosów przygotowana do
uzyskania pylników pozwoliła na otrzymanie założonej ilości zielonych regenerantów.
Wnioski
Zastosowane metody regeneracji dla jęczmienia, pszenicy i pszenżyta pozwoliły na uzyskanie
planowanej ilości regenerantów na drodze androgenezy;
19
Pozyskanie materiału genetycznego (genomowe DNA) z trzech odmian zbóż wybranych do analizy;
sprawdzenie poziomu zmienności (epi)genetycznej między roślinami donorowymi;
Materiały i metody
Wysiano nasiona ze zregenerowanych roślin uzyskując po 100 siewek dla każdego gatunku (50 nasion
x 2 genotypy jęczmienia, 50 nasion x 2 genotypy pszenicy i 33 nasiona x 3 genotypy pszenżyta). Do
analizy wybrano po jednym genotypie dla każdego gatunku: jęczmień 2dh/8, pszenica P2/9, pszenżyto
28/2. Pulę roślin donorowych stanowiły te siewki, które uzyskano z nasion jednego kłosa
regenerantów otrzymanych w poprzednim zadaniu. Docelowo wybrano po 24 rośliny donorowe dla
każdego gatunku.
Z siewek zbóż zebrano liście. DNA pozyskiwano ze 100 mg tkanki za pomocą zestawu do izolacji
firmy QIAGEN. Ilość DNA oszacowano spektrofotometrycznie a czystość oraz integralność
preparatów zweryfikowano elektroforetycznie w żelu agarozowym. Tak pozyskane preparaty DNA
poddano analizie techniką met AFLP, wykonując kolejno: trawienie DNA, ligacje adapterów, wstępny
PCR oraz selektywny PCR. Wizualizacje produktów PCR wykonywano radiograficznie. Analiza
wzorów prążkowych stanowi podstawę do szacowania zróżnicowania genetycznego między roślinami
donorowymi.
Wyniki i dyskusja
Wykonano rozdziały metAFLP wykorzystując 13 par selektywnych starterów dla 24 roślin z każdego
z wybranych gatunków zbóż uzyskując wzory fragmentów DNA wizualizowane autoradiograficznie.
Amplifikowano odpowiednio 348 fragmentów DNA dla jęczmienia, 543 dla pszenicy oraz 460 dla
pszenżyta. Średnio każda para starterów powielała 27 fragmentów u jęczmienia, 42 u pszenicy i 35
fragmentów DNA u pszenżyta. Obserwowany polimorfizm w wyniku cięcia DNA jęczmienia
enzymami Acc65I i MseI wynosił 5,17%, u pszenicy 3,86%, zaś u pszenżyta 3,04%. Analogiczne
wyniki dla cięcia DNA enzymami KpnI i MseI wynosiły odpowiednio: 2,01% dla jęczmienia, 2,76%
dla pszenicy oraz 0,87% dla pszenżyta. Po wyeliminowaniu roślin wnoszących największą zmienność
w każdym gatunku, uzyskano następujący poziom zróżnicowania genetycznego w przypadku
zastosowania enzymów Acc65I i MseI: dla jęczmienia 0,57%, 0,37% dla pszenicy i 0,65% dla
pszenżyta. Podobne wartości zmienności obserwowano gdy DNA poddano cięciu enzymami KpnI
i MseI: 0,57% dla jęczmienia, 0,37% dla pszenicy oraz 0,43% dla pszenżyta. Na podstawie danych
molekularnych wykonano analizę skupień dla roślin donorowych wszystkich trzech gatunków zbóż.
Analiza ta uwidoczniła, jednoznaczne grupowanie się danych dla obydwu par enzymów
restrykcyjnych. Wynik taki świadczy o odrębności danych uzyskanych poprzez dwa zestawy
enzymów restrykcyjnych. Jednocześnie na podstawie dendrogramu i danych molekularnych możliwe
było wskazanie rośliny o najmniejszym zróżnicowaniu (epi)genetycznym. Wytypowano podstawową
pulę roślin donorowych (32 rośliny), które posłużą do uzyskania regenerantów będących obiektem
analizy w dalszych doświadczeniach. Wśród wytypowanych roślin donorowych zmienność nie
przekraczała 1% niezależnie od badanego gatunku. Ponadto, uzyskane dane molekularne pozwolą na
wykluczenie z analiz ilościowych markerów, które wśród regenerantów pochodzących od tej samej
rośliny donorowej wykazywały zmienność identyfikowaną metodą metAFLP.
Wnioski
Wytypowane na podstawie danych metAFLP rośliny donorowe będące generatywnym potomstwem
regenerantów uzyskanych na drodze androgenezy charakteryzują się minimalnym poziomem
zmienności (epi)genetycznej i mogą być wykorzystane do dalszych badań.
20
Tytuł zadania: Opracowanie i wykorzystanie metod biotechnologicznych do skrócenia
cyklu hodowlanego pszenżyta oraz do poprawy efektywności selekcji - miejscowospecyficzna mutageneza z wykorzystaniem miejscowo-specyficznych nukleaz.
Kierownik zadania: dr A. Linkiewicz
Cel zadania:
Optymalizacja metody indukowania miejscowo-specyficznych mutacji w genomie na przykładzie
rośliny modelowej Arabidopsis thaliana
Konstrukty z genami reporterowymi pYF133 z gfp i pGH217 z uidA zostały wprowadzone do bakterii.
Prace mikrobiologiczne wykonano na E. coli szczep DH5α i A.tumefaciens szczep AGL1 i LBA4404
przy użyciu standardowych metod. Elektroporację przeprowadzano na aparacie MicroPulser wg
procedury Bio-Rad. Plazmidy izolowano przy użyciu zestawów do izolacji DNA plazmidowego
Macherey Nagel lub metodą mini preparatyki plazmidu według Sambrook, Fritsch Maniatis (1982).
Pomiar stężenia DNA wykonano na spektrofotometrze a jakość potwierdzono na żelach agarozowych.
Sprawdzenie poprawności klonowania wykonano dzięki analizie PCR oraz analizie restrykcyjnej
plazmidu. Wytypowanie sekwencji docelowej dla zaprojektowania nukleaz TALEN wykonano
poprzez analizę zgromadzonych materiałów, dane literaturowe oraz analizy sekwencji wektorów.
Sekwencje zaprojektowanych efektorów TAL zostały sprawdzone przy użyciu algorytmu blast oraz
oprogramowania Paired Target Finder™ (Cornell University, 2014) oraz TALENoffer™ Analizę
bioinformatyczną wykorzystującą algorytmy doboru i selekcji nukleaz TALEN o najwyższym
prawdopodobieństwie skuteczności w stosunku do testowanej sekwencji przeprowadzono w ramach
współpracy z Thermo Fisher Scientific GmbH. Sekwencjonowanie i analizę sekwencji rejonu edycji
genomu Arabidopsis przeprowadzono w IBB-PAN. Do badań użyto nasiona rzodkiewnika
(A. thaliana) odmiany Columbia i Wassilievskaya typu dzikiego oraz uzyskane linie transgeniczne
z genem gfp i uidA (GUS). Rośliny po wernalizacji (4°C, 4 dni) były uprawiane w fitotronie (16/8°C
dzień/noc, 20,000 lux) do momentu rozkrzewienia, przez ok. miesiąc. Po indukcji rozwoju
generatywnego rośliny rzodkiewnika z wykształconymi 3-4 pędami kwiatostanowymi poddano
infiltracji metodą floral-dip wg Bechtold i in. (1993) z modyfikacjami Clought i Bent (1998)
i własnymi. Rośliny z wykształconymi 3-4 pędami kwiatostanowymi transformowano cyklicznie 4-6
razy w odstępie 4 dniowym. Selekcja transformantów prowadzona była in vitro, po wstępnej
sterylizacji nasion. Sterylne nasiona rozprowadzano na płytce ze stałą pożywką selekcyjną ½ MS
z czynnikiem selekcyjnym. Rośliny rosły zgodnie z procedurą do transformacji zaproponowaną przez
Harrison i inni, 2006. RNA wyizolowano przy użyciu metody NucleoSpin® RNA Plant (MachereyNagel) z potomstwa roślin A. thaliana (pYF133) oraz rośliny kontrolnej (ekotyp Col-0) i pozostałych
kontroli. Intensywność fluorescencji obserwowano pod stereoskopem Leica w świetle niebieskim
o długości fali 470nm wzbudzając 2-3 dniowe siewki. W celu sprawdzenia czystości oraz
integralności wyizolowanego RNA przeprowadzono elektroforezy w żelu denaturującym
z formaldehydem. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu zestawu High-Capacity cDNA
Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems).
Wyniki i dyskusja:
Sprawdzenie możliwości edycji genomu roślin poprzez zaprojektowanie efektorów TAL do
wprowadzenia zmian w obrębie sekwencji genu reporterowego wydaje się optymalnym podejściem do
dalszych prac nad zmianami w ważnych agronomicznie cechach. Na podstawie analiz danych
literaturowych, analizy sekwencji w bazach danych, analiz w programie TALEN Targeter™
i korzystając ze wsparcia bioinformatycznego Thermo Fisher Scientific GmbH zaprojektowano
sekwencje efektorów TAL dla genu reporterowego uidA (GUS) i dla genu reporterowego gfp.
Zaprojektowane nukleazy TALEN oceniono pod kątem możliwości oddziaływania z sekwencjami
"off-target", czyli innymi miejscami w genomie poza właściwym, docelowym miejscem wiązania dla
danej cząsteczki. W celu transformacji roślin uzyskane plazmidy z genami reporterowymi zostały
poddane analizie restrykcyjnej oraz analizom PCR. W wyniku transformacji roślin zidentyfikowano
20 linii GM A. thaliana zawierających fragment T-DNA charakterystyczny dla wektora pYF133.
Aklimatyzację w pokoju hodowlanym przeżyło 16 z 20 roślin. Nie zaobserwowano fluorescencji genu
21
reporterowego gfp u linii A. thaliana/AGL1/pYF133 niosących gen gfp. Z tego powodu
przeprowadzono analizy ekspresji transgenów na poziomie RNA i potwierdzono ekspresje na
poziomie RNA. Temat zakłada uzyskanie stabilnej i wysokiej ekspresji genów reporterowych
w roślinach A. thaliana w celu obserwacji zmian powodowanych przez działanie miejscowospecyficznych nukleaz. Uzyskana ekspresja na poziomie mRNA i brak stabilnej ekspresji na poziomie
białka wymaga dopracowania konstruktu pYF133 w tym możliwej zmiany promotora. Dla
dostarczenia TALEN na teren komórki roślinnej i uzyskania efektu precyzyjnych mutacji
i unieczynnienia genów reporterowych pożądany jest stabilny poziom ekspresji bialka. A. tumefaciens
szczep AGL-1 z wektorem pGH217 został wykorzystany do transformacji 20 roślin A. thaliana ekotyp
Ws. Nasiona zostały zebrane i wysiane na pożywki selekcyjne. Rośliny pokolenia F1 są aktualnie
analizowane.
Wnioski:
 Wykazano możliwość budowy konstruktów TALEN do mutagenezy miejscowo-specyficznej dla
sekwencji genów markerowych używanych do transformacji roślin.
 Użycie proponowanych konstruktów z genami reporterowymi stanowi dogodny model do badania
edycji genomów roślin z zastosowaniem nukleaz TALEN.
 Scharakteryzowano nieliczne miejsca możliwego oddziaływania efektorów TAL_GUS i TAL_GFP
poza miejscem docelowym. Głównie homologia ogranicza się do sekwencji rejonu wiążącego DNA
i zwykle nie przekracza 15 nukleotydów.
 Istnieje małe prawdopodobieństwo oddziaływania konstruktów TALEN projektowanych dla
sekwencji transgenicznych, w tym sekwencji genów reporterowych na inne rozpoznawane sekwencje
w genomie rośliny.
 Zoptymalizowany protokół do agrotransformacji A. thaliana metodą floral-dip umożliwia
uzyskanie transgenicznych roślin, w których metodą ukierunkowanej edycji genomu TALEN mogą
być wyciszane geny reporterowe
 Zoptymalizowany protokół PCR pozwala na szybki screening roślin genetycznie
zmodyfikowanych niosących region T-DNA charakterystyczny dla wprowadzonego konstruktu
 Niedostateczny poziom ekspresji reportera uzyskany po transformacji A.th/AGL1/pYF133
wymaga modyfikacji lub zmiany konstruktu.
Tytuł zadania: Poszukiwanie markerów molekularnych genów utrzymania sterylności
pyłku u pszenżyta z cms- Tt.
Zwiększenie częstości rekombinacji w obrębie linii rekombinacyjnych metodą pojedynczych
ziarniaków na poziomie pokoleń (F4-F8).
Materiał badawczy stanowiło 5 populacji mapujących RIL5 składających się z około 250 linii
wsobnych każda prowadzona w chowie wsobnym metodą pojedynczych ziarniaków. Częstotliwość
rekombinacji badano w przypadku jednej z pięciu ww linii RIL (RIL5: MS 112(15)-2-1 dop x Borwo).
Wyniki i dyskusja:
Uzyskane wyniki dla populacji mapującej RIL5: MS 112(15)-2-1 dop x Borwo pokazują, że
zróżnicowanie genomu linii badanej populacji mapującej uległo zwiększeniu o czym świadczy
występowanie "poszatkowania" oraz krótkich fragmentów DNA pochodzących od różnych form
rodzicielskich. Należy oczekiwać, że również w przypadku pozostałych populacji mapujących RIL
częstość rekombinacji uległa zwiększeniu a dalsze prowadzenie materiałów roślinnych metodą SSD
doprowadzi do pogłębienia się obserwowanych zmian.
22
Wnioski:
Metoda SSD umożliwia zwiększanie częstości rekombinacji w obrębie linii wsobnych. Wskazanym
jest wyprowadzanie kolejnych pokoleń linii populacji mapujących metodą SSD celem kumulowania
aktów rekombinacji w obrębie poszczególnych genotypów.
Cel tematu badawczego 2:
Określenie występowania genów utrzymania sterylności pyłku w obrębie linii RIL populacji
mapujących poprzez fenotypowanie roślin BC1F4: MS 114(5)-2-1 cms Tt x [RIL4: MS 114(5)-2-1dop.
x Borwo] oraz wstęp do oceny występowania genów utrzymania sterylności pyłku w obrębie linii
RIL5 na bazie populacji wstecznych BC1F5: DB1 cmsTt x [RIL5: DB1xRB1] x oraz BC1F5: MS HT
352 cms Tt x [RIL5: MS HT 352 dop. x Borwo].
Materiał do badań stanowiły rośliny BC1F4: MS 114(15)-2-1 cms x [RIL4: MS 114(15)-2-1dop.
X Borwo], u których badano stopień zawiązywania ziarniaków. Linie populacji RIL5: DB1 x RB1
oraz RIL5: MS 112(15)-2-1 dop. x Borwo krzyżowano wstecznie z formami matecznymi tych
populacji na cms Tt. Krzyżowanie przeprowadzono pod izolatorami. Zebrano ziarniaki, które
następnie wysiano oraz zaizolowano linie RIL5: MS HT 352 dop. x Borwo do krzyżowań wstecznych
w roku 2015.
Wyniki i dyskusja:
Stwierdzono zróżnicowanie w zawiązywaniu ziaren u poszczególnych form populacji BC1F4: MS
114(5)-2-1 cms Tt x [RIL4: MS 114(5)-2-1dop. x Borwo]. Identyfikowano zarówno formy, które
praktycznie nie zawiązywały ziarniaków jak i takie, które dawały ich nawet 83 w kłosie. Analiza
rozkładu cechy wykazała, że ma ona rozkład nieznacznie odbiegający od normalnego. W wyniku
krzyżowania wstecznego RIL5: DB1 x RB1 z formą mateczną uzyskano ziarniaki BC1F5: DB1 cms Tt
x [RIL5: DB1 x RB1] reprezentujące 216 linii populacji RIL5: DB1 x RB1. Tylko w nielicznych
przypadkach stwierdzono brak zawiązywania lub występowanie niewielkiej liczby ziarniaków
w izolowanym kłosie. W przypadku krzyżówki BC1F5: MS HT 112(15)-2-1 cms Tt x [RIL5: MS HT
112(15)-2-1 dop. x Borwo], ziarniaki zawiązało 40 z 300 krzyżowanych z formą mateczną linii RIL5.
Ziarniaki obu populacji BC1F5 wysiano w polu celem oceny zawiązywania ziarniaków w roku 2015.
Wnioski:
Na podstawie danych dotyczących zawiązywania ziaren w BC1F4: MS 114(5)-2-1 cms Tt x [RIL4: MS
114(5)-2-1dop. x Borwo], stwierdzono w obrębie populacji RIL4: MS 114(5)-2-1dop. x Borwo
występowanie genów utrzymania sterylności pyłku u pszenżyta z cms Tt. Warunki pogodowe
uniemożliwiły uzyskanie odpowiedniej reprezentacji ziarniaków BC1F5: MS 112(15)-2-1 cms Tt
x [MS 112(15)-2-1dop. x Borwo] i koniecznym jest wykonanie większej ilości krzyżowań.
W przypadku pozostałych krzyżowań wstecznych realizowanych dla BC1F5: DB1 cms Tt
x [DB1xRB1], zawiązywanie ziarniaków przebiegło pomyślnie.
Cel tematu badawczego 3:
Genotypowanie linii rekombinacyjnych (konkretnie RIL4: MS 114(5)-2-1 x Borwo oraz RIL5: MS
112(15)-2-1 dop x Borwo) populacji mapujących za pomocą markerów DArTseq.
Materiałem badawczym były preparaty DNA około 200 linii RIL dwóch populacji mapujących RIL4:
MS 114(5)-2-1 x Borwo oraz RIL5: MS 112(15)-2-1 dop x Borwo prowadzonych na normalnej
cytoplazmie. Analiza molekularna została wykonana w firmie Diversity Arrays Technology P/L
w Australii.
Wyniki i dyskusja:
W wyniku genotypowania populacji RIL4: MS 114(5)-2-1 x Borwo oraz RIL5: MS 112(15)-2-1 dop
x Borwo uzyskano odpowiednio 52000 i 56000 markerów (DArTseq i silico DArT) w postaci
macierzy z segregacjami. Przy czym markerów DArTseq otrzymano około 10 000 i 12 000 dla
populacji RIL4 i RIL5. Metoda DArTseq umożliwiła uzyskanie dużej liczby markerów, która
wielokrotnie przekraczała możliwości stosowanych wcześniej markerów DArT czy SSR.
W porównaniu do markerów GBS markery DArTseq charakteryzowały się zdecydowanie niższym
stopniem brakujących danych.
23
Wnioski:
Profilowanie populacji RIL4: MS 114(5)-2-1 x Borwo umożliwiło uzyskanie ok 10000 markerów
DArTseq o pożądanej segregacji i dopuszczalnej liczbie brakujących danych użytecznych do
mapowania genetycznego. Profilowanie populacji RIL5: MS 112(15)-2-1 dop x Borwo umożliwiło
uzyskanie 12000 markerów DArTseq użytecznych do mapowania genetycznego.
Cel zadania:
Identyfikowanie QTLi warunkujących utrzymanie sterylności pyłku z wykorzystaniem mapowania
kompozytowego w oparciu o mapowanie genetyczne i badaną cechę oraz mapowanie asocjacyjne.
Mapy genetyczne opracowano z wykorzystaniem markerów DArTseq dla populacji RIL5: MS
112(15)-2-1dop. x Borwo oraz DArTseq i GBS dla populacji RIL4: MS 114(5)-2-1dop. x Borwo
z wykorzystaniem programu MultiPointUltraDense (demo). Dla każdej z grup niezrównoważenie
sprzężeń obliczono w programie GGT2. Mapowanie kompozytowe oraz asocjacyjne wykonano dla
populacji RIL4: MS 114(15)-2-1dop. x Borwo. Mapowanie kompozytowe zrealizowano w programie
WinQTL Cartographer. Mapowanie asocjacyjne przeprowadzono w programie TASSEL.
Wyniki i dyskusja:
Mapę genetyczną populacji RIL4: MS 114(5)-2-1 dop. x Borwo opracowaną w 2013r w oparciu
o markery GBS zagęszczono 1402 DArTseq, 10 markerów Xgwm, 11 Xrems, 6 Xscm. Opracowano
31 grup sprzężeń opartych o 714 markerów szkieletowych oraz 1007 markerów redundantnych. Na
podstawie mapowania porównawczego w oparciu o znaną lokalizację markerów DArTseq u pszenicy
6 grup sprzężeń (LG5, LG6, LG8, LG14, LG17, LG29) populacji mapującej przypisano do genomu A
oraz 8 (LG2, LG3, LG4, LG9, LG10, LG16, LG 21, LG26) do B. Brak danych o lokalizowaniu się
markerów DArTseq na mapach genetycznych żyta uniemożliwił określenie, które grupy odpowiadają
którym chromosomom genomu żytniego. Mapę genetyczną populacji RIL5: MS 112(15)-2-1 dop.
X Borwo opracowano w oparciu o 11 340 markerów DArTseq. Opracowano 37 grup sprzężeń z 1895
markerami szkieletowymi oraz 2266 markerami redundantnymi. Na podstawie mapowania
porównawczego, w oparciu o znaną lokalizację markerów DArTseq u pszenicy, 14 grup sprzężeń
populacji mapującej przypisano do genomu A (1A: LG21; 2A: LG6, LG12; 3A: LG9, LG11; 4A:
LG10, LG27; 5A: LG28, LG37; 6A: LG34, LG13; 7A: LG2, LG7, LG31) 17 do B (1B: LG3, LG25,
LG29, LG30; 2B: LG5; 3B: LG16, LG19, LG24, LG32; 5B: LG1, LG4, LG15; 6B: LG18, LG23;
7B: LG14, LG20, LG33). Brak danych o lokalizowaniu się markerów DArTseq na mapach
genetycznych żyta uniemożliwił określenie, które grupy odpowiadają którym chromosomom żyta.
Analiza niezrównoważenia sprzężeń ujawniła, że największy dystans pomiędzy markerami na mapie
genetycznej powinien wynosić 4 cM dla populacji RIL5: MS 112(15)-2-1 dop. x Borwo oraz 4.9 cM
dla populacji RIL4: MS 114(5)-2-1 dop. x Borwo. Interwałowe mapowanie kompozytowe dla
populacji RIL4: MS 114(5)-2-1 x Borwo pozwoliło na identyfikację QTLa determinującego cechę
męskiej sterylności pyłku u pszenżyta z cms Tt. Stwierdzono, że cecha była warunkowana genem
lokalizującym się w grupie sprzężeń LG4, którą najprawdopodobniej można przypisać do
chromosomu 5B. Mapowanie asocjacyjne z wykorzystaniem ogólnego modelu liniowego (GLM)
umożliwiało identyfikację dwudziestu trzech markerów asocjowanych z cechą męskiej sterylności
pyłku u pszenżyta. Dziewięć z nich lokalizowało się w grupie sprzężeń LG4 (5B), kolejne trzy
w grupie LG12 (brak lokalizacji), jeden w grupie LG23 (7D), a dziesięć nie znalazło się na mapie
konsensusowej. Analiza MLM potwierdziła asocjacje markerów lokalizujących się w grupie sprzężeń
LG6 (prawdopodobna lokalizacja chromosomowa 5B) oraz LG4 i LG1 (3A) z cechą męskiej
sterylności pyłku u pszenżyta. Niektóre markery identyfikowane metodą GLM i MLM w grupie LG4
pokrywały się z markerami lokalizującymi się w maksimum QTLa identyfikowanego za pomocą
mapowania kompozytowego.
Wnioski:
Opracowano dwie mapy genetyczne RIL4: MS 114(5)-2-1 x Borwo i RIL5: MS 112(15)-2-1 dop.
X Borwo. Mimo wysycenia mapy genetycznej markerami SNP obserwowano duże luki - obszary
pozbawione markerów. Takie luki są wynikiem rzadkich aktów rekombinacji w niektórych obszarach
genomu. Można dążyć do ich zagęszczenia poprzez zwiększenie liczebności profilowanych populacji,
dalsze prowadzenie linii RIL metodą SSD oraz zastosowanie markerów zdolnych do identyfikowania
polimorfizmu pojedynczych nukleotydów. Mapowanie porównawcze wykonane dla RIL4: MS 114(5)24
2-1 x Borwo umożliwiło przypisanie części grup sprzężeń do chromosomów pszenicy. Brak
analogicznych danych dla żyta nie daje możliwości wykonania podobnych badań na obecnym etapie
rozwoju metody DArTseq. Mapowanie kompozytowe wykazało, że w obrębie populacji RIL4: MS
114(5)-2-1 x Borwo za utrzymanie sterylności pyłku odpowiada co najmniej jeden gen lokalizujący
się na chromosomie 5B oraz prawdopodobnie minimum dwa dodatkowe geny o słabszych efektach.
Mapowanie asocjacyjne jest rozsądnym uzupełnieniem mapowania kompozytowego i sugeruje, że
w utrzymaniu sterylności pyłku u pszenżyta z cms Tt mogą uczestniczyć geny lokalizujące się na
chromosomach 3A, oraz na jednym z chromosomów 7 grupy homologicznej. Zarówno mapowanie
kompozytowe jak i mapowanie asocjacyjne, przynajmniej w przypadku populacji RIL4: MS
114(5)-2-1 x Borwo, sugerują, że utrzymanie sterylności pyłku u pszenżyta z cms Tt jest
warunkowane interakcją wielu genów o relatywnie słabych efektach. Taka cecha może się okazać
trudna do selekcji. Uzyskane wyniki stanowią potwierdzenie wcześniejszych danych o złożoności
badanej cechy, warunkowanej interakcją wielu genów lokalizujących się na różnych chromosomach
(genom A i B) gatunku i pokazują odrębność systemu cmsTt w porównanu z cms P u żyta.
Tytuł zadania: Badania nad optymalizacją metod indukowanego podwajania garnituru
chromosomowego w haploidalnych regenerantach pszenżyta.
Kierownik zadania: dr S. Oleszczuk
Cel zadania:
Zbadanie wpływu związków antymitotycznych na efektywność podwajania genomu i wytworzenie
płodnych regenerantów pszenżyta na drodze androgenezy.
Materiał wyjściowy uzyskano w wyniku ukierunkowanych krzyżowań genotypów pszenżyta ozimego
o różnym pochodzeniu. Z otrzymanych ziarniaków wytworzono rośliny donorowe, z których po prekulturze (3 tyg /4°C) pędów kłosonośnych wyizolowano pylniki (stadium wakuolizacji mikrospor) na
pożywki indukujące w celu zainicjowania procesu androgenezy. Wytworzone struktury androgeniczne
przenoszono na pożywki regeneracyjne. Procedurę podwajania genomu przeprowadzono w oparciu
o bezpośrednie działanie związków z grupy dinitroanilin (trifluralina -T) oraz fosforotioamidów
(aminoprophos-methyl–APM) na regeneranty znajdujące się na pożywkach regeneracyjnych. Zbadano
efekt wpływu powyższych związków antymitotycznych w zależności od stężenia (5 i 10µM) oraz
czasu działania (2-7dni). Poziom ploidalności zregenerowanych roślin określono przy pomocy
cytometru przepływowego.
Wyniki i dyskusja:
Efektem krzyżowania roślin wyjściowych było otrzymanie 4 nowych form mieszańcowych pszenżyta
ozimego. Androgeniczne regeneranty uzyskano dla wszystkich krzyżówek, a liczba roślin zielonych/
kłos wahała się od 9 do 24,5. Potomstwo mieszańca Bo 2544 (powstał w oparciu o system DH)
odznaczało się najwyższą wartością wskaźnika regeneracji. Przeżywalność eksplantatów
poddawanych działaniu inhibitorów mitozy była zależna od etapu rozwojowego rośliny, stężenia
inhibitorów i czasu ekspozycji. Negatywny wpływ badanych związków najszybciej zauważalny był na
najmniejszych roślinach (0,5-1cm), czego efektem było żółknięcie tkanek, spowolnienie wzrostu
i anomalie morfologiczne. Trifluralina miała bardziej negatywny wpływ na wzrost i rozwój
eksplantatów, w porównaniu do APM stosowanego w tych samych dawkach, niezależnie od czasu
działania. Przeżywalność regeneratów na skutek 5 dniowej ekspozycji na 5 i 10µM APM wahała się
od ok. 50% do 95%, natomiast po zastosowaniu 10µM T wskaźnik ten był dwukrotnie niższy.
Zastosowanie stężenie T rzędu 10µM przy 7-dniowym traktowaniu było przyczyną najwyższego
odsetka śmiertelności roślin. Część eksplantatów wykazywała liniowo specyficzną reakcję na
zastosowany związek. Regeneranty ze spontanicznie podwojoną liczbą chromosomów w próbach
kontrolnych stanowiły od 28,6 do 63,8% badanych linii. W zależności od genotypu, udział DH
uzyskanych w wyniku indukowanej diploidyzacji in vitro wahał się od 31,5% do 64%. Nie
zaobserwowano wpływu badanych związków na zjawisko aneuploidalności oraz powstawania roślin
25
o wyższej ploidalności. Występowanie aneuploidów, stanowiących ponad 5% wszystkich roślin
wykazano zarówno u form tri- jak i heksaplopidalnych. Ponadto otrzymano 1,2% hiperploidów (9x0,9% i 12x-0,3%) oraz 0,8 % osobników miksoploidalnych. Efektywność indukowanego podwojenia
nie była wyraźnie zależna od badanych stężeń antymitotyków oraz nie wzrastała z wydłużeniem czasu
inkubacji w ich obecności.
Pomimo, że pszenżyto podatne jest na androgenezę i regenerację tą drogą roślin, jest gatunkiem
wykazującym niestabilność mejotyczną, która jest wyższa w mieszańcach F1 niż w ustabilizowanych
formach rodzicielskich. Istotną kwestią w jej ograniczeniu może być użycie komponentów powstałych
w oparciu o linie DH. Przy optymalizacji metody diploidyzacji niskie stężenie antymitotyków może
być niewystarczająco skuteczne, natomiast zbyt wysokie może mieć letalny wpływ na traktowane
eksplantaty. Fitotoksyczny efekt inhibitorów mitozy, przy dawkach podwajających liczbę
chromosomów w dużym stopniu może obniżać przeżywalność eksplantatów. Rośliny na wczesnych
stadiach rozwoju wydają się charakteryzować dużo większą wrażliwością na te same dawki
antymitotyków w porównaniu z tkanką kalusową. Tworzenie roślin innych niż DH nie musi być
bezpośrednio związane z zastosowaniem konkretnego antymitotyku ze względu na skłonność
pszenżyta do zaburzeń mejozy oraz możliwość nabycia nowej zmienności w warunkach in vitro.
Wnioski:
 Wykorzystanie jako komponentów form o wysokim stopniu homozygotyczności może przyczynić
się do podniesienia stabilności genetycznej mieszańców, charakteryzujących się wyższą
efektywnością androgenezy i regeneracji roślin ze spontanicznie podwojonym genomem.
 Trifluralina ma bardziej toksyczny wpływ na wzrost i rozwój eksplantatów w porównaniu do
aminoprofos-metylu stosowanego w tej samej dawce i takim samym czasie inkubacji.
 Skuteczność działania herbicydów antymitotycznych w warunkach in vitro wydaje się być zależna
od genotypu. Tylko w niektórych przypadkach ich działanie miało marginalną przewagę nad
spontanicznym podwojeniem.
Tytuł zadania: Poszukiwanie markerów molekularnych genów przywracania płodności
pyłku u żyta (Secale cereale L.) z CMS-Pampa.
Temat badawczy 1: Zwiększenie częstości rekombinacji w obrębie linii rekombinacyjnych metodą
pojedynczych ziarniaków na poziomie pokoleń F5-F7.
Cel
Zwiększenie częstości rekombinacji w obrębie linii wsobnych poszczególnych populacji RIL poprzez
uzyskanie ziarniaków F5-F7 linii rekombinacyjnych dla populacji mapujących żyta z genami
przywracania płodności pyłku w systemie cytoplazmatyczno-jądrowej męskiej sterylności typu
pampa.
Materiały i metody
Materiał do wyprowadzenia kolejnych pokoleń RIL stanowiły następujące populacje mapujące:
1. S 60/08 (S 305N/00*SO 2R/05): pokolenie F6/F7; DANKO Sp. z o.o.
2. S 64/04/01 (S 305N/00*SO 37R/05): pokolenie F6/F7; DANKO Sp. z o.o.
3. RIL-A; pokolenie F5/F6; PHR Sp. z o.o.
4. RIL-B; pokolenie F5/F6; PHR Sp. z o.o.
Populacje mapujące na normalnej cytoplazmie prowadzono w chowie wsobnym metodą pojedynczych
ziarniaków. Zebrane ziarniaki wysiano w celu uzyskania kolejnych pokoleń RIL (warunki polowe).
Częstotliwość rekombinacji badano w przypadku poszczególnych linii populacji RIL-A. W tym celu
z liści roślin odpowiadających liniom populacji RIL wyizolowano DNA. Preparaty DNA poddano
profilowaniu metodą DArTseq. Wykonano mapowanie genetyczne w programie MultiPoint
UltraDense (demo). Częstotliwość rekombinacji w przypadku populacji RIL-A badano przy pomocy
programu Graphical GenoTypes Software (GGT2).
26
Wyniki
Analiza grup sprzężeń dla populacji RIL-A ukazuje wysoki poziom zróżnicowania poszczególnych
linii. Stwierdzono występowanie pochodzących od dwóch form rodzicielskich fragmentów DNA
o różnej długości. Występowanie krótkich obszarów DNA pochodzących od jednej z form
rodzicielskich świadczy o kumulacji aktów rekombinacji na krótkich fragmentach genomu dla
analizowanych linii z populacji RIL-A. Nie we wszystkich grupach sprzężeń obserwuje się jednak
dostatecznie wysoki stopień przetasowania genomów rodzicielskich.
Dyskusja
Metoda pojedynczych ziarniaków pozwala na uzyskanie kolejnych pokoleń RIL. W rezultacie
następuje zwiększenie poziomu homozygotyczności. Zwiększeniu ulega również częstotliwość
rekombinacji, która ma istotny wpływ na rozdzielczość map genetycznych oraz próby określenia
obszaru genomu związanego z daną cechą. Przetasowanie genomów nie jest jednak dostatecznie silne.
Zwiększona częstość rekombinacji pozwala na identyfikację lokalizacji cechy z większą dokładnością,
gdyż obszar lokalizacji cechy jest zawężany do mniejszego fragmentu genomu. Obserwowany wzrost
częstości rekombinacji nie jest jednak dostateczny i należy dążyć do jego zwiększenia poprzez dalsze
prowadzenie materiałów roślinnych metodą SSD.
Wnioski
1. Metoda SSD zwiększa częstość rekombinacji w obrębie linii wsobnych.
2. W obrębie niektórych grup sprzężeń występują obszary genomu, które tylko w niewielkim stopniu
uległy rekombinacji. Obszary te mogą być słabo wysycone markerami molekularnymi, co może
powodować problemy z identyfikacją markerów silnie sprzężonych z genami cechy.
3. Wskazanym jest wyprowadzanie kolejnych pokoleń linii populacji mapujących metodą SSD celem
kumulowania aktów rekombinacji w obrębie poszczególnych genotypów.
Temat badawczy 2: Ocena występowania genów przywracania płodności pyłku u żyta z cms pampa na
podstawie fenotypu roślin uzyskanych w wyniku krzyżowań wstecznych z formą mateczną
Cel
1. Ocena obecności jądrowych genów przywracania płodności pyłku linii RIL populacji mapujących
żyta (BCR-A i BCR-B).
2. Wstęp do oceny obecności jądrowych genów przywracania płodności pyłku linii RIL populacji
D(N)*R(P) S60/08 (BC1F6).
Materiały i metody
Materiał do badań stanowiły rośliny BC1F4 (BCR-A i BCR-B), u których badano płodność
poszczególnych linii. Ocena płodności roślin została opracowana na podstawie bonitacyjnej skali
pylenia Geigera. Rozkład cechy oceniono w programie XLStat (Addinsoft).
Ze względu na wyniki fenotypowania populacji BC1F4 (S305P/00 x S 60/08) uzyskane w ubiegłych
latach powtórzono doświadczenie polowe polegające na wyprowadzeniu populacji wstecznych
opartych o linie RIL S 60/08. Wyprowadzono populacje BC1F6 uzyskane w wyniku krzyżowania
3 form matecznych (linia męskosterylna z cms pampa – S305P/00, oraz dwa pojedyncze mieszańce
sterylne SIN 2 i CSIN 168) z liniami populacji mapującej S 60/08 (na cytoplazmie normalnej).
Ziarniaki BC1F6 wysiano w pole celem fenotypowania w roku 2015.
Wyniki
W obrębie populacji BCR-A stwierdzono, że formy sterylne stanowiły 51,1% tej populacji, natomiast
formy płodne – 41,1%. Formy pośrednie stanowiły 7,7% populacji. Cecha nie ma rozkładu zgodnego
z normalnym. W populacji BCR-B dominowały formy płodne i sterylne, nie stwierdzono
występowania form pośrednich.
Dyskusja
Określenie czy linie rekombinacyjne prowadzone na cytoplazmie normalnej (niesterylizującej)
zawierają geny przywracania płodności pyłku w systemie z cytoplazmatyczną męską sterylnością jest
możliwe poprzez wykonanie krzyżowania odpowiedniej linii matecznej na cms P z liniami
rekombinacyjnymi populacji mapującej. Potomstwo powstałe w wyniku takich krzyżowań powinno
wykazywać zróżnicowanie cechy. Bonitacyjna skala płodności pyłku pokazała, że oceniane pod
względem płodności pyłku populacje są w znacznej mierze pozbawione form częściowo płodnych,
a dominują linie sterylne i płodne. Zarówno populacja RIL-A jak i RIL-B nie mają rozkładu
normalnego. Występowanie skrajnych form może jednak być wykorzystane do mapowania
kontrastowego i podwyższyć rozdzielczość mapowania.
27
Wnioski
1. W obrębie badanych populacji występują geny przywracania płodności pyłku.
2. Brak rozkładu normalnego dla populacji BCR-A jak też BCR-B, brak fenotypów częściowo
płodnych i przewaga sterylnych oraz płodnych sprawia, że dostępne dane mogą by wykorzystane
do mapowania kontrastowego, które zwiększa rozdzielczość mapowania kompozytowego
w obszarze lub obszarach kodujących cechę.
Temat badawczy 3: Markerowanie genetyczne (DArTseq) linii rekombinacyjnych RIL-A i RIL-B
(pokolenie F4)
Cel
Uzyskanie markerów DNA umożliwiających opracowanie wstępnych map genetycznych dwóch
populacji mapujących, określenie, czy w populacjach występują klony oraz czy nie występuje
strukturyzacja form.
Materiały i metody
Materiał roślinny do analiz molekularnych został dostarczony w postaci liści reprezentujących 149
linii populacji RIL (RIL-A – 110 form, RIL-B – 39 form). Izolację genomowego DNA wykonano
zgodnie z procedurą rekomendowaną przez dostawcę zestawów do izolacji (Plant DNeasy MiniKit).
DNA charakteryzowano spektrometrycznie. Czystość i integralność poszczególnych preparatów
weryfikowano na żelach agarozowych. Analiza DArTseq dla linii populacji rekombinacyjnych żyta
została przeprowadzona w firmie Diversity Arrays Technology Pty Ltd, Canberra, Australia. Analizę
skupień wykonano metodą Ward'a w programie PAST.
Wyniki
W wyniku analiz dla obu populacji RIL uzyskano 14 222 markery DArTseq oraz 57 209 markerów
SilicoDArT. Nie stwierdzono występowania klonów i strukturyzacji form w badanych populacjach
RIL.
