Ksiąka konferencyjna 2011 (plik do pobrania)

Transkrypt

MIKROBIOLOGIA
w medycynie, przemyśle
i ochronie środowiska
II edycja
Łódź 2011
Książka konferencyjna
Mikrobiologia w Medycynie, Przemyśle i Ochronie Środowiska, II edycja
Organizator
Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii
Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki
ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź
tel.: +42 635 44 63, fax: +42 665 58 18
[email protected], http://biol.uni.lodz.pl/
Współorganizatorzy
Komitet Mikrobiologii Polskiej Akademii Nauk
Polskie Towarzystwo Mikrobiologów
Komitet Organizacyjny
prof. dr hab. Barbara Różalska
mgr Aleksandra Budzyńska
mgr Marcin Grzybowski
mgr Kinga Ostrowska
mgr Małgorzata Paszkiewicz
mgr Karolina Rudnicka
mgr Piotr Szpakowski
mgr Marcin Włodarczyk
studenci zrzeszeni w Sekcji Mikrobiologicznej SKNB UŁ
Komitet Naukowy
prof. dr hab. Wiesława Rudnicka
prof. dr hab. Henryka Długońska
prof. dr hab. Jerzy Długoński
prof. dr hab. Jarosław Dziadek
prof. dr hab. Adam Jaworski
prof. dr hab. Magdalena Mikołajczyk-Chmiela
prof. dr hab. Barbara Różalska
prof. dr hab. Antoni Różalski
Skład i projekt okładki
mgr Marcin Grzybowski
Druk
Drukarnia Uniwersytetu Łódzkiego
2
Podziękowania
Składamy serdeczne wyrazy wdzięczności Sponsorom za wsparcie finansowe, bez którego
niniejsza konferencja nie mogłaby zostać zrealizowana.
Pragniemy podziękować również Patronom Medialnym i Partnerom za profesjonalną współpracę przy promocji konferencji.
Serdecznie Państwu dziękujemy,
Komitet Organizacyjny
Sponsor główny
BRUKER Polska Sp. z o.o.
Sponsor strategiczny
MAXIMUS, Polskie Agarozy
Pozostali sponsorzy
ABE-IPS sp. z o.o.
A.G.A. Analytical
Alab Sp. z o.o.
BIOCORP Polska Sp. z o.o.
GRASO Biotech
PZ HTL S.A.
Olympus Polska sp. z o.o.
PZO Sp. z o.o.
Patronat honorowy
Urząd Marszałkowski w Łodzi
Patroni medialni
Biotechnolog.pl
Biotechnologia.pl
Biolog.pl
Mikrobiolodzy.pl
LAB-ALL.COM
Czasopismo LAB
Laboratorium – Przegląd Ogólnopolski
LSI – Laboratoryjny Serwis Informacyjny
INVESTIN
Kombinatorium
Fundacja Zaawansowanych Technologii
Partnerzy
MERCK
Grafika Multimedia Internet
www.mariuszoracz.pl
3
4
Spis treści
Harmonogram konferencji
6
Streszczenia prezentowanych prac
Sesja I
Nowe metody diagnostyki chorób zakaźnych człowieka
i zwierząt. Metody badawcze
9
Sesja II
Zakażenia bakteryjne, czynniki patogenności drobnoustrojów
oraz nowe metody leczenia zakażeń
29
Sesja III
Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki w biotechnologii
i mikrobiologii środowiskowej
65
Sesja IV
Nowe zagadnienia z zakresu genetyki, biochemii i biologii
molekularnej mikroorganizmów
Alfabetyczny indeks autorów
101
121
5
Harmonogram konferencji
Dzień I (sobota, 22 X 2011)
08.00 – 10.00
10.00 – 10.30
Rejestracja uczestników
Uroczyste otwarcie konferencji
Sesja I
Nowe metody diagnostyki chorób zakaźnych człowieka i zwierząt. Metody badawcze
(prowadzący: prof. Magdalena Mikołajczyk-Chmiela, Bartłomiej Micota)
10.30 – 11.15
Wykład plenarny: Metody immunologiczne w diagnostyce infekcji wirusowych i pasożytniczych, prof. H. Długońska
11.15 – 11.45
Prezentacja firmy BRUKER Polska Sp. z o.o.: MALDI Biotyper – Microbial Identification for the 21st Century, dr Guido Mix
11.45 – 12.15
Przerwa kawowa
12.15 – 12.30
Metoda gradientowo-dyfuzyjna w modyfikacji własnej. Ocena synergizmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych, mgr A. Budzyńska
12.30 – 12.45
Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella sp. w mięsie z zastosowaniem immunoenzymatycznej metody VIDAS® Salmonella Xpress,
mgr inż. W. Chajęcka-Wierzchowska
12.45 – 13.00
OMP-34 – białko błony zewnętrznej Shigella flexneri 3a jako uniwersalny marker diagnostyczny zakażeń pokarmowych, mgr A. Jarząb
13.00 – 13.15
Nowoczesna metoda diagnostyki ukrytego zakażenia wirusa wątroby
typu B, N. Kurantowicz
13.15 – 14.30
Przerwa obiadowa
14.30 – 15.15
Sesja plakatowa (wspólna dla sesji I i II)
Sesja II
Zakażenia bakteryjne, czynniki patogenności drobroustrojów oraz nowe metody leczenia
zakażeń (prowadzący: prof. Henryka Długońska, Artur Ruszczak)
15.15 – 16.00
Wykład plenarny: Patogeneza zakażeń z udziałem biofilmów – możliwości interwencji, dr hab. B. Sadowska
16.00 – 16.30
Przerwa kawowa
16.30 – 16.45
Rola oksydazy cholesterolowej Mycobacterium tuberculosis w infekcji
ludzkich makrofagów prątkami gruźlicy, mgr M. Brzezińska
16.45 – 17.00
Formy morfologiczne H. pylori i ich przypuszczalna rola w transmisji
zakażeń, M. Graczykowski
17.00 – 17.15
Izolacja i charakterystyka środowiskowych bakteriofagów wykazujących
aktywność lityczną wobec wielolekoopornych szczepów Klebsiella sp.,
mgr A. Kęsik-Szeloch
6
17.15 – 17.30
Poszukiwanie zwierzęcego rezerwuaru enterokrwotocznych szczepów
E. coli (EHEC), A. Solecka
17.30 – 17.45
Podsumowanie pierwszego dnia konferencji
20.00
Impreza integracyjna
Dzień II (niedziela, 23 X 2011)
Sesja III
Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki w biotechnologii i mikrobiologii środowiskowej
(prowadzący: dr hab. Katarzyna Lisowska, Adam Janowski)
09.00 – 09.45
Wykład plenarny: Pozytywne i negatywne skutki aktywności degradacyjnej drobnoustrojów w środowisku, prof. J. Długoński
09.45 – 10.15
Przerwa kawowa
10.15 – 10.30
Nanosrebro w kosmetykach i produktach chemii gospodarczej – fakt
czy chwyt marketingowy?, K. Juś
10.30 – 10.45
Wpływ czynników Nod na kiełkowanie i wzrost wyki oraz wydajność
symbiozy w układzie Rhizobium leguminosarum bv. viciae – Vicia villosa cv. Wista, mgr D. Kidaj
10.45 – 11.00
Biosynteza nanocząstek srebra z wykorzystaniem grzybów w warunkach in vitro, mgr A. Ogar
11.00 – 11.15
Zastosowanie wielowarstwowych nanorurek węglowych do ekstrakcji
patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, mgr inż. A. Śliwińska
11.15 – 12.00
Sesja plakatowa (wspólna dla sesji III i IV)
12.00 – 13.15
Przerwa obiadowa
Sesja IV
Nowe zagadnienia z zakresu genetyki, biochemii i biologii molekularnej mikroorganizmów
(prowadzący: dr hab. Paweł Stączek, mgr Aleksandra Strzelczyk)
13.15 – 14.00
Wykład plenarny: Poszukiwania nowych „tarcz” dla leków przeciwdrobnoustrojowych, prof. J. Dziadek
14.00 – 14.15
Kasety DIY – podstawa do konstrukcji nowych narzędzi genetycznych
dla Alphaproteobacteria, mgr M. Adamczuk
14.15 – 14.30
Zastosowanie metody RAPD w oparciu o sekwencje mikrosatelitarne do
różnicowania szczepów M. canis izolowanych od ludzi i zwierząt
w Polsce, mgr J. Dębska
14.30 – 14.45
Charakterystyka mykobakterialnej primazy DnaG jako miejsca docelowego dla nowych leków przeciwgruźliczych, mgr A. Kuroń
14.45 – 15.00
Izolacja aktywności przeciwdrożdżowych i przeciwprątkowych z endosymbiotycznych dla dżdżownicy Dendrobaena veneta bakterii Raoultella ornithinolytica, K. Pernach
15.00 – 15.45
Uroczyste zamknięcie konferencji oraz wręczenie nagród i wyróźnień
7
8
Sesja I
Nowe metody diagnostyki chorób
zakaźnych człowieka i zwierząt.
Metody badawcze
9
10
Wykład plenarny
Metody immunologiczne w diagnostyce infekcji wirusowych i pasożytniczych
Długońska H.
Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki
e-mail: [email protected]
Laboratoryjna diagnostyka chorób wirusowych i pasożytniczych obejmuje szeroką paletę metod, wśród
których bardzo znaczącą rolę odgrywają metody immunologiczne. Metody te mają charakter uniwersalny,
bowiem mogą służyć do wykrywania zarówno czynnika infekcyjnego, jak i produktów wzbudzonej przez
niego nabytej odpowiedzi immunologicznej: humoralnej (swoistych przeciwciał) oraz komórkowej (swoistych limfocytów T). W postępowaniu diagnostycznym wykorzystuje się najczęściej oznaczanie obecności i poziomu swoistych przeciwciał przeciw wirusom oraz pasożytom w surowicy krwi badanej osoby lub
zwierzęcia. Metody te jako pośrednie obarczone są z natury pewnymi ułomnościami, dlatego też interpretacja otrzymanych wyników powinna być rozważna, a zatem wymaga dobrze wykształconego i doświadczonego personelu laboratoryjnego.
Niektóre ze stosowanych obecnie w laboratoriach wirusologicznych i parazytologicznych metod immunodiagnostycznych są używane w prawie niezmienionej formie od kilkudziesięciu lat (np. odczyn
neutralizacji wirusów w diagnostyce wścieklizny czy odczyn cytolizy Sabina-Feldmana w diagnostyce
toksoplazmozy). Inne metody, jak np. liczne techniki immunochromatografii, zostały opracowane i wprowadzone w ostatnich latach. Cieszą się one dużym powodzeniem głównie dlatego, że spełniają kryteria
tzw. szybkiej diagnostyki, w której otrzymuje się na wynik w ciągu kilku-kilkunastu minut.