Dyskusja
Zastosowanie metody DArTseq przyczyniło się do opracowania dużej liczby markerów. Metoda ta
wyróżnia dwa typy markerów: DArTseq i SilicoDArT. Pierwsze to wynik zmienności pojedynczych
nukleotydów identyfikowanych dla określonych sekwencji genomowych (SNP). Markery SilicoDArT
są wynikiem zmienności w obrębie miejsca restrykcji rozpoznawanego przez restryktazę
wykorzystywaną do redukcji złożoności genomu. Ich wykorzystanie może być ograniczone do
zagęszczania map szkieletowych opartych o markery DArTseq. Markery DArTseq stanowią około
20-25% wszystkich markerów identyfikowanych tą metodą. Niemniej ich liczebność jest relatywnie
wysoka w porównaniu z liczebnością markerów DArT wykorzystywanych w latach ubiegłych. Do
oceny zróżnicowania form populacji RIL-A i RIL-B wykorzystano markery DArTseq, które na
podstawie analizy skupień wykazały, że obie populacje nie mają cech strukturyzacji.
Wnioski
1. Metoda DArTseq umożliwiła identyfikację dużej liczby markerów SNP identyfikowanych
w obrębie dwóch populacji mapujących.
2. Liczba markerów DArTseq była kilkakrotnie mniejsza niż liczba markerów SilicoDArT, co
pokazuje, że zmienność w obrębie miejsc restrykcji rozpoznawanych przez endonukleazę metody
jest większa niż zmienność wykrywana poprzez sekwencjonowanie nowej generacji.
3. Liczba markerów użytecznych do tworzenia map szkieletowych bazujących na markerach
DArTseq jest wyższa niż liczba markerów DArT.
4. Populacje mapujące RIL-A i RIL-B nie wykazują cech strukturyzacji danych.
Temat badawczy 4: Identyfikacja markerów cechy (mapowanie genetyczne/mapowanie
kompozytowe/mapowanie asocjacyjne dla przeanalizowanych populacji mapujących)
Cel
Opracowanie wstępnych map genetycznych populacji mapujących RIL-A i RIL-B oraz mapowanie
asocjacyjne i kompozytowe genów przywracania płodności pyłku.
Materiał i Metody
Mapowanie genetyczne dla populacji RIL-A oraz RIL-B wykonano w programie
MultiPointUltraDenese (demo) z wykorzystaniem markerów DArTseq oraz wybranych markerów
SilicoDArT. Mapowanie kompozytowe zostało wykonane w programie Windows QTL Cartographer
na podstawie wyników fenotypowania poszczególnych form badanych populacji z wykorzystaniem
28
markerów DArTseq i na bazie uzyskanej mapy genetycznej. Mapowanie asocjacyjne zrealizowano
w programie TASSEL na markerach DArTseq oraz SilicoDArT. Markery asocjowane z cechą
identyfikowano stosując ogólny model liniowy (General Linear Model - GLM) oraz wielokrotny
model liniowy (Multiple Linear Model - MLM). Niezrównoważenie sprzężeń LD (ang. linkage
disequlibrium - nierównowaga sprzężeń) obliczono w programie GGT2.
Wyniki
Dla obydwu populacji (RIL-A i RIL-B) na podstawie dostępnych po analizach DArTseq markerów
molekularnych uzyskano mapy genetyczne. Mapa genetyczna populacji RIL-A zawierała 8 grup
sprzężeń. Mapa genetyczna populacji RIL-B zawierała 13 grup sprzężeń. Brak danych o lokalizacji
markerów DArTseq na mapach genetycznych żyta uniemożliwił określenie, które grupy sprzężeń
odpowiadają którym chromosomom genomu żytniego. Analiza niezrównoważenia sprzężeń wykazała,
że maksymalny dystans pomiędzy markerami dla populacji RIL-A oraz RIL-B nie powinien wynosić
więcej niż odpowiednio 10 i 8 cM. Interwałowe mapowanie kompozytowe dla populacji RIL-A
pozwoliło na identyfikację QTLi sprzężonych z cechą przywracania męskiej płodności pyłku u żyta
z cms pampa. Stwierdzono, że cecha była warunkowana kilkoma genami, lokalizującymi się
w grupach sprzężeń LG1, LG5 i LG7. Analogicznie dla populacji RIL-B zidentyfikowano QTL
w grupie sprzężeń LG2. Mapowanie asocjacyjne potwierdziło wyniki mapowania kompozytowego.
Dyskusja
Mapy genetyczne populacji RIL-A i RIL-B charakteryzuje relatywnie wysokie zagęszczenie
markerami molekularnymi. Analiza niezrównoważenia sprzężeń wykazała, że występowanie
markerów genetycznych co 8-10 cM powinno wystarczyć do precyzyjnego identyfikacji obszarów
genomu odpowiedzialnych za ekspresję cechy. Mimo zagęszczenia mapy genetycznej dużą liczbą
markerów DArTseq wciąż występują obszary rozciągające się nawet na 21 cM wolne od markerów.
Biorąc pod uwagę wyniki mapowania genetycznego oraz analizę niezrównoważenia sprzężeń widać,
że należy dążyć do zwiększenia częstości rekombinacji badanych populacji metodą SSD.
Identyfikacja QTL cechy przeprowadzona za pomocą mapowania kompozytowego wykazała, że jest
ona warunkowana kilkoma jądrowymi genami przywracania płodności, które lokalizują się na różnych
chromosomach żyta. Na uwagę zasługuje fakt, że najsilniejszy QTL dla jednej jak i drugiej populacji
identyfikowano w grupach sprzężeń, do których zostało przyporządkowanych kilka tych samych
markerów. Można więc oczekiwać, że grupa LG1 populacji RIL-A oraz grupa LG2 populacji RIL-B
odpowiadają temu samemu chromosomowi, oraz że opisany QTL odpowiada genowi na chromosomie
1R. Biorąc pod uwagę specyfikę obu populacji RIL (na bazie materiałów orientalnych) jeden z QTL
może odpowiadać genowi na 4R. Jednak przypisanie grup sprzężeń na danym etapie badań nie było
możliwe i koniecznym jest kontynuowanie badań w tym zakresie.
Wnioski
1. Mapy genetyczne opracowane dla dwóch badanych populacji mapujących zostały wysycone
markerami typu DArTseq.
2. Wartości niezrównoważenia sprzężeń oraz występowanie luk sugerują konieczność dalszego
prowadzenia populacji RIL metodą SSD.
3. Mapowanie kompozytowe wykazało, że za przywracanie płodności pyłku w populacji RIL-A oraz
RIL-B odpowiada co najmniej kilka genów lokujących się na różnych grupach sprzężeń.
4. Mapowanie asocjacyjne potwierdziło wyniki mapowania kompozytowego, wskazując na
występowanie genów przywracania płodności pyłku w podobnych obszarach genomu żyta.
5. W przypadku niektórych QTL wykryto markery silnie sprzężone z genami restoracji. Markery te,
po konwersji ich do markerów LNA (lub innych) mogą okazać się użyteczne w dalszych
badaniach.
6. Koniecznym jest przypisanie grup sprzężeń do poszczególnych chromosomów żyta.
Temat badawczy 5: Uzyskanie genotypów o pożądanych kombinacjach genów przywracania
płodności pyłku z wykorzystaniem dostępnych materiałów roślinnych w oparciu o markery
molekularne.
Cel:
Uzyskanie kolejnych pokoleń linii restorerowych zawierających geny przywracania płodności pyłku.
Prowadzono krzyżowania wypierające linii restorerowych o zróżnicowanych genotypach, do których
wprowadzono gen przywracania płodności pyłku na chromosomie 4R. Wypierano genom formy
donorowej. Obecność pożądanego genu kontrolowano za pomocą markerów specyficznych.
29
Materiał i metody
Materiał roślinny stanowiły rośliny BC3F1 (218 osobników) oraz linie restorerowe (154 osobniki).
Linie BC3F1 wykastrowano i przekrzyżowano z odpowiednimi liniami restorerowymi. Analizy
molekularne wykonano na DNA roślin BC3F1 przed krzyżowaniami wstecznymi celem weryfikacji
obecności pożądanych genów. Obecność pożądanego genu kontrolowano za pomocą markerów
molekularnych opartych o reakcję PCR, opracowanych na bazie sekwencji DArT. Obecność
markerów weryfikowano elektroforetycznie na żelach agarozowych. Wykorzystano trzy markery dla
chromosomu 4R oraz dwa dla 1R.
Wyniki
Analiza 218 roślin BC3F1 za pomocą pięciu markerów molekularnych wykazała, że dla chromosomu
1R marker 508859 wystąpił u 79 osobników, zaś marker 399799 u 91 roślin. Dla chromosomu 4R
markery 401955, 506357 oraz 507026 wystąpiły odpowiednio u 175, 203 oraz 110 osobników.
Uzyskane dane świadczą o znacznym, choć niepełnym wyrównaniu tworzonych linii restorerowych
i występującej segregacji w obrębie wytwarzanych linii. Analogiczna analiza linii restorerowych
(wypierających) wykazała brak tych markerów. Rośliny BC3F1 zawierające marker na 4R i/lub 1R
zostały przekrzyżowane wstecznie z odpowiednimi liniami restorerowymi nie zawierającymi tych
markerów celem wytworzenia kolejnych pokoleń linii restorerowych wyrównanych pod względem
genetycznych w obrębie pożądanych obszarów genomu.
Dyskusja
Markery molekularne są wykorzystywane w selekcji genotypów z pożądanymi genami. W ramach
projektu markery DNA sprzężone z genami przywracania płodności pyłku umożliwiły wprowadzanie
do form restorerowych silnego genu z chromosomu 4R oraz kontrolę obecności genu lokalizującego
się na chromosomie 1R i tym samym uzyskanie linii o zróżnicowanym składzie genów przywracania
płodności. Mimo uzyskania linii BC3F1 i znacznego wzbogacenia prowadzonych materiałów
o pożądane geny wciąż obserwowano występowanie segregacji, o czym świadczy występowanie linii
BC3F1 bez markera poszczególnych genów. Oznacza to konieczność dalszego prowadzenia
materiałów roślinnych celem zwiększenia ich homozygotyczności. Biorąc pod uwagę fakt, że linie
restorerowe zawierały również inne geny przywracania płodności pyłku należy sądzić, że uzyskano
kolekcję linii restorerowych o wzbogaconym składzie genów Rf oraz o zróżnicowanych genotypach.
Wnioski
1. Specyficzne markery DNA ukierunkowane na geny lokalizujące się 1R i 4R umożliwiają
kontrolowanie przenoszenia tych genów do wybranych genotypów linii restorerowych lub
stwierdzenie tam ich obecności.
2. Uzyskanie kolejnych pokoleń linii restorerowych wzbogaconych o geny przywracania płodności,
głównie na 4R, pozwalają uzyskać zróżnicowane materiały roślinne z różnym składem tych genów.
Takie materiały mogą być użyteczne w badaniach cechy.
3. Mimo wyprowadzenia BC3F1 dla 7 genotypów restorerowych stopień homozygotyczności
uzyskiwanych materiałów wciąż nie jest dostateczny i należy przedsięwziąć działania, które
doprowadzą do ustabilizowania się prowadzonych form.
Tytuł zadania: Współdziałanie odporności na mączniaka (Blumeria graminis f.sp. hordei)
warunkowanej genem mlo z wartością cech gospodarczych jęczmienia ozimego.
Kierownik zadania: prof. dr hab. J.H. Czembor
Cel zadania:
1. Wytworzenie 4 populacji mieszańcowych F1 Mlomlo. Dwie formy wielorzędowe i dwie
dwurzędowe.
2. Wytworzenie 4 populacji mieszańcowych F1BC1, ocena molekularna na obecność genu mlo.
30
Temat badawczy 1
Do wytworzenia populacji mieszańcowych F1 Mlomlo wykorzystano linie jęczmienia ozimego
wielorzędowego BKH 735 i dwurzędowego linia 42, które maję gen mlo odporności na mączniaka
(B. gramnis f.sp. hordei) – (odmiany jęczmienia jarego jako rodzice P1). Komponentami o wysokiej
wartości innych cech gospodarczych były odmiany ozime: wielorzędowe Souleyka i Titus;
dwurzędowe SU Vireni i Metaxa (jako rodzice P2). Jarowizację i krzyżowania przeprowadzono
w warunkach kontrolowanych – fitotron z regulacją temperatury, oświetlenia i wilgotności powietrza.
Do krzyżowań wykorzystano rośliny komponentów rodzicielskich z zasiewu jesiennego po 35
dniowej jarowizacji w szklarni (wrzesień 2013r.) Krzyżowania wykonano na początku stycznia 2014r.
Nasiona F1 zebrano w fazie wczesnowoskowej, dosuszono przez 3 dni w temperaturze 350C,
wysezonowano przez 7 dni w temperaturze pokojowej. Siewki F1 po 35 dniowej jarowizacji
przeniesiono do fitotronu, w okresie krzewienia utrzymywano temperatury 190C dzień, 150C noc.
Doświetlanie dzienne 16h. Od początku strzelania w źdźbło do zbioru zmieniono warunki wzrostu
i rozwoju odpowiednio na: temperaturę 250C dzień i 190C noc i doświetlanie dzienne 18h.
Temat badawczy 2
Do wytworzenia populacji mieszańcowych F1BC1 wykorzystano rośliny 4 populacji mieszańcowych
F1 uzyskanych w zadaniu 1. Rośliny F1 przekrzyżowano odpowiednio odmianami: Souleyka, Titus,
SU Vireni i Metaxa. W poszczególnych kombinacjach uzyskano:
6-rzędowe:
(BKH 735 x Souleyka) x Souleyka – 33 nasiona,
(BKH 735 x Titus) x Titus – 27 nasion,
2-rzędowe:
(linia 42 x SU Vireni) x SU Vireni – 34 nasiona,
(linia 42 x Metaxa) x Metaxa – 31 nasion.
Uzyskane w wyniku krzyżowania ziarniaki F1BC1 zebrano w fazie wczesnowoskowej, suszono przez
3 dni w temperaturze 350C i po 7 dniowym sezonowaniu w temperaturze pokojowej wysiano
w fitotronie do jarowizacji. Po 35 dniach jarowizowane siewki przeniesiono do fitotronu w celu
uzyskania nasion pokolenia F2BC1 do analiz molekularnych. Z poszczególnych roślin zebrano kłosy
o nasionach w stadium dojrzałości wczesnowoskowej. Po wysuszeniu i wysezonowaniu jak w zadaniu
1, wysiano punktowo (multiplaty ogrodnicze):
6-rzędowe:
(BKH 735 x Titus) x Titus – 96 nasion,
2-rzędowe:
(linia 42 x SU Vireni) x SU Vireni – 80 nasion,
(linia 42 x Metaxa) x Metaxa – 72 nasiona,
formy rodzicielskie:
BKH 735, Souleyka, Titus, SU Vireni, Metaxa, linia 42.
Na materiale roślinnym przeprowadzono selekcję fenotypową oraz ocenę molekularną na obecność
genu mlo.
Do oceny fenotypowej stopnia odporności form rodzicielskich i populacji mieszańcowych na
porażenie przez B. graminis f.sp. horedi został wykorzystany izolat Bgh 27. Podstawą wyboru tego
izolatu był fakt, że jest on wirulentny w stosunku do odmian włączonych do krzyżowań, natomiast
awirulentny w stosunku do wprowadzanego genu Mlo. Doświadczenie fitopatologiczne prowadzone
było w warunkach kontrolowanych, przy fotoperiodzie 16 godz. światła i 8 godz. ciemności oraz
w temperaturze w zakresie 16-22ºC. Po upływie 8-10 dni od zakażania, została oceniona reakcja
odpornościowa roślin. Do oceny wykorzystano skalę, w której 0(4) = rośliny odporne na B. graminis
f.sp. hordei, 4 = rośliny podatne na B. graminis f.sp. hordei. Wzorce stanowiły odmiany/linie
jęczmienia o profilu mlo (kontrola pozytywna, wzorzec odporności) oraz o profilu bez mlo (kontrola
negatywna, wzorzec podatności).
W zależności od zastosowanych markerów (HVMlo1, HVMlo3), wykorzystywanych do selekcji genu
mlo, DNA wyizolowano dwoma różnymi metodami. Pierwsza metoda ekstrakcji DNA,
przeprowadzana była za pomocą buforu TPS. Otrzymany tą metodą ekstrakt, wykorzystany był
w reakcji amplifikacji dla markera HVMlo3. Druga metoda izolacji, przeprowadzana była przy użyciu
gotowego zestawu DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) i była wykorzystana podczas amplifikacji
markera HVMlo1. Podział na dwie różne metody izolacji DNA, wynikała z faktu, iż zastosowane
systemy markerowe, charakteryzują się różnymi profilami reakcji PCR, związanymi z ilością (ng) oraz
czystością DNA, wymaganą podczas reakcji amplifikacji.
31
W zależności od temperatury przyklejania się starterów do matrycy zastosowano dwa profile
termiczne reakcji PCR. Dla markera HVMlo1 warunki amplifikacji przebiegały według następującego
profilu: 94ºC/2min. denaturacji występnej, 10 cykli składających się z: 94ºC/30 sek., 55ºC/30 sek.,
72ºC/1 min., a także 30 cykli 90ºC/30 sek., 55ºC/30 sek., 72ºC/1 min. Dla markera HVMlo3 profil
reakcji PCR różnił się jedynie temperaturą hybrydyzacji, która wynosiła 55ºC/30 sek. W ostatnim
cyklu reakcji amplifikacji, etap elongacji został wydłużony do 5 min.
Produkty PCR, przed naniesieniem na żel polyakrylamidowy (Cambrex Bio Science Rockland, USA)
zostały zdenaturowane w termocyklerze, w obecności formamidu (Sigma-Aldrich, Polska)
z temperaturą grzewczą ustawioną na 105ºC i temperaturą bloku 95ºC przez 3 min.
Rozdział produktów amplifikacji PCR został przeprowadzony na sekwenatorze DNA ABI 377XL
(Applied Biosystems, USA) na 4,75% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Rozdział
elektorforetyczny przeprowadzony został w buforze 1 × TBE (0,1 M Tris, 90 mM H3BO3, 9 Mm
EDTA). Czas rozdziału produktów na żelu wynosił 2,5 godziny.
Selekcja fenotypowa:
Selekcja fenotypowa została przeprowadzona łącznie na 408 roślinach pochodzących z czterech
populacji mieszańcowych. Reakcję odporności oznaczanej w tabeli nr 1 jako 0(4) zaobserwowano
u 347 roślin, natomiast reakcję podatności oznaczanej jako 4 zaobserwowano u 61 roślin. Wszystkie
rośliny poddano selekcji molekularnej na obecność genu Mlo.
Selekcja molekularna:
Ocenie molekularnej markerem HVMlo, na obecność genu Mlo, poddano cztery populacje
mieszańcowe.
6-rzędowe:
(BKH 735 x Souleyka) x Souleyka
(BKH 735 x Titus) x Titus
2-rzędowe:
(linia 42 x SU Vireni) x SU Vireni
(linia 42 x Metaxa) x Metaxa
Wybrane siewki pokolenia F2BC1 z genem mlo umieszczono w fitotronie-chłodni celem
przeprowadzenia jarowizacji. Po jarowizacji, dalsza uprawa do uzyskania następnego pokolenia
prowadzona będzie w warunkach szklarniowych.
Wyniki:
Temat badawczy 1
Uzyskano 4 populacje mieszańcowe F1:
6-rzędowe:
BKH 735 x Souleyka – 32 nasiona,
BKH 735 x Titus – 37 nasion
2-rzędowe:
linia 42 x SU Vireni - 41
linia 42 x Metaxa - 35
Wyprowadzono w uprawie fitotronowej rośliny mieszańcowe F1 do krzyżowania wstecznego.
Temat badawczy 2
Uzyskano 4 populacje mieszańcowe F1BC1. W poszczególnych kombinacjach uzyskano:
6-rzędowe:
(BKH 735 x Titus) x Titus – 27 nasion
2-rzędowe:
(linia 42 x SU Viern) x SU Viren - 34
(linia 42 x Metaxa) x Metaxa – 31
Uzyskano siewki pokolenia F2BC1 do analiz molekularnych:
6-rzędowe:
(BKH 735 x Souleyka) x Souleyka – 160 siewek,
(BKH 735 x Titus) x Titus – 96 siewek,
2-rzędowe:
(linia 42 x SU Vireni) x SU Vireni – 80 siewek
(linia 42 x Metaxa) x Metaxa – 72 siewki.
W ocenie molekularnej markerem HVMlo stwierdzono obecność genu mlo odpowiednio:
6-rzędowe:
(BKH 735 x Souleyka) x Souleyka –
w 118 roślinach,
(BKH 735 x Titus) x Titus –
w 73 roślinach,
2-rzędowe:
(linia 42 x SU Vireni) x SU Vireni –
w 58 roślinach,
(linia 42 x Metaxa) x Metaxa –
w 50 roślinach.
Wybrane siewki pokolenia F2BC1 z genem mlo umieszczono w fitotronie-chłodni celem
przeprowadzenia jarowizacji. Po jarowizacji dalsza uprawa do uzyskania następnego pokolenia
prowadzona będzie w warunkach szklarniowych.
32
Tytuł zadania: Badanie składników determinujących wartość odżywczą i funkcjonalną
owsa oraz ich relacji w ziarnie obłuszczonym i oplewionym.
Kierownik zadania: prof. dr hab. D. Boros
Cel zadania:
Badania mają na celu opracowanie współczynników konwersji umożliwiających charakterystykę
składu chemicznego ziarna obłuszczonego na postawie składu ziarna oplewionego, niezbędnych do
szybkiego wyodrębniania genotypów owsa najbardziej przydatnych do produkcji żywności
funkcjonalnej. By ten cel osiągnąć badania składu chemicznego są prowadzone w możliwie
najbardziej zróżnicowanych pod względem genetycznym genotypach owsa zwyczajnego (Avena
sativa L.), równolegle w ziarnie oplewionym i obłuszczonym. Podjęto się również opracowania
prostych i wiarygodnych testów lepkości jako narzędzia ułatwiające w przyszłości prace w tworzeniu
genotypów owsa o wysokiej wartości funkcjonalnej bądź paszowej. Dotychczas stosowana metoda
oznaczania lepkości, opracowana do ziarna żyta, wymaga optymalizacji.
W roku 2014 realizowano trzy tematy badawcze:
1. Poznanie zmienności składu chemicznego ziarna 45 kombinacji owsa oplewionego obejmującego
zawartość składników odżywczych oraz tych o właściwościach prozdrowotnych, które są polecane
do produkcji żywności funkcjonalnej.
2. Poznanie zmienności składu chemicznego ziarna 45 kombinacji owsa obłuszczonego obejmującego
zawartość składników odżywczych oraz tych o właściwościach prozdrowotnych, które są polecane
do produkcji żywności funkcjonalnej.
3. Opracowanie optymalnych warunków pomiaru lepkości ekstraktu ziarna owsa z wykorzystaniem
ziarna obłuszczonego i oplewionego. Test ten jest główną miarą właściwości funkcjonalnych ziarna
owsa i pośrednią metodą pomiaru ilości β-glukanu ekstrahowanego do wody.
Materiałem do badań w roku 2014 były trzy zestawy ziarna: 14 linii hodowlanych i 3 odmiany owsa,
każda z nich wyprodukowana w trzech lokalizacjach o odmiennych warunkach glebowoklimatycznych: Choryni, Polanowicach i Strzelcach. Dwie odmiany oraz 13 linii były odmianami
oplewionymi, pozostałe formami nagimi. Dokładnie zważoną część ziarna (50g) każdej z próbek owsa
obłuszczono ręcznie i po zważeniu masy plewek oznaczono ich udział w masie ziarna.
W ziarnie oplewionym i obłuszczonym wykonano oznaczenia: masy tysiąca ziarniaków (MTZ), masy
hektolitra (MHL), kaloryczności oraz składników odżywczych, które obejmują zawartość białka,
składników mineralnych, lipidów ogółem, skrobi strawnej oraz cukrów wolnych. Wykonano także
analizy zawartości składników bioaktywnych, takich jak nieskrobiowe polisacharydy (NSP)
z podziałem na frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne, w tym β-glukanu, arabinoksylanów, ligniny
Klasona, oraz błonnika pokarmowego ogółem (TDF). Wszystkie wyniki przeliczono na suchą masę
i podano jako wartości średnie z 3 miejscowości.
Wyniki i dyskusja:
Temat badawczy nr 1
Plewka stanowiła średnio 24,7% ogólnej masy ziarna, przy czym najniższy udział wykazała odmiana
Bingo, a najwyższy linia STH 3-11. MTZ ziarna oplewionego wynosiła średnio 37,8g, z najwyższą
wartością w odniesieniu do linii STH 3-9, a najniższą u odmiany Krezus. Wartość średnia MHL
wynosiła 51,8kg, najcięższą masę objętościową ziarna miała odmiana Bingo a najlżejszą linia STH
3-3. Pod względem energii brutto wyróżniała się linia STH 3-11 (4522 kcal/kg). Najniższą natomiast
kalorycznością odznaczała się linia DC 13-20 (4394kcal/kg). Zawartość lipidów była cechą
najbardziej różnicującą badane oplewione linie owsa (CV=12%), spośród których wyróżniała się linia
STH 3-11. W odniesieniu do pozostałych składników, zmienność ich zawartości była w zakresie
4-7%. Ziarno oplewione zawierało średnio 11,5% białka, 2,9% składników mineralnych, 5,7%
lipidów, 41,4% skrobi oraz 1,7% cukrów wolnych. Najwyższą zawartość białka miała linia DC 13-17,
najniższą natomiast ilość tego składnika wykazały odmiana Krezus i linia STH 3-3. Spośród odmian
i linii oplewionych owsa należy wyróżnić odmianę Bingo, która charakteryzowała się najwyższą
ilością składników odżywczych w ziarnie (SSO), głównie ze względu na wysoką zawartość
składników mineralnych oraz skrobi. Najniższą SSO wykazały linie STH 3-6 i DC 13-21. Warunki
33
agro-klimatyczne miały istotny wpływ na skład chemiczny ziarna owsa. W 2013 roku najbardziej
sprzyjające warunki dla rozwoju owsa występowały w Strzelcach, a znacznie mniej sprzyjające
w Choryni.
Zawartość składników bioaktywnych była bardziej zróżnicowana, aniżeli zawartość składników
odżywczych, w zakresie od 8 do 13%. Wyższe zróżnicowanie odnosiło się do zawartości ligniny oraz
rozpuszczalnych arabinoksylanów (S-AX). Pod względem zawartości NSP na wyróżnienie zasługuje
linia DC 13-21, a także linia STH 3-11, z ilością około 26%. Odmiana Bingo odznaczała się natomiast
najniższą ich zawartością. Ziarno oplewione zawierało średnio 19,1% frakcji nierozpuszczalnej NSP,
4,1% frakcji rozpuszczalnej NSP, 8,4% ligniny oraz 31,6% włókna pokarmowego ogółem, w tym
3,1% β-glukanu i 9,8% arabinoksylanów. Pod względem zawartości składników bioaktywnych na
uwagę zasługuje linia DC 13-21 i linia STH 3-11 wyróżniające się najwyższymi zawartościami
ligniny oraz TDF.
Udział plewki w masie ziarna miał istotny (p<0.01) wpływ na zawartość wielu składników
odżywczych oraz bioaktywnych. Ze zwiększeniem jej udziału malała zawartość składników, które są
zlokalizowane wyłącznie w endospermie, a więc skrobi (r=-0.63) oraz SSO (r=-0.65). Wzrastała
natomiast zawartość składników dominujących w plewce, takich jak TDF (r=0.79), a w szczególności
I-NSP (r=0.81).
Temat badawczy nr 2
Ziarno obłuszczone badanych 15 linii i odmian owsa oplewionego oraz 2 owsa nagiego
charakteryzowało się MTZ o wartości średniej 28,4g, MHL 60,4 kg i energii brutto 4508 kcal/kg. Na
uwagę zasługuje odmiana Bingo charakteryzująca się najwyższą MTZ i jedną z najwyższych MHL.
Linia DC 13-5 wyróżniała się pod względem MHL, zaś w przypadku energii brutto najwyższą wartość
uzyskano z ziarna linii STH 9811, a najniższą z odmiany Krezus. Najniższą MTZ zmierzono
w przypadku ziarna obłuszczonego odmiany Siwek, a najniższą MHL w przypadku linii DC 13-5.
W porównaniu do ziarna oplewionego MTZ ziarna obłuszczonego obniżyła się o 25%, podczas gdy
MHL wzrosła o 16%. Z kolei energia brutto wzrosła tylko nieznacznie, o 1,4% w przypadku
obłuszczonego ziarna owsa.
Badane ziarno obłuszczone owsa charakteryzowało się zawartością białka średnio 14,6%, składników
mineralnych 2,2%, lipidów 7,6%, skrobi 59,0%, cukrów wolnych 2,0%, co składało się na 85,4%
SSO. Pod względem zawartości białka wyróżniła się linia DC 13-21, zaś w przypadku składników
mineralnych i lipidów linia STH 3-11. Podobnie jak w przypadku ziarna oplewionego lipidy były
składnikiem ziarna obłuszczonego w największym stopniu zmiennym, blisko 15%, pozostałe składniki
poniżej 10%. Najwyższą zawartością skrobi charakteryzowała się linia STH 3-3, a w zawartością SSO
linia DC 13-5 oraz DC 13-21. Ziarno obłuszczone przewyższało ziarno oplewione pod względem
zawartości białka, lipidów, skrobi i cukrów wolnych, odpowiednio o 26%, 32%, 42%, 17% oraz było
uboższe o 26% w składniki mineralne. W efekcie ziarno obłuszczone przewyższało znacznie, bo aż
o 35% SSO ziarno oplewione.
W odniesieniu do składników błonnika pokarmowego w ziarnie obłuszczonym owsa zawartość frakcji
nierozpuszczalnej NSP wynosiła średnio 4,9%, frakcji rozpuszczalnej 4,8%, zaś całkowita ich ilość
9,7%. W ogólnej ilości NSP 4,2% stanowił β-glukan i 2,8% arabinoksylany. Pod względem w/w
parametrów na uwagę zasługuje linia POB 1624/10 i linia STH 3-11. Najniższą zawartość całkowitego
NSP oznaczono w przypadku odmiany Krezus. Z pozostałych składników DF lignina stanowiła 3,6%
masy ziarniaka. Zawartość samego TDF w badanych liniach i odmianach owsa wyniosła średnio
13,3%. Pod względem zawartości ligniny wyróżniała się odmiana Siwek, a najwyższą zawartością
TDF linia STH 3-11. Usunięcie plewki składającej się głównie z ligniny, nierozpuszczalnych
w wodzie hemiceluloz oraz powiązanych z nimi składników mineralnych wpłynęło w sposób
znaczący na zawartość składników błonnika pokarmowego w ziarnie obłuszczonym. Zwiększeniu
uległy przede wszystkim zawartości β-glukanu, o 36%, oraz frakcji rozpuszczalnej NSP, o 18%,
a zmniejszyła się zawartość nierozpuszczalnej frakcji NSP o 75% i ligniny o 58%, a tym samym
zawartość TDF, również o 58%.
Temat badawczy nr 3
W pracach metodycznych nad udoskonaleniem testu lepkości ekstraktu ziarna przeznaczonego do
produkcji żywności bądź na paszę skupiono się w pierwszej kolejności nad ustaleniem najbardziej
optymalnego stopnia rozcieńczenia próbki zmielonego ziarna wodą, w czasie godzinnej ekstrakcji.
34
Stosunek masy próby do objętości wody testowano w 4 kombinacjach, zakresie 1:3 w/v do 1:15w/v.
W następnej kolejności badano wpływ temperatury ekstrakcji, w zakresie od 25 do 60°C
(7 kombinacji), na lepkość wodnego ekstraktu ziarna.
Ekstrakcja ziarna przy rozcieńczeniu 1:5 w/v daje bardzo duże zróżnicowanie, a ekstrakt jest na tyle
płynny, że wydaje się gwarantować maksymalną ekstrahowalność składników odpowiedzialnych za
lepkość. Ten wariant optymalizacji testu będzie dalej sprawdzany poprzez analizę chemiczną
ekstraktów.
Wnioski:
 Stwierdzono małe zróżnicowanie zawartości składników odżywczych, a znacznie większe
zawartości składników bioaktywnych w obrębie badanych genotypów owsa.
 Obserwowano wysoce istotną (p<0.001) dodatnią korelację między zawartością składników
mineralnych i lipidów (r=0.82), co świadczy prawdopodobnie o dużym udziale fosfolipidów w ziarnie
owsa oplewionego.
 Stwierdzono wysoce istotną (p<0.001) ujemną korelację między zawartością skrobi, a zawartością
lipidów (r=-0,74) w ziarnie obłuszczonym owsa. Ilość lipidów w równie wysokim stopniu (r=0.77)
wpływała na wartość energii brutto ziarna. Kaloryczność ziarna obłuszczonego malała istotnie
(p<0.01) w miarę zwiększania się zawartości skrobi w ziarnie obłuszczonym (r=-0.67).
 Ze zwiększeniem udziału plewki w masie ziarna malała zawartość składników, które są
zlokalizowane wyłącznie w endospermie, a więc skrobi (r=-0.63), a wzrastała zawartość składników
dominujących w plewce, takich jak TDF (r=0.79), a w szczególności I-NSP (r=0.81).
Tytuł zadania: Poszukiwanie form kukurydzy o wysokiej odporności na fuzariozę kolb
i zgorzel podstawy łodygi powodowane przez grzyby z rodzaju Fusarium spp.
Kierownik zadania: dr hab. E. Kochańska-Czembor prof. IHAR-PIB
Cel:
Identyfikacja cech morfologicznych i fenologicznych warunkujących odporność kukurydzy na
fuzariozę kolb i zgorzel podstawy łodygi oraz określenie ich efektywności w programach
poszukiwania źródeł odporności na badane choroby.
Zakres merytoryczny zadania został osiągnięty przez realizację 3 tematów badawczych:
Temat badawczy 1. Identyfikacja cech morfologicznych i fenologicznych warunkujących odporność
kukurydzy na fuzariozę kolb i zgorzel podstawy łodygi.
Cele tematu badawczego 1
(1) wykazanie różnic dla stopnia odporności linii podatnych i odpornych na fuzariozę kolb na
podstawie dynamiki rozwoju choroby na przestrzeni czasu, zdolności do akumulacji toksyn na
przestrzeni czasu i na podstawie odporności słupków na degradację po zakażeniach sztucznych
oraz określenie współzależności pomiędzy tymi cechami a innymi cechami fenologicznymi
i morfologicznymi roślin;
(2) wykazanie różnic dla stopnia odporności linii podatnych i odpornych na zgorzel podstawy łodygi
przy infekcji naturalnej i po zakażeniach sztucznych oraz określenie współzależności pomiędzy
odpornością a innymi cechami fenologicznymi i morfologicznymi roślin.
Materiały i metody
Do badań włączono linie wsobne o zróżnicowanej odporności na fuzariozę kolb lub zgorzel podstawy
łodygi: podatne i o podwyższonej odporności. W doświadczeniu założonym do badań nad fuzariozą
kolb opisano morfologię kwiatostanów żeńskich (długość kolby, długość kanału słupków, długość
osłupków nie pokrytych liśćmi okrywowymi, zawartość antocyjanu w słupkach). Genotypy
reprezentowały 3 grupy wczesności. Kolby zakażano sztucznie poprzez iniekcję 1 ml zawiesiny
zarodników F. graminearum a rośliny kontrolne, poprzez iniekcję wody destylowanej, 7–10 dni od
daty kwitnienia. Ocenę stopnia porażenia kolb prowadzono w skali 1 - 7 w 4 terminach (od fazy
dojrzałości mleczno-woskowej do fazy dojrzałości pełnej). Po ocenie, kolby zbierano, młócono, ziarno
35
i osadki osobno mielono i przygotowywano próby do oznaczeń zawartości DON. W badaniach nad
zgorzelą podstawy łodygi zakażano sztucznie łodygi patyczkami na których rósł grzyb
F. graminearum przez okres ok. 2 tygodni. Łodygi były nakłuwane pomiędzy 2 a 3 międzywęźlem.
Łodygi roślin kontrolnych były nakłuwane patyczkami czystymi. Porażenie łodyg i kolb oceniano
w skali 1 – 9 w fazie dojrzałości pełnej, a następnie kolby zbierano, młócono i jak poprzednio
przygotowywano próby mąki z ziarna i rozdrobnionych osadek do oznaczeń zawartości DON. Analizy
zawartości DON dokonano za pomocą aparatu RIDA QUICK SCAN (analiza na bazie testu
immunoenzymatycznego ELISA).
Dodatkowo w badaniach nad fuzariozą kolb określono odporność słupków na degradację
w warunkach laboratoryjnych. W okresie kwitnienia kwiatostanów żeńskich pobrane zostały próby
słupków i wyłożone na ligninę w szalkach, a następnie spryskane zawiesiną zarodników (kontrolne
wodą) w warunkach laboratoryjnych. Po 10 dniach słupki zostały wysuszone w temp. 400C
a o odporności na degradację świadczyła różnica wagi pomiędzy kontrolą a tymi, na których rosła
grzybnia grzyba.
Monitorując przebieg warunków atmosferycznych wykorzystano pomiary temperatury powietrza na
wysokości 2 m nad gruntem oraz pomiary opadów od daty kwitnienia kwiatostanów męskich do fazy
dojrzałości pełnej.
Wyniki i Dyskusja
W badaniach nad fuzariozą kolb stwierdzono istotne zróżnicowanie pomiędzy elitarnymi liniami
wsobnymi zarówno pod względem cech morfologicznych i fenologicznych jak i stopnia odporności na
fuzariozę kolb na przestrzeni czasu, kinetyki gromadzenia deoksyniwalenolu w ziarnie oraz
odporności słupków na degradację w warunkach in vitro.
Średnio, po zakażeniach sztucznych nasilenie choroby było o 3 stopnie wyższe niż przy infekcji
naturalnej. Zakres zmienności dla stopnia porażenia kolb zakażanych sztucznie wahał się od 2,0 do
5,53. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że zarówno przy infekcji naturalnej jak i po zakażeniach
sztucznych kolb zawartość DON w osadkach kolb była znacznie wyższa niż w próbach ziarna. Przy
infekcji naturalnej, w próbach ziarna pobranych z roślin na początku fazy mleczno-woskowej, późnej
mleczno-woskowej i woskowej (odpowiednio termin 1, 2 i 3) nie stwierdzono zawartości DON,
a w próbach pobranych w fazie dojrzałości pełnej zawartość tej toksyny była niska (średnio 0,4 ppm).
W próbach ziarna pobranych z zakażanych sztucznie kolb zawartość DON była znacznie wyższa,
i w zależności od terminu zbioru wahała się średnio w zakresie 9,2 (początek fazy mleczno-woskowej)
do 74,8 ppm (faza dojrzałości pełnej). W zależności od genotypu zakres zmienności zawartości DON
w próbach ziarna pobranych z roślin w fazie dojrzałości pełnej wahał się od 0,0 do 252,5 ppm.
W osadkach pobranych z roślin rosnących przy infekcji naturalnej zawartość DON w fazie dojrzałości
woskowej wahała się w zakresie od 0,0 do 23,9 ppm a w fazie dojrzałości pełnej od 4,8 do 113,3 ppm,
Wysoką zawartość DON w osadkach kolb zakażanych sztucznie stwierdzono już na początku fazy
mleczno–woskowej roślin (w zależności od genotypu od 8,8 do 304,0 ppm). W fazie dojrzałości
pełnej zakres zmienności dla zawartości DON w osadkach był bardzo szeroki od 12,6 do 1522,8 ppm
(świadczy to o istotnym wpływie genotypu na tą cechę). Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że
próby ziarna pobrane z linii najbardziej odpornej nie były skażone DON nawet po zakażeniach
sztucznych. Na przykładzie linii najbardziej podatnej stwierdzono, że akumulacja DON w ziarnie
rozpoczęła się już po upływie 20 dni od daty kwitnienia kwiatostanów żeńskich (pomiędzy
1 i 2 terminem ocen) a największy wzrost zawartości tej toksyny zaobserwowano po upływie 50 dni
od daty kwitnienia. Badania dotyczące dynamiki gromadzenia fumonizyny FB1 prowadzone przez Wit
i in. (2010) wykazały, że istotny wzrost zawartości tej toksyny zaobserwowano w okresie
późniejszym, po 35 dniu od zakażeń sztucznych F. verticillioides. Natomiast największy wzrost
zawartości nastąpił podobnie jak w bieżących badaniach - po upływie 49 dni. W pracy Wit i in. (2010)
współzależności pomiędzy stopniem porażenia kolb a poziomem skażenia prób ziarna fumonizynami
były dodatnie. Również w bieżącej pracy współzależności pomiędzy stopniem porażenia linii podatnej
przez F. graminearum a poziomem skażenia prób ziarna pobranych z tej linii DON były dodatnie.