Idealny test diagnostyczny powinien być nieinwazyjny dla pacjenta, czuły, swoisty, tani, nieuciążliwy
dla diagnostów i szybki. Powinien precyzyjnie odpowiadać na postawione cele badania, wnosząc m.in.
informacje, co do fazy infekcji, profilu wytworzonej odpowiedzi immunologicznej (wskaźnika istnienia lub
braku ochronnej odporności) i skuteczności zastosowanej terapii. Stałe udoskonalanie i wprowadzanie do
praktyki nowych testów świadczy o dążeniu do opracowania metod zbliżonych do ideału.
Wśród różnorodnych metod immunologicznych pierwszoplanowy udział mają techniki immunoenzymatyczne, używane z reguły do wykrywania swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta, rzadziej do wykrywania antygenów wirusów lub pasożytów i rzadko – do wykazania obecności swoistych kompleksów
antygen-przeciwciało. Dominująca w tej grupie metod technika ELISA jest prosta, tania, może być
zastosowana niemal w każdym laboratorium, poddaje się automatyzacji i nadaje do badań przesiewowych, ale wiele testów komercyjnych ELISA odznacza się niezadowalającą czułością i swoistością.
Celem wykładu jest przedstawienie technik immunologicznych na przykładzie diagnostyki kilku wybranych infekcji wirusowych i inwazji pasożytniczych. Metody te mają różną wartość diagnostyczną, dlatego
czasem wymagają łącznego zastosowania, a z pewnością zawsze – krytycznej interpretacji wyników
przez personel laboratorium.
11
Nadesłane streszczenia
I-1 P | Antygeny ESAT-6 i CFP 10 w rozpoznaniu zakażenia Mycobacterium tuberculosis
Borkowska D., Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E.
Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa
Wstęp: Ogromny postęp w dziedzinie genetyki umożliwił otrzymanie w formie rekombinowanej dwóch
specyficznych antygenów prątka gruźlicy ESAT-6 i CFP 10. Białka te kodowane są przez region RD-1
genomu Mycobacterium tuberculosis, którego brak w genomie Mycobacterium bovis BCG i większości
prątków środowiskowych. Nowe metody diagnostyczne umożliwiające rozpoznanie zakażenia prątkiem
gruźlicy oparte są na specyficznych antygenach, dzięki którym możliwe jest wyeliminowanie reakcji
krzyżowej z szczepionką BCG i prątkami niegruźliczymi MOTT. Obecnie na rynku są dostępne dwa,
komercyjne testy IGRA (interferon-γ release assay): QuantiFERON-TbGold i T-SPOT.TB. Cel: Celem
pracy była ocena przydatność diagnostycznej nowego testu IGRA T-SPOT.TB w rozpoznaniu zakażenia
prątkiem gruźlicy. Metody: Zakażenie prątkiem gruźlicy diagnozowano przy użyciu próby tuberkulinowej
i testu T-SPOT.TB wykorzystującego metodę ELISpot. Test IGRA wykonano z krwi obwodowej oceniając
liczbę limfocytów T, które po stymulacji antygenami ESAT-6 i CFP 10 wydzielały IFN-γ. Wyniki:
W badaniach wykazano częściową rozbieżność wyników uzyskanych za pomocą próby tuberkulinowej
i testu IGRA. Niezgodność typu TST(dodatni)/T.SPOT.TB(ujemny) mogła być związana z krzyżową
reakcją ze szczepieniem BCG lub zakażeniem prątkami MOTT. Drugi typ niezgodności TST(ujemny)/TSPOT.TB(dodatni) stwierdzono u pacjentów w podeszłym wieku i złym stanie zdrowia, co mogło być
przyczyną braku reakcji skórnej na tuberkulinę. Stwierdzono, że liczba pozytywnych wyników testów
IGRA wzrastała wraz ze wzrastającą wartością średnicy nacieku odczynu tuberkulinowego. Wnioski:
Zaletą testu T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Wielka Brytania) jest wykorzystanie specyficznych antygenów ESAT-6 i CFP 10 kodowanych przez region RD1 genomu prątka gruźlicy. Dzięki ich zastosowaniu
T-SPOT.TB jest obarczony mniejszym błędem w kierunku rozpoznania zakażenia M. tuberculosis.
W naszej ocenie test IGRA T-SPOT.TB może być stosowany obok próby tuberkulinowej i testu QuantiFERON-TbGold jako test pomocniczy w rozpoznaniu zakażenia prątkiem gruźlicy.
I-2 P/O | Metoda gradientowo-dyfuzyjna w modyfikacji własnej. Ocena synergizmu leków
przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych
Budzyńska A., Różalska B.
Instytut Mikrobiologii, Immunologii i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: W świetle faktu narastania lekooporności grzybów i częstego braku skuteczności wdrożonej
chemioterapii zakażeń, lecznicze wykorzystanie fitozwiązków ma aktualnie coraz większe znaczenie. Ich
poszukiwanie obejmuje identyfikację preparatów o bezpośrednim działaniu grzybobójczym, modulujących
lekooporność lub działających synergistycznie albo addytywnie do klasycznych leków. Zachodzi więc
potrzeba dysponowania prostą metodą skryningową służącą do znalezienia związków naturalnych
o takich pożądanych cechach. Cel: Ocena wrażliwości drożdżaków z rodzaju Candida na wybrane leki
przeciwgrzybicze, w ich połączeniu z olejkami eterycznymi. Ustalenie parametrów metodycznych badania. Metody: Badano synergizm działania worykonazolu oraz flukonazolu z olejkiem geraniowym, goździkowym i ze składnikami olejków: cytronelalem i cytralem, wobec C. albicans ATCC 10231 i C. glabrata
G1 (szczep kliniczny). Fitozwiązki użyto w ich stężeniach subinhibicyjnych - w fazie nielotnej (metoda
rozcieńczeń w agarze Sabouraud’a) i w fazie lotnej (kontrolowana ilościowo mikroatmosfera nad podło12
żem z posiewem powierzchniowym). Synergizm oceniano stosując komercyjny test paskowy MIC Test
Strip (LiofilChem, Włochy). Wyniki: Wykazano przydatność powyższej zmodyfikowanej metody w ocenie
synergizmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych oraz ich składników. Z uwagi na zastosowanie standardowych pasków z gradientem stężeń chemioterapeutyku, zaproponowana metodyka
pozwala w sposób wiarygodny zauważyć nawet niewielką zmianę wartości MIC, odzwierciedlającą efekt
synergizmu. W metodzie rozcieńczeń w agarze, subinhibicyjne stężenie olejku geraniowego spowodowało 20-25 krotny spadek wartości MIC obu leków wobec C. albicans. Podobny stopień redukcji MIC leków
uzyskano w badaniu wrażliwości C. glabrata. Cytronelal i cytral użyte w stężeniach ½ MIC również
działały skutecznie, choć słabiej. Olejki eteryczne/składniki zastosowane w fazie lotnej wykazywały też
działanie synergistyczne - uzyskany efekt był nieco niższy, jednakże znaczący. Wnioski: Zastosowana
metodyka skryningowego badania synergizmu może być równie użyteczna w ocenie skuteczności
połączeń dowolnych antybiotyków, antyseptyków i nowych związków o potencjalnej aktywności wobec
grzybów i bakterii.
I-3 P | Ocena działania wybranych olejków eterycznych, w fazie nielotnej/lotnej, na hodowle
biofilmowe Candida albicans i Staphylococcus aureus. Własne rozwiązania metodyczne
Budzyńska A., Sadowska B., Paszkiewicz M., Różalska B.
Instytut Mikrobiologii, Immunologii i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Z uwagi na znaną wysoką lekooporność biofilmów, wypracowanie standardów alternatywnego
leczenia zakażeń przebiegających z ich udziałem jest wyzwaniem nowoczesnej mikrobiologii i medycyny.
Stąd, wzrasta zainteresowanie badaniem skuteczności bezpośredniej różnych czynników biobójczych
pochodzenia naturalnego lub ich połączeń z antybiotykami. W celu ewaluacji efektu ich działania na
biomasę drobnoustrojów stosuje się różnorodne techniki barwienia - polimeru pozakomórkowego biofilmu
albo samych komórek. Istnieje jednak wciąż potrzeba opracowania nowych lub modyfikacji znanych
testów oceny żywotności biofilmu. Powinny one być dostosowane do charakteru fizyko-chemicznego
badanych związków a jednocześnie oparte o prostą procedurę, minimalizującą ryzyko uszkodzenia
biofilmu podczas barwienia. Cel: Opracowanie testu oceny efektu działania olejków eterycznych na
biofilm bakterii i grzybów. Metody: Na insertach umieszczonych w 24-studzienkowej płytce hodowlanej
zakładano biofilmy S. aureus ATCC 6538 i C. albicans ATCC 10231 (24-godzinne). Następnie poddano
je bezpośredniemu działaniu olejku goździkowego (przez zanurzenie insertu w roztworze olejku) lub
działaniu frakcji lotnej olejku (bez kontaktu bezpośredniego faz). Po 4-ro godzinnej inkubacji, biofilmy
drobnoustrojów na insertach barwiono MTT (ocena ilościowa - odczyt spektrofotometryczny), wyznaczając stężenie powodujące co najmniej 50% redukcję aktywności metabolicznej drobnoustrojów (MBEC 50).
Wyniki: Stwierdzono, że olejek goździkowy, jak również jego lotne składniki, wykazują aktywność
przeciwbiofilmową. MBEC50 fazy płynnej olejku wobec biofilmu S. aureus ATCC 6538 i C. albicans ATCC
10231 utworzonego na membranie insertów wynosiło 31 l ml-1, natomiast aktywność frakcji lotnej - 31 l
ml-1 dla biofilmu S. aureus i 62 l ml-1 dla biofilmu C. albicans. W kolejno wykonanych doświadczeniach
uzyskano wysoką powtarzalność wyników, tym samym uznano opracowaną metodykę za przydatną
w dalszych planowanych badaniach z tego zakresu. Wnioski: Proponowany model oceny in vitro efektywności przeciwbiofilmowej olejków, z zastosowaniem membranowych insertów do płytek hodowlanych,
zapewnia minimalne naruszenie jego integralności podczas badania. Pozwala na łatwe zbadanie aktywności frakcji lotnej tych preparatów, ułatwia ustalenie kinetyki ich działania oraz umożliwia analizę jakościową i ilościową produktów metabolizmu populacji biofilmowej, uwalnianych do podłoża wzrostu.
13
I-4 P/O | Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella sp. w mięsie z zastosowaniem
immunoenzymatycznej metody VIDAS® Salmonella Xpress
Chajęcka-Wierzchowska W., Zadernowska A., Kłębukowska L., Łaniewska-Trokenheim Ł.
Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Wydział Nauki o Żywności,
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Wstęp: Celem przyspieszenia wykrywania drobnoustrojów patogennych w żywności jako alternatywę
czasochłonnych badań opracowuje się nowe szybkie metody. Stosuje się metody hybrydyzacji, reakcje
łańcuchowe polimerazy i wiele metod opartych na reakcjach immunoenzymatycznych m. in. system mini
VIDAS (bioMérieux). Testy VIDAS® Salmonella Xpress (SLMX) opierają się na wykrywaniu w badanej
próbce specyficznych antygenów, wykorzystując reakcję typu ELFA z końcowym odczytem fluorescencji.
Cel: Celem badań było określenie przydatności metody do oznaczania obecności pałeczek Salmonella
sp. w mięsie drobiowym (mimo braku walidacji na tego rodzaju matryce) z wykorzystaniem procedury
opracowanej w laboratorium Katedry Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności. Metody: W badaniu zastosowano wyizolowane z drobiu szczepy Salmonella Typhimurium oraz Salmonella Enteritidis. Materiałem
do badań było mięso drobiu rzeźnego: kaczek, indyków, gęsi oraz kurcząt zakupione w sieci detalicznej.
Mięso kontaminowano pałeczkami, tak aby uzyskać trzy poziomy zanieczyszczenia: wysoki (rzędu 1000
kom/25g), średni (rzędu 100 kom/25g) oraz niski (rzędu 10 kom/25g). Jednocześnie określano tzw.
matrycę produktu oznaczając ogólną liczbę bakterii mezofilnych tlenowych oraz pałeczek z rodziny
Enterobacteriaceae. Po kontaminacji próbek pałeczkami Salmonella, przeprowadzano analizę z użyciem
aparatu mini Vidas i równolegle dalsze etapy badań zgodnie z PN-ISO-6579:2003. Wyniki: Wyniki
zarówno w metodzie hodowlanej jak i przy użyciu aparatu były zależne od rodzaju badanego mięsa oraz
od mikrobiologicznego zanieczyszczenia surowca. Testy zdecydowanie lepiej sprawdzały się dla mięsa
o niższej matrycy tj. mięsa kaczki i gęsi. W pozostałych próbach obecność mikroflory towarzyszącej
stanowiła konkurencję dla wprowadzanych do próbki pałeczek Salmonella. W takich przypadkach aparat
wskazywał na wyniki fałszywie dodatnie. Wnioski: Czas trwania analizy przy użyciu urządzenia miniVIDAS był zdecydowanie krótszy niż w przypadku procedury ISO 6579. Analiza, bez konieczności
wykonywania potwierdzeń zajmowała 20-26 godzin. Badania wykazały 100% czułość testów VIDAS®
Salmonella Xpress (SLMX) dla wszystkich rodzajów badanego mięsa. Względna specyficzność oraz
dokładność metody zależne były od rodzaju badanego mięsa oraz od mikrobiologicznego zanieczyszczenia surowca.
I-5 P | Żywność, jako potencjalne źródło występowania opornych na antybiotyki szczepów
Enterococcus ssp. i Staphylococcus ssp.
Chajęcka-Wierzchowska W.*, Sierpińska M., Łaniewska-Trokenheim Ł.
Wstęp: W ostatnich latach obserwowany jest systematyczny wzrost liczby szczepów opornych na
antybiotyki w otoczeniu człowieka. Podejrzewa się, że żywność może pełnić znaczącą rolę w rozprzestrzenianiu drobnoustrojów opornych. Dotychczas prace z tego zakresu dotyczyły występowania szczepów opornych na antybiotyki w surowcach zarówno pochodzenia zwierzęcego jak i roślinnego. Niewiele
istnieje publikacji dotyczących występowania szczepów opornych na antybiotyki w żywności gotowej do
spożycia. Cel: Celem badań było określenie oporności na antybiotyki szczepów Enterococcus ssp
i Staphylococcus ssp izolowanych z żywności gotowej do bezpośredniego spożycia oferowanej
w sprzedaży detalicznej, spełniającej wymagania jakościowe. Materiał i metody: Próbki żywności: sery
14
dojrzewające, wędliny, ryby po wstępnym namnożeniu na podłożu bulionowym z glukozą, przesiewano
na podłoża: RPF (izolacja Staphylococcus ssp) i Slanetz’a (Enterococcus ssp). Inkubację prowadzono
w temperaturze 37oC przez 24 godz. Oporność na antybiotyki wyizolowanych szczepów określono
zgodnie z wytycznymi NCCLS ( National Committee for Clinical Laboratory Standars). Do określenia
oporności stosowano standardowe podłoże Müellera-Hintona. Antybiogram szczepów z rodzaju Enterococcus ssp. obejmował 16 antybiotyków: penicylinę, ampicylinę, streptomycynę, gentamicynę, tetracyklinę, tigecyklinę, wankomycynę, teikoplaninę, ciprofloksacynę, norfloksacynę, lewofloksacynę, linezolid,
chloramfenikol, rifampicynę, nitrofurantoinę, fosfomycynę, chinupristynę/dalfopristynę. Antybiogram
szczepów z rodzaju Staphylococcus ssp. obejmował 14 antybiotyków: erytromycynę, klindamycynę,
cefoksytynę, norfloksacynę, nitrofurantoinę, trimetoprim/sulfaketoksazol, tetracyklinę, chloramfenikol,
ciprofloksacynę, rifampicylinę, gentamycynę, linezolid, oraz qinaprystynę/dalfoprystynę. Wyniki: Ze 169
próbek żywności pochodzenia zwierzęcego: sery dojrzewające (82 próbki), wędliny (58 próbek), ryby
i wyroby z ryb (29 próbek), wyizolowano 115 szczepów Enterococcus ssp oraz 42 szczepy Staphylococcus ssp. Szczepy z rodzaju Enterococcus ssp. były oporne na tetracykliny (tetracyklina, tigecyklina),
wysokie stężenia aminoglikozydów (szczególnie na streptomycynę), fosfomycynę, rifampicynę oraz
chinupristynę/dalfopristynę. Pojedyńcze szczepy były oporne na linezolid, chloramfenikol, nitrofurantoinę,
rifampicynę i teikoplaninę. Wszystkie badane szczepy były wrażliwe na wankomycynę i ciprofloksacynę.
Szczepy z rodzaju Staphylococcus ssp. były oporne na klindamycynę, cefoksytynę, trimetoprim/sulfaketoksazol, norfloksacynę oraz chloramfenikol. Wśród izolatów wstępowały szczepy wielooporne.
____________________
*Autor
otrzymał stypendium współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
Badania były współfinansowane przez grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (N N312 236138).
I-6 P | Liczebność bakterii z rodzajów Clostridium, Lactobacillus i Enterococcus (typ Firmicutes)
w kale dzieci w wieku od 5 do 14 lat
Gajek A., Lewandowska M.
Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności,
Politechnika Łódzka
e-mail: [email protected], [email protected]
Wstęp: W zespole mikroorganizmów jelitowych zdrowego, dorosłego człowieka dominującymi są gatunki
bakterii należące do typów Firmicutes i Bacteroidetes, które stanowią ponad 90% całej flory jelitowej
człowieka. Skład mikroflory jelitowej zależy od wielu czynników, m.in. wieku, diety, przebytych chorób.
Liczebność bakterii z rodzaju Bifidobacterium oraz Clostridium jest większa w jelitach dzieci niż u dorosłych. Ponieważ 80% bakterii tworzących mikroflorę jelitową to mikroorganizmy niehodowlane, dlatego
obok metod hodowlanych stosuje się metody biologii molekularnej, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Cel pracy: Celem pracy jest zbadanie liczebności bakterii z rodzajów Clostridium,
Lactobacillus i Enterococcus w kale dzieci w wieku 5-14 lat. Metody: Materiałem badanym był kał niemrożony, 48h po pobraniu, pochodzący od 10 zdrowych dzieci w wieku 5-14 lat. Analizę przeprowadzono
metodami hodowlanymi, stosując selektywnie namnażające podłoża: DRCM dla Clostridium, Rogosa dla
Lactobacillus i agar z żółcią, eskuliną i azydkiem dla Enterococcus. Próby kału rozcieńczano w zbuforowanej wodzie peptonowej. Równolegle liczebność bakterii określono metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z wykorzystaniem dwóch sond molekularnych - dla Clostridium (Erec 484) i Lactobacillus-Enterococcus (Lab 158). Wyniki: Liczba Clostridium w kale dzieci w wieku 5-14 lat określona metodami hodowlanymi wynosiła 107-108 jtk/g mokrej masy, natomiast liczba bakterii z rodzajów Lactobacillus
i Enterococcus wynosiła 105-109 jtk/g mokrej masy i nie była zależna od wieku dzieci. Liczba Clostridium
określona metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ była dwa rzędy wielkości wyższa i wynosiła 10915
1010 kom/g mokrej masy kału. Liczba Lactobacillus i Enterococcus określona tą samą metodą wynosiła
1010-1011 kom/g. Również analiza metodą FISH nie wykazała zależności liczebności bakterii od wieku.
Wnioski: U dzieci w grupie 5-14 lat wiek nie wpływa na liczebność bakterii z rodzajów Clostridium,
Lactobacillus i Enterococcus w kale. Metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ pozwala na oznaczenie
od 102 do 105 razy większej liczby bakterii.
I-7 P | Wpływ dezynfektantów na właściwości chemiczne komórek bakterii
Gernand A., Żakowska Z.
Katedra Mikrobiologii Technicznej, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii,
Wstęp: Tworzenie biofilmów jako wynik adhezji komórek do powierzchni jest szeroko opisane oraz
poznane. Nie jest ono jednak dostatecznie wyjaśnione pod kątem zmian zachodzących pod wpływem
używania środków dezynfekcyjnych powszechnych w przemyśle spożywczym. Jedną z przyczyn powstawania biofilmów wg danych literaturowych może być zmienność charakteru chemicznego zewnętrznych struktur powierzchni komórek oraz zmiana powierzchni produkcyjnych wywołana stosowanymi na
co dzień środkami chemicznymi. Cel pracy: Badania maja na celu wyjaśnienie czy środki dezynfekcyjne
o różnym charakterze chemicznym stosowane w przemyśle zmieniają charakter chemiczny zewnętrznych struktur komórkowych, wpływając na proces ich adhezji do polimerowych powierzchni instalacji
produkcyjnych. Metody: W celu zbadania tego zjawiska użyte są środki stosowane w przemyśle browarniczym oraz winiarskim. Badania będą przeprowadzone z użyciem bakterii wyizolowanych z powierzchni
urządzeń produkcyjnych po procesie mycia, które wykazują oporność na stosowane środki chemiczne.