Perkowski i in. (1991) opisali dodatnie współzależności pomiędzy skażeniem ziarna pszenicy DON
a liczbą ziaren porażonych przez F. graminearum.
Współzależność pomiędzy stopniem porażenia kolb przez F. graminearum a poziomem skażenia prób
ziarna i osadek była dodatnia i statystycznie istotna. Wykazano również dodatnie współzależności
pomiędzy ocenami fenotypowymi fuzariozy kolb, zawartością DON w ziarnie i osadkach a długością
36
znamion słupków, które nie były przykryte liśćmi okrywowymi. Ujemne współzależności wystąpiły
pomiędzy ocenami fenotypowymi fuzariozy kolb, zawartością DON w ziarnie i osadkach
a zawartością antocyjanu w znamionach słupków.
W badaniach nad zgorzelą podstawy łodygi zarówno przy infekcji naturalnej jak i po zakażeniach
sztucznych łodyg stwierdzono istotne różnice dla stopnia odporności na fuzariozę kolb jak i na zgorzel
podstawy łodygi. Jednak ze względu na duże występowanie omacnicy prosowianki wyniki nie były
powtarzalne. Wstępnie można potwierdzić, że metoda zakażeń sztucznych łodyg była skuteczna
i istotnie wpłynęła na stopień porażenia łodyg. Kolby roślin, których łodygi były zakażane sztucznie
były bardziej porażone w stosunku do roślin kontrolnych.
Wnioski
1. Stwierdzono istotny wpływ terminu oceny oraz genotypu na stopień porażenia roślin. Zarówno po
zakażeniach sztucznych jak i przy infekcji naturalnej w miarę upływu czasu nasilenie choroby
rosło, jednak przy infekcji naturalnej różnice były niewielkie.
2. Stwierdzono istotny wpływ genotypu i terminu zbioru prób ziarna na poziom ich skażenia
deoksyniwalenolem na przestrzeni czasu.
3. Stwierdzono dodatnią współzależność pomiędzy stopniem odporności roślin na porażenie przez
F. graminearum a poziomem skażenia prób ziarna pobranych w poszczególnych terminach.
4. Wykazano również dodatnie współzależności pomiędzy ocenami fenotypowymi fuzariozy kolb,
zawartością DON w ziarnie i osadkach a długością znamion słupków, które nie były przykryte
liśćmi okrywowymi.
5. Ujemne współzależności wystąpiły pomiędzy ocenami fenotypowymi fuzariozy kolb, zawartością
DON w ziarnie i osadkach a zawartością antocyjanu w znamionach słupków.
6. Stwierdzono duże różnice pomiędzy genotypami dla zawartości suchej masy w zielonej masie
znamion słupków.
Literatura
Czembor E., Matusiak M. Dynamika rozwoju fuzariozy kolb powodowanej przez Fusarium graminearum oraz
kinetyka gromadzenia deoksyniwalenolu w ziarnie na przestrzeni czasu. Biul. IHAR. w recenzji.
Czembor E., Matusiak M., Ochodzki P. 2013a. Odporność mieszańców kukurydzy na fuzariozę kolb przy
infekcji naturalnej i po zakażeniach sztucznych Fusarium graminearum i F. verticillioides w Polsce w latach
2008–2009. Biuletyn IHAR 270, 55-73.
Czembor E., Matusiak M., Warzecha R. 2013b. Poszukiwanie źródeł odporności kukurydzy na fuzariozę kolb
i zgorzel podstawy łodyg metodą rodowodową. Biuletyn IHAR 269: 123-139.
Waśkiewicz A., Wit M., Goliński P., Chełkowski J., Warzecha R., Ochodzki P., Wakuliński W. 2012. Kinetics
of fumonisin B₁ formation in maize ears inoculated with Fusarium verticillioides. Food Addit. Cont. 29(11):
1752–1761.
Wit M., Ochodzki P., Warzecha R., Wakuliński W. 2007. Znaczenie Fusarium Verticillioides (Sacc.) Nirenberg
w etiologii fuzariozy kolb kukurydzy. Biuletyn IHAR 245: 171-180.
Wit M., Waśkiewicz A., Goliński P., Chełkowski J., Warzecha R., Ochodzki P., Wakuliński W. 2010.
Występowanie fumonizyny w ziarniakach i rdzeniach kolb kukurydzy inokulowanych Fusarium Verticillioides.
Prog. Plant Protection/ Post. Ochr. Roślin 50(4): 1832-1836.
Temat badawczy 2. Określenie efektu połączenia kilku cech, potencjalnie świadczących o stopniu
odporności na fuzariozę kolb lub zgorzel podstawy łodygi w jednym genotypie oraz określenie
wpływu form ojcowskich i matecznych na stopień odporności potomstwa – określenie efektu
addytywnego i ogólnej zdolności kombinacyjnej dla fuzariozy kolb i zgorzeli podstawy łodygi,
Cele szczegółowe realizowane w bieżącym roku to uzyskanie pokolenia F1 metodą krzyżowań
prostych pomiędzy liniami podatnymi i odpornymi osobno na fuzariozę kolb lub zgorzel podstawy
łodygi, które będzie postawą do realizacji tematu w kolejnych latach
Materiały i metody
W krzyżowaniach uwzględniono elitarne linie wsobne, których pierwsza grupa została
scharakteryzowana w ramach zadania 1 w bieżącym sezonie wegetacyjnym, a druga grupa zostanie
scharakteryzowana w sezonie wegetacyjnym 2015.
Zarówno do badań nad fuzariozą kolb jak i nad zgorzelą podstawy łodygi, krzyżowania prowadzono
w układach: podatna x podatna, podatna x o podwyższonej odporności, o podwyższonej odporności
x podatna, o podwyższonej odporności x o podwyższone odporności. Uwzględniono również
zróżnicowanie morfologiczne roślin pod względem cech potencjalnie świadczących o stopniu
odporności.
37
Wyniki i Dyskusja
Wprawdzie łącznie wykonano 56 krzyżowań, jednak ze względu na fakt, że w obrębie niektórych
kombinacji nie uzyskano wystarczającej liczby nasion, krzyżowania będzie należało powtórzyć, lub
zastąpić innymi. Innym ograniczeniem, uniemożliwiającym prowadzenie krzyżowań w układzie każda
linia z każdą, stał się fakt, że należy uwzględnić nie tylko zróżnicowanie dla stopnia odporności na
fuzariozę kolb lub zgorzel podstawy łodygi oraz cech morfologicznych, które potencjalnie mogą o tym
świadczyć, ale również pochodzenie materiału tzn: stworzyć osobne bloki dla materiałów o typie
ziarna szklistym, zębokształtnym, IDT i Lancaster. Krzyżowania dodatkowe zostaną przeprowadzone
w Meksyku w sezonie wegetacyjnym 2014/2015 a pokolenie F1 włączone do badań w kolejnym
sezonie wegetacyjnym 2015 w warunkach Polski.
Brak jest doniesień literaturowych w zakresie uzyskania ewentualnego efektu heterozji dla stopnia
odporności na fuzariozę kolb lub zgorzel podstawy łodygi oraz cech morfologicznych, które mogą
o tym świadczyć czy zdolności kombinacyjnej.
Temat badawczy 3 Określenie efektywności zidentyfikowanych cech morfologicznych roślin
mogących pełnić rolę w procesie odpornościowym kukurydzy na fuzariozę kolb i zgorzel podstawy
łodygi w programach poszukiwania źródeł odporności na badane choroby
Celem tematu jest porównanie efektywności poszukiwania źródeł odporności na FK i ZP metodą
rodowodową tylko na podstawie ocen fenotypowych stopnia odporności z efektywnością
poszukiwania źródeł odporności na FK i ZP w oparciu o oceny fenotypowe stopnia odporności
i o cechy morfologiczne roślin
Materiały i metody
Materiałem roślinnym były linie pokolenia S1 i S2 oraz populacje pokolenia S0. Łącznie wysiano
w siewie rzędowym 1888 linii pokolenia S2 oraz 583 linie pokolenia S1, które zostały wytypowane
jako potencjalne źródła odporności w sezonie wegetacyjnym 2012 i 2014. Najwcześniej kwitnące
rośliny zostały zaizolowane i zapylone wsobnie. W badaniach nad fuzariozą kolb były one zakażone
zawiesiną zarodników grzyba F. graminearum (zgodnie z metodyką opisaną dla tematu 1; średnio
minimum 3 rośliny w obrębie każdej linii pokoleń S1 i S2 oraz 25 w obrębie populacji S0). Oceniano
fenotypowo stopień odporności na fuzariozę kolb w fazie dojrzałości pełnej (wykorzystując skalę
bonitacyjną 1 – 7). W badaniach nad zgorzelą podstawy łodygi zakażano sztucznie łodygi zapylonych
wsobnie roślin (zgodnie z metodyką opisaną w temacie 1). Dodatkowo w bieżącym roku wykonano
krzyżowania proste, uzyskano pokolenie F1, które po rozmnożeniu w roku następnym będzie
materiałem wyjściowym do dalszych badań nad efektywnością poszukiwania źródeł odporności
w oparciu o oceny fenotypowe stopnia odporności oraz cechy morfologiczne roślin, zidentyfikowane
w trakcie realizacji Zadania 1 i 2 jako te, które potencjalnie na nią wpływają.
Wyniki i Dyskusja
Łącznie do badań włączono 1888 linii pokolenia S2 oraz 583 linie pokolenia S1. Rośliny, których
stopień porażenia kolb po zakażeniach sztucznych kolb oceniony został w zakresie 2–3/4 (poniżej
10% ziarniaków z objawami porażenia) wytypowane zostały jako potencjalne źródła odporności na
fuzariozę kolb, natomiast rośliny, których stopień porażenia łodyg po zakażeniach sztucznych
oceniono w zakresie 1 – 4 (w skali 1 – 9) wytypowane zostały jako potencjalne źródła odporności na
zgorzel podstawy łodygi. Wysokie temperatury w drugiej połowie lipca (maksymalne powyżej 35oC)
spowodowały, że efektywność zapyleń w grupie materiałów średnio późnych i późnych była niska.
Jest to spowodowane m. in. faktem, że uzyskano duży postęp hodowlany pod względem redukcji
wielkości wiechy kwiatostanów męskich, które m. in. zacieniają łan. Wraz z uwsobnieniem materiału,
redukcja wiech pogłębia się. Łącznie z grupy roślin pokolenia S1 do dalszych badań wytypowano 316
roślin jako pokolenie S2 oraz z pokolenia S2 - 1430 roślin jako pokolenie S3.
Brak jest w literaturze doniesień opisujących skuteczność metody rodowodowej w poszukiwaniu
źródeł odporności kukurydzy na fuzariozę kolb i zgorzel podstawy łodygi. Efektywność tej metody
została opisana dla materiałów wykorzystywanych w Ameryce Północnej i Południowej. W ramach
projektów realizowanych w Instytucie Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie – PIB w latach
2002–2005 wykazano wstępnie, że metoda rodowodowa umożliwia uzyskanie postępu biologicznego
dla stopnia odporności na te choroby (Czembor i in., 2005, 2011a, 2011b, 2013a). Jednak w żadnej
z tych prac nie uwzględniono cech morfologicznych roślin, potencjalnie świadczących o stopniu
odporności na badane choroby, co jest planowane do realizacji w kolejnych latach.
38
Wnioski
1. Metoda rodowodowa pozwala na uzyskanie postępu biologicznego dla stopnia odporności na
fuzariozę kolb po zakażeniach sztucznych
2. W kolejnych latach realizacji projektu należy zwrócić uwagę na fakt, że okres kwitnienia
kwiatostanów męskich uległ znacznemu skróceniu.
Literatura
Czembor E., Warzecha R., Adamczyk J., Kurczych Z. 2005. Wytwarzanie materiałów wyjściowych kukurydzy
o podwyższonej odporności na fuzariozę kolb i zgorzel podstawy łodygi. Biuletyn IHAR 236: 203-213.
Czembor E., Presello D., Adamczyk J., Wójcik K. . 2011a. Enhancing disease resistance to Fusarium by using
exotic genotypic variability” Book of Abstracts ISM Conference “Strategies to reduce the impact of mycotoxins
in a global context”, 18-18.11, p. 116.
Czembor E., Presello D., Warzecha R., Adamczyk J., Wójcik K. 2011b. Responses of pedigree selection for ear
and stalk rot resistance in F2, F3 and F4 generations of maize. Book of Abstracts Conference “Sustainable use of
pesticides and integrated pest management in East-Central Europe and the Baltics”, Radzikow, Poland, 4-6.
09.2011, p. 63
Czembor E., Matusiak M., Warzecha R. 2013a. Poszukiwanie źródeł odporności kukurydzy na fuzariozę kolb
i zgorzel podstawy łodyg metodą rodowodową. Biuletyn IHAR, 269: 123-139.
Tytuł zadania: Gromadzenie i ocena kolekcji ekotypów traw wieloletnich
z uwzględnieniem cech warunkujących ich wykorzystanie na cele alternatywne.
Kierownik zadania: dr hab. E. Kochańska-Czembor prof. IHAR-PIB
Cel
Badanie procesów interakcji genotypowo - środowiskowej w kolekcji traw wieloletnich
zgromadzonych w Banku Genów prowadzonym przez IHAR-PIB oraz w trakcie ekspedycji własnych.
Zakres merytoryczny zadania został osiągnięty przez realizację 2 tematów badawczych:
Temat badawczy 1 Zgromadzenie puli genowej na bazie materiałów dostępnych w Banku Genów
Krajowego Centrum Roślinnych Zasobów Genowych IHAR-PIB oraz w trakcie ekspedycji własnych
oraz założenie szkółek polowych KOLEKCJI I w użytkowaniu nasiennym i kośnym
Cele
(1) Wstępna analiza danych paszportowych traw wieloletnich przechowywanych w Banku Genów
KCRZG, zgromadzenie puli genowej KOLEKCJI I oraz założenie szkółek w warunkach polowych
w użytkowaniu kośnym i nasiennym, będących podstawą badania zmienności międzygatunkowej
i wewnątrzgatunkowej w trakcie realizacji projektu;
(2) Poszerzenie kolekcji traw wieloletnich dostępnych w Banku Genów o nowe obiekty poprzez zbiór
ekotypów z terenów specjalnych w trakcie ekspedycji własnych, przygotowanie materiału do
założenia KOLEKCJI II będącej podstawą do realizacji tematu w latach następnych.
Materiały i metody
W badaniach uwzględniono 7 gatunków traw (śmiałek darniowy – Deschampsia cespitosa, kostrzewa
trzcinowa - Festuca arundinacea, kostrzewa łąkowa – Festuca pratensis, życica trwała - Lolium
perenne, kostrzewa czerwona – Festuca rubra, tymotka łąkowa – Phleum pratense, wiechlina łąkowa
- Poa pratensis). Obiekty do badań w ramach KOLEKCJI I wytypowano z bazy ekotypów
zgromadzonych w Banku Genów KCRZG na podstawie danych paszportowych uwzględniając region
fizyko geograficzny, długość i szerokość geograficzną, wysokość nad poziomem morza, rodzaj gleby
(mineralne i organiczne, suche oraz okresowo zalewane), stanowisko i wilgotność siedliska oraz dane
klimatyczne dla danego regionu. Analizowano dane paszportowe 906 ekotypów zebranych na
stanowiskach naturalnych w trakcie ekspedycji odbytych przez zespół Ogrodu Botanicznego IHAR –
PIB w Bydgoszczy, w latach 2002 – 2013 na obszarze prawie całej Polski, w zróżnicowanych
środowiskach ekogeograficznych – nieużytkach, pastwiskach, łąkach (na których nie stosowano
obsiewu od co najmniej 15 lat), przydrożach i lasach. Do dalszych badań w ramach KOLEKCJI I
wytypowano 102 obiekty.
39
Nasiona ekotypów i odmian wzorcowych zostały wyłożone na bibułę filtracyjną, która została
umieszczona na kiełkowniku typu Jacobsen. Po skiełkowaniu siewki zostały wysadzone do doniczek
o średnicy ok. 7 cm w warunkach szklarniowych. Dla każdego genotypu przygotowano średnio ok. 56
sadzonek. Dobrze rozkrzewione sadzonki zostały wysadzone w 3 szkółkach polowych: 2 typy
użytkowania (kośny - 1 lokalizacja: Radzików; nasienny - 2 lokalizacje: OB. Bydgoszcz oraz
w zależności od gatunku Nieznanice/Polanowice/Szelejewo). Szkółki KOLEKCJI I zostały założone
w układzie losowanych bloków: 3 powtórzenia, 5 roślin w powtórzeniu. Rozstawa roślin: 50 x 50 cm.
Rozpoczęto również prace nad przygotowaniem materiału roślinnego do założenia KOLEKCJI II
w roku 2015. Zorganizowano 4 ekspedycje. Na miejsca ekspedycji wybrano rejony Polski nie
reprezentowane w KOLEKCJI I (Polska północno-wschodnia, południowo-zachodnia) oraz tereny
składowania odpadów kopalnianych i przemysłowych (tereny Górnego Śląska, składowiska
Janikowskich Zakładów Sodowych). Obiekty zbierano również na terenach naturalnie zasolonych
(okolice Szubina). Dla miejsc zbioru sporządzono karty siedliskowe stosowane przy zbiorze ekotypów
dla banku genów (Majtkowski i in. 2003), dodatkowo pobrano próbki glebowe, dla których określono:
pH, zasolenie (w g/dm3), zawartość makroskładników (N – NO3, P i K w mg/dm3), zbadano również
wilgotność gleby (w mm niedosytu). Ekotypy pozyskiwano w postaci klonów (co najmniej dwie
rośliny na obiekt), Po powrocie z ekspedycji wysadzono je do inspektu, gdzie do następnego sezonu
będą stanowiły bazę do tworzenia KOLEKCJ II.
Wyniki i Dyskusja:
Na podstawie informacji paszportowych zgromadzonych w bazach danych Banku Genów KCRZG
IHAR-PIB i danych klimatycznych otrzymanych w programie DIVA –GIS, z 908 ekotypów
zebranych w latach 2002 – 2013 wytypowano do badań 102 ekotypy w obrębie 7 gatunków: życica
trwała (13), kostrzewa czerwona (21), kostrzewa łąkowa (10), kostrzewa trzcinowa (15), tymotka
łąkowa (15), śmiałek darniowy (11), wiechlina łąkowa (12). Większość obiektów pochodziła z łąk,
z wyjątkiem kostrzewy łąkowej (najwięcej zebrano ich na pastwiskach) i wiechliny łąkowej (najwięcej
na pastwiskach i nieużytkach). Przewagę tych siedlisk w zbiorach zasobów genowych Ogrodu
Botanicznego KCRZG IHAR w Bydgoszczy potwierdzają opisy ekspedycji prezentowane przez
Majtkowskiego i in. (2003, 2007) oraz Schmidta (2010). Przewaga ekotypów pochodzących z łąk
wynika ze sposobu ich zbioru w terenie (pozyskiwane są w postaci nasion), często w czasie
eksploracji na pastwiskach nie ma roślin posiadających nasiona. Tereny pozyskania obiektów
położone są pomiędzy równoleżnikami 49o04’04,3’’ i 54o04’18,5” szerokości geograficznej północnej
i południkami: 014o14’05,6’’ i 022 o33’29,0’’ długości geograficznej wschodniej, na wysokości od
7 do 1250 m nad poziomem morza. Warunki klimatyczne miejsc, z których pochodziły, były
zróżnicowane (średnia temperatura powietrza od 6,7 do 11,5oC, średnia minimalna temperatura
najchłodniejszego miesiąca od -8,1 do -2,3oC, roczna suma opadów od 534 do 1055 mm, suma
opadów dla najwilgotniejszego miesiąca od 73 do 160 mm).
W trakcie ekspedycji na Śląsku, Podlasiu, Dolnym Śląsku, Kujawach i Pałukach zebrano 98 ekotypów
w ramach następujących gatunków: życica trwała (16), kostrzewa czerwona (23), kostrzewa łąkowa
(14), kostrzewa trzcinowa (8), tymotka łąkowa (9), śmiałek darniowy (15), wiechlina łąkowa (13). Na
terenach zbioru gleby charakteryzowały się różnym stopniem zasolenia (0,03-7,00 g/dm3), pH od 4,6
do 8,2, zmienną zasobnością w składniki pokarmowe (N-NO3 8–48 mg/dm3; P 18–72 mg/dm3; K 114–
254 mg/dm3) oraz zróżnicowanym deficytem wody w glebie (0-19 mm). Ekotypy kostrzewy
trzcinowej były najrzadziej zbierane podczas ekspedycji prowadzonych w bieżącym roku jak
i w latach 2002–2013, co potwierdza badania Zająca i in. (2001), Majtkowskiego i in. (2003).
Warunki klimatyczne miejsc zbiorów ekotypów tylko dla maksymalnej średniej temperatury
powietrza najcieplejszego miesiąca i minimalnej sumy opadów najsuchszego miesiąca poszerzały
zakres zmienności zanotowanej dla siedlisk obiektów KOLEKCJI I
Wnioski
1. Ze względu na fakt, że w wybranej KOLEKCJI I brak reprezentacji ekotypów z Polski
południowo-zachodniej, Polski wschodniej oraz północno–wschodniej, jak również ekotypów ze
szczególnych stanowisk (tereny składowania odpadów poprzemysłowych, pokopalnianych,
zasolonych), należy przeprowadzić ekspedycje w te miejsca, w celu poszerzenia
ekogeograficznego zróżnicowania pochodzenia badanych obiektów.
2. Siedliska zbiorów ekotypów podczas ekspedycji w 2014 poszerzają ekogeograficzne
zróżnicowanie badanych obiektów.
40
3. Ze zbieranych gatunków, kostrzewa czerwona pochodziła z najbardziej zróżnicowanych warunków
ekogeograficznych
Literatura
Majtkowski W., Majtkowska G. 2007. Gromadzenie zasobów genowych przez Ogród Botaniczny Instytutu
Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Bydgoszczy w latach 1999–2005. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 517: 91-99.
Majtkowski W., Żurek G., Schmidt J., Majtkowska G. 2003. Collections of grass genetic resource of information
for distribution of species. W: Problems of grass biology. Edited Frey L. W. Szafer Institute of Botany, Polish
Academy of Sciences. Kraków: 219–227.
Schmidt J. 2004. Pochodzenie jako czynnik warunkujący zmienność ekotypów życicy trwałej (Lolium
perenne L.). Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 497: 569-579.
Schmidt J. 2010. Zasoby genowe roślin dziko rosnących z rodziny motylkowatych (Fabaceae) - ekspedycje
Ogrodu Botanicznego w Bydgoszczy. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 555: 79-92.
Zając, A., Zając, M. (Eds.). 2001. Atlas rozmieszczenia roślin naczyniowych w Polsce. Distribution Atlas of
Vascular Plants in Poland. Nakładem Pracowni Chorologii Komputerowej Instytutu Botaniki Uniwersytetu
Jagiellońskiego. Kraków. 714 ss.
Temat badawczy 2. Opis zmienności w obrębie KOLEKCJI I z uwzględnieniem stopnia odporności na
stresy biotyczne i abiotyczne.
Materiały i metody
Materiałem roślinnym była KOLEKCJA I ekotypów i współcześnie uprawianych odmian wzorcowych
należących do 7 gatunków wieloletnich: śmiałek darniowy (Deschampsia cespitosa), kostrzewa
trzcinowa (Festuca arundinacea), kostrzewa łąkowa (Festuca pratensis), kostrzewa czerwona
(Festuca rubra), życica trwała (Lolium perenne), tymotka łąkowa (Phleum pratense), wiechlina
łąkowa (Poa pratensis) (120 genotypów, w tym 92 ekotypy). Do oceny stopnia odporności roślin na
rdze, których sprawcami są grzyby z rodzaju Puccinia spp., użyto wizualnej, dziewięciostopniowej
skali odzwierciedlającej wielkość porażonej powierzchni liści. Oceniano każdą roślinę osobno (czyli
15 roślin w obrębie każdego genotypu: 3 powtórzenia x 5 roślin w każdym powtórzeniu). Oceny
prowadzono na drugim od góry, w pełni wykształconym liściu. W okresie jesiennym określano
wielkość porażenia organów wegetatywnych roślin przez grzyby z rodzaju Drechslera spp. Do oceny
użyto również skali 1–9, adekwatnej do tej, która została użyta przy ocenie stopnia odporności na
rdzę. Ocena ogólnego wyglądu roślin późną jesienią (ocena jesienna) w sposób kompleksowy
odzwierciedlała wigor roślin w tym okresie, na który istotny wpływ miał stopień odporności na stresy
biotyczne i abiotyczne występujące w trakcie całego sezonu wegetacyjnego. Do oceny wigoru
jesiennego roślin używano skali 1–9 (w której 1 oznacza brak roślin a 9 to rośliny charakteryzujące się
dobrym wigorem).
W opracowaniu wykorzystano pomiary temperatury powietrza na wysokości 2 m nad gruntem oraz
pomiary opadów, które wykonano w stacjach meteorologicznych w lokalizacjach, gdzie materiały
były waloryzowane.
Wyniki i dyskusja
Stopień odporności na rdze, plamistości liści oraz stan roślin przed zimą 120 obiektów tworzących
KOLEKCJĘ I – w tym 92 ekotypów należących do gatunków: śmiałek darniowy, kostrzewa trzcinowa,
kostrzewa łąkowa, kostrzewa czerwona, życica trwała, tymotka łąkowa i wiechlina łąkowa oceniano
w trzech środowiskach. Temperatura i wilgotność miały istotny wpływ na rozwój grzybów z rodzaju
Puccinia spp, które są sprawcami rdzy traw wieloletnich oraz grzybów z rodzaju Drechslera spp.
i Bipolaris spp., które są sprawcami plamistości liści. Istotne różnice pomiędzy poszczególnymi
lokalizacjami stwierdzono dla ilości opadów, natomiast różnice dla średnich temperatur były
niewielkie. W Bydgoszczy i Szelejewie w sierpniu i we wrześniu ilość opadów była znacznie niższa
niż w pozostałych lokalizacjach. Stopień odporności na rdze to cecha która w sposób najbardziej
istotny różnicowała badane genotypy w obrębie wszystkich gatunków zarówno w pierwszym
środowisku (Radzików) jak i w trzecim środowisku (Szelejewo, Polanowice lub Nieznanice).
Nasilenie tej choroby w Bydgoszczy było niższe, gdzie porażenie odnotowano jedynie dla wiechliny
łąkowej. W żadnym ze środowisk nie stwierdzono istotnego zróżnicowania pod względem stopnia
odporności na plamistości liści (nasilenie choroby było niskie).
Wykazano, że średnio kostrzewa trzcinowa i czerwona oraz tymotka łąkowa były materiałami średnio
odpornymi lub charakteryzowały się podwyższoną odpornością na rdze, natomiast śmiałek darniowy,
kostrzewa łąkowa, życica trwała i wiechlina łąkowa były gatunkami średnio podatnymi lub
podatnymi. Zróżnicowanie dla stopnia odporności na rdze pomiędzy obiektami było największe
41
w obrębie kostrzewy łąkowej (w Radzikowie przekraczało 40%), kostrzewy trzcinowej
(w Radzikowie przekraczało 30%) oraz w obrębie śmiałka darniowego (w Radzikowie przekraczało
20%). Wysokie współczynniki zmienności dla tej cechy świadczą, że w obrębie tych gatunków można
wytypować obiekty o podwyższonej odporności. W obrębie pozostałych gatunków zróżnicowanie dla
tej cechy nie przekraczało 20%.
Wyniki ocen stopnia odporności badanych materiałów na rdze w Radzikowie korespondowały
z wynikami uzyskanymi w Szelejewie, Polanowicach lub Nieznanicach – współczynniki korelacji
dodatnie i statystycznie istotne (co świadczy o stabilności tej cechy). W Radzikowie (środowisko 1)
oraz Szelejewie, Polanowicach lub Nieznanicach (środowisko 3) stopień odporności na rdze w sposób
istotny wpływał na stan roślin przed zimą, co wykazały współczynniki korelacji prostych jak i analiza
składowych głównych. Gatunki o podwyższonej odporności na rdze charakteryzowały się również
dobrym wigorem w okresie późnej jesieni.
Uzupełnianie posiadanych już kolekcji roboczych o nowe zasoby genowe oraz tworzenie nowych
kolekcji ze szczególnym uwzględnieniem możliwości ich wykorzystania do zagospodarowywania
terenów ekologicznych, porolnych, zdegradowanych, parków, terenów rekreacyjnych
i zurbanizowanych spowoduje, że hodowla nie wpłynie ujemnie na zakres zmienności genetycznej
a nawet umożliwi jej poszerzenie w obrębie gatunku.
Charakterystyka zmienności genetycznej w obrębie różnych kolekcji ekotypów zebranych na terenie
Polski, dla ważnych gospodarczo cech prowadzona jest od wielu lat i wyniki tych badań zostały
opisane w pracach takich jak: Czembor i wsp. (2001 a, 2001 b, 2002 a, 2002 b), Czembor (2003,
2004), Majtkowski (1991), Sadowski i wsp. (1997), Schmidt i Kaszuba (1997), Schmidt i wsp. (2005).
Jednak w badaniach tych nie porównywano kilku gatunków jednocześnie i nie uwzględniano
możliwości wykorzystania opisywanych materiałów na cele alternatywne. Założenie to było podstawą
prac realizowanych w ramach bieżącego projektu.
Na zdolność adaptacyjną traw wieloletnich istotny wpływ ma odporność na stresy biotyczne
i abiotyczne (Duller i in., 2010). Potrzebne są nowe źródła odporności, które mogą być
wykorzystywane w programach hodowlanych jako materiały wyjściowe. Na szczególną uwagę
zasługuje stopień odporności na rdze, co potwierdzono również w bieżących badaniach. Hodowla
twórcza prowadzona w krajach Europy Zachodniej w okresie ostatnich kilkudziesięciu lat pozwoliła
na podwyższenie odporności traw na rdze (n.p. Roderick i in., 2003; Schubiger i in., 2010). Natomiast
w Polsce postęp ten jest znacznie niższy ponieważ większość odmian jest podatna na grzyby z rodzaju
Puccinia spp. (Czembor, 2007 a, 2007 b, 2008, Czembor i in, 2010). Dodatkowo, stopień odporności
na rdze w sposób istotny wpływał na stan roślin przed zimą co potwierdzają badania m.in. Duller i in.
2010.
Wnioski
1. Oceny stopnia odporności na rdze w sposób najbardziej istotny różnicowała badany materiał
roślinny.
2. Stopień odporności na rdze w sposób istotny wpływał na stan roślin przed zimą.
3. Duża powtarzalność ocen stopnia odporności na rdze zapewnia możliwość uzyskania postępu
biologicznego dla tej cechy i dla cech z nią skorelowanych.
4. Gatunkami najbardziej podatnymi na rdze były wiechlina łąkowa, życica trwała, śmiałek darniowy
oraz kostrzewa łąkowa. Zakres zmienności dla tej cechy był największy w obrębie kostrzewy
łąkowej i pozwalał wyodrębnić genotypy średnio odporne.
5. Średnio, w obrębie uwzględnionych w badaniach gatunkach, można było wskazać genotypy, nie
odbiegające pod względem stopnia odporności na rdze, plamistości liści i stanu roślin przed zimą
od wzorcowych odmian uprawnych. Wyjątkiem była wiechlina łąkowa w obrębie której, zakres
zmienności na rdze był niski.
Literatura
Czembor E. 2003. Resistance of Kentucky bluegrass (Poa Pratensis L.) ecotypes from Polish Gene Bank to
melting out (Drechslera poae) under field conditions in 1998–2000. Genet. Res. Crop Evol. 50: 747—756
Czembor E. 2004. Resistance of Kentucky bluegrass ecotypes to melting out (Drechslera poae) under
greenhouse conditions. Australasian J. Phytopathology 33: 437—439.
Czembor E. 2008. Zależności pomiędzy odpornością na rdzę i pleśń śniegową a cechami fenotypowymi form
gazonowych życicy trwałej. Biul. IHAR 247: 99—117.
Czembor E. 2011. Wielocechowy opis zmienności genetycznej w kolekcji ekotypów, klonów i odmian życicy
trwałej (Lolium perenne L.). Monografie i Rozprawy Naukowe IHAR-PIB 35/2011.
42
Czembor E. 2011. Characterization and preliminary evaluation of Polish Lolium per enne L. ecotypes. Book of
Abstracts EUCARPIA Genetic Resources section meeting "To Serve and Conserve", Wageningen, The
Netherlands, April 5-7, 2011, p. 65.
Czembor E., Feuerstein U., Żurek G. 2001a. Powdery mildew resistance in Kentucky bluegrass ecotypes from
Poland. Plant Breed. Seed Sci. 45(2): 21—27.
Czembor E., Feuerstein U., Żurek G. 2001b. Preliminary observations on resistance of Kentucky bluegrass
ecotypes from Poland to rust diseases. J. Phytopathol. 149: 83—89.
Czembor E., Feuerstein U., Żurek G. 2002a. Diversity of Polish ecotypes of Kentucky bluegrass in green mass
production. In: “Broad Variation and Precise Characterization — Limitation for the Future” Święcicki W. K.,
Naganowska B., Wolko B. (eds.), IGR, IPGRI, IHAR, Poznań, Poland, pp. 307—309.
Czembor E., Feuerstein U., Żurek G. 2002b. Some characteristics of Kentucky bluegrass ecotypes from Poland.
In: “Broad Variation and Precise Characterisation — Limitation for the Future” Święcicki W. K., Naganowska
B., Wolko B. (eds.), IGR PAN, IPGRI, IHAR, Poznań, Poland, pp. 310—311.
Schubiger F. X, Boller B., Baert J., Bourdon P., Cagas B., Cernoch V., Chosson J. F., Czembor E., Eickmeyer
F., Feuerstein U., Hartmann S., Jakesova H., Krautzer B., Leenheer H., Lellbach H., Pecetti L., Posselt U., Russi
L., Schulze S., Tardin M. C., VanHee F., Willner E., Wolters L. 2010. Susceptibility of European cultivars of
Italian and perennial ryegrass to crown and stem rust. Euphytica,
Tytuł zadania: Badanie cech warunkujących zawiązywanie nasion, ich jakość oraz plon
w wybranych gatunkach traw wieloletnich.
Kierownik zadania: dr hab. G. Żurek prof. IHAR-PIB
Cel zadania:
Celem głównym zadania jest określenie zróżnicowania wewnątrz- i międzyobiektowego badanych
form traw wieloletnich w obrębie zestawu cech związanych z plonowaniem generatywnym, jak
również wybranych cech fizjologicznych mierzonych w różnych fazach dojrzałości jak np. zawartość
azotu w liściach, określana pośrednio za pomocą pomiaru zawartości chlorofilu. Cele do realizacji
w roku 2014 to wyodrębnienie materiałów do badań, z uwzględnieniem odmian wzorcowych, rodów
oraz form dzikich w gatunkach z rodzaju kostrzewa (k. czerwona, k. trzcinowa oraz k. łąkowa) oraz
charakterystyka pokroju roślin, wykształcania kwiatostanów w roku siewu oraz występowania chorób.
Materiał i metody:
Przy wyodrębnianiu materiałów do badań uwzględniano informacje o ich aktualnym potencjale
nasiennym (COBORU 2013) oraz o cechach determinujących jakość nasion oraz ich plon (np. ciężar
tysiąca nasion, dostępna ilość nasion, zdolność kiełkowania). Przy wybieraniu odmian wzorcowych do
badań przyjęto założenia, aby były to odmiany krajowe oraz aby ich plonowanie nasienne było co
najmniej na poziomie wzorca zbiorczego. Przy wyborze pozostałych obiektów uwzględniano również
sugestie osób, zaangażowanych w realizację badań w punktach doświadczalnych oraz informacje
własne (Martyniak, Prończuk 2003, 2004, Żyłka i wsp. 2001). Doświadczenie założono
w 4 miejscowościach (Radzików, Leszno, Szelejewo i Nieznanice) w 3-powtórzeniowym układzie
losowanych bloków. Wysiew nasion przeprowadzono w multipalety bądź wiaderka plastikowe. Każdy
obiekt reprezentowany był przez 150 roślin, posadzonych po 50 sztuk na powtórzenie w rozstawie
50 x 50 cm. W roku 2014 wykonano obserwacje: pokroju roślin (w skali 1 - 9, gdzie 1 to rośliny
płożące, 9 – rośliny wyprostowane), wykształcania pędów generatywnych w roku siewu (% roślin
z kwiatostanami w stosunku do ogólnej liczby roślin), porażenia przez choroby - w skali 1 – 9 (gdzie
1 to rośliny zniszczone przez choroby, 9 – rośliny zdrowe, bez śladów porażenia).
Charakterystyka warunków glebowo-klimatycznych: Pod koniec sezonu wegetacyjnego 2014 r.
pobrano próby glebowe w miejscach, w których założono doświadczenia z 15 obiektami w rodzaju
kostrzewa dla określenia zasobności gleb oraz identyfikacji różnic pomiędzy blokami oraz
miejscowościami. Analizy składu granulometrycznego, odczynu gleby oraz zawartości makroi mikroskładników wykonano w Okręgowej Stacji Chemiczno–Rolniczej w Warszawie. Dane
meteorologiczne podano według informacji z poszczególnych punktów badawczych. Średnie
z wielolecia dla Radzikowa podano według danych ze stacji meteorologicznej zlokalizowanej
w Radzikowie, natomiast dla Nieznanic, Szelejewa i Leszna według serwisu internetowego IMGiW.
43
Wyniki i dyskusja:
Na podstawie analizy dostępnych informacji wybrano następujące odmiany wzorcowe: ‘Pasja’
kostrzewy łąkowej i ‘Areta’ kostrzewy czerwonej rozłogowej (plonowanie nasienne na poziomie
100% wzorca zbiorczego) oraz ‘Rahela’ kostrzewy trzcinowej (plonowanie nasienne ok. 2 dt/ha
powyżej wzorca zbiorczego). Korzystając z sugestii osób, zaangażowanych w realizację
doświadczenia uwzględniono również formy kostrzewy łąkowej (POBS-84, POBS-89, POBS-91) oraz
czerwonej (NIB-289, NIB-231 oraz NIB-304). Pozostałe obiekty uwzględnione w doświadczeniu to:
ekotyp kostrzewy łąkowej 49-8b, charakteryzujący się bardzo dużymi nasionami (MTZ=115% wzorca
odmianowego), ród kostrzewy czerwonej 109-2/1, charakteryzujący się plonowaniem powyżej
plonowania wzorców odmianowych. Obiekty kostrzewy trzcinowej (121-2/8, 124-1/8, 127-1/1 oraz
128-1/6) to formy zróżnicowane pod względem MTZ oraz cech kwiatostanów.
W odniesieniu do cech obserwowanych w roku 2014 stwierdzono zróżnicowanie pomiędzy badanymi
obiektami w poszczególnych gatunkach, uwarunkowane zarówno wpływem warunków środowiska
w punkcie doświadczalnym jak i specyfiką genotypową badanych form. Największe zróżnicowanie
stwierdzono dla obiektów kostrzewy trzcinowej, nieco mniejsze dla kostrzewy łąkowej oraz
najmniejsze – dla kostrzewy czerwonej. Roślinami o pokroju najbliższym wyprostowanego
charakteryzowały się obiekty kostrzewy trzcinowej (średnio 6,5 w skali od 1 do 9), natomiast
najbardziej rozłożyste (średnio 5,9) były rośliny kostrzewy czerwonej. Pokrój roślin był najsilniej
modyfikowany w kostrzewie trzcinowej oraz łąkowej – stwierdzono istotność statystyczną efektów
poszczególnych czynników oraz ich interakcji. Dla kostrzewy czerwonej nie stwierdzono interakcji
genotypu ze środowiskiem (GxE) dla tej cech. Według obserwacji z roku 2014 najbardziej podatne na
porażenia przez występujące w tym okresie choroby były rośliny kostrzewy trzcinowej (średnie
porażenie od 4,5 do 6,9) natomiast najmniej podatne okazały się rośliny kostrzewy czerwonej (średnie
porażenie od 7,7 do 8,4). Rośliny tego ostatniego gatunku rosnące w Radzikowie były w zasadzie
wolne od chorób (średnie porażenie 8,7). Nieco większe nasilenie objawów zaobserwowano
w Lesznie (średnio 8,0) natomiast istotnie większe - w Szelejewie i w Nieznanicach (średnio
odpowiednio 7,8 i 7,9). Zaobserwowane objawy na badanych gatunkach wskazywały na
występowanie rdzy oraz plamistości liści. Porażenie przez choroby pozostawało pod istotnym
wpływem warunków doświadczenia (lokalizacji) jednak nie zawsze genotypu (tylko dla kostrzewy
trzcinowej). Dla tego gatunku stwierdzono również istotność interakcji GxE omawianej cechy.
Najintensywniej pędy generatywne w roku siewu wykształcały rośliny kostrzewy trzcinowej (średnio
43,1% roślin), zdecydowanie słabiej - kostrzewy łąkowej (średnio 12,9%) a kostrzewa czerwona
w ogóle nie tworzyła kwiatostanów. Zarówno dla kostrzewy trzcinowej jak i łąkowej stwierdzono
istotność interakcji GxE dla tej cechy.
Na procesy fizjologiczne kształtujące wiązanie nasion, ich jakość oraz plon wpływają warunki
siedliskowe, czynniki agrotechniczne, właściwości genetyczne gatunku i odmian, oraz ich wzajemne
współdziałania (Martyniak 2006; Boelt i Studer, 2010; Szczepanek, 2013). W gatunkach obcopylnych,
o znacznym zróżnicowaniu wewnątrzobiektowym (jak np. w obrębie rodzaju kostrzewa), uzyskanie
miarodajnych wyników uzależnione jest od wyjściowego poziomu zmienności badanych form (Kalton
i wsp. 1966, Martyniak 2005 a, b). Planując badania np. nad cechami warunkującymi zawiązywanie
nasion, ich jakość oraz plon, należy poszukiwać form, reprezentujących możliwie szerokie spektrum
zmienności (Martyniak i Martyniak 2008; Gozdowski i in. 2009). Dlatego też z jednej strony
uwzględniono odmiany komercyjne, o znanym poziomie plonowania nasiennego, a z drugiej formy
hodowlane bądź ekotypy, których zmienność może wykraczać poza poziom reprezentowany przez
odmiany (Martyniak i Martyniak 2010).
Pokrój roślin jako cecha w znacznym stopniu determinowana genotypowo stanowi jeden z elementów
oceny odrębności, wyrównania i trwałości odmian według zaleceń UPOV (2002, 2006). Wyniki
obserwacji z roku 2014 potwierdzają istotny wpływ genotypu na zmienność tej cechy we wszystkich
badanych gatunkach. Przejście roślin z formy wegetatywnej w generatywną następuje w efekcie
wydłużającego się dnia na wiosnę, i oznakami tej zmiany jest elongacja stożka wzrostu. Moment,
w którym stożek wzrostu przechodzi te zmiany uzależniony jest od gatunku, odmiany, lokalnych
warunków edaficznych, pogodowych oraz długości dziennego okresu naświetlania światłem
słonecznym, zależnej z kolei od szerokości geograficznej (Griffiths i wsp. 1978). Gatunkiem
najintensywniej wykształcającym pędy kwiatostanowe w roku siewu była kostrzewa trzcinowa.
Według Meyera i Watkinsa (2003) gatunek ten wykazuje brak bezwzględnej wernalizacji dla
44
wytwarzania kwiatostanów i kwitnienia, co uważane jest za zaletę w pracach hodowlanych. Jest on
w stanie kwitnąć w szerokim zakresie warunków fotoperiodu (Tempelton i wsp. 1961). Inicjacja
rozwoju pędów generatywnych u kostrzewy łąkowej oraz trzcinowej jest typowa jak dla innych
gatunków traw strefy umiarkowanej (Sleper i West, 1996). Optimum wzrostu (elongacja pędów
wegetatywnych i generatywnych) następuje na wiosnę, z kolei na jesień występuje kolejny szczyt
wzrostu jednak jedynie pędów wegetatywnych. Z kolei u kostrzewy czerwonej indukcja rozwoju
pędów generatywnych następuje późną jesienią roku siewu jedynie w tych pędach, które przeszły bez
zakłóceń (np. na skutek koszenia czy spasania) jeden pełny sezon wzrostu (Elliot, 1967).
Wykształcenie kwiatostanów w tym gatunku możliwe jest dopiero w roku następnym, dlatego też
w opisywanym doświadczeniu dla form kostrzewy czerwonej nie stwierdzono wykształcania pędów
generatywnych w roku siewu.
Porażenie przez choroby, obserwowane w roku bieżącym na roślinach wszystkich badanych gatunków
było uzależnione głównie od warunków lokalnych, natomiast jedynie w wypadku kostrzewy
trzcinowej – również od predyspozycji genetycznych badanych form. Jedną z głównych chorób
porażających kostrzewy (szczególnie k. trzcinową i k. czerwoną) zwłaszcza przy uprawie na nasiona
jest rdza źdźbłowa powodowana przez Puccinia graminis ssp. graminicola (Prończuk 2000, Rogli
i wsp. 2010). Drugą chorobą, obserwowaną w roku 2014 były plamistości liści powodowane przez
grzyby z rodzajów Dreschlera i Bipolaris, które uważane są za równie powszechnie występujące na
trawach w uprawie nasiennej jak wymienione wyżej rdze (Prończuk 2000, Rogli i wsp. 2010).
Obserwacje dotyczące porażenia przez patogeny grzybowe, mogące wyodrębnić odporne formy traw
wymagają kontynuacji w kolejnych latach.
Charakterystyka warunków glebowo-klimatycznych: Analiza statystyczna wyników oceny składu
granulometrycznego, odczynu gleby oraz zawartości makro- i mikroskładników w próbach glebowych
wykazała wyrównanie warunków w poszczególnych miejscowościach w odniesieniu do większości
badanych parametrów. Zróżnicowanie pomiędzy powtórzeniami pod względem zawartości substancji
organicznej stwierdzono w Nieznanicach, pod względem zawartości fosforu – w Radzikowie, pod
względem zawartości żelaza i cynku – w Szelejewie, natomiast pod względem zawartości manganu –
w Lesznie. Z kolei pomiędzy punktami badawczymi stwierdzono istotne zróżnicowanie w odniesieniu
do większości analizowanych parametrów, z wyjątkiem zawartości azotu ogólnego, wapnia oraz boru.
Skład granulometryczny badanych próbek gleby wskazuje na to, iż gleba z Radzikowa i Szelejewa to
glina piaszczysta, z Leszna – piasek gliniasty. Gleba z Nieznanic to mozaika gliny piaszczystej
i piasku gliniastego. Posługując się parametrami składu granulometrycznego określono również
współczynniki infiltracji gruntu, które wynosiły: dla Radzikowa 0,125 cm/godz., dla Szelejewa 0,179
cm/ godz.; dla Nieznanic 0,376 cm/godz. oraz dla Leszna 0,659 cm/godz.
Warunki pogodowe w sezonie wegetacyjnym 2014 (średnie temperatury oraz sumy opadów od marca
do września) były korzystne do zakładania doświadczeń. Temperatury powietrza w tym okresie były
najczęściej wyższe (o 1,4 do 4,2°C) od średnich z wielolecia, ewentualnie równe lub tylko nieco
niższe (do 1,0°C) w maju, czerwcu i sierpniu. Łączna suma opadów w sezonie wegetacyjnym była we
wszystkich punktach badawczych wyższa od średnich z wielolecia od 11% (Szelejewo) do 39%
(Leszno). W poszczególnych miesiącach sumy opadów w Radzikowie i Nieznanicach były również
wyższe od średnich z wielolecia, jedynie w Szelejewie i Lesznie sumy opadów w czerwcu wyniosły
nieco ponad 50% średnich wartości z wielolecia oraz w lipcu ponad 80% wartości z wielolecia.
Wnioski:
Przeprowadzona wstępna ocena materiałów do badań wykazała, iż charakteryzowały się one dużą
zmiennością badanych cech nasiennych (CTN, kiełkowanie). Uzyskane wyniki wykazują, iż
czynnikiem najsilniej wpływającym na zmienność pokroju roślin oraz porażenia przez choroby jest
zespół warunków glebowo-klimatycznych, specyficzny dla poszczególnych punktów badawczych.
Wpływ genotypu na zmienność badanych cech uzależniony był od gatunku – w przypadku kostrzewy
trzcinowej dotyczył wszystkich cech, w kostrzewie łąkowej wszystkich za wyjątkiem porażenia przez
choroby a w kostrzewie czerwonej – tylko pokroju roślin.
Literatura:
Boelt B., Studer B. 2010. Breeding for grass seed yield. W: Boller B. i wsp. (wyd.) Fodder Crops and Amenity
Grasses, Handbook of Plant Breeding 5, Springer Science+Business Media, LLC, 161–174.
COBORU, 2013. Wyniki porejstrowych doświadczeń odmianowych. Trawy pastewne 2012. Wyd. COBORU,
Słupia Wielka, nr 100, str. 1–80.
45
Elliot C.R. 1967. Factor affecting grass seed yields. Canada Agriculture, 1–3.
Gozdowski D., Martyniak D., Mądry W. 2009. Wielowymiarowa ocena zróżnicowania odmian i rodów życicy
trwałej pod względem cech użytkowych w uprawie na nasiona. Biuletyn IHAR, 253: 315–322.
Griffiths D.J., Roberts H.M., Bean E.W., Lewis J., Pegler R.A.D., Carr A.J.H., Stoddart J.L. 1978. Principles of
herbage seed production. Second Edition. Welsh Plant Breeding Station, Plas Gogerddan, Aberystwyth, 1–147.
Kalton R.R., Barker R.E., Welty R.E. 1996. Seed Production. W: Moser L.E., Buxton D.R., Casler M.D. (wyd.)
Cool-season forage grasses. Nr 34, Agronomy. Am. Soc. of Agronomy, Crop Sci. Soc. of America, Soil Sci.
Soc. of America, Madison, WI, USA, 383–411.
Martyniak D., Prończuk S. 2003. Ocena odmian i rodów form kępowych i rozłogowych Festuca rubra L.
z zastosowaniem wskaźnika wartości ogólnogospodarczej. Biul. IHAR, 225: 303–311.
Martyniak D., Prończuk S. 2004. Ocena i stopień wykorzystania kolekcji ekotypów kostrzewy czerwonej
w hodowli nowych odmian gazonowych. Zeszyty Probl. Post. Nauk Roln., 497: 449-454..
Martyniak D. 2005a. Wpływ ilości wysiewanych nasion na obsadę i plonowanie odmian gazonowych kostrzewy
czerwonej (Festuca rubra L.) w uprawie na nasiona. Biuletyn IHAR nr 237/238: 259-267.
Martyniak D. 2005b. Optymalizacja obsady roślin Festuca rubra L. w uprawie na nasiona i użytkowaniu
trawnikowym, s. 71-72. Konferencja naukowa „Walory paszowe i krajobrazowe zbiorowisk trawiastych”,
5-7.05. 2005 r. AR w Lublinie.
Martyniak D. 2006. Reakcja odmian Festuca rubra L. na zróżnicowane ilości wysiewu w uprawie na nasiona
i na trawniki. Biuletyn IHAR nr 242: 112-121.
Martyniak D., Martyniak J. 2008. Przyśpieszenie hodowli traw o zwiększonej reprodukcji nasiennej. Hodowla
Roślin i Nasiennictwa nr 2/2008: 43-49.
Martyniak D., Martyniak J. 2010. Wartość gospodarcza materiałów hodowlanych wybranych gatunków traw
paszowych. Hodowla Roślin i Nasiennictwo, 3/2010: 23–31.
Meyer W.A, Watkins E. 2003. Tall fescue (Festuca arundinacea). W: Casler M.D., Duncan R.R. (wyd.)
Turfgrass biology, genetics, and breeding. John Wiley & Sons. Inc. Hoboken, New Jersey, USA, 107–127.
Prończuk M. 2000. Choroby traw – występowanie i szkodliwość w uprawie na nasiona i użytkowaniu
trawnikowym. Monografie i Rozprawy Naukowe IHAR,4: 1–183.
Rogli O.A., Saha M. C., Bhamidimarri S., Heijden S. van der, 2010. Fescues. W: Boller B. I wsp. (wyd.) Fodder
Crops and Amenity Grasses, Handbook of Plant Breeding 5, Springer Science+Business Media, LLC 2010, 261–
292.
Sleper D.A., West C.P. 1996. Tall fescue. W: Moser L.E., Buxton D.R., Casler M.D. (wyd.) Cool-season forage
grasses. Nr 34, Agronomy. Am. Soc. of Agronomy, Crop Sci. Soc. of America, Soil Sci. Soc. of America,
Madison, WI, USA, 471–502.
Szczepanek M. 2013. Agrotechniczne uwarunkowania rozwoju i plonowania zróżnicowanych odmian kostrzewy
trzcinowej (Festuca arundinacea Schreb.) uprawianej na nasion. Rozprawy UTP, Bydgoszcz, nr 172, str. 1–98.
Tempelton Jr. W.C., Mott G.O., Bula R.J. 1961. Some effects of temperature and light on growth and flowering
of tall fescue, Festuca arundinacea Schreb. II. Floral development. Crop Science 1:
283–286.
UPOV 2002, UPOV Guidelines for the Conduct of Tests for Distinctness, Homogeneity and Stability. Meadow
fescue, Tall fescue, Doc No. TG/39/6
UPOV 2006, UPOV Guidelines for the Conduct of Tests for Distinctness, Homogeneity and Stability. Red
fescue, Sheep’s fescue, Hair fescue, Reliant hard fescue, Shade fescue, Pseudovina, Doc No. TG/67/5
Żyłka D., Prończuk S., Prończuk M. 2001. Porównanie kępowych i rozłogowych podgatunków kostrzewy
czerwonej (Festuca rubra L.) pod względem przydatności na użytkowanie trawnikowe i nasienne. Zesz. Probl.
Post. Nauk Roln. 451: 161–166.
Tytuł zadania: Badania nad mechanizmami warunkującymi proces embriogenezy
gametycznej u buraka cukrowego.
Kierownik zadania: dr hab. M. Gośka prof. IHAR-PIB
Celem zadania jest poszerzenie wiedzy na temat genetycznych mechanizmów warunkujących rozwój
haploidalnych zarodków oraz analiza udziału i biologicznej roli AGP w przebiegu tego procesu.
Punktem wyjścia planowanych prac jest dokładna cytologiczna i molekularna charakterystyka
komórek zalążka buraka. Z powyższych względów, planowane jest przeprowadzenie detekcji
wybranych epitopów AGP oraz precyzyjne określenie ich przestrzennej dystrybucji w komórkach,
46
tkankach i organach podczas kolejnych etapów rozwoju niezapłodnionych zalążków buraka
cukrowego.
Materiałem wyjściowym do badań były wielonasienne diploidalne zapylacze buraka cukrowego
pochodzące z Kutnowskiej Hodowli Buraka Cukrowego - Stacji Hodowli Roślin w Straszkowie.
Korzenie 8 różnych linii DH wysadzono w kwietniu 2014 roku na poletku doświadczalnym
znajdującym się na terenie IHAR-PIB O/Bydgoszcz. W okresie kwitnienia (czerwiec) pobierano
kwiatostany, z których izolowano zalążki z zamkniętych pąków znajdujących się na pędzie powyżej
kwiatu w stadium antezy. Niezapłodnione zalążki wykładano na pożywkę indukcyjną Murashige
i Skooga (MS, 1962) zawierającą 1 mgdm-3 BAP i 0,1 mgdm-3 NAA. Ogółem na pożywkę w okresie
kwitnienia buraków cukrowych wyłożono 7000 zalążków. Na podstawie liczby regenerujących
zarodków określono potencjał embriogenetyczny badanych linii i wybrano 4 genotypy (niski i wysoki
potencjał regeneracyjny), które stanowiły materiał roślinny do analiz w kolejnych etapach badań.
W okresie kwitnienia buraków cukrowych pobierano również wierzchołki wzrostu pędów
kwiatostanowych w celu zachowania materiału roślinnego do dalszych badań. Eksplantaty o długości
0,3–0,5 cm wykładano na pożywkę indukcyjną MS zawierającą 1,0 mgdm-3 BAP. Ogółem wyłożono
400 wierzchołków wzrostu (8 linii po 50 wierzchołków). Prawidłowo rozwinięte pędy rozmnażano na
pożywce regeneracyjnej MS z dodatkiem 0,2 mgdm-3 BAP. Po czterech tygodniach kultury na
pożywce regeneracyjnej, pędy przenoszono na pożywkę ukorzeniającą MS zawierającą 3,0 mgdm-3
IBA. Ukorzenione w kulturach in vitro rośliny przesadzono do doniczek o średnicy 9 cm,
zawierających mieszaninę sterylizowanej ziemi z piaskiem w stosunku 3:1 i umieszczono w kabinach
o wysokiej wilgotności. Bezpośrednia regeneracja roślin z wierzchołków wzrostu pędów
kwiatostanowych buraka cukrowego pozwala na otrzymanie regenerantów o genotypie rośliny
rodzicielskiej, stabilnych cytologicznie. Umożliwia również efektywne rozmnażanie wartościowych
genotypów oraz pozwala na zabezpieczenie jednorodnego materiału w kolejnych latach badań.
W pierwszym roku realizacji zadania wykonano wstępne analizy histologiczne oraz
immunocytochemiczne materiału roślinnego. Immunocytochemiczną analizę z użyciem przeciwciał
monoklonalnych skierowanych do domen oligosacharydowych charakterystycznych zarówno dla
AGP, jak i dla pektyn związanych z proteoglikanami AGP wykonano zgodnie z metodyką opisaną
przez Wiśniewską i Majewską (2007). W celu wizualizacji epitopów, zastosowano drugorzędowe
przeciwciała sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) oraz z fosfatazą alkaliczną. Analizy
mikroskopowe przeprowadzono z użyciem mikroskopu świetlnego oraz fluorescencyjnego.
Obserwacje mikroskopowe ujawniły wstępowanie podobieństw w obecności i relatywnej zawartości
domen strukturalnych rozpoznawanych przez przeciwciało JIM7, jak również różnic w obecności
i relatywnej zawartości domen strukturalnych rozpoznawanych przez przeciwciało LM2, które wydają
się szczególnie ważne ze względu na związek z odmiennym potencjałem embriogenetycznym buraka.
Analizy preparatów mikroskopowych wykazały, że obecność antygenów typowych dla pektyn,
reagujących z przeciwciałem JIM7 stwierdzono w większości komórek zalążka linii o wysokim
i niskim potencjale embriogenetycznym. Natomiast, zaobserwowano pewne różnice w detekcji
epitopów charakterystycznych dla części polisacharydowej proteoglikanów AGP, rozpoznawanych
przez przeciwciało LM2. Stwierdzono tendencję wskazującą na to, iż epitopy te występują w większej
ilości w komórkach zalążków pochodzących z linii o niższym potencjale embriogenetycznym.
Reakcje kontrolne do powyższych analiz, wykonane z pominięciem etapu inkubacji z przeciwciałami
pierwotnymi, wykazały brak znakowania komórek zalążka, co świadczy o poprawnym wykonaniu
analiz immunocytochemicznych.
Przeprowadzono również optymalizację izolacji RNA z niezapłodnionych zalążków buraka. Izolację
przeprowadzono na materiale pochodzącym z jednej linii buraka. Do ewaluacji procedur użyto łącznie
8 próbek, z których każda zawierała po 100 niezapłodnionych zalążków. Przeprowadzono
spektrofotometryczną i elektroforetyczną ocenę jakości i ilości uzyskanego RNA, co umożliwiło
ostateczny wybór optymalnej metody izolacji RNA z tkanek generatywnych. Ponadto
przeprowadzono analizę różnic w ekspresji genów roślin matecznych na czterech etapach
rozwojowych wśród genotypów o wysokim i niskim potencjale embriogenetycznym. Frakcje nowo
zsyntetyzowanego cDNA posłużyły jako matryca do amplifikacji PCR z zastosowaniem łącznie po 15
kombinacji starterów RAPD, ISSR. Na podstawie uzyskanych wyników reakcji PCR zidentyfikowano
potencjalne produkty różnicujące poszczególne etapy rozwoju roślin matecznych (wegetatywny,
47
początek wybijania w pędy, pełnia kwitnienia, początek wiązania nasion) wśród genotypów buraka
cukrowego o różnym potencjale embriogenetycznym.
W wyniku przeprowadzonych reakcji PCR uzyskano łącznie 75 produktów reakcji. Z 15
przetestowanych starterów typu ISSR i 15 starterów typu RAPD, 6 okazało się przydatnych do
dalszych analiz. Liczba prążków generowanych przez jeden starter wyniosła od 6 do 19, a ich
wielkość zawierała się w przedziale od 250 pz do1562 pz. Łącznie uzyskano 10 produktów
wykazujących zmienioną ekspresję. Dwa z tych produktów charakteryzowały się większą ilością
w kolejnych etapach rozwojowych. Jeden produkt wykazał wyższą intensywność u genotypów słabo
regenerujących, zaś nieco niższą u genotypów dobrze regenerujących. Pozostałych siedem produktów
charakteryzowało się zmienioną ilością w zależności od typu użytkowego analizowanych linii buraka.
Zaobserwowane różnice wstępujące w produktach reakcji PCR między analizowanymi liniami miały
charakter ilościowy, co objawiało się zwiększoną lub zmniejszoną intensywnością prążków. Ścisły
związek powyższych produktów z faktycznymi różnicami wynikającymi z etapów rozwojowych
powinien być zweryfikowany w toku kolejnych badań.
Wyniki badań zostały zaprezentowane w formie posteru pt. „Immunolocalization of pectin and
arabinogalactan protein epitopes in unpollinated ovules of Beta vulgaris L. genotypes” na III
Ogólnopolskiej Konferencji pt. „Genetyka i genomika w doskonaleniu roślin uprawnych – od rośliny
modelowej do nowej odmiany”, która organizowana była przez Instytut Genetyki Roślin Polskiej
Akademii Nauk w Poznaniu w dniach 5–7 listopada. Streszczenia str. 102.
Tytuł zadania: Badanie genomu rzepaku ozimego przy wykorzystaniu markerów
molekularnych.
Kierownik zadania: prof. dr hab. I. Bartkowiak-Broda
Cel zadania:
Charakterystyka molekularna oraz określenie zróżnicowania kolekcji odmian i linii rzepaku
o znaczeniu gospodarczym
Materiał roślinny stanowiły polskie i zagraniczne odmiany populacyjne rzepaku ozimego, a także
genotypy rzepaku wytworzone i znajdujące się w kolekcji IHAR-PIB, Oddz. Poznań: mieszańce F1
oraz linie CMS ogura i linie restorery Rfo dla systemu hybrydyzacji CMS ogura, linie podwojonych
haploidów (DH), linie mutantów o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych w oleju nasion i ich
rekombinanty, linia DH o żółtej barwie nasion, a także linia rzepaku otrzymana w wyniku resyntezy
z gatunków podstawowych.
Wyizolowano genomowy DNA z 27 roślin z badanej kolekcji, a następnie prowadzono analizy
molekularne. Stopień podobieństwa genetycznego badano z zastosowaniem markerów typu AFLP,
w oparciu 10 kombinacji starterów i enzymy restrykcyjne EcoR I / Mse I oraz wybranych 48 loci
mikrosatelitarnych (STR), ze znakowanymi fluorescencyjnie starterami metodą ‘M13-tailing’.
Występowanie męsko-sterylnej cytoplazmy typu ogura oraz genu restorera Rfo monitorowano przy
użyciu analizy ‘multipleks PCR’, natomiast formy alleliczne genów desaturaz Fad2 i Fad3
identyfikowano, odpowiednio, z zastosowaniem kodominującego markera CAPS oraz allelospecyficznych markerów funkcjonalnych typu SNaPshot. Produkty reakcji analizowano metodą
elektroforezy w żelu agarozowym wybarwianym bromkiem etydyny oraz z zastosowaniem
elektroforezy kapilarnej; te ostatnie odczytywano stosując program PeakScanner.
Podobieństwo genetyczne (GS) badanych obiektów oszacowano stosując miarę Nei i Li.
Współczynniki posłużyły do hierarchicznego grupowania linii metodą średnich połączeń. Wyniki
przeprowadzonych grupowań przedstawiono w formie dendrogramów. Wszystkie obliczenia
wykonano korzystając z pakietu statystycznego GenStat.
Przed założeniem doświadczeń polowych namnożono w szklarni materiał siewny i poddano
kompleksowej analizie biochemicznej dla określenia zawartości tłuszczu, białka ogólnego, włókna
pokarmowego, glukozynolanów oraz składu kwasów tłuszczowych w oleju nasion. Wybrano 25
48
genotypów i wysiano w dwóch doświadczeniach polowych (Łagiewniki i Borowo) w układzie bloków
kompletnie zrandomizowanych, w czterech powtórzeniach. Wykonano ocenę bonitacyjną wschodów
i stanu roślin przed zimą w skali 1-9 na wszystkich obiektach doświadczenia, określono obsadę roślin
przed zimą oraz zawartość chlorofilu w roślinach.
Wyniki i dyskusja:
Określono stopień podobieństwa w obrębie badanej kolekcji genotypów rzepaku w wyniku analizy
AFLP oraz STR. Zastosowano 10 kombinacji starterów AFLP i otrzymano 442 produkty amplifikacji,
w tym 362 były polimorficzne. Jeden starter generował średnio 36,2 markera. Liczba polimorficznych
fragmentów DNA dla pojedynczego startera wahała się od 16 do 48. W reakcji ze starterem E-ACC
NED : M-CAC otrzymano największą liczbę polimorficznych fragmentów DNA — 48. Najwyższy
poziom polimorfizmu – 97,43 otrzymano dla kombinacji starterów E-ACC NED : M-CTC. Poziom
polimorfizmu dla poszczególnych kombinacji starterów wynosił około 81%. Wszystkie kombinacje
starterów różnicowały badane genotypy rzepaku ozimego. Na podstawie analizy polimorfizmu
markerów AFLP przeprowadzonej przy użyciu 258 różnicujących markerów otrzymanych w wyniku
analiz za pomocą 7 par starterów AFLP na 26 badanych genotypach rzepaku utworzono dendrogram
ich podobieństwa genetycznego; genotypy zostały przyporządkowane do poszczególnych grup
zgodnie z ich pochodzeniem. Metoda AFLP jest używana do określania zróżnicowania genetycznego
genotypów roślin w badaniach prowadzonych w wielu ośrodkach na świecie; w IHAR-PIB, Oddz.
Poznań stosowana jest od kilku lat, a wprowadzona ostatnio metoda analizy barwionych
fluorescencyjnie produktów reakcji z zastosowaniem elektroforezy kapilarnej umożliwiła zwiększenie
efektywności prowadzonych badań. Dzięki temu można poszerzać zakres analizowanych loci
określanych metodą AFLP, co zwiększa precyzyjność badań.
Wykonano analizę zróżnicowania w obrębie 27 genotypów rzepaku z badanej kolekcji przy użyciu par
starterów dla 48 loci STR, przy czym jednoznaczne analizy można było przeprowadzić dla 15 spośród
analizownych genotypów oraz 35 loci. Dla każdego locus zidentyfikowano od 1 do 4 lub
6 polimorficznych produktów amplifikacji; niektóre były monomorficzne. Wyznaczono wstępnie
dendrogram podobieństwa genetycznego, który częściowo odzwierciedlał pochodzenie badanych
genotypów. Markery mikrosatelitarne, podobnie jak innego typu markery genetyczne, znajdują
zastosowanie do mapowania genetycznego, mapowania asocjacyjnego, identyfikacji rodziców
i potomstwa, identyfikacji danej próby, zarówno na poziomie indywidualnym, jak i populacyjnym;
mogą służyć nie tylko do określania wzajemnych zależności między osobnikami w badanej populacji
lub kolekcji, lecz także precyzyjnej identyfikacji danego genotypu na zasadzie odcisku palca (ang.
fingerprinting). Rozpoczęte analizy z zastosowaniem uniwersalnych markerów loci STR stanowią
o postępie w badaniach genomu rzepaku w IHAR-PIB, Oddz. Poznań.
Wykazano, metodą ‘multipleks PCR’, występowanie męko-sterylnej cytoplazmy CMS ogura
w 11 z 27 badanych genotypów, a gen restorer Rfo – w 7 genotypach. Markery te są bardzo przydatne
do jednoznacznej identyfikacji genotypów mieszańców F1, a także rekombinantów linii z genem Rfo,
które fenotypowo są identyczne z odmianami populacyjnymi; ich zastosowanie pozwoliło na
precyzyjną identyfikację pożądanych genotypów.
Obecność zmutowanych homozygotycznych alleli fad2A wykryto metodą CAPS w trzech liniach,
heterozygotycznych – w dwóch, natomiast zmutowanych homozygotycznych alleli fad3A i fad3C
(metodą SNaPshot) – w dwóch genotypach; heterozygot nie stwierdzono. Zastosowane markery typu
CAPS i SnaPshot umożliwiają jednoznaczną identyfikację form allelicznych genów desaturaz Fad2
i Fad3 w genomach A i C rzepaku odpowiedzialnych za cechy zawartości, odpowiednio, kwasu
oleinowego i linolenowego w oleju nasion linii mutantów rzepaku ozimego, otrzymanych w IHARPIB, Oddz. Poznań. Dotąd należą one do nielicznych tego typu opublikowanych markerów
funkcjonalnych.
Wykonana przed siewem ocena biochemiczna nasion rzepaku 25 badanych obiektów wykazała ich
zróżnicowanie pod względem: procentowej zawartość tłuszczu w nasionach w zakresie od 38,5% do
53,4%, zawartości włókna NDF od 21,2% do 32,5%, zawartości włókna ADF od 14,1% do 30,4%
oraz zawartości białka ogólnego w zakresie od 15,7% do 26,5%. Analiza chemiczna składu kwasów
tłuszczowych nasion uwidoczniła również dużą zmienność zawartości: kwasu oleinowego (od 60,2%
do 83,6%), kwasu linolowego (od 5,3% do 23,5%), kwasu linolenowego (od 3,3% do 11,5%). Duże
zróżnicowanie badane obiekty wykazały także w zawartości sumy glukozynolanów (od 3,8 μmol g-1
do 65,5μmol g-1) oraz glukozynolanów alkenowych (od 1,4 μmol g-1 do 62,6 μmol g-1). Analizy nasion
49
wykonane uproszczoną metodą NIRS w pełni potwierdziły zróżnicowanie jakościowe nasion
badanych genotypów. Przy wyborze genotypów do badań kierowano się zarówno pochodzeniem
danych materiałów jak również obserwacjami ekspresji fenotypowej cech jakościowych takich jak
zawartość glukozynolanów, profile kwasów tłuszczowych oraz zawartość białka i włókna.
Ocena punktowa wschodów i stanu roślin przed zimą wykonana w obu doświadczeniach polowych
i na wszystkich obiektach wykazała statystycznie wysoce istotne ich zróżnicowanie. Istotne
zróżnicowanie obiektów stwierdzono także w obsadzie roślin przed zimą na poletkach
doświadczalnych oraz zawartości chlorofilu w liściach, która kształtowała się w zakresie od 45 do
56,2 jedn. SPAD.
Wnioski:
Uzyskane wyniki analiz molekularnych wykazują przydatność markerów molekularnych do określenia
zmienności genetycznej rzepaku ozimego ze względu dużą precyzję, powtarzalność, która jest
porównywalna do badań przeprowadzonych tymi metodami w innych ośrodkach badawczych na
roślinach z rodziny Brassicaceae. Badania te będą kontynuowane poprzez zwiększenie liczby
badanych loci w analizie stopnia podobieństwa genetycznego pomiędzy liniami rzepaku ozimego
w obrębie badanej kolekcji z zastosowaniem markerów typu AFLP i STR, jak również poprzez
dążenie do uzyskania jednoznacznych i powtarzalnych wyników w analizie loci STR i wytypowanie
markerów polimorficznych, a także monitorowanie w badanych genotypach obecności męskosterylnej cytoplazmy (CMS) typu ogura i genu restorera Rfo oraz form allelicznych genów desaturaz
Fad2 i Fad3 w genomach A i C B. napus. Analizy molekularne będą dalej prowadzone
z jednoczesnym zwiększeniem liczby loci AFLP i STR w celu poznania struktury kolekcji linii
rzepaku ozimego oraz tworzenia bazy danych, obejmującej molekularną charakterystykę badanych
genotypów. W kolejnym roku zostaną uwzględnione również inne, wartościowe gospodarczo linie
rzepaku, rekomendowane przez hodowców do badań stopnia podobieństwa genetycznego oraz
monitorowania obecności genu Rfo i CMS ogura w poszczególnych genotypach.
Badany w rozpoczętych doświadczeniach polowych materiał roślinny wykazuje duże zróżnicowanie
fenotypowe niezbędne do analiz molekularnych oraz genotypowania. Obserwacje fenotypowe
i fenologiczne będą prowadzone w kolejnym sezonie wegetacyjnym; do badań zostaną włączone
również wartościowe genotypy rzepaku rekomendowane przez hodowców.
Tytuł zadania: Badanie bioróżnorodności gatunków z plemienia Brassiceae w celu
otrzymania form rzepaku ulepszonych pod względem odporności na patogeny.
Kierownik zadania: dr hab. M. Starzycki prof. IHAR-PIB
Podstawowym celem przeprowadzonych badań było: wytwarzanie mieszańców międzygatunkowych
techniką in vitro oraz poszukiwanie genotypów z plemienia Brassiceae odpornych na porażenie
powodowane przez Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp. Ponadto celem było poszukiwanie DNA
(amplikonów) u genotypów wykazujących wyższy poziom odporności poligenicznej.
Zakres prac realizowanych w danym roku obejmował: wytwarzanie mieszańców międzygatunkowych
techniką in vitro i poszukiwanie genotypów z plemienia Brassiceae odpornych na porażenie
powodowane przez Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp. W pracy wykorzystano techniki klonowania
in vitro i in vivo. Badano również odporność siewek otrzymanych z mieszańców międzygatunkowych
i roślin kontrolnych oraz donorowych rzepaku, wybranych genotypów na porażenie powodowane
przez patogeny Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp. Na wybranych roślinach mieszańcowych
wykonano analizy DNA.
Do krzyżowań międzygatunkowych użyto dotychczas nie stosowane nowe genotypy roślin
matecznych i ojcowskich oraz gatunki pokrewne, które wstępnie przeselekcjonowano na patogeny
z rodzaju Leptosphaeria sp. i Alternaria sp. W badaniach wykorzystano następujące gatunki
podstawowe: kapustę brukselską B. oleracea var. gemmifera 2n = 18 (CC), kapustę pastewną
B. oleracea var. acephala 2n = 18 (CC), kapustę jarmuż B. oleracea var. acephala subvar. Lacinista
2n = 18 (CC), oraz B. campestris o liczbie chromosomów 2n = 20 (AA), B. carinata 2n = 34 (BBCC),
50
B. nigra 2n = 16 (BB), B. juncea 2n = 36 (AABB). Do krzyżowań wypierających zostały użyte
otrzymane w ubiegłych latach mieszańce międzygatunkowe z cytoplazmą B. oleracea i B. campestris
oraz mieszańce z cytoplazmą rzepaku B. napus (AACC). Po osiągnięciu przez rośliny fazy kwitnienia
w większości przypadków krzyżowano je przemiennie tak, aby otrzymane potomstwo posiadało
cytoplazmę genotypów wcześniej selekcjonowanych pod względem odporności na porażenie przez
patogeny z rodzaju Alternaria i Leptosphaeria. Uzyskane embriony stadiów: globularnych lub
sercowatych zostały nałożone na pożywki agarowe B5 z fitohormonami BAP 1mg/l (cytokinina)
i 0,01mg/l IAA (auksyna), i przeniesione do warunków fitotronowych. Następnie otrzymane rośliny
pokolenia F1 mieszańców międzygatunkowych klonowano w warunkach in vitro celem namnożenia
tego materiału do testów odpornościowych. Najlepiej rozwinięte eksplantaty skierowano do dalszych
badań. W obrębie powyższych form wykonano 23 udane przekrzyżowania (łącznie ponad 60),
z których wypreparowano 61 żywych embrionów. Obecnie rozklonowano 60 nowych genotypów
w warunkach in vitro. Aby podnieść wydajność otrzymywania embrionów mieszańcowych we
wniosku zwrócono uwagę na odpowiednio dobrane kombinacje temperaturowe (powinny być niższe),
a długość czasu doświetlenia, podczas hodowli izolowanych zarodków in vitro, powinna wynosić
powyżej 12h. Podane dwa parametry fizyczne mogą przyczynić się do wyższej wydajności otrzymania
żywych embrionów.
Następnym zagadnieniem dotyczącym mieszańców międzygatunkowych było poszukiwanie
genotypów z plemienia Brassiceae odpornych na porażenie powodowane przez Leptosphaeria sp. oraz
Alternaria sp. Na podstawie badania odporności, indywidualnie ocenianych pod względem chorób,
form donorowych z plemienia Brassicae, zostały wykonane prace w warunkach polowych na
doświadczeniach PDOiR oraz DW. Każdy obiekt oceniany był (IP) na podstawie obserwacji 40 roślin
w 1 powtórzeniu (najczęściej 3 powtórzenia). Przyjęto trójstopniową skalę oceny odporności (0-brak
porażenia, 1-średnie, 2-silne porażenie). Powyższe badania występowania patogenów lub określenie
(IP - indeks porażenia) były prowadzone w całym okresie wegetacyjnym w warunkach polowych,
w miejscowościach: Małyszyn, Borowo (HR Strzelce) i Bąków (HR Smolice Sp. z o.o. Grupa IHAR).
Odporność mieszańców międzygatunkowych wyrażoną Indeksami Porażenia dla Leptosphaeria sp.
(po analizie wariancji i testu Duncana na poziomie α=0,050, NIR=0,04473) wskazały formy: 301
x Digger (Choryńska x B.n.) IP=0,01, 301 x 303 TP/06 p. (Choryńska x B.n.) x (Californium x B.n.)
IP=0,01, 295 x 645 TP/06 p.(Br. X Bn) x Lisek IP=0,01, 297/06 p.(Jar x Bn) x B.n. P=0,007 oraz
38B.t. x B.n./2 P=0,007. Odporności mieszańców międzygatunkowych dla Alternaria sp. wykazały
formy (z IP=0,001): 38B.t. x B.n./1, 301 x Digger/06 p.(Choryń x Bn)xCalif, 53 Bru, 301 x 303 TP/06
p. Choryńska. Na wybranych obiektach wykonano analizy GC dla wyeliminowania genotypów
o dużym udziale związków antyżywieniowych. Na podstawie badań odporności indywidualnie
ocenianych pod względem chorób (Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp.) form donorowych
z plemienia Brassicae, wyselekcjonowano najodporniejsze w doświadczeniach PDOiR i DW w celu
piramidyzacji rezystencji. Genotypy te zostaną także użyte do krzyżowań międzygatunkowych, jako
formy ojcowskie-zapylacze w następnym sezonie wegetacyjnym. Podczas badań odporności roślin
B. napus odnotowano niewielką liczebność roślin chorych do fazy „po kwitnieniu”. Dopiero pod
koniec okresu wegetacyjnego zaobserwowano choroby, które bonitowano. Na podstawie otrzymanych
wyników wyróżniono odmiany rzepaku oraz grupy odmian charakteryzujące się podwyższoną
odpornością na Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp. co wykazano statystycznie. We wniosku
wskazano, że rody i odmiany rzepaku, u których zaobserwowano wyższą rezystencję będą stanowić
dobry materiał (formy ojcowskie) do dalszych badań związanych z hodowlą odpornościową.