W celu zidentyfikowania tych oddziaływań zbadane zostały komórki bakteryjne pod kątem ich hydrofobowości/hydrofilowości za pomocą metody BATH (bacterial adhesion to hydrocarbons). Wyniki: Komórki
bakterii wyizolowanych ze środowiska produkcyjnego były zbadane za pomocą metody BATH. Metoda ta
wykazała dużą wrażliwość na śladowe ilości środków dezynfekcyjnych zawartych w badanych zawiesinach komórek. Wyniki zebrane za pomocą tej metody są trudne do zinterpretowania. Konieczne jest
zastosowanie alternatywnej metody badawczej dla tego typu oddziaływań. Wnioski: Niezbędna jest
wiedza dotycząca zwilżalności powierzchni komórek, ponieważ ich charakter decyduje o pierwszym
etapie adhezji. Bardziej hydrofobowy charakter będzie sprzyjał tworzeniu się powłoki bakteryjnej, natomiast hydrofilowy charakter nie jest sprzyjający dla tego rodzaju procesu. W późniejszym etapie prac
porównane zostaną właściwości komórek, które nie były wcześniej poddawane wpływowi środków
dezynfekcyjnych z tymi, które zmieniły swój charakter pod wpływem substancji chemicznych i jaki to ma
wpływ na proces adhezji. Badania te pomogą wskazać, jakiego rodzaju środki chemiczne będą bardziej
efektywnie zapobiegać tworzeniu się biofilmów.
I-8 P/O | OMP-34 – białko błony zewnętrznej Shigella flexneri 3a jako uniwersalny marker
diagnostyczny zakażeń pokarmowych
Jarząb A.1, Witkowska D.1, Szostko B.1, Szkudlarek J.1, Hirnle L.2, Gamian A.1
1
2
Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław,
Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich, Wrocław
Wstęp: Gram-ujemne pałeczki należące do rodziny Enterobacteriaceae są jednym z czynników etiologicznych zakażeń pokarmowych, które są przyczyną śmierci 1,9 miliona osób rocznie i pod względem
śmiertelności zajmują trzecie miejsce wśród chorób trapiących ludzi na całym świecie. Ważnym aspek16
tem w zapobieganiu zakażeniom pokarmowym jest nie tylko zachowanie odpowiedniej higieny sanitarnej
i skierowanie uwagi na badania dotyczące nowych leków i skutecznych szczepionek, lecz także opracowanie odpowiednich markerów umożliwiających szybką diagnostykę i monitorowanie zakażeń. Obecnie
nie jest dostępny żaden test diagnostyczny, gwarantujący szybką identyfikację patogenu stanowiącego
czynnik etiologiczny zatrucia, co warunkuje podjęcie skutecznego leczenia. Białko OMP-34 izolowane
z błony zewnętrznej ściany komórkowej pałeczek Shigella flexneri 3a jest brane pod uwagę, jako potencjalny marker diagnostyczny, umożliwiający szybką identyfikację patogenu w próbkach biologicznych.
Cel pracy: Produkcja przeciwciał monoklonalnych skierowanych na epitopy białka OMP-34 znajdujące
się na powierzchni komórki bakterii S. flexneri 3a i wykorzystanie ich do opracowania testu diagnostycznego. Metody: Białka błony zewnętrznej (OMPs) pałeczek S. flexneri 3a wyizolowano przy użyciu
szybkiej i wydajnej metody ekstrakcji z użyciem kwasu walerianowego. Myszy BALB/c immunizowano
trzykrotnie preparatem OMPs w określonych odstępach czasu. Po izolacji komórek śledziony immunizowanej myszy przeprowadzono ich fuzję z komórkami plazmocytoma SP 2/0. Przeszukiwanie biblioteki
uzyskanych klonów przeprowadzono z wykorzystaniem zarówno testu ELISA, w którym jako antygenu do
opłaszczania płytek używano komórek bakteryjnych S. flexneri 3a, a także testu Western blot z wykorzystaniem preparatów białek błony zewnętrznej z różnych gatunków bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae oraz innych gatunków reprezentujących zarówno drobnoustroje Gram-ujemne jak i Gramdodatnie. Wyniki: Badania wykazały, że otrzymane przeciwciało monoklonalne jest skierowane na epitop
białka OMP-34, eksponowany na powierzchni komórki bakteryjnej S. flexneri 3a, z której zostało wyizolowane. Testy dodatkowe pozwoliły na sformułowanie hipotezy, że epitop ten występuje także na powierzchni białek błonowych E. coli, gatunku należącego do rodziny Enterobacteriaceae, blisko spokrewnionego z S. flexneri. Wnioski: Uzyskanie swoistego przeciwciała monoklonalnego, rozpoznającego
unikalne epitopy białek błonowych zlokalizowanych w błonie zewnętrznej bakterii z gatunków należących
do Enterobacteriaceae, co stwarza realne szanse na opracowanie testu umożliwiającego szybką identyfikację tych patogenów w próbkach materiału biologicznego.
I-9 P | Markery stresu oksydacyjnego w osoczu pacjentów ze stwardnieniem rozsianym
Kontek B.1, Kulifer A.1, Miller E.2, Wachowicz B.1
1 Katedra
2 III
Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska,
Szpital Miejski im. K. Jonschera w Łodzi, Oddział Rehabilitacji, Milionowa 14, 93-113 Łódź, Polska
Wstęp: Stwardnienie rozsiane (MS) jest zapalno – demielinizacyjną chorobą ośrodkowego układu nerwowego, która na skutek zniszczenia osłonki mielinowej zaburza komunikację pomiędzy mózgiem a całym
organizmem. Przyczyn upatruje się w czynnikach genetycznych, infekcyjnych, sposobie odżywiania
(dostarczanie egzogennych antyoksydantów) oraz stresie oksydacyjnym towarzyszącym tej chorobie.
Zachwianie równowagi redox i nadprodukcja reaktywnych form tlenu i azotu (RFT i RFA) prowadzi do
zniszczenia kluczowych dla organizmu struktur komórkowych neuronów oraz zaburzeń w przekaźnictwie
sygnałów. Cel pracy: Celem pracy było oznaczenie w osoczu chorych na stwardnienie rozsiane poziomu
biomarkerów stresu oksydacyjnego – peroksydacji lipidów określanych poprzez stężenie związków
reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), 3-nitrotyrozyny (3-NT) oraz grup karbonylowych
w białkach osocza. Metody: Stres oksydacyjny badano poprzez pomiar stężenia grup karbonylowych
w białkach przy zastosowaniu dwóch metod immunoenzymatycznych (testu ELISA i konkurencyjnego
testu ELISA) oraz stężenia produktów peroksydacji lipidów - TBARS w osoczu. Wyniki: Przeprowadzone
badania wykazały, że u chorych na stwardnienie rozsiane ma miejsce podwyższona peroksydacja lipidów
(w porównaniu do poziomu TBARS w osoczu osób zdrowych). Oznaczanie stężenia grup karbonylowych
osocza, wykazało, że w remisyjno-nawracającej postaci stwardnienia rozsianego występuje najwyższe
stężenie grup karbonylowych w białkach osocza. W białkach osocza chorych na stwardnienie rozsiane
17
zanotowano także znaczny wzrost powstawania 3-NT. Wykazano również, że nadtlenoazotyn powoduje
w sposób istotny statystycznie (p < 0,01) zwiększoną karbonylację i nitrowanie białek osocza osób
chorych na MS w porównaniu do osób zdrowych. Wnioski: 1. Przeprowadzone badania potwierdziły
udział stresu oksydacyjnego w powstawaniu zaburzeń jakie występują w poszczególnych postaciach
stwardnienia rozsianego. 2. Dochodzi do oksydacyjno-nitracyjnych modyfikacji białek osocza i peroksydacji lipidów.
____________________
Praca finansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810.
I-10 P | Oznaczanie parametrów stresu oksydacyjnego w osoczu chorych na raka piersi
Kontek B.1, Kędzierska M.1, Sekret J.1, Olas B.1, Wachowicz B.1, Czernek U.2, Szydłowska-Pazera K.2,
Potemski P.2, Piekarski J.3, Jeziorski A.3
1 Katedra
Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska
Chemioterapii Nowotworów Katedry Onkologii, Uniwersytet Medyczny, Wojewódzki Szpital
Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi, Pabianicka 62, 93-513 Łódź, Polska
3 Klinika Chirurgii Onkologicznej Katedry Onkologii, Uniwersytet Medyczny, Wojewódzki Szpital
Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi, Pabianicka 62, 93-513 Łódź, Polska
2 Klinika
Wstęp: Stres oksydacyjny towarzyszy różnorodnym schorzeniom, m.in. chorobom układu krążenia,
nowotworom (rak piersi) czy chorobom neurodegeneracyjnym. Podczas stresu oksydacyjnego dochodzi
do znacznego wzrostu reaktywnych form tlenu (RFT), a to w konsekwencji powoduje zniszczenie kluczowych dla organizmu struktur komórkowych. Niekontrolowany wzrost stężenia RFT inicjuje łańcuchową
reakcję wolnorodnikową, w wyniku której uszkadzane są białka, lipidy, cukrowce jak również kwasy
nukleinowe. Negatywne działanie stresu oksydacyjnego niejednokrotnie wyprzedza zjawiska toksyczności hematologicznej i niehematologicznej u chorych z rakiem piersi. Cel pracy: W niniejszej pracy
określono poziom wybranych biomarkerów stresu oksydacyjnego w osoczu chorych na raka piersi przed
i po zabiegu operacyjnym oraz podczas chemioterapii (doksorubicyna + cyklofosfamid). Uzyskane wyniki
porównano z grupą kontrolną złożoną ze zdrowych kobiet. Metody: Stres oksydacyjny badano poprzez
pomiar stężenia wybranych markerów: grup karbonylowych w białkach osocza metodą ELISA, oraz
produktów peroksydacji lipidów - TBARS w osoczu. Wyniki: Uzyskane wyniki wykazały wzrost (ok. 20%)
poziomu TBARS u kobiet chorych na raka piersi po zabiegu operacyjnym w porównaniu do osób zdrowych. Poziom grup karbonylowych w białkach osocza kobiet chorych na nowotwór piersi po zabiegu
operacyjnym był także wyższy w porównaniu do białek osocza kobiet zdrowych. Wnioski: Otrzymane
wstępne wyniki potwierdzają istnienie stresu oksydacyjnego u kobiet cierpiących na raka piersi. Świadczy
o tym podwyższone stężenie substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym - TBARS oraz poziom
grup karbonylowych w białkach osocza. Stres oksydacyjny jest spotęgowany przez zabieg chirurgiczny
oraz stosowaną chemioterapię.
____________________
I-11 P | Czystość mikrobiologiczna powierzchni użytkowych oraz materiałów biologicznych
Kubala N., Szczęsna E., Stańczyk J., Malinowska M., Stanuch M., Agier J., Ibran J., Mazurczyk M.,
Pali M., Mądrzak K., Micota B., Moryl M., Sadowska B.
Studenckie Koło Naukowe Biologów – Sekcja Mikrobiologiczna, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Przedmioty codziennego użytku mogą być rezerwuarem drobnoustrojów stanowiących zagrożenie dla człowieka. Znane są przypadki ludzi, którzy chwytają klamki jedynie przez chusteczkę. Osoby
18
cierpiące na mizofobię chorobliwie unikają zabrudzenia, często mają przy tym natręctwo kompulsywnego
mycia rąk. Drobnoustroje nie żyją jedynie na powierzchniach sztucznych, ale przede wszystkim na
materiałach biologicznych. Dłonie poprzez ciągły kontakt ze środowiskiem a także sprzyjające warunki na
powierzchni skóry sprawiają, że są one dogodną niszą dla ich bytowania. Cel pracy: W niniejszej pracy
oceniono czystość mikrobiologiczną przedmiotów codziennego użytku. Obliczono także ilość drobnoustrojów na dłoniach biorąc pod uwagę płeć oraz wiek ochotników. Metody: Zarówno powierzchnie jak
i dłonie badano metodą płytek kontaktowych. Powierzchnie użykowe badano płytkami z trzema rodzajami
podłóż tj. Sabourauda w kierunku grzybów, TSA aby wyznaczyć ogólną liczbę bakterii i Chapmana
w kierunku gronkowców. Każdą płytkę trzymano 6 sekund na każdej z powierzchni następnie inkubowano 24h w 37 stopniach Celsjusza. Dłonie ochotników badano płytkami z podłożem TSA przytrzymując
każdą przez 3 sekundy na 3 środkowych palcach. Wyniki: W przypadku powierzchni codziennego użytku
najwięcej drobnoustrojów wyizolowano z klamki w męskiej toalecie. W przypadku dłoni natomiast zaobserwowano duże zróżnicowanie jeżeli chodzi o ogólną liczbę drobnoustrojów. Liczba drobnoustrojów na
dłoniach jest cecha osobniczą i nie zależy ani od wieku ani od płci badanego. Wnioski: Drobnoustroje są
obecne w naszym życiu codziennym, czy to na naszych dłoniach, czy też na powierzchniach, z którymi
się codziennie stykamy. Następuje ciągła wymiana mikroflory pomiędzy środowiskiem nieożywionym
i ożywionym. Obawa przed podaniem ręki czy dotknięciem klamki może wydawać się uzasadniona.
I-12 P | Markery endotoksyny w materiale biologicznym - zastosowanie chromatografii gazowej
sprzężonej z tandemową spektrometrią mas
Kuder P.1, Szponar B.2
1 Politechnika
2 Instytut
Wrocławska, Wydział Chemiczny, kierunek Biotechnologia
Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu
Wstęp: Zastosowanie 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych (3-OH FAs) jako markerów endotoksyny
daje unikalną możliwość analitycznego, ilościowego oznaczania LPSu za pomocą GC-MSMS (chromatografii gazowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas) w próbkach różnego pochodzenia, w tym
biologicznych. Istotą metody jest ilościowe oznaczanie na specyficznych 3-OH FAs – kwasy tłuszczowe
tego typu występują wyłącznie w lipopolisacharydach, u bakterii Gram-ujemnych. Cel pracy: Dostosowanie metodyki oznaczania 3-OH FAs jako ilościowych markerów endotoksyny, do rodzaju badań
i materiału, w którym są one oznaczane, tj. ustalenie warunków rozdziału chromatograficznego i detekcji
w zakresie gradientu temperatur oraz doboru stężenia standardu wewnętrznego. Metody: Analiza
standardów 3-OH FAs (C10-C18) w chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas, za pomocą aparatu TSQ Quantum (Thermo), wyposażonego w kolumnę kapilarną Restek Rxi-5ms oraz detektor
z potrójnym kwadrupolem. Wyniki: Optymalizacja warunków analizy markerów endotoksyny została
osiągnięta, wyniki dla zastosowanych standardów zewnętrznych skorelowano ze stężeniem standardu
wewnętrznego. Wnioski: Wartość diagnostyczną chemicznych markerów endotoksyny wykazano
w posocznicy (na modelu zwierzęcym)1,2 oraz w monitorowaniu bakteriemii/endotoksemii u pacjentów
poddawanych zabiegom kardiochirurgicznym3. Oryginalnym podejściem diagnostycznym było zastosowanie 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych jako markerów zapalenia przyzębia (periodontitis) oznaczanych w ślinie pacjentów4 oraz u chorych cierpiących na przewlekłe zapalenia jelita grubego (inflammatory bowel diseases, IBD), u których profil 3-OH FAs w stolcu okazał się charakterystyczny dla różnych wariantów choroby, ale także wskazywał na korelację między stanem flory jelitowej, określanym
przez profil 3-OH FAs, a stanem klinicznym pacjentów5. Uzyskane wyniki pozwolą na dalsze zastosowania metody, m.in. w ustaleniu wzorca profilu 3-OH FAs bakteryjnego konsorcjum jelitowego u noworodków w celu monitorowania zmian mikroflory w odniesieniu do rozwoju alergii i chorób autoimmunologicznych.
19
I-13 P/O | Nowoczesna metoda diagnostyki ukrytego zakażenia wirusa wątroby typu B
Kurantowicz N.
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Rolnictwa i Biologii, Warszawa
Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Pracownia Biologii Molekularnej Wirusów, Zakład Wirusologii,
Warszawa
Wstęp: Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest niezwykle istotnym i rozpowszechnionym na świecie
patogenem człowieka. Około jedna trzecia ludzkości została zainfekowana HBV, a w Azji i w Afryce
ciągle odnotowywane są epidemie. W Polsce 15-20% ludzi przebyło to zakażenie w przeszłości, a 2%
jest chronicznie chora. Ukryte zakażenie wirusem HB (OBI, ang., occult HBV infection) jest definiowane
obecnie jako: „obecność DNA HBV w wątrobie, przy wykrywalnym lub nie HBV DNA w osoczu, oraz
niewykrywalnym antygenie HBs za pomocą dostępnych metod serologicznych, nie przekraczająca
wartości 200 IU/ml”. OBI jest szczególnym przypadkiem zakażenia HBV, którego reaktywacja może
w skrajnych przypadkach doprowadzić między innymi do marskości wątroby. Cel pracy: Opracowanie
ultraczułej metody diagnostyki OBI przy bardzo niskim stężeniu DNA wirusa za pomocą real-time PCR
z osocza. Metody: Osocze było preinkubowane z buforem zawierającym protezę, a następnie izolowano
z niego DNA w urządzeniu wykorzystującym złoże krzemionkowe (EasyMag, Biomerieux). Detekcja DNA
HBV przeprowadzana była za pomocą real-time PCR (Rotor Gene 3000, Corbett Research). Wyniki:
Otrzymana metoda diagnostyki OBI posiada wysoką czułość detekcji DNA HBV, która wynosi 100% na
poziomie 5 IU/ml i 75% na poziomie 2,5IU/ml. Wnioski: Metoda ta pozwala nam na wykrywanie bardzo
niskich stężeń DNA HBV, z którymi mamy do czynienia w przypadku OBI. Jest to wysoce specyficzny
test diagnostyczny o unikalnej kombinacji sekwencji sondy i primerów zdegenerowanych, która umożliwia
wykrywanie 7 genotypów HIV.
I-14 P | Surowica monowalentna przeciwko mutantowi Rc Yersinia enterocolitica O:3 jako
narzędzie do badania ECA-immunogenności
Rabsztyn K.1,2, Łukasik M.1, Kasperkiewicz K.1, Li C-M.2, Duda K.A.3, Radziejewska-Lebrecht J.1,
Skurnik M.2
1 Department
of Microbiology, University of Silesia, Katowice, Poland
Institute, University of Helsinki, Helsinki, Finland
3 Research Center Borstel, Division of Structural Biochemistry, Borstel, Germany
2 Haartman
Wstęp: Wspólny Enterobakteryjny Antygen (ECA) jest obok lipopolisacharydu (LPS) ważnym składnikiem powierzchniowym błony zewnętrznej bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Sugerowano, że ekspresja ECA w pałeczkach Yersinia enterocolitica O:3 (YeO3) jest regulowana temperaturą. Badania
z wykorzystaniem surowic monowalentnvch bogatych w przeciwciała specyficzne dla ECA, otrzymanych
dla mutantów Rc YeO3 hodowanych w 22°C i 37°C, umożliwiłyby ustalenie zależności ekspresji ECA od
temperatury hodowli pałeczek YeO3. Cel pracy: Usunięcie przeciwciał anty-LPS z poliwalentnych
surowic odpornościowych przeciwko YeO3-c-trs8-R (z 22°C i 37°C) poprzez absorpcję martwymi
i żywymi bakteriami ECA-ujemnymi, celem uzyskania surowic monowalentnvch bogatych w przeciwciała
specyficzne dla ECA. Metody: W pilotowym doświadczeniu do absorpcji użyto bakterie ECA-ujemne,
które gotowano przez 2,5 h. W kolejnej analizie wykorzystano do absorpcji żywe komórki. Nieabsorbowane i dwukrotnie absorbowane surowice analizowano techniką Western blot z preparatem standardowym ECAPG S. Montevideo SH94, preparatami LPSPCP i lizatami komórkowymi szczepów Yersinia enterocolitica O:3 oraz S. Montevideo SH94. Wyniki: Surowicę przeciwko YeO3-c-trs8-R absorbowaną martwymi bakteriami ECA-ujemnymi analizowano techniką Western blot z preparatem standardowym ECA PG
20
i preparatami LPSPCP szczepów Ye75S, Ye75R i YeO3-c-trs8-R. Standard ECAPG silnie reagował
w postaci charakterystycznego dla ECA profilu drabinkowego z nieabsorbowaną surowicą anty-YeO3-ctrs8-R. Dla dwukrotnie absorbowanej surowicy obserwowano słabe immunobarwienie ze standardem
ECAPG. Preparaty LPSPCP wykazały silną reakcję w wysokim i niskim regionie cząsteczkowym zarówno
z surowicą poliwalentną, jak i surowicą absorbowaną. Otrzymane wyniki sugerowały, że zastosowana
metoda absorpcji nie pozwoliła na efektywne usunięcie przeciwciał anty-LPS z badanej surowicy poliwalentnej. Stąd, do kolejnej analizy Western blot wykorzystano surowicę absorbowaną żywymi ECAujemnymi bakteriami. Jako antygenów użyto LPSPCP YeO3-c-trs8-R i lizatów komórkowych szczepów:
YeO3-c-trs8-R, YeO3-c-OCR-ECA, S. Montevideo SH94. Nieabsorbowana surowica anty-YeO3-c-trs8-R
zawierała przeciwciała przeciwko wszystkim w/w antygenom. Surowica absorbowana nie reagowała
z lizatem ECA-ujemnego szczepu, co sugerowało usunięcie przeciwciał anty-LPS z surowicy poliwalentnej. Wnioski: Otrzymane wyniki sugerują, że absorpcja żywymi bakteriami ECA-ujemnymi pozwoliła na
bardziej efektywne usunięcie przeciwciał anty-LPS z poliwalentnej surowicy przeciwko YeO3-c-trs8-R niż
absorpcja martwymi komórkami.