Kolejnym zadaniem w temacie było wykorzystanie w badaniach technik klonowania in vitro i in vivo
dla otrzymania roślin mieszańców międzygatunkowych. Po wykonanych doświadczeniach
stwierdzono, że do klonowania otrzymanych mieszańców międzygatunkowych niezbędne są dobrze
wykształcone zarodki, które po fragmentowaniu rokują dobry ich rozwój. Ważny jest także czas,
w którym czynności te należy wykonać. Jeżeli tkanki zostaną pocięte zbyt wcześnie, często dochodzi
do ich zamierania, późniejsze z reguły przeżywają. Następną czynnością związaną z klonowaniem jest
użycie kultur hydroponicznych w celu ukorzenienia eksplantatów lub ich oczyszczenie z podłoża
agarowego zawierającego związki organiczne. Hodowla ta pozwala na pozbycie się resztek pożywki
agarowej, która bardzo często wpływa na silne infekcje eksplantatów po przesadzeniu roślin do
warunków glebowych. Należy podkreślić, że po użyciu kultur hydroponicznych, procent
ukorzenionych roślin w glebie jest bliski 100%. Powyższe badania stanowią ważną informację
51
dotyczącą optymalizacji otrzymywania rozklonowanych żyjących eksplantatów mieszańców
międzygatunkowych, które następnie wykorzystywane są do testów odpornościowych. Wykonane
badania pozwoliły na sformuowanie następujących wniosków:
1./ Aby zwiększyć wydajność klonowanych mieszańców międzygatunkowych otrzymanych in vitro
należy zwrócić uwagę na ich stan fizjologiczny, a szczególnie ich wielkość (powyżej stadium
torpedalnego), a następnie po wyrośnięciu eksplantatów do większych struktur można je
pofragmentować – klonować.
2./ Użyte w badaniach kultury hydroponiczne pozwalają na otrzymanie wysokiego procentu żywych
roślin mieszańców międzygatunkowych, które po ich przesadzeniu do warunków glebowych nie
stwarzają problemów z ich dalszym rozwojem.
Następne badania dotyczyły prac związanych z odpornością siewek otrzymanych z mieszańców
międzygatunkowych wybranych genotypów na porażenie powodowane przez patogeny z rodzaju
Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp.. Celem tematu badawczego było stwierdzenie odporności
otrzymanych roślin (siewek) mieszańcowych na porażenie powodowane przez powyższe patogeny.
Czystość gatunkową użytego inokulum potwierdzano za pomocą analizy DNA ITS1 (NCBI/BLAST),
a koncentrację zarodników konidialnych stosowanych do testów oceniano nefelometrycznie. Badania
prowadzono w taki sposób, aby wyselekcjonować formy wykazujące maksymalną odporność na
wybrane patotypy chorobotwórczych grzybów. Ponadto wykonano wstępne badania DNA
mieszańców międzygatunkowych w celu wyboru fragmentów DNA, które będą kojarzone
z odpornością roślin. Po przeprowadzonych badaniach odporności siewek przy użyciu uproszczonego
testu Williamsa można było wskazać genotypy odporniejsze na porażenie powodowane przez:
Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp. Na Leptosphaeria sp. odporniejsze były mieszańce: 15.301
x Digger (Choryń x Bn)xCalif (ACC), 18. B. taurica x B.n. (ACC). Na Alternaria sp. odporniejsze
były mieszańce: 15. 301 x Digger/06 p.(Choryń x Bn)xCalif (ACC), 18. B. taurica x B. n (ACC).
Powyższe analizy mogą być obarczone pewnymi błędami, ponieważ nie weryfikowano ich
w warunkach polowych. Warunki naturalne stymulują w wielu przypadkach elicitory, których brak
jest w tzw. hodowlach kontrolowanych, nawet w fitotronie. Wykonano wstępne 30 analiz DNA, form
wyjściowych oraz mieszańców międzygatunkowych. Do tego zadania wykorzystano 6 wybranych
starterów RAPD, które wykazały duży polimorfizm badanych obiektów. Po badaniach DNA
i analizach fitopatologicznych rzepaku na porażenie powodowane przez chorobotwórcze grzyby:
Leptosphaeria sp. oraz Alternaria sp., we wniosku wskazano, że najbardziej obiecującym gatunkiem
donorowym genów odporności była kapusta - Brassica taurica.
Tytuł zadania: Wprowadzanie nowych alleli z pul genowych różnych gatunków z rodzaju
Brassica do bazy genowej rzepaku ozimego.
Kierownik zadania: prof. dr hab. T. Cegielska-Taras
Cel zdania na 2014 rok:
A/ Uzyskanie roślin z rodzaju Brassica rapa i Brassica oleracea z pędami generatywnymi
odpowiednimi do krzyżowań międzygatunkowych.
B/ Uzyskanie roślin mieszańcowych, poprzez krzyżowanie międzygatunkowe, z diploidalnych
gatunków podstawowych: B. rapa i B. oleracea.
Materiał
Materiałem do badań w obu tematach były różne podgatunki B. rapa: dwie odmiany rzepiku jarego,
pięć odmian rzepiku ozimego i kapusta pekińska oraz B. oleracea: trzy odmiany jarmużu i jedna
odmiana kapusty brukselskiej. Nasiona odmian rzepiku jarego i ozimego pochodzą z kolekcji roślin
oleistych w Borowie oraz z Banku Genów w Radzikowie. Nasiona odmian jarmużu, kapusty
brukselskiej i kapusty pekińskiej – komercyjne – dostępne w sprzedaży.
52
Ad. A. Badania nad wymaganiami jarowizacyjnymi B. rapa i B. oleracea
Metody
Rośliny B. rapa jaryzowano, standardowo w fazie 4-5 właściwych liści w komorach chłodniczych
przez 8 tygodni w temperaturze +40 C przy ośmiogodzinnym oświetleniu. Natomiast rośliny kapusty
pekińskiej do jaryzacji przenoszono w stadium dobrze wykształconej rozety liści. Po czasie jaryzacji
rośliny przesadzano do większych pojemników z glebą i dalsza ich wegetacja przebiegała w fitotronie
w warunkach 130C dzień/100 C noc przy 16-godzinnym fotoperiodzie. Wegetacja wszystkich roślin
obu badanych gatunków po okresie jaryzacji przebiegała w tych samych warunkach światła
i temperatury w fitotronie.
Wyniki
Brassica rapa. Po ośmiotygodniowej jaryzacji badane formy jare i ozime B. rapa, oprócz dwóch
odmian rzepiku ozimego, wytwarzały pędy generatywne w ciągu dwu miesięcy. Dlatego okres
jaryzacji dla roślin tych dwu odmian rzepiku ozimego przedłużono do dziesięciu tygodni. Po tym
czasie uzyskano prawidłowo wykształcone pędy generatywne. Wszystkie badane odmiany jare, po
okresie jaryzacji, rozwijały się szybciej oraz wytwarzały bujniejsze pędy kwiatowe.
Brassica oleracea. Rośliny jednej odmiany jarmużu, po okresie standardowej jaryzacji (8 tygodni
w temp. +40C w warunkach krótkiego dnia) w okresie sześciu tygodni zaczęły rozwijać pędy
generatywne. Natomiast roślinom pozostałych dwu odmian jarmużu okres jaryzacji w fazie 5 liści
przez 8 tygodni był niewystarczający do wytworzenia pędów kwiatowych. Dla tych odmian
przedłużano jaryzację do 12 lub nawet do 16 tygodni. Rośliny brukselki jaryzowane w warunkach
komory jarowizacyjnej w stadium 5 liści, po 12 i 16 tygodniach jaryzacji w ogóle nie wytwarzały
pędów. W kolejnym eksperymencie do jaryzacji kierowano rośliny brukselki w stadium 10-16
prawidłowo wykształconych liści. Po 16 tygodniach jaryzacji w komorach chłodniczych rośliny te
przeniesiono do fitotronu. W przeciągu kolejnych dwu miesięcy zaobserwowano powolne tworzenie
pędów generatywnych.
Dyskusja
Na zakwitanie roślin ozimych i dwuletnich wpływają procesy biochemiczne indukowane wpływem
niskich temperatur. Rośliny te bez okresu chłodu rozwijają się tylko wegetatywnie, nie tworząc pędów
kwiatowych (Kopcewicz 2002). W literaturze nie spotyka się prac dotyczących warunków sztucznej
wernalizacji roślin ozimych z rodzaju Brassica, oprócz rzepaku, ani roślin dwuletnich.
W przeprowadzonych badaniach rośliny większości odmian rzepiku ozimego w stadium czterechpięciu liści przechodziły wernalizację w ciągu ośmiu tygodni, taką - jaką opisano dla rzepaku
(Cegielska-Taras 2002) i po tym czasie wchodziły w fazę generatywną. Jedynie tradycyjna odmiana
rzepiku ozimego wymagała dłuższego - 12 tygodniowego okresu jaryzacji. Rośliny rzepiku jarego
i kapusty pekińskiej z powodzeniem przechodziły ośmiotygodniowy okres wernalizacji, w fitotronie
wytwarzały bujne pędy kwiatowe. Natomiast dłuższego okresu jaryzacji niezbędnej do zainicjowania
fazy generatywnej wymagają rośliny dwuletnie z rodzaju Brassica takie jak jarmuż, a szczególnie
brukselka. Dla jarmużu stadium pięciu liści było odpowiednie do rozpoczęcia jaryzacji. Jednakże
wystąpiły różnice odmianowe w długości czasu wernalizacji. Jak wynika z przeprowadzonych badań
dla rozpoczęcia fazy generatywnej brukselki, w warunkach sztucznych, wymagane jest stadium roślin
w fazie ponad 10 liści oraz 16 tygodni jaryzacji.
Cegielska-Taras 2002. Monografie i Rozprawy Naukowe 18/2002. Kultura in vitro mikrospor w genetycznym
ulepszaniu rzepaku ozimego (Brassica napus L.)
Kopcewicz J. 2002. Rozwój generatywny W: Fizjologia roślin (red. Kopcewicz Jan, Lewak Stanisław).
Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN.
Wnioski
Wymagania jarowizacyjne roślin z rodzaju Brassica zależą od gatunku rośliny i stadium jej rozwoju.
Szczególnie duże wymagania jarowizacyjne stwierdzono u kapusty warzywnej brukselskiej
- 16 tygodni w fazie ponad 10 liści.
Ad. B. Badania nad otrzymaniem roślin mieszańcowych z obukierunkowych krzyżowań gatunków
diploidalnych: B. rapa i B. oleracea.
Metody
Do krzyżowania międzygatunkowego wykorzystano metodę zapylania in vivo, polegającą na
nakładaniu pyłku formy ojcowskiej na znamienia słupka, głównie dla kierunku krzyżowania B. rapa
z B. oleracea. Natomiast dla kierunku krzyżowania B. oleracea z B. rapa wykorzystano zapylanie
53
in vitro, które polegało na nanoszeniu pyłku na izolowane odcięte zalążnie w kulturze in vitro. Po
7, 12 i 15 dniach od zapylenia, zarówno słupków jak i zalążni, izolowano powiększone zalążki, które
przeniesione zostały na pożywkę MS z 2% sacharozą z dodatkiem 0,2 mg/l BAP lub 10% wody
kokosowej. W każdej kombinacji liczbę prawidłowo wykształconych zarodków obliczano w stosunku
do wyłożonych powiększonych zalążków. Rozwinięte zarodki przeniesione zostały na pożywkę MS
z kinetyną w celu regeneracji pędów.
Wyniki
Zapylanie in vivo
W W eksperymencie wykorzystano odmiany rzepiku jarego, ozimego oraz kapustę chińską i jarmuż
tradycyjny oraz brukselkę. Po siedmiu dniach od zapylenia (dpz) 20 słupków k. chińskiej pyłkiem
jarmużu z powiększonych zalążni wyizolowano 43 powiększone zalążki. Z wyizolowanych
powiększonych zalążków nie rozwinęły się zarodki. Następnie z tej samej kombinacji krzyżówkowej
z zapylonych 80 słupków po 12 dpz wyizolowano 90 powiększonych zalążków. Po przeniesieniu na
pożywkę uzyskano jeden prawidłowo wykształcony zarodek. Także po 12 dpz z 66 słupków
z krzyżowania rzepiku ozimego z jarmużem wyizolowano 45 powiększonych zalążków. Po
przeniesieniu na pożywkę uzyskano 2 prawidłowo wykształcone zarodki. Natomiast z 40 zapylonych
słupków, w krzyżowaniu brukselka × kapusta chińska, wyizolowano 44 powiększone zalążki,
z których otrzymano jeden zarodek. Kolejne eksperymenty polegały na przeniesieniu powiększonych
zalążków na pożywkę po 15 dpz. W tej kombinacji łącznie z zapylonych 386 słupków wyizolowano
z zalążni 272 powiększone zalążki, z których po przeniesieniu na pożywkę rozwinęło się
15 zarodków, co stanowiło 5,5%. Były to krzyżowania rzepików jarych i ozimych, rzepiku i brukselki,
odm. jarmużu oraz kapusty chińskiej.
Zapylanie in vitro
W eksperymencie wykorzystano odmiany rzepiku jarego, ozimego oraz kapustę chińską i jarmuż
tradycyjny oraz brukselkę.
Po 7 dpz z 16 zapylonych pyłkiem kapusty chińskiej zalążni jarmużu wyizolowano 60 powiększonych
zalążków i przeniesiono na pożywkę MS. Z tych struktur nie rozwinęły się żadne zarodki. Podobny
wynik uzyskano wykładając 12 zapylonych zalążni z krzyżowania brukselki × kapusta chińska - po
7 dpz wyizolowano na pożywkę MS 24 powiększone zalążki, z których również nie rozwinęły się
zarodki. Natomiast z tej samej kombinacji krzyżówkowej po 12 dpz wyizolowano 12 powiększonych
zalążków i po kilkunastu dniach rozwinął się jeden zarodek. Z zalążni brukselki po 12 dniach od
zapylenia rzepikiem ozimym wyizolowano 34 powiększone zalążki, z których rozwinęły się trzy
prawidłowo wykształcone zarodki. Kolejne powiększone zalążki z zapylonych zalążni izolowano po
15 dpz. Łącznie z 357 zapylonych zalążni wyizolowano 173 zalążki, z których na pożywce MS
rozwinęło się 8 zarodków, co stanowi ok. 4,6 %.
Wyniki zamieszczono w prezentacjach jako wykłady i plakat zał. nr 1, 2, 3.
Dyskusja
Materiałem do hybrydyzacji międzygatunkowej były podgatunki: B. oleracea i B. rapa, które są
gatunkami ancestralnymi allotetraploidalnego rzepaku (Brassica napus) i krzyżują się bardzo trudno.
Dlatego wykonano obukierunkowe krzyżowania B. rapa i B. oleracea poprzez zapylanie in vivo oraz
in vitro. Olsson (1960) stwierdził, podczas krzyżowania międzygatunkowego roślin Brassica
o nierównej liczbie chromosomów, drogą zapylania in vivo, pożądany efekt uzyskuje się wówczas gdy
forma mateczna posiada większą liczbę chromosomów niż forma ojcowska. B. rapa posiada 2n=20,
a B. oleracea 2n=18. Natomiast odwrotnie, kiedy forma mateczna posiada mniej chromosomów
krzyżowanie bardzo rzadko się udaje (Takeshita i in 1980). Powszechnie podkreślane są trudności
w uzyskiwaniu zarodków mieszańcowych w kombinacji B.oleracea × B. rapa (Chen, Heneen 1989;
Lu i in, 2001; Malek i in. 2012; Rahman 2004). W krzyżowaniach oddalonych istnieją bowiem bariery
pre- i postzygotyczne (Zenkteler 1990, Sosnowska 2011). Bezpośrednie zapylanie in vitro zalążni
połączone z kulturą izolowanych zarodków we wczesnym etapie rozwoju może być przydatne
w obejściu tych barier niezgodności, a tym samym możliwe jest uzyskanie mieszańców
międzygatunkowych. Izolacja zalążków z zalążni po 7 dniach od zapylenia okazała się zbyt wczesna.
Prawdopodobnie zarodki mieszańcowe znajdowały się w stadium kulistym zbyt wczesnym jak na
dalszy rozwój w warunkach kultury in vitro. Jak wynika z uzyskanych wyników jedynie zalążki
izolowane z zalążni po 12-15 dniach od zapylenia znajdują się w odpowiednim stadium do dalszego
ich rozwoju. W literaturze spotyka się izolowanie zalążków w bardzo różnych terminach od 10 dni
54
nawet do 20 dni (Lu i in, 2001; Malek i in. 2012 Rahman 2004, Zhang i in. 2004). Dlatego konieczne
są badania eksperymentalnie nad ustaleniem liczby dni od zapylenia przed wykładaniem zalążków.
Metoda kultury in vitro izolowanych zarodków we wczesnym stadium rozwoju (embryo rescue)
pozwala przełamać bariery postzygotyczne, przede wszystkim związane z niedorozwojem bielma. Bez
pomocy kultury in vitro taki zarodek ulega degeneracji. W niniejszych badaniach efektywność
zapylania in vitro obliczona stosunkiem wyłożonych zalążków do uzyskanych zarodków, wynosiła
4,6%. Wydajność tej metody była podobna do uzyskania zarodków poprzez zapylanie, in vivo, która
wynosiła 5,5%. Ten efekt uzyskano wykładając powiększone zalążki na pożywkę MS z 2% sacharozą
oraz dodatkiem 10% wody kokosowej i 0,2 mg/l BAP. Zarówno substancje biologicznie aktywne
zawarte w wodzie kokosowej jak i dodatek fitohormonu BAP korzystnie wpływały na rozwój
zarodków mieszańcowych. Z każdego zarodka przeniesionego na pożywkę w kulturze in vitro
uzyskano roślinę.
Literatura
Chen B-Y, Heneen W. 1989. Hereditas 111, 255-263
Lu C.M., Zhang B., Kakihara F., Kato M. Plant Breeding.120: 405-410.
Malek M.A., Ismail M.R., Rafii M.Y., Rahman M. 2012.The Scientific World Journal 2012 ID 416901,
doi:1.1100/2012/416901.
Olsson G. 1960. Hereditas 46: 351-386.
Rahman M.N. 2004. Can.J.Plant Sci. 84: 965-969.
Sosnowska K. 2011. Rośliny Oleiste-Oilseed Crops, XXXII: 211-222.
Takeshita M., Kato M., Tokumasu S. 1980. Japan J Genet 55: 373-387.
Zenkteler M. 1990. CRC Crit Rev Plant Sci 9: 267-279.
Zhang G.Q., Tang G.X., Song W.J., Zhou W.J. 2004. Euphytica 140: 181-187.
Tytuł zadania: Badania nad indukcją embriogenezy mikrospor u roślin z rodzaju
Brassica.
Kierownik zadania: prof. dr hab. T. Cegielska-Taras
Cele zdania:
A/ Badanie wpływu warunków wzrostu - na kondycję fizjologiczną roślin dawców mikrospor.
B/ Badania nad ustaleniem markera morfologicznego - długości pąka – powiązanego ze stadium
mikrospory zdolnej do zmiany z rozwoju generatywnego na wegetatywnego.
C/ Badania nad wpływem skutecznej stymulacji izolowanych mikrospor do podziałów w kulturze
in vitro.
D/ Badania nad kulturą zarodków mikrosporowych rzepaku i gorczycy.
E/ Badania nad konwersją zarodków mikrosporowych w rośliny lub stymulacją wtórnej
embriogenezy.
Materiał wykorzystywany we wszystkich tematach
Materiałem do badań w realizowanych tematach było 10 różnych genetycznie dawców mikrospor
rzepaku ozimego oraz gorczyca biała (Sinapis alba) podwójnie ulepszona odm. Warta.
ad. A/ Badanie wpływu warunków wzrostu - na kondycję fizjologiczną roślin dawców mikrospor.
Metody
Nasiona badanych dawców wysiewano w kilku etapach. W fazie czterech liści rośliny jaryzowano
przez 7 tygodni w temperaturze 4C, przy ośmiogodzinnym oświetleniu. Po tym czasie dalsza ich
wegetacja przebiegała w fitotronie przy 16 godzinnym fotoperiodzie, temperaturze dnia/nocy
130/100C. Część roślin gorczycy białej rozwijała się w fitotronie bez okresu jaryzacji, a część roślin
gorczycy białej przejdzie okres jaryzacji podobny jak rośliny rzepaku.
Wyniki
Warunki wzrostu roślin donorowych mają istotny wpływ na uzyskanie efektu wydajnej embriogenezy
mikrospor w kulturze in vitro. Rośliny rzepaku w fazie 4-5 właściwych liści rozpoczynały okres
sztucznej wernalizacji. Po okresie jaryzacji rośliny rozwijały się w warunkach fitotronu - temperatura
dzień/noc 130/100C. Rośliny podzielono na trzy grupy. Pierwsza grupa roślin przechodziła okres
55
jarowizacji sześć tygodni. Okres rozwoju pędów generatywnych tych roślin wynosił więcej niż trzy
miesiące. Druga grupa roślin okres jaryzacji przechodziła w ciągu 7 tygodni. Pędy kwiatowe rozwijały
się w ciągu 2-2,5 miesiąca. Wszystkie rośliny rozwijały się równomiernie tworząc prawidłowo
wykształcone pędy generatywne. Trzecia grupa rośliny, przechodziła okres jaryzacji 8 tygodni.
Rośliny rozwijały się podobnie jak w przypadku siedmiotygodniowego okresu jaryzacji.
Rośliny gorczycy białej w sztucznych warunkach wzrostu, bez traktowania chłodem rozwijały się
nierównomiernie wytwarzając pędy generatywne fizjologicznie słabe. Natomiast rośliny po okresie
traktowania chłodem przez 7 tygodni, po przeniesieniu do fitotronu w krótkim czasie wytwarzały pędy
kwiatowe.
Dyskusja
Hodowla haploidów i podwojonych haploidów zaczyna się od wyboru rośliny dawcy mikrospor.
Zasadniczym warunkiem uzyskania efektywnej androgenezy jest kondycja fizjologiczna roślin
dawców mikrospor, przede wszystkim w badaniach z rzepakiem ozimym, gdy rośliny muszą przejść
okres wernalizacji. Warunki sztucznej jaryzacji form ozimych, parametry temperatury, oświetlenia
oraz czas traktowania chłodem roślin są różne w zależności od danego ośrodka czy laboratorium.
(Kott i in. 1990). Jak wynika z prezentowanych badań testowane linie rzepaku ozimego nie miały
zróżnicowanych wymagań jarowizacyjnych. Nawet po najkrótszym okresie wernalizacji,
w warunkach komory chłodniczej, w fitotronie wytworzyły pędy generatywne, ale w dłuższym czasie.
Natomiast po 7 i 8 tygodniach działania chłodu nie zaobserwowano znaczących różnic w tempie
rozwoju pędów kwiatowych.
Gorczyca biała roślina jara, podwójnie ulepszona jest bardzo wrażliwa na warunki prowadzenia
uprawy w sztucznym środowisku. Natomiast rośliny po okresie jaryzacji przez 7 tygodni wzrastały
szybciej i były bujniejsze.
Kott L., Beversdorf W.D. 1990. Plant Cell,Tissue and Organ Culture 23: 187-192.
Wnioski
 Wymagania jaryzacyjne badanych genotypów nie były większe niż 7 tygodni, co świadczy o ich
podobnych zdolnościach do wernalizacji. Możliwe, że pula genetyczna rzepaku ozimego została
znacznie zawężona pod względem tej cechy w trakcie procesów hodowlanych.
 Gorczyca biała po okresie działania chłodu rozwija się szybciej i posiada bujne pędy generatywne.
ad. B/ Badania nad ustaleniem markera morfologicznego - długości pąka – powiązanego ze stadium
mikrospory zdolnej do zmiany z rozwoju generatywnego na wegetatywny.
Wyniki
Po zakwitnięciu pierwszego kwiatu na pędzie generatywnym rzepaku ozimego pobierano pąki do
analizy cytologicznej. Na preparacie mikroskopowym oceniano stadium mikrospor z pylników
pobranych z pąków o danej długości. Wybierano jedynie pąki o takiej długości, które zawierają
pylniki z mikrosporami w późnym stadium jednojądrowym. Dla większości badanych linii były to
pąki od 3,5 mm do 3,8 mm. Wyjątek stanowiła jedna linia, której pąki w większym zakresie długości
(3,2-3,8 mm), zawierały mikrospory w stadium odpowiednim do izolacji. Natomiast wyróżniały się
dwie linie nr 9, dla której ustalono długość pąków 4,0-4,3 mm oraz linia nr 10, u której
selekcjonowano pąki o długości 4,5-5,5mm.
Z gorczycą białą postępowano podobnie. Pylniki o długości ok. 3mm zawierały mikrospory w stadium
jednojądrowym.
Dyskusja
Ważnym czynnikiem warunkującym skuteczną indukcję androgenezy in vitro jest prawidłowe
określenie stadium rozwoju mikrospor. Jedynie mikrospora w późnym stadium jednojądrowym, kiedy
synteza DNA jest zakończona krótko po pierwszej mitozie, jest najbardziej podatna na zmianę drogi
rozwojowej (Dunwell 2010). W prezentowanych badaniach stosowany pomiar pąka kwiatowego
z roślin rozwijających się w kontrolowanych warunkach wzrostu był użytecznym sposobem na
powtarzalność efektów kultury izolowanych mikrospor. Zmienność długości pąka kwiatowego
w badanym materiale była niewielka. Wyróżniały się dwa genotypy linia nr 9 i linia nr 10, u których
pąki o długości 4,0 do 5,5 mm, zawierały pylniki z mikrosporami w pożądanym stadium. W literaturze
spotyka się prace, które opisują długości pąków kwiatowych od 3,0 do 4,0 mm selekcjonowanych do
izolacji mikrospor (Tsuwamoto, Takahata 2008). Dla gorczycy białej po raz pierwszy badano
korelacje długości paka kwiatowego ze stadium rozwoju mikrospory.
56
Dunwell J.M. 2010. Plant Biotechnology Journal 8: 377-424.
Tsuwamoto R., Takahata Y. 2008. Breeding Science 58: 251-259.
Wnioski
Obserwacje cytologiczne mikrospor w pylnikach i ustalanie długości pąków selekcjonowanych do
izolacji mikrospor determinują efektywność procesu androgenezy.
ad. C/ Badania nad czynnikami skutecznej stymulacji izolowanych mikrospor do podziałów
w kulturze in vitro.
Metody
Kultura izolowanych mikrospor rzepaku ozimego
Z selekcjonowanych pąków kwiatowych rzepaku ozimego izolowano mikrospory wg/ modyfikowanej
metody Lichtera (1982). Po trzykrotnym odpłukaniu i wirowaniu końcowe stężenie mikrospor
wynosiło od 80 do 100 000 ml-1. Po ostatnim wirowaniu mikrospory zawieszano w pożywce NLN-13
lub NLN-13 z 0,05% kolchicyną. W następnym dniu mikrospory po odpłukaniu zawieszano w świeżej
pożywce NLN-13 w stężeniu koło 50 000- 40 000 ml-1. Kultury izolowanych mikrospor prowadzono
w ciemności w temperaturze 30C przez 10 dni, 32,5 przez 1 dzień, a następnie szalki przenoszone
były do 300C oraz 1 dzień w temperaturze 32,50C. Po tym okresie szalki z mikrosporami przenoszone
były do termostatu w ciemności i temperaturze 24C.
Kultura izolowanych mikrospor gorczycy białej podwójnie ulepszonej
Z wyselekcjonowanych pąków preparowano pylniki, które wykładano na pożywkę stałą (Leelavathi
i in. 1984,). Pre-kulturę pylników prowadzono jeden dzień w niskiej temperaturze (4C lub 1C).
Następnie z tych pylników izolowano mikrospory w pożywce KB5. Szalki z izolowanymi
mikrosporami przenoszono do termostatu z temperaturą 240 C.
Wyniki
Rzepak
Badano wpływ kolchicyny na skuteczność podziałów mikrospor rzepaku zaraz po ich izolacji oraz
warunki temperatury inkubacji mikrospor w pierwszych dniach prowadzenie kultury. Prowadzono
wstępne obserwacje kultury mikrospor z dwu dawców o zróżnicowanej zdolności do podziałów.
Pierwsza linia wykazywała podatność do stymulacji podziałów (w standardowym toku postępowaniu)
i do pożywki dodano 0.05% kolchicyny zaraz po izolacji mikrospor. Uzyskano wówczas 236
zarodków. Natomiast z kultury bez dodania kolchicyny do pożywki otrzymano 158 zarodków
mikrosporowych rzepaku. Druga linia charakteryzowała się niską podatnością do podziałów. Z kultury
w której mikrospory zawieszone były w NLN z kolchicyną, uzyskano 7 zarodków. Natomiast nie
uzyskano żadnych zarodków z kultury NLN bez kolchicyny.
Badano także wpływ temperatury na inicjację podziałów mikrospor mierzoną liczbą uzyskanych
zarodków. Obserwacje prowadzone były na 10 roślinach dawcach zróżnicowanych genetycznie.
Z przeprowadzonych wstępnych badań wynika, że reakcja na stymulację do podziałów mikrospor
wysoką temperaturą, zależy od genotypu dawcy. Miarą skuteczności tego postępowania była liczba
uzyskanych androgenicznych zarodków. W pierwszych przeprowadzonych eksperymentach
zauważono, że genotypy o niskich skłonnościach do androgenezy, w trzech badanych wariantach
temperaturowych, wykazywały niską stymulacją mikrospor do podziałów.
Wyniki badań prezentowano w formie plakatu i wykładu Zał. 1,2.
Gorczyca
Mikrospory izolowane z pylników po jednym dniu w temp.10C były całkowicie obkurczone.
Natomiast po jednym dniu w temperaturze 40 C znaczna część mikrospor nie była obkurczona. Po
izolacji i odpłukaniu mikrospory zawieszano w samej pożywce KB5 lub z dodatkiem 0,2 mg/l ABA.
W drugiej serii doświadczeń mikrospory zawieszono w pożywce KB5 z dodatkiem 0.025%
kolchicyny, szalka kontrolna była bez kolchicyny. Po 20 godzinach mikrospory odpłukano
i zawieszono w świeżej pożywce.
Dodatek kolchicyny powodował obkurczanie mikrospor gorczycy. Natomiast w pożywce z ABA po
paru dniach zaobserwowano pierwsze podziały mikrospor gorczycy. Są to pierwsze eksperymenty
z inicjacją podziałów mikrospor gorczycy.
Lichter R. 1982. Z. Pflanzenphysiol.105: 427-434
57
Dyskusja
Od początku prowadzenia badań nad skuteczną indukcją mikrospor do podziałów, w różnych
ośrodkach badawczych, stosowano różne czynniki stymulujące podziały. Zastosowanie szoku
termicznego przez Kellera i Amstronga (1978) stanowiło przełom w uzyskiwaniu efektywnej
embriogenezy w kulturach pylników rzepaku. Okazało się, że stres temperaturowy jest niezbędny do
zainicjowania procesu androgenezy roślin z rodzaju Brassica. Wysoka temperatura w przedziale
300-350 C przez pierwsze 3-10 dni od izolacji stymuluje znacząco embriogenezę (Nehlin 1999). We
wcześniejszych badaniach (Cegielska-Tars i in. 2002) wykazano, że inkubacja mikrospor przez 10 dni
w temp. 300C , jest optymalną do inicjowania podziałów. Natomiast w prezentowanych badaniach
oprócz 300C, zastosowano także inkubację jeden dzień w 32,50C, a następnie 300C oraz jedną dobę
w 32,50C. Zaobserwowano zróżnicowaną reakcję na stymulacje wysoką temperaturą mikrospor do
podziałów z różnych genetycznie dawców.
Nie opublikowano dotychczas prac dotyczących kultury izolowanych mikrospor gorczycy białej
podwójnie ulepszonej, warunków prowadzenia kultury i stymulacji podziałów mikrospor.
Prezentowane wyniki są pierwszymi informacjami o kulturze izolowanych mikrospor i indukcji
embriogenezy mikrospor gorczycy białej.
Cegielska-Taras T., Tykarska T., Szała L., Kuraś L., Krzymański. 2002. Euphytica 124, 341-347.
Keller W.A., Armstrong K.C. 1978. Z. Pflanzenzuchtung 80: 100-108.
Nehlin L. 1999. Doctoral thesis Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala 8-42.
Wnioski
 Wstępne wyniki wskazują na stymulujący wpływ kolchicyny na kulturę izolowanych mikrospor.
 Stres temperaturowy jest niezbędny do zainicjowania podziałów mikrospor. Ze wstępnych
obserwacji wynika, że wysokość temperatury i czas indukcji jest zależny prawdopodobnie od
genotypu dawcy.
 Pierwsze wyniki o indukcji embriogenezy mikrospor wskazują na możliwość uzyskiwania
androgenicznych roślin gorczycy białej rośliny obcopylnej.
ad. D/ Badania nad kulturą zarodków mikrosporowych rzepaku i gorczycy białej.
Metody
Prawidłowo wykształcone zielone zarodki w kulturze płynnej NLN z 13% sacharozą przenoszono na
pożywkę NLN z 8% sacharozą oraz na świeżą pożywkę NLN z 13% sacharozą. Obserwowano rozwój
i stan fizjologiczny zarodków mikrosporowych po kilkunastu dniach prowadzenia kultury. Następnie
zarodki przenoszono na pożywkę stałą i traktowano chłodem (10C przez 14 dni).
Pierwsze zarodki mikrosporowe gorczycy przeniesiono na pożywkę MS z kinetyną.
Wyniki
Wstępne wyniki wskazują, że redukcja sacharozy w pożywce nie wpływa negatywnie na ich rozwój.
Zaobserwowano, że zarodki zarówno z 8% sacharozy jak i 13% sacharozy w pożywce nie ulegają
zmianom morfologicznym. Nie stwierdzono zróżnicowania w tempie dalszego rozwoju zarodków.
Będą kontynuowane dalsze badania nad rozwojem zarodków mikrosporowych z obu wariantów
pożywek Zaobserwowano powolny rozwój pędów z zarodków androgenicznych gorczycy białej na
pożywce MS z kinetyną.
Dyskusja
W pracach nad konwersją zarodków stwierdzono, że redukcja sacharozy w pożywce NLN z 13% do
8%, stymuluje merystem wierzchołkowy pędu do rozwoju. Wówczas istnieje szybki sposób uzyskania
pędów poprzez konwersję zarodków. We wstępnych badaniach nie stwierdzono takiej zależności.
Będą prowadzone dalsze badania nad skuteczną stymulacją merystemu wierzchołkowego zarodków
androgenicznych rzepaku.
Wnioski
 Ze wstępnych obserwacji wynika, że redukcja sacharozy w pożywce NLN z 13% do 8% nie
wpływa negatywnie na rozwój zarodków mikrosporowych.
 Pierwsze obserwacje wskazują, że wysokie stężenie kinetyny stymuluje powstawanie pędów
z zarodków androgenicznych gorczycy białej.
58
ad. E/ Opracowanie warunków konwersji zarodków mikrosporowych w rośliny lub stymulacja wtórnej
organogenezy.
Metody
W pełni wykształcone zarodki androgeniczne z płynnej kultury przenoszono na pożywkę stałą
B5 z 2% sacharozą oraz z dodatkiem 0,1% GA3 na okres 14 dni i umieszczano w temperaturze 10C
przy ośmiogodzinnym oświetleniu. Po tym czasie szalki przenoszono do warunków pokoju
hodowlanego. Przez kolejne kilka tygodni obserwowano konwersje zarodków w rośliny. Obliczano
liczbę uzyskanych pędów po konwersji.
Zarodki, które nie uległy konwersji, przenoszono na pożywkę MS z 2% sacharozą oraz kinetyną
w stężeniu 10-4 mola.
Wyniki
Z wyłożonych zarodków mikrosporowych po traktowaniu chłodem (10C) wstępnie zaobserwowano
zbliżony procent konwersji dla zarodków rozwijających się na pożywce B5 bez GA3 i z GA3.
Zarodki, które nie uległy konwersji przenoszono na pożywkę z kinetyną, która skutecznie wpływała
na rozwój pędów. Przez zastosowanie tych dwu metod istnieje możliwość, że z każdego zarodka
androgenicznego rzepaku istnieje możliwość uzyskania roślin
Dyskusja
Najkorzystniejszą metodą w masowym uzyskiwaniu podwojonych haploidów jest stymulowanie
konwersji zarodków w rośliny. Niska temperatura stymuluje rozwój merystemu wierzchołkowego
zarodka nie tylko do konwersji w roślinę, ale także do szybszego uzyskiwania pędów poprzez inicjację
organogenezy wtórnej. Z przeprowadzonych wstępnych badań wynika, że wystarczy jeden pasaż na
pożywkę z kinetyną, dla uzyskania prawidłowego pędu z zarodka, który nie uległ konwersji po
kulturze traktowanej chłodem. Wiele publikacji poświęconych konwersji zarodków mikrosporowych
w rośliny dotyczyło rzepaku jarego (Kott, Beversdorf 1990). Jednak warunki kultury dla tych roślin są
nieskuteczne dla rzepaku ozimego. Dlatego podjęto badania nad uzyskiwaniem roślin
z androgenicznych zarodków rzepaku ozimego.
Cegielska-Taras T., Tykarska T., Szała L., Kuraś L., Krzymański J. 2002. Euphytica 124, 341-347.
Kott L., Beversdorf W.D. 1990. Plant Cell,Tissue
Wnioski
Wstępne wyniki wskazują, że:
- kwas giberelinowy może wzmagać stymulację rozwoju merystemu wierzchołkowego zarodka,
- niska temperatura (10C) indukuje merystem wierzchołkowy do rozwoju w roślinę w procesie
konwersji jak i wtórnej organogenezy.
Tytuł zadania: Wykorzystanie nowej puli genowej dla uzyskania form rzepaku ozimego
o zmienionych cechach jakościowych.
Kierownik zadania: dr S. Spasibionek
Cel zadania
Przeprowadzenie szczegółowej analizy badanego materiału roślinnego w odniesieniu do ekspresji cech
fenotypowych, decydujących o wartości gospodarczej danego genotypu. Należą do nich zawartość
poszczególnych kwasów tłuszczowych w oleju nasion, glukozynolanów w śrucie, oraz odporność na
stresy abiotyczne i biotyczne.
Materiały i metody
Materiał roślinny stanowiło 58 genotypów obejmujących: 2 linie mutantów typu HO (od 78,6
do79,5%), 10 rekombinantów typu HO z wysoką zawartością kwasu oleinowego (od 79,3 do 82,2%),
1 linię mutanta typu LL ze znacznie obniżoną zawartością kwasu linolenowego (do 1,5%),
23 rekombinanty typu HOLL (uzyskane w wyniku krzyżowania mutantów typu HO i LL) z wysoką
zawartością kwasu oleinowego (od 75,0 do 81,5%) i niską zawartością kwasu linolenowego (od 2,2 do
4,5%), 10 rekombinantów o wysokiej zawartości tłuszczu (od 49,2 do 50,9%), 12 rekombinantów
o ekstremalnie niskiej zawartości sumy glukozynolanów alkenowych (od 0,2 do 0,9µM g-1nasion).
59
W trakcie wegetacji w szkółkach hodowlanych linie mutantów i rekombinantów rzepaku oceniano pod
względem głównych cech agronomicznych: stan roślin po zimie (bonitacja przezimowania, skala 1–9
stopni), początek kwitnienia (liczba dni od 01.01.2014), długość kwitnienia (liczba dni od
01.01.2014), wyleganie (skala 1-90). Na podstawie obserwacji cech związanych z morfologią roślin
mutantów oraz rekombinantów (pokrój rośliny, intensywność kwitnienia) przeprowadzono selekcję
roślin w wyniku której wykonano izolację roślin przed obcozapyleniem. Z tych roślin do krzyżowań
w szklarni wybrano po 10 najlepszych genotypów o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych
18-węglowych jedno- i wielonienasyconych, wysokiej zawartości tłuszczu i niskiej zawartości
glukozynolanów alkenowych. Nasiona wybranych genotypów wysiewano do doniczek. Rośliny
w fazie pięciu liści poddano jarowizacji przez okres sześciu tygodni. Dalszy wzrost roślin
i prowadzenie krzyżowań przebiega w warunkach szklarniowych. Ponadto do badań wybrano 25
genotypów o zróżnicowanej zawartości kwasów tłuszczowych, tłuszczu i glukozynolanów
alkenowych. Doświadczenia założono metodą bloków losowanych w czterech powtórzeniach,
w dwóch Stacjach Hodowli Roślin: Borowo „Spółka Hodowli Roślin Strzelce” i Łagiewniki „Spółka
Hodowli Roślin Smolice”. Jesienią przeprowadzono następujące pomiary i obserwacje: bonitacja
wschodów (skala 1-9), bonitacja stanu roślin jesienią (skala 1-9), pomiar zawartości chlorofilu
w liściach przy użyciu chlorometru N tester SPAD-502 (Soil Plant Analysis Development), liczenie
roślin na każdym poletku na powierzchni 3m2.
Rekombinanty typu HOLL oraz ich formy rodzicielskie monitorowano pod kątem występowania
niezmutowanych i zmutowanych alleli genów desaturaz FAD2 i FAD3. W tym celu genomowy DNA
wyizolowano z młodych liści linii mutantów typu HO z wysoką zawartością kwasu oleinowego, linii
mutanta typu LL ze znacznie obniżoną zawartością kwasu linolenowego oraz z rekombinantów typu
HOLL (uzyskane w wyniku krzyżowania mutantów typu HO i LL) metodą ekstrakcji buforem
z CTAB według Doyle’a. Następnie przeprowadzono analizy molekularne za pomocą specyficznych
markerów funkcjonalnych: CAPS - dla alleli genu desaturazy FAD2 w genomie A B. napus oraz SNP
dla alleli genów desaturazy FAD3 w genomach A i C B. napus. Do przeprowadzenia testów na
obecność zmutowanych alleli genu BnaA.FAD2, związanych z wystąpieniem cechy podwyższonej
zawartości kwasu oleinowego w nasionach rzepaku, wykorzystano procedurę opracowaną już
w poprzednich latach. W bieżącym roku wykorzystywano uproszczoną wersję metody bez
dodatkowego oczyszczania DNA przed etapem trawienia enzymem restrykcyjnym. Dla
wyizolowanego DNA rzepaku wykonywano PCR ze starterami H3H4CON1 i H3H4CON2 w celu
amplifikacji odcinka DNA o długości 732 pz, stanowiącego fragment badanego genu. Amplifikowany
fragment DNA poddawano następnie reakcji trawienia przy użyciu enzymu restrykcyjnego FspBI
(Thermo Scientific), rozpoznającego sekwencję 5’-C↓TAG-3’. Zarówno produkty amplifikacji jak
i produkty reakcji trawienia rozdzielano za pomocą elektroforezy w 1,8% żelu agarozowym,
wybarwiano bromkiem etydyny i obserwowano w świetle UV. Występowanie form allelicznych
genów fad3 monitorowano z zastosowaniem allelo-specyficznych markerów metodą SNaPshot
(Mikolajczyk i wsp., 2010).
Analizy chemiczne zebranych nasion wykonywano w Laboratorium Biochemicznym IHAR
w Poznaniu. Procentową zawartość tłuszczu oznaczano za pomocą szerokopasmowego analizatora
magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) firmy Newport Instruments LtD. Skład kwasów
tłuszczowych oznaczano za pomocą chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów
tłuszczowych - chromatograf firmy Hewlett Packard typ 3390A, Agillent Technologies 6890N
Network GC System, a wycenę ilościową chromatogramów wykonywano całkując powierzchnie pod
pikami. Metoda ta jest zgodna z polskimi normami PN-EN-ISO 5508: 1996 i PN-ISO 5509: 1996.
Zawartość i skład glukozynolanów wykonano również metodą chromatografii gazowej, rozdzielając je
w formie pochodnych sililowych desulfoglukozynolanów (Michalski i in. 1995). W metodzie tej do
kalibracji chromatografu zastosowano wzorzec europejski CRM-366 o sumarycznej zawartości
glukozynolanów 12,1 M/g nasion z tolerancją 0,8 M/g nasion. Wzorzec ten został opracowany
przez Comunity Bureau of Reference-BCR jako uśredniona wartość analiz z ring-testu pomiędzy
osiemnastoma laboratoriami.
Wyniki i dyskusja
Na podstawie przeprowadzonych obserwacji polowych stwierdzono duże zróżnicowanie genotypów
pod względem przezimowania, wczesności, długości kwitnienia oraz wylegania. Wyodrębniono
9 genotypów dobrze zimujących oraz 8 genotypów wczesnych. Obecnie w pracach hodowlanych,
60
poza wysokim plonowaniem i zmienioną zawartością kwasów łuszczowych w oleju nasion, dąży się
również do uzyskiwania odmian dobrze zimujących, wczesnych, bardziej odpornych na okresy suszy
w czasie kwitnienia i podczas dojrzewania nasion. Dla ulepszenia wartości gospodarczej otrzymanych
mutantów i rekombinantów o podwyższonej zawartości kwasu oleinowego i obniżonej zawartości
kwasu linolowego i linolenowego oraz rekombinantów o wysokiej zawartości tłuszczu i niskiej
zawartości glukozynolanów alkenowych, konieczna jest wiedza na temat ekspresji genów tych cech.
Określenie wpływu efektów cytoplazmatycznych, genetycznych (jądrowych) matki czy zarodka na
zawartość badanych cech, pozwali na odpowiedni wybór kierunku krzyżowania. W tym celu
prowadzone są krzyżowania wzajemno-przemienne genotypów z wysoką zawartością kwasu
oleinowego i niską zawartością kwasu linolenowego, wysoką zawartością tłuszczu i niską zawartością
glukozynolanów alkenowych. Dla dokładniejszej oceny sposobu dziedziczenia kwasów: oleinowego,
linolowego i linolenowego oraz tłuszczu i glukozynolanów wybrano do badań genotypy o znacznym
zróżnicowaniu tych cech.
Najlepszych 25 genotypów pod względem cech jakościowych i agronomicznych oceniano w dwóch
doświadczeniach porównawczych. W trakcie wegetacji jesiennej dokonano ocenę wschodów. Cecha ta
istotnie różnicowała badane genotypy. Dokonano pomiaru zawartości chlorofilu w liściach. Cecha ta
również istotnie różnicowała badane genotypy. Największe uszkodzenie syntezy chlorofilu
zaobserwowano u rekombinanta z genotypem mutanta typu HO 388/1i+6i+7i/14. Największą
koncentracją chlorofilu w liściach charakteryzowały się 3 genotypy powyżej 50 jednostek SPAD. Na
podstawie oceny stanu roślin przed zimą stwierdzono brak zróżnicowania genotypów pod względem
tej cechy. Rozwój roślin przed zimą ze szczególnym uwzględnieniem kondycji i rozwoju rozety
przyjmowane są jako kryterium dobrego lub gorszego przygotowania do zimowania. Oceniane
genotypy wytworzyły dobrze rozwiniętą rozetę o 7-9 liściach.
Użyte do selekcji markery typu CAPS i SNP umożliwiają jednoznaczną identyfikację zmutowanych
form allelicznych genów desaturazy FAD2 w genomie A B. napus i desaturazy FAD3 w genomach
A i C B.napus odpowiedzialnych za zawartości odpowiednio kwasu oleinowego i linolenowego
w oleju nasion linii mutantów i rekombinatów typu HO i HOLL rzepaku ozimego. W obrębie
badanych 95 genotypów typu HOLL zidentyfikowano 42 genotypy homozygotyczne typu HOR4 oraz
5 homozygotycznych typu HOR3, 14 form heterozygotycznych typu HOR4 oraz 2 formy
heterozygotyczne typu HOR3. Zidentyfikowano 32 formy homozygotyczne typu dzikiego. Analizy na
obecność zmutowanych alleli desaturazy FAD3 w genomach A i C B. napus wykazały 39 genotypów
zmutowanych i homozygotycznych w obu loci (genotyp aacc), 11 genotypów typu dzikiego (AACC)
oraz różne formy heterozygotyczne: 15 genotypów AAcc, 10 Aacc, 9 AaCc, 6 AACc, 1 AaCC1,
3 aaCC, 1 aaCC. Na podstawie tych badań wyodrębniono 31 form typu HOLL, w których stwierdzono
kumulację zmutowanych alleli genów desaturaz FAD2 i FAD3 w genomach A i C B. napus.
W związku z powszechnym zastosowaniem oleju rzepakowego w różnych działach przemysłu
zwiększa się różnorodność pożądanych cech jakościowych, które dyktują nowe cele badawcze.
W związku z tym badania koncentrują się na uzyskaniu odmian rzepaku typu HO (ang. high oleic)
wytwarzających olej o podwyższonej zawartości kwasu oleinowego C18:1 (ok. 77%) i obniżonej
zawartości kwasu linolowego C18:2 (ok. 7%) i kwasu linolenowego C18:3 (ok. 7%). Wysoka
zawartość kwasu oleinowego wpływa korzystnie na obniżenie poziomu szkodliwej frakcji cholesterolu
LDL a stosunek ilościowy zawartości niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT) tj.
C18:2 (ω-6) do zawartości C18:3 (ω-3) równy 1:1 jest optymalny dla prawidłowego funkcjonowania
organizmu człowieka. Z otrzymanych, izolowanych 335 pojedynczych roślin typu HO pokoleń
F13―F4 do dalszych badań wybrano 110 genotypów charakteryzujących się wzrostem zawartości
kwasu oleinowego w oleju nasion (od 72,0% do 82,1%). Zawartości sumy glukozynolanów
i glukozynolanów alkenowych u badanych rekombinantów wahały się odpowiednio (4,7–30,9µM g1
nasion) i (0,1–28,1µM g-1nasion). W analizowanych nasionach zawartość tłuszczu wahała się
w granicach od 33,2 do 50,5%.
Drugim ważnym kierunkiem prac jest uzyskanie genotypów typu HOLL (ang. high oleic low
linolenic) o podwyższonej zawartości kwasu oleinowego (C18:1) do (ok. 75%) i obniżonej zawartości
kwasu linolenowego (C18:3) do (ok. 3%). Olej z nich wykorzystany na cele spożywcze posiada
wyższą termostabilność, co zwiększa jego trwałość w czasie głębokiego smażenia, a także ogranicza
tworzenie szkodliwych dla zdrowia izomerów trans podczas procesu utwardzania. Ponadto olej tego
typu ze względu na znacznie spowolniony proces oksydacji nadaje się do celów technicznych np. jako
61
komponent biopaliwa. Spośród zebranych 221 izolowanych roślin pokoleń F8―F2 do dalszych badań
wybrano grupę 102 rekombinantów typu HOLL wykazujących wzrost zawartości kwasu oleinowego
w oleju nasion (do 81,2%) oraz obniżenie zawartości kwasu linolenowego (do 1,9%). Zawartość
tłuszczu w wysianych liniach wynosiła (od 40,6 do 47,6%). Zawartości sumy glukozynolanów
i glukozynolanów alkenowych u badanych rekombinantów wahały się odpowiednio (7,9–17,3µM g-1
nasion) i (3,9–11,2µM g-1nasion).
W śrucie występuje od 37% do 43% białka pastewnego charakteryzującego się wysoką wartością
żywieniową ze względu na korzystny skład aminokwasów. Możliwości wykorzystywania białka, które
pozostaje po ekstrakcji lub wytłoczeniu oleju w śrucie bądź wytłokach są limitowane przez związki
antyżywieniowe - glukozynolany alkenowe występujące w nasionach rzepaku. Stąd konieczne są
badania nad formami pozbawionymi zawartości tych związków. Z wyselekcjonowanych izolowanych
236 pojedynczych roślin typu wysokotłuszczowego i niskoglukozynolanowego w pokoleniach F12―F3
do dalszych badań wybrano 98 rekombinantów o wysokiej zawartości tłuszczu (do 53,6%) oraz
o niskiej zawartości glukozynolanów alkenowych (do 0,2µM g-1nasion) i sumy glukozynolanów (do
2,0µM g-1nasion).
Wnioski
Po przeprowadzeniu prac selekcyjnych uzyskano genotypy dobrze zimujące, wczesne
i średniowczesne. Formy te wykorzystane będą dla określenia determinacji genetycznej ważnych cech
fenotypowych oraz poszerzą zmienność tego gatunku. Zastosowana analiza z wykorzystaniem
markerów genetycznych w powiązaniu z obserwacjami fenotypowymi decyduje o znaczącym postępie
biologicznym prowadzonych prac badawczych w zakresie identyfikacji form rzepaku o zmienionych
profilach kwasów tłuszczowych w oleju nasion.
Tytuł zadania: Opracowanie modeli kalibracyjnych dla spektrometru NIRS o zakresie
widma 400-2500 nm dla oznaczania glukozynolanów, białka, NDF, ADF oraz steroli
i badania zmienności tych związków w roślinach oleistych.
Kierownik zadania: dr K. Michalski
Temat badawczy 1. Określenie zmienności składu i zawartości glukozynolanów w próbkach nasion
rzepaku.
Celem tematu jest rozbudowanie bazy danych o nową zmienność zawartości glukozynolanów dzięki
wykorzystaniu reprezentatywnych próbek rzepaku z przebadanych próbek nasion rzepaku.
W roku 2014 pozyskano do celów kalibracyjnych 350 próbek rzepaku o zróżnicowanych cechach
jakościowych zebranych w różnych miejscowościach. Dane referencyjne otrzymano za pomocą
analizy chemicznej - analiza chromatograficzna silylowych pochodnych desulfogukozynolanów
(metoda ze wzorcem wewnętrznym). Zebrane próbki zostały następnie zeskanowane na aparacie
NIRS, 6500 aby pozyskać widma w bliskiej podczerwieni w zakresie 400-2500 nm.
Wybrane materiały pozwoliły poszerzyć kalibrację o próbki wysokoglukozynolanowe, szczególnie
cenne dla wzmocnienia odporności kalibracji na próbki o nietypowej zawartości glukozynolanów.
Próbki charakteryzowały się zakresem zmienności glukozynolanów od 4,1 do 94,6 µM/g. Obejmują
one zmienność występującą w roku 2014 na obszarze Polski zachodniej (Borowo, Bąków, Małyszyn),
co pozwala wprowadzić do kalibracji zmienność geograficzną i gwarantuje równomierne wypełnienie
kalibrowanego zakresu a w efekcie pozwala na otrzymanie równań odpornych na nieprzewidziane
zmiany składu mierzonych próbek.
Temat badawczy 2. Określenie zmienności zawartości białka, tłuszczu i włókna w próbkach nasion.
Celem tematu jest wyselekcjonowanie we współpracy z hodowcami próbek rzepaku cechujących się
zróżnicowaną zawartością białka w nasionach, zeskanowanie widm tychże oraz ich analiza
referencyjna.
W roku 2014 pozyskano do celów kalibracyjnych 104 próbki rzepaku o zróżnicowanych cechach
jakościowych zebrane w różnych miejscowościach. Zgromadzone próbki zostały zeskanowane na
aparacie NIRS 6500 aby pozyskać widma w bliskiej podczerwieni. Dane referencyjne otrzymano za
62
pomocą analizy chemicznej (białko- metodą Kjeldahla, włókno frakcja NDF i ADF metodą van
Soesta).
Wybierając próby do zbioru kierowano się pochodzeniem próbek, opierając się na nim starano się
wyszukać próbki o maksymalnie zróżnicowanej zawartości białka, tłuszczu i włókna. Zbiór obejmuje
zmienność występująca w roku 2014 w obszarze Polski zachodniej (Borowo, Bąków, Małyszyn), co
pozwala wprowadzić do kalibracji zmienność geograficzną i gwarantuje równomierne wypełnienie
kalibrowanego zakresu a w efekcie pozwala na otrzymanie równań odpornych na nieprzewidziane
zmiany składu mierzonych próbek. Zebrane materiały charakteryzowały się zmiennością dla tłuszczu
od 35 do 55%, dla białka od 16 do 33%, dla włókna odpowiednio 16-37%(NDF) i 10-26% (ADF).
Temat badawczy 3: Określenie zmienności w składzie i zawartości podstawowych steroli w oleju.
Celem tematu było wyselekcjonowanie we współpracy z hodowcami próbek rzepaku o zróżnicowanej
zawartości steroli, zapis widm na spektrofotometrze NIRS 6500 oraz ich analiza metodą referencyjną.
Pobrano próbki nasion rzepaku z linii i odmian będących w opracowaniu w IHAR O/Poznań
i spółkach HR oraz z kolekcji w ilości 60 próbek w zakresie 3000-29000 ppb. Zebrane próbki
zeskanowano na spektrofotometrze NIRS 6500 i poddano analizie referencyjnej (analiza steroli
w oleju metodą chromatografii gazowej na chromatografie HP5890). Widma z wynikami posłużą do
stworzenia bazy danych która pozwoli wykonać wstępną estymację kalibracji.
Wybierając próby do analiz kierowano się pochodzeniem próbek i zawartością steroli w próbce –
preferowane były zróżnicowane zawartości steroli. Z uwagi na to iż zebrany zbiór jest stosunkowo
niewielki i nie istnieje kalibracja której można by użyć jako skriningowej wybierano próbki losowo
i kierując się doświadczeniem. Zebrany zbiór został wykorzystany do wstępnej estymacji możliwości
stworzenia równania. Otrzymane kalibracje pozwalają sądzić iż przynajmniej niektóre sterole
(cholesterol, campestanol, avenasterol) nadają się do kalibracji.
Aczkolwiek otrzymany zbiór kalibracyjny jest niewielki, to udało się otrzymać równania dla
wybranych steroli o obiecujących parametrach.
Otrzymane równania mogą posłużyć do screeningu próbek i selekcji takich, które będą mogły
wzbogacić zbiór kalibracyjny.
Tytuł zadania: Badania ekspresji i genetyczna charakterystyka odporności na bakterie
„Dickeya solani” w wyróżnionych źródłach odporności w ziemniaku na poziomie
diploidalnym.
Kierownik zadania: dr hab. R. Lebecka prof. IHAR-PIB
Cel zadania:
Dickeya solani (Wolf et al., 2014) to nowy gatunek bakterii powodujący czarną nóżkę i mokrą
zgniliznę bulw ziemniaka. Celem projektu jest zidentyfikowanie genów/loci cech ilościowych
odporności na bakterie D. solani w populacji mapującej ziemniaka diploidalnego, scharakteryzowanie
reakcji odpornościowej bulw i roślin 2x mieszańców międzygatunkowych ziemniaka w zależności od
temperatury oraz zbadanie zdolności do systemicznej kolonizacji wysokoodpornej rośliny ziemniaka
przez bakterie D. solani i możliwości przenoszenia tej infekcji na bulwy potomne.
W 2014 r. celem pracy było: (a) ustalenie warunków testowania odporności bulw ziemniaka na
bakterie D. solani, (b) ocena odporności bulw diploidalnych (2x) mieszańców międzygatunkowych
Solanum oraz (c) określenie ich płodności w celu wybrania form rodzicielskich populacji mapującej.
(a) Ustalenie warunków testowania odporności bulw ziemniaka na bakterie D. solani.
Odmiany ziemniaka: Glada (standard w testach odporności bulw na mokrą zgniliznę, ocena 5 w skali
9 stopniowej, gdzie 9 = najodporniejszy), Irys (standard podatny - ocena 3), Gandawa (5 w badaniach
własnych), Sonda (odmiana skrobiowa, nie testowana). Bakterie: szczep IFB0099 gatunku D. solani
otrzymano z kolekcji bakterii Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu
Gdańskiego i Akademii Medycznej w Gdańsku.
63
Zastosowano modyfikowaną metodę punktowej inokulacji bulw i metodę oceny wirulencji bakterii.
Bakterie namnażano na pożywce Lysogeny Broth z dodatkiem agaru, inkubowano je w temperaturze
25oC przez 48 godzin a następnie spłukiwano destylowaną wodą i doprowadzano do absorbancji 0,1
przy długości fali 600 nm w spektrofotometrze Hitachi U-1900. Zawiesinę bakterii trzymano na
mieszadle magnetycznym przez okres inokulacji. Bulwy ziemniaka przechowywano po zbiorze co
najmniej jeden miesiąc. Dzień przed testem bulwy myto, moczono w 1% roztworze podchlorynu sodu
przez 15 minut, ponownie myto i układano do wyschnięcia. W dniu testowania bulwy kłuto za
pomocą stalowego pręta o długości 10 mm i średnicy 2 mm. Do otworu wprowadzano 10 µl inokulum
a po wprowadzeniu otwór zaklejano wazeliną umieszczoną na kawałku parafilmu. Bulwy układano
w pojemnikach, zraszano wodą destylowaną za pomocą spryskiwacza i pojemniki zamykano szczelną
pokrywką. Bulwy umieszczono w czterech różnych temperaturach: 20oC, 23oC, 26oC i 30oC. Czas
inkubacji został dostosowany do reakcji podatnej odmiany wzorcowej Irys i średnio-odpornej
odmiany Glada. Doświadczenie przeprowadzono w dwóch terminach. W każdym doświadczeniu
testowano po 10 bulw czterech odmian, w dwóch powtórzeniach, w czterech temperaturach (łącznie
640 bulw). Po okresie inkubacji zgniłą tkankę ważono w bulwach krojonych wzdłuż miejsca
inokulacji.
Do analizy ocen porażenia bulw zastosowano trzyczynnikową analizę wariancji, oraz test Tuckeya do
uszeregowania średnich (STATISTICA)
Wyniki i dyskusja:
Bakterie pektynolityczne wywołujące mokrą zgniliznę bulw ziemniaka z rodzaju Pectobacterium
i Dickeya, różnią się między sobą optymalną temperaturą wzrostu. Dla wzrostu bakterii
P. atrosepticum i P. carotovorum subsp. carotovorum optymalna temperatura wynosi 24-27oC oraz
28-30oC odpowiednio, a dla bakterii z rodzaju Dickeya wynosi 34-37oC (Perombelon i Kelman, 1980).
Optymalna temperatura wzrostu bakterii D. solani szczepu IFB0099 na pożywce pełnej płynnej LB
wynosi 33-35oC (badania własne, projekt POTPAT, 2014). Optymalna temperatura dla
patogeniczności P. atrosepticum wynosi 20oC (Latour et al. 2007), a do produkcji enzymów
pektynolitycznych 12-24oC (Smadja et al. 2004). Stopień porażenia bulw przez bakterie rośnie wraz ze
wzrostem temperatury i czasem inkubacji. Na stopień porażenia ma także wpływ odporność bulw,
w tym przypadku szereg enzymów ma swoje optimum działania w niższych temperaturach.
W warunkach dobrego zaopatrzenia w tlen bulwy potrafią wytworzyć suberynę w miejscu zranienia
i zahamować rozwój bakterii. Celem przeprowadzonego testu było wybranie warunków optymalnych
do oceny odporności bulw ziemniaka na bakterie D. solani. Na podstawie otrzymanych wyników
wybrano temperaturę 26oC i czas inkubacji trzy dni. Test w tych warunkach pokazał największe
różnice pomiędzy porażeniem podatnej odmiany Irys a innymi odmianami o wyższej odporności.
Przeprowadzono trzyczynnikową analizę wariancji wyników porażenia bulw przez bakterie gatunku
D. solani, szczepu IFB0099. Porażenie wyrażane było masą zgniłej tkanki bulwy. Analiza wariancji
wykazała istotny wpływ odmiany, warunków testu oraz ich interakcji na cechę badaną. Termin testu
nie miał istotnego wpływu na średnią porażenia. Najsilniejsze porażenie bulw wystąpiło
w temperaturze 26oC po trzech dniach inkubacji. Podatna na Pectobacterium odmiana Irys była
istotnie najsilniej porażona we wszystkich temperaturach, z wyjątkiem temperatury 20 oC. W tej
temperaturze średnie porażenie odmiany Irys nie różniło się istotnie od porażenia średnioodpornych na
Pectobacterium odmian Gandawy i Glady. W temperaturze 20oC porażeniu uległo 28,8% testowanych
bulw, w temperaturze 23oC – wskaźnik ten wynosił 76,9%. W 30oC porażeniu uległy wszystkie
bulwy, podobnie w temperaturze 26oC, w której jedna bulwa ze 160 testowanych nie uległa porażeniu.
Na podstawie otrzymanych wyników, do testowania odporności bulw ziemniaka na D. solani wybrano
temperaturę 26oC i czas inkubacji trzy dni. Test w tych warunkach pokazał największe różnice
pomiędzy porażeniem podatnej odmiany Irys a innymi odmianami o wyższej odporności.
(b) Ocena odporności bulw diploidalnych (2x) mieszańców międzygatunkowych Solanum.
Odmiany Irys i Glada, 26 2x mieszańców międzygatunkowych ziemniaka, które w uprzednich
badaniach charakteryzowały się wysoką odpornością na bakterie pektynolityczne z rodzaju
Pectobacterium, 13 podatnych mieszańców, jeden mieszaniec somatyczny USA 249, złożony
z diploidalnego S. brevidens (gatunku nietuberyzującego) i S. tuberosum (wzorzec wysokiej
odporności na bakterie z rodzaju Pectobacterium.
64
Bakterie: opisano powyżej.
Metody: opisano powyżej. Inkubacja trwała trzy dni w temperaturze 26oC. Doświadczenie
przeprowadzono w trzech terminach, w każdym terminie testowano po 10 bulw z każdego klonu i po
20 bulw wzorców (odmiany Irys i Glady). Porażenie wyrażono masą zgniłej tkanki.
Bulwy 13 klonów podatnych na Pectobacterium testowano metodą punktowej inokulacji bulw
w jednym terminie, po 10 bulw każdego klonu. Porażenie wyrażono średnicą zgniłej tkanki w mm.
Wyniki i dyskusja:
W pierwszym terminie testu podatna odmiana Irys uległa silnemu porażeniu, które wynosiło 11,1g
zgniłej tkanki, natomiast porażenie średnio-odpornej odmiany Glada wynosiło 2,3g. Ze względu na
słabe porażenie odmiany Irys w drugim i trzecim terminie po trzech dniach inkubacji test wydłużono
o jeden dzień. Analiza wariancji otrzymanych wyników wykazała istotne różnice w porażeniu
testowanych genotypów ziemniaka, brak istotnych różnic w porażeniu badanych form w różnych
terminach testu oraz brak istotnej interakcji pomiędzy terminem testu i genotypem. Średnia porażonej
masy tkanki podatnej odmiany Irys wynosiła 12,94g, średnio-odpornej odmiany Glada – 4,69g, jeden
klon diploidalny był silniej porażony od odmiany Glada, a jeden klon – słabiej, oba klony nie różniły
się od niej istotnie, a średnia porażenia masy tkanki tych klonów wynosiła odpowiednio 4,81g i 2,35g.
Pozostałe klony (24) charakteryzowały się wysoką odpornością, a średnia porażenia masy tkanki
klonów wynosiła od 0,01 do 2,00g. Testowane podatne mieszańce 2x uległy porażeniu od słabego do
silnego. Średnie porażenie pozwoliło na wyróżnienie pięciu grup. Podatna odmiana Irys uległa
najsilniejszemu porażeniu, średnia wynosiła 28 mm (średnica zgniłej tkanki na przekroju bulwy
wzdłuż miejsca inokulacji), drugim silnie porażonym klonem był DG 07-104, którego porażenie
wynosiło 22,5 mm.
(c) Określenie płodności 2x mieszańców Solanum w celu wybrania form rodzicielskich populacji
mapującej.
27 mieszańców 2x Solanum. Pyłek zebrano z kilku dojrzałych kwiatów paru roślin. Po zabarwieniu
pyłku kwaśną laktofuksyną określono procentowy udział wybarwionych na kolor ciemnoróżowy,
niezdeformowanych ziaren pyłku, przy powiększeniu 200x, w kilku polach widzenia, wśród 100-200
ziaren.
Wyniki i dyskusja:
Wszystkie klony diploidalne charakteryzowały się płodnością pyłku, a średnia płodność wynosiła 65%
(zakres od 30% do 90%). Pyłek wybarwiony przynajmniej w 30% jest płodny i może być efektywnym
zapylaczem w programie krzyżowań (Abdalla, 1970; Janssen et.al., 1976).
Wnioski:
Agresywność bakterii D. solani rośnie wraz z temperaturą w badanym przedziale temperatur od 20oC
do 30oC. W temperaturze 26oC zaobserwowano większe różnice w porażeniu odmiany podatnej
i średnioodpornej niż w temperaturze 30oC, dlatego do testowania odporności bulw na bakterie
D. solani wybrano temperaturę 26oC i czas inkubacji 3 lub 4 dni (w zależności od reakcji wzorców –
podatnej odmiany Irys i średnioodpornej odmiany Glada). Do krzyżowania i otrzymania populacji
mapującej wybrano klon diploidalny DG 00-270 - wysokoodporny na bakterie D. solani w teście
inokulacji bulw. Poszukiwanie form podatnych jest w trakcie realizacji, dotychczasowymi
kandydatami są klony DG07-104 i DG08-305. Wybrane formy posiadają płodny pyłek.
Literatura:
1. Abdalla M.M.F. 1970. Inbreeding, heterosis, fertility, plasmon differentiation and Phytophthora resistance in
Solanum verrucosum Schlechtd. and some interspecific crosses in Solanum. Agr. Res. Rep. Wageningen 748:
213.
2. Janssen A.W.B., Hermsen J.G.T. 1976. Estimating pollen fertility in Solanum species and haploids.
Euphytica 25: 577-586.
3. Latour X., Diallo S., Chevalier S., Morin D., Smadja B., Burini J.F., Haras D., Orange N. 2007.
Thermoregulation of N-Acyl Homoserine Lactone-Based Quorum Sensing in the Soft Rot Bacterium
Pectobacterium atrosepticum. Appl. Environ. Microbiol. 73(12): 4078–4081.
4. Pérombelon M.C.M., Kelman A. 1980. Ecology of the soft rot erwinias. Annu Rev Phytopathol 18: 361-387.
65
5. Smadja B., Latour X., Trigui S., Burini J.F., Chevalier S., Orange N. 2004. Thermodependence of growth
and enzymatic activities implicated in pathogenicity of two Erwinia carotovora subspecies (Pectobacterium
spp.). Can. J. Microbiol. 50: 19–27.
6. van der Wolf J.M., Nijhuis E.H., Kowalewska M.J., Saddler G.S., Parkinson N., Elphinstone J.G., Pritchard
L., Toth I.K., Lojkowska E., Potrykus M., Waleron M., de Vos P., Cleenwerck I., Pirhonen M., Garlant L.,
Hélias V., Pothier J.E., Pfluger V., Duffy B., Tsror L., Manulis S. 2014. Dickeya solani sp. nov.,
a pectinolytic plant-pathogenic bacterium isolated from potato (Solanum tuberosum). Int J Syst Evol
Microbiol 64: 768–774.
Tytuł zadania: Badania nad opracowaniem metod selektywnej izolacji oraz czułej
identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w trudnych
diagnostycznie próbach środowiskowych.
Kierownik zadania: dr W. Przewodowski
Cel zadania:
Głównym celem zadania było opracowanie materiałów i procedur do selektywnej izolacji
kwarantannowej bakterii - Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) z różnych prób
środowiskowych oraz opracowanie i weryfikacja wysoce czułych i specyficznych metod identyfikacji
tej bakterii.
W celu opracowywania materiałów do izolacji bakterii Cms z tkanek roślinnych i wody, w pierwszej
części zadania pozyskano, charakteryzowano i odpowiednio selekcjonowano na potrzeby badań
szczepy bakterii Cms oraz innych patogenów ziemniaka. Na bazie tych pierwszych opracowywano
specyficznie działające cząstki receptorowe, które umieszczano na uprzednio wyselekcjonowanych
i opracowanych matrycach uzyskując docelowo materiały do selektywnej izolacji Cms. Opracowane
materiały oceniano w obecności soku różnych odmian ziemniaka stosując jako odnośną zalecany
przez EPPO test IFAS. Oceniano jednocześnie przydatność dwóch różnych metod izolacji IgG, jak
również sposób blokowania powierzchni immunosorbenta białkami z soku bulw ziemniaka.
Analizując stopień degradacji DNA oraz czułość testu PCR oceniano przydatność 4 różnych metod
izolacji DNA bakterii Cms z wody oraz soku roślinnego. Na bazie metody dającej najczulszy wynik
w teście PCR opracowano procedurę specyficznej izolacji i identyfikacji bakterii Cms z ww. mediów.
Jako odnośne stosowano dwa komercyjne zestawy do izolacji genomowego DNA z bakterii.
W dalszej części zadania badano podatność różnych odmian ziemniaka na porażenie bakteriami Cms.
W tym celu z krajowego rejestru odmian ziemniaka wyselekcjonowano na potrzeby badań 16 odmian
ziemniaka zróżnicowanych pod kątem wartości użytkowej i agrotechnicznej, wczesności i zawartości
skrobi oraz pochodzenia (odmiany polskie i zagraniczne). Badane odmiany impregnowano zawiesiną
bakterii Cms, a następnie wysadzono na początku maja na specjalnie przygotowanych do tego celu
mikropoletkach doświadczalnych o różnych profilach glebowych. Podatność i stopień porażenia
badanych odmian oceniano zarówno na podstawie objawów makroskopowych, jak i testów
diagnostycznych na obecność bakterii Cms. Diagnostykę przeprowadzano w trakcie wegetacji roślin
oraz po zbiorze bulw ziemniaka, stosując jako próby badawcze odpowiednio tkanki (liście i łodygi)
porażonych roślin oraz bulwy potomne ziemniaka.
Aby określić wpływ czynników zewnętrznych na stopień porażenia, w okresie wegetacyjnym
prowadzono obserwacje terminów wschodów, kwitnienia i zasychania roślin oraz obserwacje pod
kątem objawów porażenia części nadziemnej porażonych roślin ziemniaka. Dodatkowo każdy z profili
glebowych biorących udział w doświadczeniu badano pod kątem właściwości chemicznych natomiast
w trakcie wegetacji dokonywano regularnego pomiaru temperatury i wilgotności tych gleb oraz
temperatury powietrza.
W kolejnym zadaniu z udziałem roślin in vitro ziemniaka, oceniano zdolność bakterii Cms do
infekowania roślin utrzymywanych w kulturach in vitro. Prowadzono badania mające na celu
opracowanie efektywnego sposobu porażania roślin in vitro bakteriami Cms, następnie opracowania
metody izolacji i identyfikacji tych bakterii z roślin in vitro oraz selekcji odmian ziemniaka
o największej wrażliwości na porażenie Cms. Badania wykonywano przy udziale odmian ziemniaka
66
wyselekcjonowanych we wcześniejszej części zadania. Spośród 4 opracowanych sposobów porażania,
wyselekcjonowano najbardziej efektywny, który stosowano w dalszej części badań z udziałem całej
puli badanych odmian. W celu zbadania stopnia porażenia badanych roślin bakteriami Cms,
opracowano warunki pozwalające na molekularną ocenę komórek obecnych wewnątrz badanych
roślin po uprzedniej maceracji tkanek tych roślin. Opracowane warunki pozwoliły na przeprowadzenie
badań i różnicowanie badanych odmian pod względem wrażliwości na porażenie bakteriami Cms.
Dalsze prace badawcze związane były z identyfikacją potencjalnych źródeł zakażeń
mikrobiologicznych w pożywkach hodowlanych roślin in vitro oraz opracowaniem metodyki
zapobiegania tego typu kontaminacjom. W celu ustalenia potencjalnych źródeł występowania oraz
dróg rozprzestrzeniania zakażeń mikrobiologicznych z udziałem bakterii Cms, opracowano schemat
postępowania z roślinami in vitro w Banku Genów Ziemniaka. Dla wyznaczonych miejsc
potencjalnego porażenia komórkami sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, prowadzono
badania mające na celu opracowanie metodyki zapobiegania kontaminacjom mikrobiologicznym
w Banku Genów. W tym celu opracowywano i charakteryzowano substancje koloidalne wykazujące
działanie antymikrobiologiczne w stosunku do bakterii Cms. Następnie poprzez impregnację podłoży
wzrostowych dla roślin in vitro oceniano fitotoksyczność tych substancji względem badanych roślin
in vitro. Badania prowadzono na podstawie obserwacji makroskopowych oraz współczynnika
rozmnażania wyznaczonego dla średniej z 10-ciu powtórzeń dla każdego z przyjętych wariantów
badania.
Wyniki i dyskusja:
Wyselekcjonowano, scharakteryzowano i zróżnicowano materiał biologiczny do badań w postaci
szczepów bakterii Cms oraz innych patogenów ziemniaka, jak również 16 odmian ziemniaka.
W wyniku badań przeprowadzonych w pierwszej części zadania opracowano materiały do izolacji
bakterii Cms z tkanek roślinnych i wody. Na bazie odpowiednio dobranych i scharakteryzowanych
pod względem mukoidalności oraz patogeniczności szczepów bakterii Cms, opracowano nowej
jakości cząsteczki receptorowe, które w odróżnieniu od dostępnych komercyjnie przeciwciał
pozwalały na specyficzne wykrywanie wszystkich badanych szczepów Cms. Spośród dwóch
ocenianych metod, które wykazały równoważną przydatność w izolacji IgG, wybrano metodę mniej
czasochłonną.
Dzięki odpowiedniej konfiguracji cząstek receptorowych oraz powierzchni matryc, opracowano
materiały do selektywnej izolacji bakterii Cms. Prowadzone próby polepszenia właściwości
opracowanych materiałów poprzez blokowanie ich powierzchni białkami z soku różnych odmian
ziemniaka nie przyniosły zakładanych rezultatów, w wyniku czego powierzchnie matryc pokrywano
powszechnie stosowanym do tego celu białkiem blokującym.
Spośród badanych metod izolacji DNA bakterii Cms, za najbardziej przydatną uznano metodę
pozwalającą uzyskać najwyższą czułość testu PCR oraz niezdegradowane DNA bakteryjne.
Stosowane jako odnośne komercyjne zestawy do izolacji genomowego DNA z bakterii wykazały
mniejszą czułość w izolacji DNA z soku, ale lepszą z wody. Przy pomocy wybranej metody izolacji
DNA bakteryjnego oraz opracowanych materiałów do selektywnej izolacji bakterii Cms, opracowano
procedurę specyficznej izolacji i identyfikacji bakterii Cms z prób z prób takich, jak woda oraz sok
roślinny.
Wykazano przydatność opracowanej metody zarówno w identyfikacji prób przygotowanych
w warunkach laboratoryjnych, jak i prób pozyskanych ze środowiska naturalnego (pola). Wyniki
uzyskane w pierwszym przypadku w zewnętrznych laboratoriach potwierdziły przydatność
opracowanych rozwiązań w izolacji Cms w obecności komponentów soku różnych odmian ziemniaka,
wskazując na wyższą skuteczność izolacji oraz łatwość wykorzystania opracowanych sorbentów
w odróżnieniu od zalecanego przez EPPO testu IFAS. Natomiast badania prowadzone na próbach
w warunkach polowych pozyskanych w okresie wegetacji z tkanek porażonych roślin oraz po zbiorze
z bulw potomnych ziemniaka wykazały lepszą przydatność standardowego testu IFAS w identyfikacji
prób latentnych oraz większą skuteczność opracowanej metody w analizie prób wykazujących
symptomy choroby.