I-15 P | Aktywność β-glukuronidazy i β-glukozydazy Escherichia coli izolowanych z kału ludzi ze
zdiagnozowanymi chorobami jelita grubego oraz ludzi zdrowych
Mroczyńska M.1, Lubudzisz Z.1, Gałęcka M.2, Szachta P.2, Cichy W.3, Roszak D.3
1 Politechnika
Łódzka, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Łódź
Mikroekologii w Poznaniu, Poznań
3 Klinika Gastroenterologii Dziecięcej i Chorób Metabolicznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu
2 Instytut
Wstęp: Nieswoiste zapalenia jelit (IBD, ang.: inflammatory bowel diseases) to choroby, których etiologia
nie została ostatecznie wyjaśniona. Najczęściej występują w postaci choroby Leśniowskiego - Crohna
(ang.: Crohn Diseases) oraz wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (łac.: colitis ulcerosa). Prawdopodobnie istotną rolę w patogenezie choroby odgrywa czynnik mikrobiologiczny, który w połączeniu
z defektem układu immunologicznego i podatnością genetyczną pacjenta przyczynia się do rozwoju
i podtrzymania stanu zapalnego. Nieswoiste choroby zapalne jelit predysponują do rozwoju nowotworów
przewodu pokarmowego. Obecnie około 25 – 40% przypadków IBD diagnozuje się u osób poniżej 20
roku życia i liczba ta ciągle rośnie. U zdrowego człowieka układ jakościowy i ilościowy mikroflory jelitowej
zawiera dominującą przewagę mikroorganizmów korzystnych dla zdrowia. Jednak nadmierna aktywność
enzymów bakterii dominujących w jelicie grubym może doprowadzić do generowania wielu produktów
genotoksycznych, mutagennych i karcynogennych. Cel: Celem badań było określenie aktywności
β-glukuronidazy i β-glukozydazy bakterii Escherichia coli wyizolowanych z kału ludzi ze zdiagnozowanymi nieswoistymi chorobami zapalnymi jelit, w wieku od 3 do 57 lat oraz zdrowych osób, w wieku od
jednego roku do 30 lat. Metody: Analizie poddano 9 izolatów Escherichia coli pochodzących od osób
chorych oraz 30 szczepów wyizolowanych od zdrowych osób. Aktywność enzymów oznaczono spektrofotometrycznie, stosując właściwe substraty do oznaczanych enzymów. Za jednostkę aktywność przyjęto
taką ilość fenoloftaleiny (dla -glukuronidazy) oraz p-nitrofenolu (-glukozydazy) wyrażoną w mM, która
została uwolniona podczas reakcji w czasie 1 godz. w przeliczeniu na mg białka. Wyniki: Badania
dowiodły, że aktywność β-glukuronidazy szczepów Escherichia coli pochodzących od młodych osób
chorych (do 15 roku życia) mieściła się w przedziale 0,047-6,587 mM/h/mg białka, natomiast od zdrowych osób (do 30 roku życia), 0,053-2,589 mM/h/mg białka. Aktywność β-glukozydazy szczepów Escherichia coli wyizolowanych od osób ze zdiagnozowanymi chorobami jelita grubego mieściła się w przedziale 0,001-0,01mM/h/mg białka natomiast aktywność izolatów pochodzących od zdrowych osób
0-0,012mM/h/mg białka. Stwierdzono, że aktywność β-glukozydazy szczepów E.coli wyizolowanych od
ludzi młodych z chorobami jelita grubego była dwukrotnie wyższa od aktywności izolatów uzyskanych od
21
osób zdrowych. Wnioski: Stwierdzono, że aktywność β-glukozydazy szczepów E.coli wyizolowanych od
ludzi młodych z chorobami jelita grubego była dwukrotnie wyższa od aktywności izolatów uzyskanych od
osób zdrowych. Aktywność β-glukuronidazy izolatów pochodzących od ludzi chorych była o 28% wyższa
od aktywności izolatów pochodzących od zdrowych osób.
I-16 P | Ocena obecności genów warunkujących produkcję enterotoksyny niehemolitycznej NHE
u emetycznych szczepów z grupy Bacillus cereus
Seifert K., Bednarczyk-Drąg A., Daczkowska-Kozon E.G., Dąbrowski W.
Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii Stosowanej, Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa,
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie
e-mail: [email protected]; [email protected]
Wstęp: Grupa Bacillus cereus obejmuje sześć gatunków. Są one szeroko rozprzestrzenione w środowisku, w tym w żywności. Jedną z głównych przyczyn wywołujących zatrucia pokarmowe typu biegunkowego na tle B.cereus są enterotoksyny, w tym enterotoksyna niehemolityczna NHE. Budują ją 3 jednostki, a mianowicie NheA, NheB, NheC. Są one kodowane przez geny (odpowiednio) nheA, nheB oraz
nheC. Do wywołania reakcji chorobowej konieczne jest wystąpienie 3 jednostek toksyny jednocześnie.
Dotychczas sądzono, iż ten typ zatruć mogą wywoływać jedynie szczepy enterotoksyczne. Cel: Za cel
pracy postawiono sobie ocenę potencjału emetycznych szczepów B. cereus wyizolowanych z produktów
żywnościowych do produkcji enterotoksyny hehemolitycznej (NHE), tj. oceny występowania genów
kodujących trzy komponenty tej toksyny (nheA, nheB oraz nheC) u grupy wymiotnych bakterii B.cereus.
Metody: Materiał badawczy wyizolowany został z produktów żywnościowych (artykułów zbożowych).
Ekstrakcję bakteryjnego przeprowadzono DNA metodą kolumienkową. Badane szczepy wcześniej
zaklasyfikowano do grupy B.cereus oraz określono ich zdolność do produkcji toksyny emetycznej.
Obecność trzech fragmentów genów oznaczano techniką jakościowej Real-Time PCR. Wyniki weryfikowano analizując profile topnienia amplikonów oraz przy pomocy elektroforezy w żelu agarozowym,
porównując rezultaty z tymi uzyskanymi dla szczepów referencyjnych.Wyniki: Na podstawie przeprowadzonych analiz Real-Time PCR stwierdzono, że 100% badanych szczepów było nośnikami fragmentu
genu nheA oraz nheB, natomiast 87% szczepów posiadało także gen nheC. Należy uznać, iż 87%
przebadanych szczepów wymiotnych miało potencjał wywoływania także zatrucia typu biegunkowego.
Wnioski: Badania wykazały, iż emetyczne szczepy mogą być nośnikami genów kodujących enterotoksynę niehemolityczną NHE. We wszystkich próbach oznaczono jednocześnie obecność fragmentów nheA
oraz nheB, a dodatkowo nheC wystąpił aż w 87% prób. Na podstawie przebadanego materiału stwierdzono łączne występowanie u emetycznych B. cereus genów nheA i nheB, przy obecności lub braku
genu nheC. Stwierdzono zatem, że emetyczne B.cereus posiadają wyższy potencjał chorobotwórczy niż
dotychczas sądzono.
____________________
Badania były finansowane z projektu badawczego MNiSW N N312 234538.
I-17 P | Ocena stanu zdrowia pacjentów z podejrzeniem alergii pokarmowej w kontekście składu
mikroflory jelitowej.
Wróblewska B.1.; Ogrodowczyk A.1, Kaliszewska A.1.; Wasilewska E.1., Zakrzewska M.2
1 Instytut
Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, Polska Akademia Nauk , Olsztyn
Zakład Opieki Zdrowotnej Poradnia Alergologiczna Allergica w Olsztynie
2 Niepubliczny
Wstęp: Badania potwierdzają, że zaburzenia składu mikroflory jelitowej odgrywają kluczową rolę w etiopatogenezie chorób alergicznych. Śluzówka przewodu pokarmowego pozostaje w stałym kontakcie
22
z pożywieniem. Fizjologia układ pokarmowego zapewnia równowagę pomiędzy immunologiczną funkcją
obronną błony śluzowej, a tolerancją ogólnoustrojową. W przebiegu alergii pokarmowej równowaga ta
jest zachwiana. Nie rozwija się wystarczająca tolerancja organizmu na przenikające z pożywieniem do
organizmu alergeny. Potwierdzono, że obecność w diecie bakterii probiotycznych np. Lactobacillus casei
sps. Rhamnosus stymuluje produkcję TGF-beta, hamującego reakcję alergiczną zależną od limfocytów
Th2. Cel: W pracy wykonano analizę porównawczą składu mikroflory jelitowej u osób ze zdiagnozowaną
alergią pokarmową oraz u osób zdrowych w celu oceny obecności w mikrobiocie gatunków bakterii
decydujących o pojawieniu się stanu nadwrażliwości. Metody: Oszacowano częstość występowania
reakcji IgE-zależnych wśród pacjentów zgłaszających się do lekarzy alergologów z podejrzeniem polialergii. Wstępna diagnostyka obejmowała szczegółową ankietę oraz test screeningowy Euroimmun,
pozwalający na prześledzenie obecności przeciwciał IgE skierowanych do 20-27 alergenów podczas
jednej analizy. Wykorzystano również współczesne techniki immunofluorescencyjne, dające możliwość
precyzyjnego pomiaru nawet bardzo nieznacznie podwyższonego poziomu przeciwciał specyficznych
w klasie E (IgE) z wykorzystaniem aparatu ImmunoCAP 100. Na badania uzyskano zgodę Komisji
Bioetycznej UWM w Olsztynie. Następnie wykorzystano standardowe metody posiewowe na podłożach
w celu prześledzenia różnic w składzie mikroflory jelitowej badanych populacji. Wyniki: Badania wykazały, że u wielu pacjentów z objawami wskazującymi na alergię pokarmową, nie stwierdzono podwyższonego miana ogólnej IgE. Problemy zdrowotne mogły być wynikiem podwyższonej specyficznej IgE dla
alergnów wziewnych (trawy mix-gx, brzozy-t3, Dermatophagoides pter-d1 i kota e1). W nielicznych
przypadkach stwierdzono podwyższone IgE (do 3,5 kU/I) na soję –f14, orzechy ziemne-f13 i orzechy
laskowe-f17. Badana mikroflora w zakresie Lactobacilus, Bifidobacterium, enterokoki, enterobakterie oraz
drożdże nie wykazała istotnego zróżnicowania. Wnioski: Diagnoza pacjentów w kierunku obecności
ogólnej i specyficznej IgE wykazała, że w wielu przypadkach alergia jest stwierdzana na podstawie
wywiadu z pacjentem, co nie zawsze jest potwierdzane analitycznie. Wskazuje to na nadinterpretowalność stanu pacjentów w kierunku alergii. Można przypuszczać, że istnieje korelacja pomiędzy składem
mikroflory jelit, a częstością pojawiania się stanu nadwrażliwości np. na alergeny obecne w żywności,
aczkolwiek niezbędne są badania na większej grupie pacjentów.