Zastosowanie metod diagnostycznych oraz wykonana w okresie wegetacji roślin analiza parametrów
gleby, warunków atmosferycznych oraz ocena objawów makroskopowych na roślinach i bulwach
potomnych pozwoliły określić wpływ czynników zewnętrznych na stopień porażenia bakteriami Cms
67
badanych odmian, jak również wykazać zróżnicowanie w wrażliwości badanych odmian na obecność
w tkance ziemniaka bakterii Cms.
Prace z udziałem wyselekcjonowanych odmian ziemniaka w formie roślin in vitro pozwoliły ocenić
zdolność bakterii Cms do infekowania roślin utrzymywanych w kulturach in vitro. Spośród
4 opracowanych sposobów porażania roślin in vitro testowanych na dwóch odmianach,
wyselekcjonowano najbardziej efektywny, który stosowano w dalszej części badań z udziałem całej
puli badanych odmian. Opracowano również skuteczny sposób izolacji i identyfikacji tych bakterii
z roślin in vitro, co pozwoliło na selekcję odmian ziemniaka o największej wrażliwości na porażenie
Cms. Prawdopodobnie wskutek zbyt silnej presji patogenicznych bakterii Cms, praktycznie wszystkie
rośliny badanych odmian in vitro wykazywały symptomy chorobowe związane m. innymi z brakiem
ukorzenienia, nekrozami liści oraz częściowym bądź całkowitym zahamowaniem wzrostu. Na
podstawie uzyskanych wyników badane odmiany podzielono na silnie i średnio podatne na bakteriozę
pierścieniową.
W wyniku analizy czynności w Banku Genów, przeprowadzonej na podstawie ankiety, za potencjalne
źródła zakażeń mikrobiologicznych uznano momenty związane z wprowadzaniem do banku nowych
odmian/rodów, jak również momenty namnażania/pasażowania istniejących w banku zasobów. Aby
zapobiegać powstawaniu i rozprzestrzenianiu się kontaminacji w tych miejscach, prowadzono badania
zmierzające do opracowania metodyki pozwalającej zapobiegać tego typu kontaminacjom w Banku
Genów. W tym celu opracowano i scharakteryzowano substancje koloidalne wykazujące działanie
antymikrobiologiczne w stosunku do bakterii Cms. Następnie poprzez impregnację podłoży
wzrostowych dla roślin in vitro oceniano fitotoksyczność tych substancji względem badanych roślin
in vitro. Opracowane substancje koloidalne o działaniu antybakteryjnym w stosunku do bakterii Cms
różniły się między sobą stopniem fitotoksycznego oddziaływania na rośliny ziemniaka w kulturach
in vitro.
Tytuł zadania: Opracowanie czułych metod wykrywania najważniejszych wirusów
ziemniaka.
Kierownik zadania: dr K. Treder
Głównym celem niniejszego projektu jest opracowanie czułych metod wykrywania wirusa Y
ziemniaka (PVY), wirusa M ziemniaka (PVM) oraz wirusa liściozwoju ziemniaka (PLRV) w bulwach,
kiełkach i liściach roślin ziemniaka. Główny cel zadania realizowano w postaci pięciu tematów
badawczych:
1. Opracowanie i optymalizacja nowych metod wykrywania wirusów.
2. Ocenę wpływu odporności odmian ziemniaka na skuteczność wykrywania wirusów w bulwach.
3. Badania nad wykrywaniem wirusów w bulwach i kiełkach ziemniaka za pomocą koktajl i DASELISA.
4. Adaptację i optymalizację metod molekularnych do wykrywania wirusów w roślinach in vitro.
5. Opracowanie testów diagnostycznych do szybkiego wykrywania wirusów.
Temat badawczy 1. Opracowano sposób wytwarzania mikrosfer magnetyczno-krzemionkowych
i osadzenia na ich powierzchni przeciwciał specyficznych wobec PVY, PVM i PLRV. Opracowane
mikrosfery porównano z komercyjnymi mikrosferami dedykowanymi do wiązania przeciwciał.
Przygotowano rozcieńczenia soku z liści roślin porażonych badanymi wirusami oraz z roślin
zdrowych (kontrola negatywna). Cząstki wirusa zagęszczono na mikrosferach magnetycznych z 1 ml
rozcieńczeń i wykonano test ELISA. Porcje 0,1 ml tych samych rozcieńczeń bezpośrednio
analizowano za pomocą DAS-ELISA.
Temat badawczy 2. Wysadzono w polu zdrowe bulwy odmian Irys, Korona, Quincy, Rosalind i Zeus.
Na początku września zebrano i ponumerowano bulwy. Po czterech tygodniach przechowywania
z bulw pobrano fragment tkanki przystolonowej, który badano za pomocą koktajl-ELISA. Z tych
samych bulw wycięto oczka do próby oczkowej oraz oczka do badania kiełków. Kiełki badano za
68
pomocą DAS-ELISA i koktajl-ELISA. Liście roślin z próby oczkowej badano za pomocą DASELISA.
Temat badawczy 3. Porównanie prowadzone było przez niezależnych wykonawców. Każdy
wykonawca badał co najmniej 3 rody lub odmiany ziemniaka. Zdrowe sadzeniaki wysadzono na polu.
Spod krzaków pobrano bulwy. Wykonano koktajl-ELISA bezpośrednio w ekstraktach z bulwach oraz
wycięto oczka do uzyskania kiełków i roślin potomnych do wykonania próby oczkowej. Kiełki
i rośliny z prób oczkowych oceniano za pomocą DAS-ELISA.
Temat badawczy 4. Opracowano startery do wykrywania PLRV i porównano czułości wykrywania
PLRV za ich pomocą optymalizując dla PLRV metodykę wg Zacharzewska i in. (2014). Czułość
badano dla starterów L2, L4, L5 i L6 oraz starterów literaturowych (Singh i in., 1995) stosując
rozcieńczenia RNA izolowanego z zainfekowanych roślin. Oceniono skuteczności wykrywania PVY
w roślinach in vitro za pomocą SC-RT-PCR. Rośliny infekowano mechanicznie wirusem PVY. RNA
izolowano wg Zacharzewska i in. (2014) oraz za pomocą komercyjnego zestawu. W badanych
roślinach nie wykryto PVY za pomocą standardowego RT-PCR. Dlatego wykonano dodatkowo
detekcję za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym. Badanie to wykonano w Interdyscyplinarnym
Centrum Nowoczesnych Technologii Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu.
Temat badawczy 5. Startery projektowano za pomocą programu LAMP Designer (Premier Biosoft).
W celu porównania czułości wykrywania PVY, RNA izolowane z roślin doprowadzono do 100 pg/1µl
i seryjnie rozcieńczono do 10 fg/1µl. Po 1 µl takich rozcieńczeń dodano do mieszaniny reakcyjnej
RT-LAMP i wykonywano reakcję w 65°C przez 30 min. Procedurę izolacji RNA na krzemionce
(Zacharzewska i inni 2014) optymalizowano do wykonania w warunkach polowych. W tym celu
krzemionkę zastąpiono mikrosferami magnetycznymi. Opracowano skrócone warianty, w których
pominięto etap przemywania acetonem oraz suszenia osadu.
Wyniki i dyskusja:
Temat badawczy 1. Wytworzono mikrosfery o dobrych właściwościach magnetycznych
i dyspersyjnych, jednak procedura wiązania przeciwciał na ich powierzchni była mało wydajna,
związano 80 µg przeciwciał na 1 mg mikrosfer. Komercyjne mikrosfery posiadają zdolność do
wiązania ok 7 mg przeciwciał na 1 mg mikrosfer. Tą różnicą, w zdolności do wiązania przeciwciał
przez mikrosfery wytworzone oraz komercyjne, tłumaczyć można różnice w uzyskanych wynikach.
Gdy magnetyczny test ELISA wykonano na wytworzonych mikrosferach, w ogóle nie wykryto PVY
i PVM a wartości uzyskane dla PLRV były niskie, choć wystarczająco wysokie by wykryć wirus
nawet w 1000 razy rozcieńczonym soku. Z wykorzystaniem komercyjnych mikrosfer wykryto badane
wirusy we wszystkich rozcieńczeniach. Ponadto wartości absorbancji uzyskane dla 1000 razy
rozcieńczonych soków z roślin porażonych, były bardzo wysokie.
Temat badawczy 2. Stwierdzono związek pomiędzy odpornością odmian na PVY a wykrywalnością
tego wirusa w bulwach. Im wyższy stopień odporności odmian, tym większa rozbieżność wyników
wykrywania PVY w bulwach i w próbie oczkowej.
Temat badawczy 3. W bieżącym roku żaden z wykonawców nie wykrył w badanym materiale
obecności PLRV. Również PVM w ogóle nie został wykryty przez jednego z wykonawców
a w badaniach Wykonawcy II wykryto go tylko w 8 roślinach na 90 badanych. PVY również
występował nielicznie. W badaniach wykazano niską skuteczność wykrywania PVY bezpośrednio
w bulwach. Testowanie kiełków przez wszystkich wykonawców dawało dobrą zgodność z próbą
oczkową, niezależnie od tego, czy wykonano je testem koktajlowym, czy DAS ELISA.
Temat badawczy 4. Opracowano startery (L2, L4, L5, L6), które porównano ze starterami wg Singh
i inni. (1995). Najwyższą czułość uzyskano stosując startery L2. Oceniano również skuteczności
wykrywania PVY w roślinach in vitro za pomocą SC-RT-PCR. Doświadczenie powtarzano
kilkukrotnie, ponieważ nie wykrywano PVY w badanych roślinach. Dlatego ostatnią serię roślin
przebadano za pomocą testu RT-PCR w czasie rzeczywistym. RNA izolowano na krzemionce wg
Zacharzewska i in. (2014) oraz za pomocą komercyjnego zestawu. W obu przypadkach uzyskano taką
samą skuteczność wykrywania PVY, przy czym stosując izolację na krzemionce wirusa wykrywano
przy mniejszej liczbie cykli niż dla RNA izolowanego za pomocą komercyjnego zestawu.
Temat badawczy 5. Zaprojektowano trzy zestawy starterów (Y2, Y4 i Y5) i porównano skuteczność
i czułość wykrywania PVY za ich pomocą i za pomocą starterów literaturowych. Spośród badanych
starterów najwyższą czułość detekcji umożliwiły startery Y4. Dla tych starterów optymalizowano
izolację RNA do warunków polowych. Zastosowano statyw magnetyczny oraz opracowano
69
uproszczoną metodę izolacji RNA na mikrosferach magnetycznych. Wykazano, że zastosowany układ
buforowy oraz skrócona do kilku minut (8-20) procedura izolacji RNA pozwala na skuteczne
wykrycie PVY w próbach zawierających 10 pg całkowitego RNA. Nieznacznie dłuższa procedura
pozwoliła na wykrycie PVY w 1 pg całkowitego RNA.
Tytuł zadania: Badania tolerancji odmian ziemniaka na stresy abiotyczne w świetle
postępujących zmian klimatycznych.
Kierownik zadania: prof. dr hab. K. Rykaczewska
Cel podzadania I: Ocena tolerancji wybranych genotypów ziemniaka na wysoką temperaturę
w różnych stadiach wegetacji roślin w warunkach suszy i optymalnej wilgotności gleby.
Materiał i metody:
Przeprowadzono doświadczenie wazonowe w hali wegetacyjnej i komorach wegetacyjnych
z sześcioma odmianami ziemniaka: Miłek (bardzo wczesne), Gwiazda, Hubal (wczesne), Tetyda,
Oberon (średnio wczesne). W okresie wegetacji rośliny czterokrotnie poddano 2-tygodniowemu
stresowi podwyższonej temperatury (38/25oC) w warunkach suszy i optymalnej wilgotności gleby:
I - w drugiej połowie maja; II - w pierwszej połowie czerwca; III – w drugiej połowie czerwca;
IV - w pierwszej połowie lipca. Przed każdym okresem stresu abiotycznego i po jego zakończeniu
określano stan fizjologiczny roślin. Po zakończeniu wegetacji w Kontroli (bez stresu abiotycznego) we
wszystkich kombinacjach określono: plon końcowy, strukturę plonu, defekty fizjologiczne bulw oraz
długość okresu spoczynku. Dodatkowo przeprowadzono doświadczenie w aeroponice w celu
określenia rozwoju systemu korzeniowego 17 odmian ziemniaka. W okresie tuberyzacji określono
cechy morfologiczne i anatomiczne korzeni.
Wyniki i dyskusja:
Rozwój roślin badanych odmian w momencie poddawania ich kolejnym stresom abiotycznym był
zróżnicowany: I termin przypadał na okres przed tuberyzacją, II termin – na okres tuberyzacji,
III termin – na okres początkowego wzrostu bulw a IV termin – na okres intensywnego wzrostu bulw.
Powierzchnia asymilacyjna roślin w wymienionych terminach wynosiła średnio dla badanych odmian
kolejno: 2841 cm2, 7167 cm2, 10023 cm2 i 11403 cm2. Stwierdzono istotny wpływ badanych
abiotycznych czynników stresowych na stan fizjologiczny roślin w okresie wegetacji tuż po
zakończeniu ich działania ((wysokość roślin, RWC- Relative Water Content, PI oraz Fv/Fm
(parametry fluorescencji chlorofilu a świadczące o wydajności fotosyntezy), LAI – Leaf Area Index)
oraz na plon końcowy, liczbę bulw, wielkość bulw i strukturę plonu. Najwyższym plonem
w kombinacji kontrolnej charakteryzowała się odmiana Lord (2352 g/ roślinę), a najniższym odmiana
Hubal (1792g/roślinę). Plon pozostałych odmian w Kontroli wynosił: Tetyda - 2120 g/roślinę,
Gwiazda – 2080 g/roślinę , Oberon – 2053 g/roślinę, Miłek - 1827 g/roślinę.
W momencie zbioru, który zgodnie z przyjętą metodyką miał miejsce po dojrzałości w Kontroli,
rośliny poddane wcześniej abiotycznym czynnikom stresowym – wysokiej temperaturze i suszy
wykazały znaczny stopień regeneracji i nie zakończyły jeszcze wegetacji. Powierzchnia asymilacyjna
tych roślin wynosiła średnio 3078 cm2 i była największa u odmiany Hubal – 4179 cm2 (LAI 1,67).
Wskazywało to na wystąpienie zjawiska wtórnej wegetacji.
Pod wpływem stresu wysokiej temperatury plon bulw uległ obniżeniu średnio do 82%, a pod
wpływem stresu wysokiej temperatury i suszy łącznie średnio do 57%. Reakcja odmian zależna była
od okresu występowania czynników stresowych. Największe obniżenie plonu pod wpływem wysokiej
temperatury wystąpiło, gdy stres oddziaływał w II okresie (pierwsza połowa czerwca). Zaznaczył się
najsilniej u odmiany Oberon, u której plon obniżył się do 67%. Łączny wpływ czynników stresowych
był najbardziej szkodliwy dla odmiany Miłek (spadek plonu do 16%) oraz odmiany Lord (spadek
plonu do 42%). Liczba bulw > 3 cm w plonie zwiększyła się pod wpływem wysokiej temperatury do
118% i była najwyższa u odmian bardzo wczesnych (Lord -140%, Miłek - 135%). II i III okres stresu
był najbardziej szkodliwy dla tuberyzacji i dalszego wzrostu bulw.
70
Reakcja odmian zależna była od okresu występowania czynników stresowych. Stwierdzono
zmniejszenie wielkości bulw w plonie średnio z 97 g w Kontroli do 67 g w kombinacji z podwyższoną
temperaturą i do 57g w kombinacji z podwyższoną temperaturą i suszą łącznie. Największe różnice
wystąpiły u odmian Miłek i Lord. Pod wpływem badanych czynników stresowych wystąpiło
intensywne wiązanie bulw wielkości 1-3 cm. Było to dowodem na wtórną tuberyzację roślin badanych
odmian ziemniaka.
Udział bulw z defektami fizjologicznymi w plonie był tym większy im wcześniej wystąpił stres
abiotyczny. Reakcja odmian była zróżnicowana. Największy udział bulw zdeformowanych w plonie
wystąpił u odmiany Hubal – 40,0% w przypadku stresu wysokiej temperatury, a najmniejszy
u odmiany Tetyda (średnio 3%). Najpoważniejszym defektem plonu była obecność bulw
chronologicznie młodszych – niedojrzałych, z bardzo cienką skórką. Im wcześniej wystąpił stres
abiotyczny, tym udział bulw chronologicznie młodszych w plonie był większy.
Spoczynek bulw badanych odmian w Kontroli kończył się między 5 września a 25 października. Stres
wysokiej temperatury i suszy oddziaływujący na rośliny w I i II okresie powodował wydłużenie
spoczynku dochodzące do 54 dni (Tetyda), ale stres ten działający na rośliny w III i IV okresie
spowodował znaczne skrócenie spoczynku bulw dochodzące do 46 dni (Miłek).
Rozwój systemu korzeniowego badanych odmian ziemniaka roślin rosnących w urządzeniu do
aeroponicznej produkcji bulw był wysoce istotnie zróżnicowany. Długość korzeni 17 badanych
odmian ziemniaka w czasie tuberyzacji (11 lipca) wynosiła średnio 82,6 cm i wahała się od 109,3 cm
u odmiany Hubal do 44,0 cm u odmiany Miłek. Uszeregowanie odmian pod względem długości
korzeni jest następujące: Hubal, Michalina, Kuba, Gandawa, Stasia, Denar, Etiuda, Justa, Aruba,
Tetyda, Lord, Gwiazda, Etola, Oberon, Bila Finezja, Miłek. Nie stwierdzono istotnej korelacji między
długością a masą korzeni badanych odmian (współczynnik korelacji 0,32). Prowadzone badania
anatomiczne korzeni wskazują na istotne zróżnicowanie ilości wytworzonego ksylemu wtórnego.
Wyniki niniejszych badań są potwierdzeniem ogólnej tezy przedstawionej przez Wahid’a
i współautorów pracy “Heat tolerance in plants: An overview”, Environmental and Experimental
Botany, Vol. 61, 2007, iż przejściowe lub stale wysokie temperatury mogą powodować szereg morfoanatomicznych, fizjologicznych i biochemicznych zmian w roślinach, które mają wpływ nie tylko na
ich wzrost i rozwój, ale również mogą doprowadzić do drastycznego spadku plonu i jego jakości.
Negatywne skutki stresu cieplnego mogą być złagodzone przez wprowadzenie do uprawy roślin
odmian o ulepszonej termoregulacji. Z tego powodu dokładne zrozumienie fizjologicznych
mechanizmów reakcji roślin na wysoką temperaturę jest koniecznością.
Ziemniak jest typową rośliną klimatu umiarkowanego. Optymalna temperatura dla części nadziemnej
to 20-25oC, a dla tuberyzacji i rozwoju bulw 15-20oC. Temperatura wyższa od optymalnej powoduje
ograniczenie lub całkowite zahamowanie tuberyzacji oraz intensyfikację wzrostu części nadziemnej
roślin. Badania nad wpływem wysokiej temperatury na rozwój i plon ziemniaka były już wcześniej
prowadzone w warunkach naturalnych, głównie w Izraelu (np. D. Levy “Tuber yield and tuber quality
of several potato cultivars as affected by seasonal high temperature and by water deficit in a semi-arid
environment”, Potato Research, Vol. 29, 1986) oraz w fitotronach w Holandii (np. J. Van Dam, P. L.
Kooman, P. C. Struik, “Effects of temperature and photoperiod on early growth and final number of
tubers in potato (Solanum tuberosum L)”, Potato Research, Vol. 39, 1996), a także w Polsce
(Rykaczewska 1993, 2004a, 2004b, 2004c, 2013b). Brak było jednak danych na temat wpływu
wysokiej temperatury w różnych okresach rozwoju roślin, w warunkach suszy i optymalnej
wilgotności gleby, na rozwój i plon ziemniaka. Przeprowadzone badania pozwoliły na uzupełnienie
informacji w tym zakresie.
W wyniku przeprowadzonych badań własnych stwierdzono, że wysoka temperatura i susza
oddziaływująca na rośliny badanych odmian ziemniaka w I i II okresie wegetacji spowodowała
częściową zmianę kierunku transportu asymilatów z bulw do części nadziemnej. Świadczy o tym
bardzo wysoki stopień regeneracji masy nadziemnej roślin. Skutkiem tego było znaczne obniżenie
plonu bulw i pogorszenie jego struktury oraz wtórna tuberyzacja. Było to jednak zależne od odmiany,
rodzaju stresu abiotycznego i okresu jego występowania. Uzyskane wyniki wymagają potwierdzenia
w kolejnym roku badań.
Wnioski:
1. Stopień ujemnego wpływu wysokiej temperatury i suszy na rośliny ziemniaka w czasie wegetacji
był zależny od stanu rozwoju roślin w okresie działania stresu abiotycznego.
71
2. Wysoka temperatura i susza oddziaływująca na rośliny badanych odmian ziemniaka spowodowała
częściową zmianę kierunku transportu asymilatów z bulw do części nadziemnej. Skutkiem tego
było znaczne obniżenie plonu bulw i pogorszenie jego struktury oraz wtórna tuberyzacja. Było to
jednak zależne od odmiany, rodzaju stresu abiotycznego i okresu jego występowania.
3. Odmianą najbardziej tolerancyjną na działanie stresu wysokiej temperatury i suszy była Tetyda.
4. Rozwój systemu korzeniowego badanych odmian ziemniaka roślin rosnących w urządzeniu do
aeroponicznej produkcji bulw był wysoce istotnie zróżnicowany. Długość korzeni w okresie
tuberyzacji sięgała 109 cm u odmiany Hubal. Nie stwierdzono istotnej korelacji między długością
a masą korzeni. Prowadzone badania anatomiczne korzeni wskazują na istotne zróżnicowanie ilości
wytworzonego ksylemu wtórnego.
5. Uzyskane wyniki wymagają potwierdzenia w kolejnym roku badań.
Cel podzadania II: Wyróżnienie wskaźników tolerancyjności genotypów ziemniaka na niekorzystne
warunki środowiska.
Materiał i metody:
Przeprowadzono doświadczenie wazonowe dla sześciu genotypów ziemniaka, w którym zastosowano
dwutygodniową suszę glebową, trzy tygodnie po rozpoczęciu tuberyzacji. Głównym kryterium
rolniczym odporności na suszę był spadek plonu w warunkach niedoboru wody. Oceniono również
wielkości plonu w warunkach kontrolnych i suszy glebowej, indeks odporności na suszę glebową oraz
porównano wybrane parametry fizjologiczne takie jak: RWC metodą Barra i Weatherley’a (1962),
wielkości powierzchni asymilacyjnej przy pomocy aparatu LI-3000A (LI-COR, USA), proces
więdnięcia i regeneracji, fluorescencji chlorofilu przy użyciu fluorymetru jak również względną
zawartość chlorofilu w liściach za pomocą chlorofilomierza 502 SPAD. Badano następujące odmiany:
Bogatka, Cekin, Gawin, Gwiazda, Oberon, Satina. Dla tych samych odmian prowadzono badania
systemu korzeniowego w specjalnie skonstruowanych tubach o wysokości 1m umożliwiających
prawidłowy rozwój systemu korzeniowego. Dokonano następujących pomiarów systemu
korzeniowego: zasięg, rozkład w poszczególnych warstwach, świeża i sucha masa całego systemu,
świeża i sucha masa i w poszczególnych warstwach. Wyniki pomiarów systemu korzeniowego
otrzymanych w pierwszym doświadczeniu przedstawiano wg stopnia odporności na suszę mierzonego
spadkiem plonu.
Opracowano również metodę ekstrakcji korzeni do uzyskania obrazów elektroforezy dwukierunkowej
pozwalających na wytypowanie markerów białkowych różnicujących warunki kontrolne i suszy
glebowej oraz szybką kolorymetryczną metodę wykrywania reduktazy azotanowej w formacie
mikropłytkowym.
Wyniki i dyskusja:
Badane odmiany uszeregowano pod względem spadku plonu pod wpływem suszy. Spadek plonu
kształtował się od 10% u odmiany Gwiazda do 46% u odmiany Oberon. Zasięg systemu
korzeniowego był duży i sięgał u wszystkich odmian do 100 cm, z tym że podstawowa masa korzeni
zalegała na głębokość do 40-50 cm. W pozostałych warstwach masa korzeni była niewielka.
Stwierdzono bardzo duże zróżnicowanie odmian pod względem wielkości systemu korzeniowego jak
i jego rozkładu w poszczególnych warstwach gleby. Największym systemem korzeniowym
charakteryzowała się odmiana Gawin, najmniejszym zaś odmiana Bogatka. Średnia wartość
wskaźnika RWC mierzonego po 2-tygodniowej suszy dla kombinacji kontrolnej zawiera się
w przedziale 84-91%, u roślin poddanych suszy waha się w granicach 37–54%. Największą zdolność
do unikania odwodnienia wykazały odmiany Gwiazda, Satina i Gawin. Powierzchnia asymilacyjna
roślin w warunkach suszy była najniższa u odmian Bogatka i Cekin, a najwyższa u odmian Gawin
i Gwiazda. Proces więdnięcia najszybciej nastąpił u odmiany Cekin, najwolniej u odmian Gwiazda,
Bogatka i Gawin. Wartość indeksu zieloności liścia mierzonego chlorofilometrem SPAD wynosiła
średnio 38,8 dla roślin optymalnie zaopatrywanych w wodę (kontrola) a 48,5 dla roślin poddanych
suszy. Wartość SPAD wzrosła u wszystkich badanych odmian. W warunkach suszy maksymalna
wydajność fotoukładu II oraz wskaźnik funkcjonowania fotoukładu II zmniejszył się u wszystkich
badanych genotypów. Wskaźnik funkcjonowania fotoukładu II w warunkach kontrolnych średnio
wynosił 4,22 i 2,98 dla roślin poddanych suszy.
W pracy przedstawiono wyniki elektroforegramów elektroforezy dwukierunkowej korzeni ziemniaka
ekstrahowanych metodą lizy komórkowej oraz metoda fenolową. Wyraźniejsze spoty białkowe
72
i większą ich liczbę uzyskano przy ekstrakcji metodą fenolową dlatego wybrano tę metodę do
dalszych badań.
W metodzie mikropłytkowego oznaczania aktywności reduktazy azotanowej ustalano optymalną masę
żywej tkanki liści ziemniaka w mieszaninie reakcyjnej. Oceniano również wpływ genotypu ziemniaka
na aktywność reduktazy azotanowej. W stosowanych warunkach oznaczania, badane odmiany nie
różnią się wielkością aktywności właściwej reduktazy azotanowej.
O istnieniu różnic odmianowych w budowie systemu korzeniowego ziemniaka donosiło wielu
autorów (Vos i Groenwold 1986, Głuska 1996, Iwama 1998, 2008). Nasze badania również
potwierdziły obserwowane wcześniej zróżnicowanie. Odnotowano również różnice w parametrach
systemu korzeniowego, co potwierdzają doniesienia dotyczące zróżnicowania tej cechy wśród
genotypów Solanum tuberosum. W pracach Iwamy (2008) zasięg korzeni mierzony w naturalnym
profilu glebowym wynosił 50-120 cm. Zróżnicowanie naszych odmian było mniejsze, ale zakres
zbliżony. Podobne zgodności dotyczyły świeżej i suchej masy korzeni. W doświadczeniach badaczy
japońskich przeprowadzonych na wielu odmianach stwierdzono generalnie dodatnią korelację między
wielkością systemu korzeniowego a masą nadziemną roślin i plonem bulw. Taka zależność nie zawsze
jest prosta, co potwierdzają nasze badania.
Poszukiwaniem prostych wskaźników odporności roślin na suszę glebową zajmuje się wielu badaczy
(Monneveux i in. 2013). Z fizjologicznego punktu widzenia takim wskaźnikiem może być względny
spadek zawartości wody w warunkach suszy. Z agronomicznego punktu widzenia o odporności
genotypu decyduje zdolność do utrzymania wysokiego plonu o dobrej jakości. W naszych badaniach
nie znaleziono prostej zależności pomiędzy RWC a spadkiem plonu. Znaczenie wyższej zawartości
chlorofilu (bardziej zielone liście) w utrzymywaniu wyższego plonowaniem w warunkach suszy jest
ciągle dyskutowane (Blum, 1988). Badania przeprowadzone na dwóch odmianach ziemniaka
różniących się poziomem odporności przedstawiają istotny wzrost wartości SPAD wraz ze spadkiem
RWC, co było obserwowane wcześniej (Haverkort i MacKerrron, 2000). Nasze badania potwierdzają
te zależności. Może być to związane ze wzrostem SLA.
Proteomika, pomimo swoich ograniczeń i wyzwań, pomaga zrozumieć zależności pomiędzy
genotypem a fenotypem. Sposób analizy proteomu różni się znacząco od klasycznych technik
biochemicznych, za pomocą których staramy się identyfikować pojedyncze białka i szczegółowo
opisywać ich właściwości oraz funkcje. Proteomika natomiast łączy szereg technik (2-DE lub 2-DIGE,
LC, MS) służących do równoczesnej analizy setek lub tysięcy białek. A o jakości wyników
w badaniach proteomicznych decyduje właściwe przygotowanie próbki. Dlatego bardzo ważny jest
wybór odpowiedniego sposobu przygotowania ekstraktów białkowych do analizy proteomicznej.
Reduktaza azotanowa jest enzymem umożliwiającym roślinie asymilację azotu poprzez redukcję
azotanu (NO3-) do azotynu (NO2-). Aktywność reduktazy azotanowej podlega wielopoziomowej
kontroli metabolicznej i genetycznej. Dlatego może stanowić dobry marker odpowiedzi roślin na stres.
Aby możliwe było prowadzenie badań pod tym kątem, potrzebny jest prosty i szybki test oznaczania
aktywności reduktazy azotanowej, umożliwiający jednoczesny monitoring wielu roślin. Taki test
opracowano w niniejszym podzadaniu adaptując i optymalizując powszechnie stosowaną metodę
oznaczania aktywności reduktazy azotanowej in vivo (Jaworski, 1971).
Wnioski:
1. Zasięg głębokościowy korzeni roślin ziemniaka był duży i wynosił do 100 cm. Głębokość taką
osiągały tylko pojedyncze korzenie, podczas gdy zasadnicza część systemu korzeniowego
ulokowana była w warstwie do 50 cm.
2. Badane odmiany były zróżnicowane pod względem parametrów systemu korzeniowego, głównie
jego masy i rozkładu w poszczególnych warstwach.
3. Udział systemu korzeniowego w całej biomasie rośliny był bardzo zróżnicowany u odmian
i wynosił od 14 do 32 %.
4. Na podstawie jednorocznych badań zarysowuje się zależność pomiędzy wielkością systemu
korzeniowego a wielkością masy nadziemnej rośliny i plonem bulw, ale nie u wszystkich odmian
jest to zależność prostoliniowa.
5. Nie stwierdzono korelacji pomiędzy spadkiem plonu a zdolnością unikania odwodnienia
mierzoną jako RWC oraz wielkością powierzchni asymilacyjnej w warunkach suszy.
6. Parametry wydajności fotoukładu II (Fv/Fm, PI) zmniejszały się pod wpływem suszy
u wszystkich odmian.
73
Względna zawartość chlorofilu mierzona jako SPAD wzrastała w warunkach niedoboru wody.
Fenolowa metoda ekstrakcji pozwala na detekcję większej liczby białek korzeni ziemniaka
w pełnym zakresie pH 3-7 i masy cząsteczkowej.
9. Opracowano mikropłytkową metodę oznaczania aktywności reduktazy azotanowej in vivo.
Optymalna masa żywej tkanki w próbie wynosi ok. 5 mg.
10. Badane odmiany posiadają podobny poziom aktywności reduktazy azotanowej w optymalnych
warunkach oświetlenia, wilgotności i temperatury.
7.
8.
Tytuł zadania: Wyróżnianie form ziemniaka o złożonej odporności na mątwiki atakujące
ziemniak przy wykorzystaniu metod konwencjonalnych i molekularnych.
Charakterystyka nowego źródła odporności na Globodera pallida znalezionego
w Solanum gourlayi.
Kierownik zadania: mgr D. Milczarek
Cel zadania:
Celem głównym zadania jest poznanie genetycznych uwarunkowań odporności na mątwiki
zaobserwowanej w gatunku S. gourlayi oraz wyróżnienie w obrębie ziemniaka o różnych kierunkach
użytkowania form o złożonej odporności na mątwiki atakujące ziemniak (patotypy mątwika
ziemniaczanego - Globodera rostochiensis i mątwika agresywnego - G. pallida).
Celem tematów realizowanych w ramach zadania w 2014 roku była: ocena odporności wybranych
form S. gourlayi na patotypy Pa1, Pa2 i Pa3 G. pallida; uzyskanie populacji diploidalnej, która
posłuży do zbadania podłoża genetycznego odporności na mątwika agresywnego (G. pallida)
zidentyfikowanej w gatunku S. gourlayi; otrzymanie populacji tetraploidalnych w wyniku
skrzyżowania odmiany Innovator, o podwyższonej odporności na G. pallida, z klonami odpornymi na
wszystkie patotypy mątwika ziemniaczanego (G. rostochiensis), które pochodzą z kolekcji IHAR-PIB
w Młochowie. Populacje te posłużą do zbadania możliwości selekcji polskich materiałów
hodowlanych pod kątem odporności na patotypy Pa2 i Pa3 G. pallida przy użyciu markera HC.
W 2014 roku w ramach tematu przeprowadzono ocenę odporności na wszystkie patotypy mątwika
agresywnego dziewięciu klonów diploidalnych. Testy odporności zostały wykonane zgodnie
z procedurą EPPO. Próby zostały przeprowadzone na pojedynczych bulwach w doniczkach
o pojemności 1 litra z glebą zawierającą żywe cysty nicieni. Test został wykonany w pięciu
powtórzeniach dla każdej kombinacji klon/patotyp. Rośliny po posadzeniu rosły w szklarni przez
sześć tygodni. Po tym okresie liczono cysty z każdej doniczki. Stosunek liczby cyst z badanego klonu
do liczby cyst z podatnej odmiany kontrolnej stanowi o stopniu odporności danego genotypu.
Odporność na nicienie jest oceniana w skali 9-cio stopniowej, gdzie 9 oznacza najwyższy stopień
odporności.
Wykonano również program krzyżowań form diploidalnych i tetraploidalnych. Wszystkie wybrane do
krzyżowań rośliny zostały przetestowane pod kątem obecnosci patogenów kwarantannowych: PSTVd
i CMS. Test na obecność wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd) został wykonany wg.
procedury zatwierdzonej jako Standard EPPO w 2003-09. Test na obecność bakterii
Clavibacter michiganensis (Cms) został wykonany zgodne z procedurą dla testu
immunofluorescencyjnego (IF). Ze zdrowych bulw przygotowano rośliny do krzyżowań w formie
szczepień na podkładkach z psianki i pomidora. Rośliny odmiany Innovator, stanowiącej formę
ojcowską w krzyżowaniach 4x, pozyskano z kolekcji in vitro, posadzono w formie ukorzenionych
sadzonek i pozostały niezaszczepione. W celu przedłużenia okresu kwitnienia rośliny prowadzono na
1-2 pędy. W trakcie kwitnienia pyłek zebrano, zabezpieczono oraz oceniono pod kątem płodności.
Zabezpieczono DNA wszystkich wykorzystanych form rodzicielskich. Formy tetraploidalne zostały
sprawdzone pod kątem amplifikacji markera PCR HC.
74
Wyniki i dyskusja:
Potwierdzono bardzo niski stopień odporności (1) na wszystkie trzy badane patotypy G. pallida pięciu
form rodzicielskich wytypowanych do wykorzystania w krzyżowaniach jako podatne formy mateczne.
Natomiast dla czterech form rodzicielskich wytypowanych jako odporne formy ojcowskie
odnotowano zróżnicowanie odporności na wszystkie patotypy G. pallida, zarówno jakościowe, jak
i ilościowe. Każdy z badanych klonów charakteryzował się podwyższoną odpornością na jeden
z badanych patotypów. Klon DG 06-28 charakteryzował się umiarkowanym stopniem odporności na
patotyp Pa1. Klon DG 90-1 wykazywał umiarkowany stopnień odporności na patotyp Pa2. Klony DG
92-227 i DG 90-245 charakteryzowały się umiarkowanym i umiarkowanym do wysokiego stopniem
odporności na patotyp Pa3. Odnotowane zróżnicowanie odporności na różne patotypy mątwika
agresywnego pomiędzy klonami oraz różny stopień tej odporności (5, 6) może wskazywać na
poligeniczny charakter odporności. Odporność na G. pallida w większości obecnie
scharakteryzowanych źródeł odporności ma charakter ilościowy, przy odpowiednim połączeniu genów
odporności o małych efektach można jednak uzyskać genotypy charakteryzujące się zwiększoną
odpornością.
Badania odporności na G. pallida wybranych klonów potwierdziły ich przydatność jako form
rodzicielskich do uzyskania populacji mapującej. Wybrane diploidalne klony ojcowskie
charakteryzowały się płodnością pyłku od 50% do 80%. Trzy z nich wytwarzają również ziarna pyłku
o niezredukowanej liczbie chromosomów. W wyniku przeprowadzonego programu krzyżowań
uzyskano łącznie 78 jagód. Liczba jagód uzyskanych z krzyżowań wyniosła od 1 do 26 dla
poszczególnych kombinacji krzyżówkowych. Uzyskano jagody z następujących kombinacji: 26 jagód
z krzyżowania DG 06-1082 x DG 90-1, 17 jagód z krzyżowania DG 92-4862 x DG 06-28, 11 jagód
z krzyżowania DW 94-4235 x DG 06-28, 7 jagód z krzyżowania DW 94-4235 x DG 90-1, 5 jagód
z krzyżowania DG 88-9 x DG 92-227, po 4 jagody z krzyżowań DG 06-1007 x DG 06-28 i DG 924862 x DG 92-227, 2 jagody z krzyżowania DG 92-4862 x DG 00-908 oraz po 1 jagodzie
z krzyżowań DW 94-4235 x DG 92-227 i DW 94-4235 x DG 00-908. Z trzech kombinacji
krzyżówkowych otrzymano liczbę jagód wskazującą na możliwość otrzymania odpowiednio licznej
populacji mapującej (26, 17, 11).
Wykonano również krzyżowania tetraploidalne z udziałem 4 form rodzicielskich. Celem krzyżowań
było otrzymanie populacji, które posłużą do zbadania możliwości selekcji polskich materiałów
hodowlanych pod kątem odporności na patotypy Pa2 i Pa3 mątwika agresywnego (G. pallida) przy
użyciu markera HC. Wykorzystanie markerów DNA do selekcji pozwala na potwierdzenie obecności
genów odporności na bardzo wczesnym etapie hodowli. Z utrzymanej w polu kolekcji 41 klonów
o złożonej odporności na patotypy mątwika ziemniaczanego (G. rostochiensis) i/lub mątwika
agresywnego (G. pallida) wybrano trzy klony o wysokiej odporności na wszystkie patotypy
G. rostochiensis, a podatne na G. pallida, jako formy mateczne. Formą ojcowską była odmiana
Innovator o podwyższonej odporności na patotypy Pa2 i Pa3 G. pallida. Potwierdzono obecność
markera HC w odmianie Innovator i jego brak w wybranych do krzyżowań formach matecznych.
Pyłek formy ojcowskiej był płodny w 50%. Liczba jagód uzyskanych z krzyżowań wyniosła od 18 do
34 dla poszczególnych kombinacji krzyżówkowych. Otrzymano łącznie 72 jagody. Otrzymana liczba
jagód pozwoli na uzyskanie populacji wystarczająco licznych by możliwe było przetestowanie
możliwości selekcji form o podwyższonej odporności na G. pallida za pomocą markera HC.
Wnioski:
1.
Badania odporności na G. pallida klonów pochodzących po S. gourlayi wykazały
zróżnicowanie zarówno jakościowe jak i ilościowe. Aby potwierdzić uzyskane wyniki test
zostanie powtórzony w kolejnym sezonie.
2.
Badania odporności na G. pallida wybranych klonów potwierdziły ich przydatność jako form
rodzicielskich do uzyskania populacji mapującej.
3.
Otrzymana z przeprowadzonego programu krzyżowań 2x liczba jagód dla poszczególnych
kombinacji krzyżówkowych powinna być wystarczająca do wytypowania populacji mapującej,
która posłuży do zbadania podłoża genetycznego odporności pochodzącej z S. gourlayi.
4.
Obecność markera HC w odmianie Innovator oraz jego brak w wytypowanych formach
matecznych potwierdza ich przydatność jako form rodzicielskich do stworzenia populacji, które
posłużą do sprawdzenia możliwości wykorzystania markera HC do selekcji form odpornych na
G. pallida w polskich materiałach hodowlanych.
75
5.
Otrzymana z przeprowadzonego programu krzyżowań 4x liczba jagód pozwoli na uzyskanie
populacji wystarczająco licznych by możliwe było przetestowanie możliwości selekcji form
o podwyższonej odporności na G. pallida za pomocą markera HC.
Tytuł zadania: Wyróżnianie i charakterystyka tetraploidalnych form ziemniaka
odpornych na wirusy M i S ziemniaka z wykorzystaniem selekcji metodami
konwencjonalnymi i markerami molekularnymi.
Kierownik zadania: dr B. Tatarowska
Cele zadania:
1. Wybór form rodzicielskich 4x oraz 2x do programu krzyżowań tetraploidalnych 4x (Rm) × 4x (Rm),
4x (Gm) × 4x (Gm) i interploidalnych 4x (Ns) × 2x (Ns).
2. Wybór efektywnego sposobu kolchicynowania wytypowanych diploidalnych form ziemniaka
odpornych na PVS w celu podwojenia liczby chromosomów.
3. Uzyskanie populacji tetraploidalnych 4x × 4x, mających w swym pochodzeniu odporność na PVM
pochodzącą z dwóch dzikich gatunków: Solanum megistacrolobum i Solanum gourlayi w celu
poznania dodatkowych czynników genetycznych warunkujących tę odporność w różnych
warunkach środowiskowych.
4. Uzyskanie populacji interploidalnej 4x × 2x (obie formy rodzicielskie odporne na PVS, forma
diploidalna zdolna do wytwarzania 2n gamet) w celu zbadania wpływu dawki genu Ns na
odporność.
W ramach tematu 1 przeprowadzono oceny fenotypowe i genotypowe 49 form rodzicielskich 4x i 2x.
Wykonano testy na obecność patogenów kwarantannowych: PSTVd i CMS. Test na obecność wiroida
wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd) został wykonany wg. procedury zatwierdzonej jako
Standard EPPO w 2003-09. Test na obecność bakterii Clavibacter michiganensis (Cms) został
wykonany zgodne z procedurą dla testu immunofluorescencyjnego (IF). Wytypowane formy
rodzicielskie zostały sprawdzone pod względem płodności pyłku. Pyłek wybarwiony w co najmniej
30% uznany został za płodny w stopniu wystarczającym do wykorzystania w krzyżowaniach.
W testach laboratoryjnych oceniono poziom odporności na wirus M i S ziemniaka wybranych rodów
2x i 4x. Badano obecność markerów typu CAPS sprzężonych z genem Rm (GP 283 i GP 250)
i markera typu SCAR sprzężonyego z genem Gm (SC811) w celu potwierdzenia obecności form
odpornych na PVM w grupie rodów 4x. Dla potwierdzenia obecności form odpornych na PVS
w grupie rodów 4x i 2x zastosowano marker ISSR sprzężony z genem Ns (UBC811).
W ramach tematu 2 przeprowadzono kolchicynowanie wytypowanych diploidalnych form ziemniaka
2x odpornych na PVS (z genem Ns) w celu podwojenia liczby chromosomów. Zastosowano
zmodyfikowaną metodę Dionne’a polegającą na kolchicynowaniu merystemów kątowych (pędów)
ziemniaka. Zastosowano dwa stężenia roztworu kolchicyny: 0,5% oraz 0,1%, oraz dwa czasy
kolchicynowania 24h i 48h. W każdym z czterech wariantów (0,1% - 24h, 0,1% - 48h, 0,5% - 24h,
05% - 48h) kolchicynowaniu poddano 10 roślin oraz zastosowano jedną roślinę kontrolną. Odrastające
z kolchicynowanych kątów liściowych pędy były systematycznie ścinane i ukorzeniane w piasku.
Ukorzenione pędy następnie przesadzano do doniczek w celu otrzymania z nich bulw. Proces
kolchicynowania przeprowadzony został na trzech klonach diploidalnych (płodnych i posiadających
2n gamety), pochodzących z kolekcji in vitro.
W ramach tematu 3 i 4 przeprowadzono krzyżowania tetraploidalne 4x (Rm) × 4x (Rm), 4x (Gm) × 4x
(Gm) oraz interploidalne 4x (Ns) × 2x (Ns). Ze zdrowych bulw wycięto oczka, które po wstępnym
podkiełkowaniu wysadzono w doniczkach w szklarni. Po czterech tygodniach wzrostu z roślin tych
zostały pobrane zrazy, które zaszczepiono na przygotowanych uprzednio podkładkach z pomidora
i psianki. Rośliny wysadzono następnie w foliowcach. W celu przedłużeniu okresu kwitnienia rośliny
prowadzono na 1-2 pędy. W trakcie kwitnienia z klonów 4x i 2x wytypowanych jako formy ojcowskie
sukcesywnie zbierano pyłek do zapyleń.
76
Wyniki i dyskusja:
W ramach tematu 1 wstępnej ocenie poddano 22 formy rodzicielskie 4x mające w swym pochodzeniu
źródło odporności na PVM z S. megistacrolobum oraz 7 form 4x z genem odporności na PVM
z S. gourlayi. Po przeprowadzeniu oceny fenotypowej i genotypowej wytypowano 5 rodów
tetraploidalnych (4x) z genem Rm oraz 5 rodów (4x) z genem Gm do krzyżowań 4x × 4x. Do programu
krzyżowań 4x (Rm) × 4x (Rm) wybrano rody posiadające oba markery genu Rm: GP 250 i GP 283 oraz
wykazujące odporność w testach fenotypowych po zakażeniu mechanicznym. Rody z wysoko
płodnym pyłkiem (>60%) wykorzystano jako formy ojcowskie. Do programu krzyżowań 4x (Gm) ×
4x (Gm) wybrano rody posiadające marker genu Gm: SC878 oraz odporne w testach fenotypowych po
zakażeniu mechanicznym. Rody z wysoko płodnym pyłkiem (>50%) wykorzystano jako formy
ojcowskie. Do programu krzyżowań 4x × 2x wytypowano 6 rodów tetraploidalnych i 2 diploidalne
z genem Ns z S. tuberosum subsp. andigena. U wszystkich form stwierdzono obecność markera
UBC811 oraz potwierdzono odporność na PVS w testach fenotypowych. W celu przeprowadzenia
w przyszłym sezonie powtórnych krzyżowań interploidalnych dodatkowo wytypowano, oceniono
i rozmnożono 10 diploidalnych klonów odpornych na PVS z genem Ns.
W ramach tematu 2 po kolchicynowaniu uzyskano tylko 9 roślin. Dla klonu diploidalnego DW-276
nie uzyskano pędów przybyszowych. Po próbie ukorzenienia pędy zasychały i zamierały. Dla
pozostałych dwóch klonów liczba ukorzenionych pedów była również niewielka: DW 83-3121
(5 roślin), DW 83-3127 (4 rośliny). W przyszłym roku zostanie sprawdzony poziom ploidalności
osobników uzyskanych w wyniku kolchicynowania (na roślinach uzyskanych z ich pokolenia
wegetatywnego). Doświadczenie wstępne przeprowadzone w 2014 roku pokazało wiele trudności
jakich można spodziewać się przy podwajaniu liczby chromosomów u ziemniaka metodą
kolchicynowania. W obecności kolchicyny, która jest inhibitorem wrzeciona kariokinetycznego, nie
następuje rozdzielenie chromosomów siostrzanych na dwa jądra potomne. Powstaje jedno jądro
z podwójną liczbą chromosomów. Jeżeli stężęnie kolchicyny jest za wysokie lub jej działanie trwa
zbyt długo następują dalsze podziały chromosomów, prowadzące do śmierci komórki na skutek
przekroczenia poziomu ploidalności, przy którym może ona jeszcze zachować żywotność. Stężenie
i okres działania kolchicyny muszą być tak dobrane, aby nie przekroczyć etapu podwojenia liczby
chromosomów. Duży wpływ na wydajność procesu kolchicynowania ma interakcja genotyp × stężenie
× czas kolchicynowania. Te zależności i obserwowana zmienność uzyskiwanych wyników została
przedstawiona w wielu pracach. Autorzy publikacji pracując na różnych genotypach ziemniaka
stosowali roztwory kolchicyny o różnych stężeniach (od 0,005% do 1,0%) oraz różne czasy
kolchicynowania (od 24h do 92h), uzyskując bardzo rozbieżne wyniki. Praktycznie każdy genotyp
ziemniaka poddawany procesowi kolchicynowania musi mieć dopracowane własne warunki
i parametry, przy których frekwencja uzyskiwanych roślin o podwojonej liczbie chromosomów jest
zadowalająca.
W ramach tematu 3 przeprowadzono 8 kombinacji krzyżówkowych 4x (Rm) × 4x (Rm) oraz
8 kombinacji 4x (Gm) × 4x (Gm). Dla 8 kombinacji 4x (Rm) × 4x (Rm) uzyskano w sumie 217 jagód.
Dla 2 z 8 kombinacji krzyżówkowych 4x (Gm) × 4x (Gm) uzyskano w sumie 30 jagód. Celem zadania
było uzyskanie populacji interploidalnych pochodzących ze skrzyżowania form o odporności
pochodzącej z S. megistacrolobum 4x (Rm) × 4x (Rm) oraz o odporności pochodzącej z S. gourlayi
4x (Gm) × 4x (Gm). Uzyskanie takich materiałów pozwoli w kolejnych latach badań określić reakcję
form z genem Rm lub Gm na nowe warianty wirusa M ziemniaka oraz poznać dodatkowe czynniki
genetyczne warunkujące tę odporność w różnych warunkach środowiskowych przy zastosowaniu
ilościowych metod molekularnych. W przypadku odporności warunkowanej genem Rm określona
zostanie również zależność między odpornością, a występowaniem reakcji nekrotycznej. Badania te
pozwolą na usprawnienie metodyki wyróżniania form odpornych na PVM.
W ramach tematu 4 przeprowadzono krzyżowania interploidalne 4x x 2x (obie formy rodzicielskie
odporne na PVS, forma diploidalna zdolna do wytwarzania 2n gamet). Z 12 kombinacji tylko dla
jednej kombinacji PW-363 × DW-276 uzyskano jagodę. Rody diploidalne wytwarzały dużą liczbę
kwiatów. Natomiast kwiaty form matecznych po zapyleniu były zrzucane i nie dochodziło do
zawiązywania jagód. Z tego powodu do dalszych badań wytypowane zostały w tym sezonie kolejne
formy ojcowskie 2x z genem Ns. Klony wytypowane oceniono fenotypowo i genotypowo pod kątem
odporności na PVS oraz rozmnożono. Pyłek z tych form został zebrany i zamrożony w ciekłym
77
azocie. Wprowadzanie do materiałów hodowlanych odporności z dzikich gatunków Solanum odbywa
się różnymi metodami, zależnie od poziomu ploidalności oraz występujących barier krzyżowalności.
Jedną z metod jest krzyżowanie typu 4x × 2x, 2x × 4x lub 2x × 2x z wykorzystaniem gamet
o niezredukowanej liczbie chromosomów. Duży wpływ na żywotność ziaren pyłku mają zaburzenia
przebiegające w procesie mejozy. Zaburzenia podczas mikrosporgenezy i rozwoju ziaren pyłku roślin
uprawnych, ozdobych czy dziko rosnących mogą mieć bardzo różną etiologię łącznie z czynnikami
genetycznymi, cytoplazmatycznymi czy cytoplazmatyczo-genetycznymi. Należy również pamiętać, iż
na jakość pyłku w dużym stopniu wpływają warunki zwnętrzne: długość fotoperiodu, temperatura,
dostęp do niezbędnych substancji mineralnych, stresy fizjologiczne np. susza. Blokada rozwoju
niezgodnego pyłku jaką obsrwowaliśmy w przypadku przeprowadzonych krzyżowań 4x × 2x jest
procesem aktywnym, warunkowanym obecnością genetycznie zaprogramowanych mechanizmów.
W tym sezonie nie udało się uzyskać jagód do dalszych badań mających na celu zbadanie wpływu
dawki genu Ns na odporność. Program krzyżowań interploidalnch 4x × 2x zostanie powtórzony
w przyszłym sezonie, przy zwiększonej liczbie form ojcowskich 2x.
Wnioski:
W ramach tematu 1 z puli posiadanych materiałów tetraploidalnych wbrano pięć form rodzicielskich
odpornych na PVM z genem Rm i pięć form z genem Gm do krzyżowań tetraploidalnych 4x × 4x. Do
krzyżowań interploidalnych 4x × 2x z puli rodów tetraploidalnych z genem Ns wybrano sześć form
oraz dwie formy diploidalne. Dodatkowo oceniono 10 klonów 2x z genem Ns w celu wykorzystania
ich jako formy ojcowskie w powtórnych krzyżowaniach interploidalnych.
W ramach tematu 2 uzyskano po kolchicynowaniu 9 ukorzenionych roślin dla których w kolejnym
sezonie sprawdzony zostanie poziom ich ploidalności. Do określenia poziomu ploidalności
wykorzystana zostanie pośrednia metoda, polegająca na liczeniu chloroplastów w komórkach
przyszparkowych aparatu szparkowego. Będzie można stwierdzić czy zastosowane stężenia roztworu
kolchicyny i czasy kolchicynowania były właściwymi. Do dalszych badań w 2015 roku zostaną
wykorzystane dwa diploidalne klony ziemniaka: DW 83-3121 i DW 83-3127, które najlepiej
regenerowały. Niska wydajność proceu kolchicynowania wskazuje na konieczność wprowadzenia
nowych modyfikacji w metodyce. Wprowadzone zostanie 24-godzinne chłodzenie roślin
w temperaturze 4°C, poprzedzające moment nałożenia kolchicyny.
W ramach tematu 3 udało się uzyskać populacje tetraploidalne o odporności pochodzącej
z S. megistacrolobum 4x (Rm) × 4x (Rm) oraz odporności pochodzącej z S. gourlayi 4x (Gm) × 4x
(Gm). Liczba uzyskanych jagód w obu wariantach krzyżowań powinna być wystarczająca do
kontynuowania badań w przyszłym sezonie.
W ramach tematu 4 nie udało się uzyskać populacji interaploidalnej o odporności pochodzącej
z S. tuberosum subsp. andigena 4x (Ns) × 2x (Ns), prawdopodobnie na skutek niedopasowania formy
ojcowskiej 2x do formy matecznej 4x, zaburzeń procesu mikrosporgenezy i rozwoju ziaren pyłku, czy
też niekorzystnego wpływu warunków zewnętrznych. W celu powtórzenia krzyżowań
interploidalnych w przyszłym roku wytypowano 10 nowych diploidalnych form ojcowskich
z genem Ns.
Tytuł zadania: Analiza interakcji genotypowo-środowiskowej w odniesieniu do
wybranych cech użytkowych ziemniaka jadalnego w różnych systemach uprawy.
Kierownik zadania: dr hab. B. Flis prof. IHAR-PIB
Celem badań jest ocena wpływu interakcji genotypowo-środowiskowej na kształtowanie zmienności
wybranych cech jakości istotnych dla ziemniaka jadalnego (smak, wady bulw, ciemnienie miąższu
bulw oraz cech związanych z kształtowaniem się plonu), która powstaje w odpowiedzi na zmieniające
się środowisko uprawy. Analiza interakcji genotypowo-środowiskowej pozwoli na: (a) ocenę udziału
czynników genetycznych, środowiskowych i interakcyjnych w kształtowaniu poszczególnych cech (na
podstawie statystycznej istotności) oraz (b) oszacowanie stopnia stabilności ekspresji cech kulinarnych
78
w ziemniaku jadalnym o zróżnicowanym pochodzeniu (na podstawie statystycznej istotności efektów
interakcji genotypowo-środowiskowej) oraz charakteryzowanie niestabilnej ekspresji.
W 2014 roku celem prac było wyselekcjonowanie klonów tetraploidalnych wyróżniających się
dobrym poziomem cech użytkowych i wybranych cech odpornościowych. Wykonano selekcję
młodych materiałów (linii siewkowych) oraz materiałów starszych, dla wyróżnienia rodów, które
w latach następnych będą badane w doświadczeniach polowych pod kątem cech istotnych dla
ziemniaka jadalnego, tj. smaku, wad bulw, ciemnienia miąższu bulw oraz cech związanych
z kształtowaniem się plonu.
Materiał i metody:
W polu prowadzono 156 klonów ziemniaka, będących pierwszym rozmnożeniem bulwowym (linie
siewkowe). Linie te pochodziły z ośmiu kombinacji krzyżówkowych, w których wykorzystano:
(a) rody własne o dobrych właściwościach kulinarnych oraz wyróżniające się odpornością na wirusy
Y i M ziemniaka, (b) odmiany będące donorami cech jakościowych oraz, w przypadku odmiany Sarpo
Mira, wysokiej odporności na zarazę ziemniaka.
Ponadto prowadzono w polu 60 zaawansowanych klonów tetraploidalnych, które uzyskano
z krzyżowań prowadzonych w następujących grupach (a) rodów/odmian wyróżniających się
odpornością na wirusy i dobrymi właściwościami kulinarnymi (38 form), (b) rodów własnych
odpornych na wirusy z formą diploidalną (7 form pochodzących z krzyżowań interploidalnych) oraz
(c) rodów i odmian odpornych na zarazę ziemniaka (15 form).
Bulwy przeznaczone do sadzenia zostały przetestowane pod kątem porażenia Clavibacter
michiganensis. Linie wysadzono 24 kwietnia na poletkach 15-krzakowych, a klony zaawansowane na
poletkach 30-krzakowych. W trakcie wegetacji: (a) przeprowadzono opis wzrostu i zdrowotności
roślin, (b) wykonano testy na obecność wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (c) z roślin linii
siewkowych pobrano materiał (liście) do izolacji DNA, do badań obecności markerów genetycznych
związanych z odpornością na wirus Y i M ziemniaka oraz (d) przeprowadzono test listkowy oceny
odporności na Phytophthora infestans (dla linii, w których można spodziewać się takiej odporności).
Zbiór bulw przeprowadzono w pierwszej dekadzie września. Przygotowano test plastrowy dla oceny
odporności bulw na P. infestans. Przeprowadzono opis plonu bulw w celu oceny plonu ogólnego
i udziału plonu handlowego, zawartości skrobi oraz morfologii i właściwości kulinarnych bulw.
Wyniki i Dyskusja:
Spośród 156 linii siewkowych wyselekcjonowano 76 form, a pozostałe zostały usunięto ze względu na
słaby wzrost, brak markera genu krańcowej odporności na PVY i/lub wady bulw. Dla wybranych linii
średni plon bulw wyniósł 1,51 kg/krzak, udział plonu handlowego – 92% i zawartość skrobi 14,9%.
Średnie wartości ocen dla wielkości bulw, regularności zarysu bulw i głębokości oczek wyniosły
odpowiednio 6,3, 6,0 i 6,1 (wszystkie oceny w skali 1-9, gdzie 9 to ocena najlepsza). W teście
listkowym średnia ocena dla linii pochodzących od odpornej odmiany Sarpo Mira wyniosła 6,8, a dla
pozostałych linii – 3,3 (w skali 1-9, gdzie 9 to brak porażenia). Przygotowano test plastrowy dla oceny
odporności bulw na P. infestans oraz wykonano badania obecności markera związanego z odpornością
na PVM (markery GP 283 i GP 250).
W grupie 60 rodów zaawansowanych prowadzono selekcję usuwając formy o słabym wzroście lub
wykazujące objawy porażenia wirusami. Łącznie usunięto 20 takich klonów. Oceniane klony
charakteryzują się niższym średnim plonem ogólnym (średni plon 1,16 kg/krzak) i niższym udziałem
plonu handlowego (90%) w stosunku do odmian wzorcowych (odpowiednie wartości wynoszą
1,8 kg/krzak i 94%), ale wyższą zawartością skrobi (badane klony średnio 15,6%, a wzorce 14,3%).
Niższa jest również ocena wielkości bulw klonów (klony ocena 4,3, wzorce – 4,7 w skali 1-9, gdzie
9 oznacza największe bulwy), ale oceny pozostałych cech morfologicznych są na poziomie
obserwowanym w odmianach wzorcowych (ocena dla klonów i odmian 6,1 w skali 1-9, gdzie 9 to
najbardziej regularny zarys lub najpłytsze oczka). Właściwości kulinarne klonów są na poziomie
wyższym (słabsze ciemnienie enzymatyczne nieenzymatyczne w porównaniu do odmian
wzorcowych) lub nieodbiegającym od poziomu odmian wzorcowych (średnia ocena smaku dla
klonów 5,1, a dla wzorców 5,3 w skali 1-9, gdzie 9 to smak najlepszy).
Spośród ocenianych form wyselekcjonowano grupę 28 klonów, dla których średnie wartości
najważniejszych cech wynoszą: (a) plon 1,16 kg/krzak, (b) udział plonu handlowego 90%,
(c) zawartość skrobi 15,6%, (d) regularność zarysu 6,1, (e) smak bulw 5,1 oraz (f) ciemnienie miąższu
bulw gotowanych 6,8.
79
Celem projektu jest określenie jak stabilna jest ekspresja cech użytkowych, w tym właściwości
kulinarnych. Ocena stabilności zostanie przeprowadzona na podstawie serii doświadczeń. Oceny takie
dotyczą stabilności w ujęciu dynamicznym i sprowadzają się do analizy interakcji genotypowo –
środowiskowej za pomocą odpowiednich metod statystycznych dla danych stanowiących kompletną
klasyfikację dwukierunkową, tj. klasyfikację typu genotypy × środowiska. Analiza stabilności
w ujęciu dynamicznym nie nakłada specjalnych warunków na oceniany materiał. Biorąc to pod
uwagę, selekcja form do takich doświadczeń powinna prowadzić do wyboru klonów niewadliwych
pod względem ocenianych cech (zarówno związanych z plennością, jak i cech użytkowych),
zapewniając zarazem pewną ich zmienność.
Przyszłe doświadczenia polowe będą przebiegać w zróżnicowanych systemach uprawy, także takich
z ograniczonymi nakładami. To sprawia, że badany materiał powinien cechować się wysoką
odpornością, szczególnie na zarazę ziemniaka i choroby wirusowe (zwłaszcza na wirus Y ziemniaka).
Wnioski:
W 2014 r. z dwóch grupach materiałów wyselekcjonowano:
a) grupę 76 linii przeznaczonych do dalszej selekcji;
b) grupę 28 rodów odpornych na wirusy i/lub zarazę ziemniaka, charakteryzujących się niewadliwym
poziomem cech użytkowych, wykazujących zróżnicowanie tych cech, co stanowi o ich przydatnych
do doświadczeń polowych w kolejnych latach.
Tytuł zadania: Eliminacja patogenów niekwarantannowych (bakterie endogenne
i wirusy) oraz kontrola zdrowotności roślin ziemniaka w banku in vitro.
Kierownik zadania: inż. D. Sekrecka
Cel projektu:
Głównym celem projektu są prace nad doskonaleniem metod uwalniania roślin ziemniaka od
patogenów niekwarantannowych (bakterie endogenne i wirusy) przy pomocy kultur in vitro.
W 2014 roku w ramach zadania prace badawcze prowadzono w dwóch tematach:
1. Opracowanie metod skutecznego uwalniania od wirusów genotypów wprowadzanych do Banku
Genów in vitro ziemniaka.
Cel tematu:
Głównym celem tematu badawczego było dopracowywanie metod eliminacji wirusów, szczególnie
wirusa S i M ziemniaka z genotypów gromadzonych w Banku Genów in vitro. W temacie
zaplanowano badania nad uwalnianiem roślin od wirusów S i M ziemniaka przy pomocy termo- i/lub
chemioterapii połączonej z izolacją merystemów.
Materiał i metody
Rośliny in vitro i bulwy wybranych 13 genotypów ziemniaka (Solanum tuberosum L.) podzielono na
3 grupy badawcze. I grupę stanowiły rośliny in vitro wysadzone do doniczek i poddane termoterapii.
II grupa to rośliny uzyskane z wysadzonych bulw i również poddane termoterapii. III grupa badawcza
to rośliny in vitro poddane chemioterapii. Rośliny in vitro (I grupa) na przełomie stycznia i lutego
wysadzono do doniczek z substratem torfowym i po 7 dniach umieszczono w fitotronie
w temperaturze 37/330C (dzień/noc), przy oświetleniu ok. 10 W.m2, z zachowaniem 16 godzinnego
fotoperiodu. Od 2.tygodnia trwania termoterapii, co 7 dni pobierano część pąków kątowych
i izolowano merystemy. Rośliny 8 genotypów wyrosłe z bulw (II grupa) poddano termoterapii na
przełomie maja i czerwca z zachowaniem parametrów jak przy grupie I. W 5.tygodniu trwania
termoterapii wyizolowano po 100 merystemów z każdego genotypu. Przed izolacją merystemów
materiał roślinny sterylizowano w 70% etanolu przez 20 sekund, a następnie w 1,5% roztworze
chloraminy przez 15 minut. Z pąków wierzchołkowych i bocznych izolowano merystemy wielkości
ok. 0,3 mm, a następnie umieszczano w zestalonej agarem pożywce MS (Murashige, Skoog, 1962)
z dodatkiem lub bez hormonów wzrostu (kinetyna, giberelina) ewentualnie antymetabolitów
(rybawiryna (RBV) w dawce 10 i 20mg/l; zieleń malachitowa (ZM) w dawce 0,02 i 0,04mg/l).
Wyłożone do probówek merystemy pozostawiono w fitotronie w optymalnych warunkach dla ich
80
wzrostu i rozwoju (16 h w świetle w temperaturze 220C oraz 8 h w ciemności w temperaturze 200C.
Dla stymulacji kiełkujące merystemy sukcesywnie przeszczepiano na świeżą pożywkę. Po 4-8
miesiącach z merystemów uzyskano rośliny in vitro. Rośliny in vitro z III grupy badawczej poddano
działaniu antymetabolitów. Jednowęzłowe fragmenty roślin in vitro umieszczano pojedynczo
w probówkach zawierających 2-3 ml pożywki MS z dodatkiem witamin, glicyny, myo-inozytolu,
hydrolizatu kazeiny, sacharozy i agaru. Odczyn pH pożywki ustalono na poziomie 5,8. Podłoże
rozlewano do probówek szklanych i wyjaławiano w autoklawie z zachowaniem parametrów procesu
sterylizacji (temperatura 1210C, ciśnienie 0,2 MPa i czas 15 minut). Do sterylnej pożywki, przy
pomocy filtrów strzykawkowych dodano ustalone dawki rybawiryny i zieleni malachitowej.
Wszystkie kultury in vitro prowadzono w fitotronie w temperaturze 22-200C, przy 16 godzinnym dniu
i oświetleniu ok. 8 W.m2 przez okres 4-5 tygodni. Co 7 dni analizowano wzrost i rozwój roślin in vitro
tj. stopień ukorzenienia, wysokość roślin, współczynnik rozmnażania. W 4. tygodniu z każdej
kombinacji pobierano po 10 roślin in vitro i wysadzano w szklarni do doniczek z substratem
torfowym. Po kolejnych 4 tygodniach rośliny badano testem DAS ELISA na obecność wirusów.
Doświadczenie wykonano w czterech powtórzeniach każdorazowo pasażując po 30 eksplantatów na
kombinację (2400 testów). Wyniki badań opracowano statystycznie za pomocą analizy wariancji.
Istotność różnic oceniono za pomocą testu Tukey’a przy p=0,05.
Wyniki i dyskusja
I grupa badawcza - Reakcja badanych genotypów na zastosowane pożywki oraz czas trwania
termoterapii była zróżnicowana. Najwięcej roślin uzyskano z merystemów izolowanych w 3 i 4
tygodniu termoterapii (19,0% - 22,1%), znacznie mniej po 5 i 6 tygodniach działania wysoką
temperaturą (9,2%). Z 5 roślin genotypu 1 wyizolowano 245 merystemów, z których wyrosło 18 roślin
in vitro (7,35%). Na tak niski procent uzyskanych roślin wpływ miała wielkość izolowanych
merystemów (ok.0,3mm) oraz ich izolacja na przełomie stycznia i lutego, czyli w okresie mniej
korzystnym dla wzrostu roślin. Wykonano 3-krotną ocenę zdrowotności testem DAS ELISA roślin
in vitro. W wyniku zastosowanej termoterapii i izolacji merystemów uzyskano 27,8% wolnych od
PVS roślin. Dodatek kinetyny i gibereliny do pożywki MS (Murashige, Skoog 1962), na którą
wykładano merystemy nie miał istotnego wpływu na liczbę uzyskanych roślin. Z kolei dodanie do
pożywki antymetabolitów (rybawiryna lub zieleń malachitowa) spowodowało zamieranie
merystemów. Przeprowadzono analizę wariancji danych z doświadczenia dwuczynnikowego,
bezpowtórzeniowego i nie uzyskano istotnych różnic między poziomami zarówno dla badanych roślin
jak i dla zastosowanych pożywek w teście Tukeya (p=0,05).
Termoterapia II grupy - W 5. tygodniu trwania termoterapii z 8 genotypów wyrosłych z bulw-matek
wyizolowano po 100 merystemów wielkości 0,1-0,3 mm. Preparowania merystemów dokonano na
przełomie maja i czerwca i miało to korzystny wpływ na liczbę otrzymanych roślin in vitro. Rośliny
wyrosłe z bulw-matek są znacznie silniejsze i łatwiej znoszą terapię wysokimi temperaturami. Procent
roślin in vitro uzyskanych z wyizolowanych merystemów wynosi średnio 46% (28%-96%).
Przeprowadzono analizę statystyczną otrzymanych wyników (analiza wariancji danych
z doświadczenia dwuczynnikowego, bezpowtórzeniowego), która nie wykazała istotnych różnic
między genotypami jak i bulwami wyjściowymi. Pierwsze rośliny in vitro z merystemów uzyskano po
100 dniach (ok. 20 września) i obecnie są one sukcesywnie poddawane kontroli zdrowotności.
Chemioterapia – III grupa badawcza. Jednowęzłowe fragmenty roślin in vitro umieszczono
pojedynczo w probówkach zawierających 2-3 ml sterylnej pożywki MS do której dodano rybawirynę
(10 i 20 mg/l) albo zieleń malachitową (0,02 i 0,04mg/l). Po 4 tygodniach wzrostu roślin w probówce
zostały one przesadzone do szklarni i przebadane testem DAS ELISA na obecność wirusów S i M
ziemniaka. Wyższa dawka rybawiryny - RBV (20 mg/l) dodana do pożywki miała negatywny wpływ
na wzrost i rozwój roślin in vitro u badanych genotypów. Rośliny in vitro były znacznie słabsze od
roślin kontrolnych i bardzo słabo się korzeniły. W przypadku zastosowanych dawek zieleni
malachitowej (ZM) nie zauważono negatywnego wpływu na wzrost i rozwój roślin in vitro.
Jednocześnie wpływ obu antymetabolitów na eliminację cząstek wirusa S i M ziemniaka z roślin był
niezadawalający. Ród 10 porażony wirusem S ziemniaka pozytywnie zareagował na dodatek do
pożywki zarówno rybawiryny jak i zieleni malachitowej, które wpłynęły na obniżenie poziomu
ekstynkcji wirusa S ziemniaka w roślinach. Przeprowadzona analiza wariancji danych
z doświadczenia 3-czynnikowego, bezpowtórzeniowego dla roślin in vitro porażonych wirusem S
ziemniaka i poddanych chemioterapii wykazała istotne różnice pomiędzy badanymi rodami jak
81
i cyklami badań. Pomiędzy zastosowanymi antymetabolitami nie wykazano istotnych różnic.
W przypadku roślin in vitro porażonych wirusem M ziemniaka i poddanych chemioterapii uzyskano
istotne różnice pomiędzy badanymi genotypami, cyklami badań oraz zastosowanymi
antymetabolitami.
Wnioski:
 Termoterapia roślin powinna być przeprowadzona na przełomie wiosny i wczesnego lata tj.
w okresie korzystnym dla wzrostu roślin.
 Merystemy wyizolowane z wysadzonych roślin in vitro są delikatniejsze i uzyskanie z nich roślin
jest mniej efektywne (ok. 8%).
 Rośliny wyrosłe z bulw-matek są silniejsze i łatwiej znoszą terapię wysokimi temperaturami.
Procent roślin uzyskanych z merystemów jest znacznie wyższy i średnio wynosi 46%.
 Dodatek do pożywki antymetabolitów (rybawiryny i zieleni malachitowej) spowodował zamieranie
wyłożonych merystemów.
 Skuteczność oddziaływania rybawiryny i zieleni malachitowej na wirusy S i M ziemniaka była
niska i tylko w niewielkim stopniu obniżyła ekstynkcję wirusa w roślinie.
2. Badanie preparatów do zwalczania zanieczyszczeń bakteryjnych w kulturach in vitro ziemniaka.
Celem tematu 2 w 2014 roku było przebadanie dwóch dostępnych na rynku preparatów
bakteriobójczych, stosowanych do ograniczania bakterii u innych gatunków roślin, pod kątem
skuteczności zwalczania zanieczyszczeń bakteryjnych w kulturach in vitro ziemniaka bez obawy o ich
fitotoksyczność.
Materiał i metody:
Materiał badawczy stanowiły rośliny in vitro 5 odmian pozyskane z Banku Genów in vitro ziemniaka,
w których stwierdzono zanieczyszczenia bakteryjne. Z preparatów dostępnych na rynku wybrano dwa:
Plant Preservative Mixture (PPMTM) i ProClin 300®. Oba stosowane są efektywnie w kulturach
in vitro innych gatunków roślin, brak jest natomiast informacji na temat zastosowania w kulturach
in vitro ziemniaka.
Plant Preservative Mixture PPMTM jest biocydem o szerokim spektrum działania i polecanym
w hodowli tkanek roślinnych do powszechnego stosowania. Wykorzystywany jest przeciw bakteriom
i grzybom rosnącym w pożywce jak i w zanieczyszczonych tkankach. W zależności od dawki i stopnia
zakażenia może pełnić funkcję składnika biostatycznego jak i środka zapobiegawczego. ProClin 300®
to biocyd oraz konserwant do odczynników stosowanych w diagnostyce in vitro. Przedstawiany jest
jako wysoce efektywny środek z szerokim spektrum aktywności, o doskonałej stabilności a także
niskiej toksyczności. Nie wykazywał fitotoksyczności dla eksplantatów gerbery, chryzantemy, maliny,
jabłoni i hosta (Orlikowska i in.2010).
Jednowęzłowe fragmenty roślin in vitro genotypów zanieczyszczonych bakteriami umieszczono
w probówkach z pożywką MS. Wybrane do badań preparaty dodano do pożywki MS w dawkach
zalecanych przez producenta w 3 stężeniach; PPMTM w stężeniach 0,05; 0,125 i 0,2%, natomiast
ProClin 300 w stężeniach: 0,02; 0,05 i 0,07%. Wszystkie kultury in vitro prowadzono w fitotronie
w temperaturze 20-180C, przy 16 godzinnym dniu i oświetleniu ok. 8 W.m2 przez okres 4 tygodni.
Pierwsze obserwacje kultur wykonano po 3 dniach od wyszczepienia eksplantatów. Oceniano
obecność bakterii na podstawie pojawiającego się zmętnienia pożywki pod eksplantatem. Następnie co
7 dni analizowano wzrost i rozwój roślin in vitro tj. stopień ukorzenienia, wysokość roślin,
współczynnik rozmnażania. Wyniki badań opracowano statystycznie za pomocą analizy wariancji
danych z doświadczenia dwuczynnikowego, bezpowtórzeniowego. Istotność różnic oceniano za
pomocą testu Tukey’a przy p=0,05.
Wyniki i dyskusja:
Reakcja badanych genotypów na zastosowane w pożywce biocydy była bardzo zróżnicowana.
Eksplantaty wyszczepione na pożywkę z PPMTM ładnie rosły i dobrze się korzeniły. W 4 tygodniu
utrzymywania kultur osiągały ok. 8-10 cm a współczynnik rozmnażania, w zależności od genotypu
kształtował się od 5 do 9. Preparat PPM™ w dawce 0,2% dosyć skutecznie wyeliminował bakterie
w kulturach in vitro. Skuteczność ta wynosiła 79-92%. Przy niższych dawkach PPMTM eliminacja
bakterii endogennych była słabsza i wahała się w zakresie 15-80% w zależności od genotypu. Z kolei
eksplantaty wyłożone na pożywkę z ProClin300® już na 2-3 dzień zamierały. W miejscu zetknięcia
fragmentu rośliny z pożywką następowało bielenie łodygi i powolne jej zamieranie. Tylko przy
82
najniższej dawce ProClin300® (0,02%) z kilku fragmentów wyrosły rośliny in vitro, lecz były one
słabsze od roślin kontrolnych. ProClin300® w dawce 0,05 i 0,07% w 100% wyeliminował bakterie
endogenne z kultur in vitro, jednocześnie wykazał silną fitokoksyczność w stosunku do ziemniaka.
Preparat został wybrany do doświadczenia, gdyż w badaniach dla eksplantatów gerbery, chryzantemy,
maliny, jabłoni i hosta nie był toksyczny i był wg Orlikowskiej i in.(2010) bardzo obiecujący.
W stosunku do roślin ziemniaka okazał się bardzo fitotoksyczny i nie może być polecany do
stosowania. Analiza wariancji danych z doświadczenia wykazała istotne różnice pomiędzy
preparatami. Nie wykazano natomiast istotnych różnic pomiędzy ocenianymi genotypami.
Wnioski:
 PPMTM w zależności od zastosowanej dawki ogranicza występowanie zanieczyszczeń bakteryjnych
w 15-92%. Nie wykazuje fitotoksyczności w stosunku do roślin ziemniaka.
 Preparat ProClin300® w kulturach in vitro ziemniaka prawie w 100% skutecznie eliminował
zanieczyszczenia bakteryjne. Wykazuje bardzo wysoką fitotoksyczność i powoduje zamieranie
eksplantatów ziemniaka.
Cytowana literatura:
Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.
Physiol.Plant. 15; 473-479.
Orlikowska T., Sobiczewski P., Zawadzka M., Zenkteler E. 2010. Kontrola i zwalczanie zakażeń
i zanieczyszczeń bakteryjnych w kulturach roślinnych in vitro. Praca przeglądowa Biotechnologia 2(89), 57-71
Prace opublikowane:
Sekrecka D., Michałowska D., Krzewińska A. 2014. Zdrowotność zasobów genowych zgromadzonych
i udostępnianych z Banku Genów in vitro ziemniaka w Boninie. Ziemniak Polski 2, 16-19.
83

badania podstawowe na rzecz postępu biologicznego w produkcji

Transkrypt

Podobne dokumenty

Laboratoria w IEn OTGS w Radomiu

Poradnia Immunologiczna - Centrum Onkologii Ziemi Lubelskiej im

Wyniki badań uzyskane w 2014 roku - IHAR-PIB

Baryt jest wypełniaczem mineralnym wysokiej

selekcja hodowlana odmian odpornych na - IHAR