____________________
Autor otrzymał stypendium współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
I-18 P | Analiza płynu stawowego oraz surowicy krwi żylnej w aspekcie procesów zapalnych
prowadzących do destabilizacji endoprotezy stawu biodrowego
Strzelec-Nowak D., Kozioł-Montewka M., Niedźwiadek J., Bogut A., Sikora A.
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
email: [email protected]
Wstęp: Mimo rozwoju technik operacyjnych oraz różnorodności biomateriałów obluzowanie implantu
stawu biodrowego to nadal główny problem chirurgii ortopedycznej uniemożliwiający prawidłowe funkcjonowanie wszczepu. W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się na poszukiwaniu markerów
pozwalających na szybkie wykrycie oraz zróżnicowanie typu obluzowania. Cel: Celem pracy była mikrobiologiczna oraz immunologiczna ocena płynu stawowego oraz surowicy krwi żylnej u 30 pacjentek
poddanych rewizji z powodu klinicznie stwierdzonego aseptycznego obluzowania implantu stawu biodrowego. Metodyka: Metody badawcze płynu stawowego obejmowały mikroskopową ocenę zawartości
leukocytów oraz procentowego udziału wśród nich granulocytów obojętnochłonnych zestawioną tradycyj23
ną hodowlą bakteriologiczną płynu na podłożach mikrobiologicznych oraz analizą immunoenzymatyczną
zawartości osteoprotegeryny (OPG). Analiza surowicy krwi obejmowała oznaczenie podstawowych
parametrów jak OB, CRP, prokalcytonina, WBC, RBC, białko całkowite a także stężenia OPG. Wyniki:
Podwyższoną ilość leukocytów, w tym granulocytów obojętnochłonnych w płynie stawowym, przewyższającą punkt odcięcia charakterystyczny dla obluzowania septycznego (1,75x10 9 kom/l oraz >65% neutrofili) zaobserwowano u 7 pacjentek zakwalifikowanych do operacji jako obluzowanie aseptyczne. Obluzowanie septyczne u tych pacjentek potwierdzono dodatnią hodowlą bakteriologiczną. Zaobserwowano
również podwyższoną wartość OPG oraz OB u pacjentek septycznych w porównaniu do grupy w której
wynik hodowli był ujemny. Badanie stężenia osteoprotegeryny w surowicy i płynie stawowym wykazała
istotną wartość diagnostyczno-prognostyczną stężeń w płynie stawowym. Wnioski: Płyn stawowy jest
dobrym materiałem do oceny procesów zapalnych toczących się w obrębie implantu w zakresie liczby
leukocytów i stężenia OPG. Pełne różnicowanie obluzowania septycznego od aseptycznego endoprotezy
wymaga kompleksowej analizy materiałów poprzez identyfikację bakteriologiczną, immunologiczną
i molekularną.
I-19 P | Wykorzystanie metod fenotypowych i genotypowych do wykrywania metalo-beta-laktamaz
u szczepów Acinetobacter baumannii opornych na karbapenemy
Szejbach A., Mikucka A.
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy,
Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Wstęp: Pałeczki Acinetobacter baumannii są ważnym czynnikiem etiologicznym zakażeń szpitalnych.
W ostatnich latach obserwuje się wzrost liczby szczepów A. baumannii opornych na karbapenemy.
Oporność na karbapenemy może wynikać m.in. z wytwarzania metalo-beta-laktamaz (MBL) hydrolizujących prawie wszystkie antybiotyki beta-laktamowe. Szczepy A. baumannii wytwarzające MBL stanowią
poważny problem terapeutyczny ze względu na trudności w leczeniu spowodowane opornością na wiele
grup antybiotyków. Cel: W niniejszej pracy dokonano oceny wartości MIC karbapenemów, oceny podobieństwa genetycznego badanych szczepów za pomocą metody PCR-RAPD oraz oceny wytwarzania
MBL z wykorzystaniem różnych metod fenotypowych i techniki PCR. Materiały i metody: Badaniem
objęto 78 szczepów A. baumannii opornych na co najmniej jeden z karbapenemów. Do oceny wrażliwości na karbapenemy zastosowano metodę Etestu (bioMérieux). Do oceny wytwarzania MBL za pomocą
metod fenotypowych użyto krążki z imipenemem (10 µg), meropenemem (10 µg) i ceftazydymem (30
µg), inhibitory MBL - EDTA i kwas 2-merkaptopropionowy (2-MPA) oraz Etest MBL. Do wykrywania MBL
zastosowano także metodę dupleks-PCR. Wyniki: Wśród badanych szczepów 89,7% było opornych na
imipenem, 94,9% na meropenem i 88,5% na doripenem. Przeprowadzona analiza PCR-RAPD wykazała
istnienie 18 wzorów PCR-RAPD, w tym 5 wzorów odmiennych oraz 13 wzorów do których przyporządkowano dwa lub więcej szczepów. Z grupy 18 szczepów rożniących się wzorami PCR-RAPD 66,7%
szczepów było MBL(+) w metodzie z użyciem ceftazydymu, imipenemu oraz meropenemu z EDTA.
W analogicznej metodzie z 2-MPA 88,9% szczepów wykazywało fenotyp MBL(+). W metodzie porównania średnic stref zahamowania wzrostu dla 94,4% szczepów stwierdzono fenotyp MBL(+). W metodzie
Etest MBL stwierdzono 88,9% szczepów MBL(+). Spośród szczepów MBL(+) w metodach fenotypowego
wykrywania MBL u ośmiu szczepów potwierdzono wytwarzanie genów kodujących MBL. U tych 8 szczepów stwierdzono obecność genu blaIMP-1. Wnioski: Wykazanie metodą dupleks-PCR obecności genu
blaIMP-1 u ośmiu szczepów potwierdza, że jest to jeden z głównych mechanizmów oporności na karbapenemy wśród badanych szczepów A. baumannii.
24
I-20 P | Cząsteczka CD14 jako potencjalny biomarker w diagnostyce gruźlicy
Włodarczyk M.1, Druszczyńska M.1, Drobińska-Janiszewska B.2, Zawadzka J.2, Kielnierowski G.2,
Rudnicka W.1
1 Katedra
Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki,
Szpital Gruźlicy, Chorób Płuc i Rehabilitacji w Tuszynie
2 Specjalistyczny
Wstęp: Gruźlica pozostaje wciąż olbrzymim problemem nie tylko w krajach afrykańskich, lecz również
w rozwijających się państwach. Według doniesień WHO 1/3 populacji świata jest zakażona prątkami
Mycobacterium tuberculosis. Rocznie odnotowuje się ok. 2 mln zgonów oraz 9,5 mln nowych przypadków
gruźlicy. Diagnostyka tej choroby opiera się na zdjęciu RTG klatki piersiowej, bakterioskopii, posiewie,
tuberkulinowym teście skórnym oraz zaaprobowanych przez WHO testach interferonowych: Quanti®FERON-TB Gold (Cellestis) oraz TB.SPOT (Oxford Immunotec). Ten szeroki wachlarz narzędzi
w diagnostyce gruźlicy bywa niekiedy zawodny. Wychodząc naprzeciw światowym zapotrzebowaniom
w projekcie podjęto próbę znalezienia immunologicznych parametrów, które mogłyby być pomocne
w diagnozowaniu gruźlicy. Jako pierwsza linia obrony nieswoistej (wrodzonej) monocyty/makrofagi
odbywają kluczową rolę w zakażeniu drobnoustrojami, w tym prątkami gruźlicy. Za pomocą receptorów
PRR (pattern recognition receptors) rozpoznają one konserwatywne struktury drobnoustrojów zwane
PAMP (pathogen associated molecular patterns). Do receptorów tych należy między innymi cząsteczka
CD14. Występuje ona w dwóch formach – rozpuszczalnej (sCD14) w surowicy oraz związanej z błoną
komórkową (mCD14) fagocytów. Receptor ten uczestniczy w rozpoznawaniu wielu ligandów, w tym
lipoarabinomannanu (LAM) M. tuberculosis. Cel pracy: W projekcie oceniono wykorzystanie receptora
CD14 jako markera infekcji prątkami gruźlicy. W tym celu przebadano 165 ochotników szczepionych
BCG: 35 pacjentów z gruźlicą potwierdzoną klasycznymi metodami diagnostycznymi, 40 pacjentów
z innymi niż gruźlica chorobami płuc (zapalenia płuc, nowotwory, POCHP), 50 zdrowych osób pozostających w kontakcie z chorymi na gruźlicę (personel medyczny, rodziny chorych) oraz 40 osób zdrowych,
nie mających kontaktu z chorymi na gruźlicę. Metody: Na monocytach krwi obwodowej analizowano
metodą cytometrii przepływowej ekspresję receptora mCD14. Rozpuszczalny wariant tej molekuły
(sCD14) oznaczono metodą immunoenzymatyczną ELISA (R&D System). Polimorfizm genu cząsteczki
CD14 oceniono techniką PCR. Wyniki: Zaobserwowano znamienny wzrost ekspresji mCD14 (p < 0,003)
oraz podwyższone stężenie sCD14 w surowicy (p < 0,001) pacjentów z aktywną gruźlicą (potwierdzoną
mikrobiologicznie) w porównaniu do osób z pozostałych grup badanych. Nie wykazano korelacji pomiędzy polimorfizmem genu CD14 a ekspresją mCD14 czy poziomem sCD14.Wnioski: Wzmożona ekspresja receptora mCD14 oraz podwyższony poziom surowiczego sCD14 mogą sugerować aktywną postać
gruźlicy.
____________________
Projekt pt. „Doktoranci – Regionalna Inwestycja w Młodych naukowców – Akronim D-RIM” jest współfinansowany przez
Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki,
Priorytet VIII, Poddziałanie 8.2.1.
Praca finansowana ze środków pochodzących z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego o nr N402 098 539.
I-21 P/O | Ocena adhezji mikroorganizmów do nici chirurgicznych, wykonanych z różnych
materiałów
Własak A., Fijałkowski K., Nawrotek P.
Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów, Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej,
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie,Szczecin
Wstęp: Jedną z częstych przyczyn powikłań pooperacyjnych jest zapalenie miejsca cięcia chirurgicznego, spowodowane infekcją bakteryjną lub grzybiczą. Powikłania te przedłużają czas i koszty leczenia
25
pacjenta, a niekiedy powodują nawet jego śmierć. Istotną rolę odgrywa tu adhezja chorobotwórczych
mikroorganizmów, która zależy od właściwości fizycznych i chemicznych nici. Coraz częściej na rynku
medycznym pojawiają się nici chirurgiczne o właściwościach antybakteryjnych z dodatkiem antybiotyków
lub innych środków, których celem jest zminimalizowanie infekcji. Cel pracy: Celem niniejszej pracy było
określenie stopnia adhezji mikroorganizmów chorobotwórczych do powierzchni naturalnych i sztucznych
nici chirurgicznych. Materiał i metody: W badaniu wykorzystano pięć mikroorganizmów testowych:
Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa
oraz Candida albicans. Adhezje badano na różnych typach nici chirurgicznych w rozmiarze 3-0, wykonanych z różnych materiałów (kolagen, nylon, polipropylen, poliglaktyna 910, poliester, polidioxanon, kwas
poliglikolowy, jedwab, politereftalan etylowy oraz nici pokrytej powłoką antybakteryjną). Stopień adhezji
mikroorganizmów ustalono, za pomocą testów redukcji MTT, AlamarBlue, barwienia safraniną a także
przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, (barwienie oranżem akrydyny oraz fluoresceiną). Wyniki:
Zaobserwowano znaczące różnice powinowactwa mikroorganizmów do badanych nici chirurgicznych,
w zależności od rodzaju materiału z jakiego były one wykonane. Badania wykazały, że różny stopień
adhezji mikroorganizmów zależy od parametrów chemicznych i fizycznych nici chirurgicznych oraz
rodzaju mikroorganizmów zastosowanych w teście. Ponadto stwierdzono, iż liczba komórek mikroorganizmów ulegających adhezji, jest zależna od czasu i warunków inkubacji. Wnioski: Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że rodzaj materiału z którego wykonana jest nić chirurgiczna w zasadniczy sposób wpływa na stopień rozwoju flory mikrobiologicznej na jej powierzchni, co może mieć ścisły
związek z liczbą powikłań pooperacyjnych.
I-22 P | Analiza i ocena metod badania adhezji bakterii do powierzchni metalowych o różnym
składzie pierwiastkowym
Żywicka A., Fijałkowski K., Nawrotek P.
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Szczecin
Wstęp: Wiele drobnoustrojów posiada zdolność do adhezji do powierzchni metalowych. We współczesnej
inżynierii coraz częściej poszukuje się stopów metali, które wykazują właściwości antyadhezyjne wobec
mikroorganizmów. Jednakże, badania adhezji na powierzchniach metalowych, ze względu na ich właściwości fizykochemiczne są często utrudnione. Cel pracy: Celem pracy była analiza i ocena metod badania stopnia adhezji bakterii do metalowych powierzchni o różnym składzie pierwiastkowym. Materiał
i metody: Materiał do badań stanowiło 12 płytek metalowych o różnym składzie pierwiastkowym. Adhezja oceniana była po inkubacji bakterii (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, i Acinetobacter baumannii) z badanymi próbami metali. Do oceny stopnia adhezji wykorzystano następujące metody:
test redukcji MTT, test AlamarBlue (test bezpośredni i pośredni), barwienie safraniną oraz posiewy
powierzchniowe po inkubacji prób badanych w roztworze saponiny. Ponadto, ocenę liczebności bakterii
na powierzchni prób dokonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Wyniki: Badania wykazały, że
pierwiastki wchodzące w skład powierzchni metalowych mogą reagować ze składnikami testów AlamarBlue i MTT dając reakcję podobną bądź taką samą jak żywe komórki bakterii. Największą reaktywnością
charakteryzowały się próby, w których skład wchodził cynk. Dodatkowo próby w skład, których wchodził
ten pierwiastek cechowały się wysoką reaktywnością z kwasem octowym wykorzystywanym w teście
barwienia safraniną. Testy MTT i AlamarBlue dawały pozytywne rezultaty tylko w przypadku wykonywania testu pośredniego. Na uzyskiwane wyniki, oprócz składu, wpływ miała również struktura próby – przy
zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego nie było możliwe oznaczenie stopnia adhezji w próbach
o zróżnicowanej powierzchni. Wnioski: Na podstawie badań można stwierdzić, że przy doborze metody
badania adhezji do powierzchni metalowych należy kierować się ich składem, strukturą, zabarwieniem,
26
stopniem utlenialności, wrażliwością na zmiany pH, a także reaktywnością z poszczególnymi składnikami
wykorzystywanych w badaniach testów.
27
28
Sesja II
Zakażenia bakteryjne, czynniki
patogenności drobnoustrojów,
nowe metody leczenia zakażeń
29
30
Wykład plenarny
Patogeneza zakażeń z udziałem biofilmów – możliwości interwencji
Sadowska B., Różalska B.
Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź, Polska
Biofilmy drobnoustrojów – przestrzenne struktury utworzone z mikrokolonii zanurzonych w zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS, ang. extracellular polymer), stanowią jedną z dwóch podstawowych form bytowania mikroorganizmów. Powszechnie występują zarówno w środowisku naturalnym,
jak i w różnych miejscach anatomicznych organizmów wyższych (np. jama ustna, jelita, górne drogi
oddechowe, dolne odcinki układu moczowo-płciowego). Wiadomo, iż populacja biofilmu jako całość
cechuje się wielokrotnie większą opornością na działanie czynników środowiskowych, włączając w to
humoralne i komórkowe mechanizmy układu odpornościowego gospodarza czy terapeutyki stosowane
w leczeniu zakażeń. Wynika to zarówno ze złożonej struktury biofilmu, odmiennej niż w hodowlach
planktonowych ekspresji genów (w tym genów oporności czy genów warunkujących działanie systemów
naprawczych), jak i z heterogenności (głównie metabolicznej) grup drobnoustrojów wchodzących w skład
biofilmu. W obrębie jednej populacji biofilmowej zwykle można wyróżnić komórki aktywne metabolicznie
(szybko rozwijające się), komórki o zahamowanym metabolizmie (wolno rozwijające się) oraz komórki
wykazujące tolerancję w stosunku do wyższych stężeń chemioterapeutyków – określane mianem „persisters”. Tym samym tworzenie biofilmów przez patogeny wydaje się być zjawiskiem niezwykle dla nich
korzystnym i powinno być postrzegane jako najbardziej wyspecjalizowana obronna strategia ich przeżycia w stresogennych warunkach in vivo.
Początkowo osiadłe populacje drobnoustrojów wiązano tylko z zakażeniami towarzyszącymi stosowaniu inwazyjnych technik medycznych z zastosowaniem biomateriałów (cewników, drenów, implantów itp.)
– tzw. BAI (ang. biomaterial-associated infections). Obecnie podłoża biofilmowego upatruje się we
wszelkiego typu trudnych do eradykacji infekcjach o charakterze przewlekłym, nawracającym, jak:
infekcje dolnych dróg oddechowych u osób chorych na mukowiscydozę, przewlekłe zakażenia ran (np.
pooperacyjnych, oparzeniowych, będących następstwem zmian metabolicznych u diabetyków – tzw.
„stopa cukrzycowa”), infekcje otolaryngologiczne, zakażenia układu moczowo-płciowego. Uważa się
również, że tworzenie in vivo biofilmów „patologicznych” może, zwłaszcza na etapie dyspersji (uwalniania
z biofilmu pojedynczych komórek lub ich grup), sprzyjać uogólnieniu się infekcji i rozwojowi sepsy
u zakażonego osobnika.
Specyfika infekcji o podłożu biofilmowym wymusza poszukiwanie nowych strategii leczenia tego typu
zakażeń. Skutecznie udało się zmniejszyć ryzyko wystąpienia BAI przez wprowadzenie nowych technik
zakładania biomateriałów oraz stosowanie rygorystycznych procedur profilaktyki i opieki nad miejscem
ich założenia (ograniczenie dostępu potencjalnie patogennych mikrobiontów lub patogenów pochodzących ze środowiska zewnętrznego). Ważny jest również postęp w metodach modyfikacji samych materiałów, z których produkowane są przyrządy medyczne, tak aby były mniej podatne na zasiedlanie (zmiana
cech fizykochemicznych powierzchni biomateriału, np. zmiana ładunku powierzchniowego, hydrofobowości, opłaszczanie lub włączanie w strukturę czynników antyadhezyjnych, biostatycznych/biobójczych).
Biorąc pod uwagę podwyższoną oporność biofilmów próbuje się również stosować leczenie „pulsacyjne”
zakażeń z ich udziałem (kilka następujących po sobie serii podawania chemioterapeutyków). Jednakże
podstawowym wydaje się zrozumienie mechanizmów powstawania tego typu powikłań, ponieważ tylko
wciąż pogłębiana wiedza na temat fizjologii tworzenia biofilmu i jego małej podatności na eradykację
pozwoli na ustalenie efektywnego sposobu terapii.
31
II-1 P | Escherichia coli – przyjaciela nie należy się bać
Adamczyk M., Gorzkiewicz M.
Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów "Ferment"
Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, Łódź
e-mail: adamczyk_m[email protected], [email protected]
Wstęp: Pałeczka okrężnicy (łac. Escherichia coli) to gram-ujemna bakteria należąca do rodziny Enterobacteriaceae. Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt
stałocieplnych. Uczestniczy w rozkładzie pokarmu i w produkcji witamin z grupy B i K. Pałeczka okrężnicy
w określonych warunkach wykazuje chorobotwórczość dla człowieka, wywołując głównie schorzenia
układu pokarmowego i moczowego. Bakteria ta zawładnęła niedawno mediami w całej Europie. Zdominowała programy informacyjne, wpłynęła ujemnie na sprzedaż warzyw. Czy naprawdę jest się czego
bać? Cel: Plakat jest odpowiedzią na ostatnie doniesienia mediów dotyczące licznych zachorowań
i zgonów wywołanych spożyciem warzyw skażonych zmutowanym szczepem E.coli. Jego głównym
celem jest wnikliwa charakterystyka bakterii oraz przedstawienie sposobów profilaktyki i leczenia chorób
przez nią wywoływanych. Charakterystyka: Escherichia coli jest względnie tlenową pałeczką o długości
około 2 μm i średnicy około 0,8 μm. Wewnątrz komórki tej bakterii znajduje się 1-4 identycznych łańcuchów DNA (w zależności od aktywności podziałowej) oraz do 30.000 rybosomów. Ważne klinicznie geny
oporności zlokalizowane są na plazmidach, co sprzyja ich poziomemu przekazywaniu. Podział komórek
w sprzyjających warunkach trwa około 20 minut. Pałeczka okrężnicy ginie po 20 minutach ogrzewania
w temperaturze 60°C, jest wrażliwa na dezynfektanty. Wykorzystanie i znaczenie: E. coli należy do
organizmów modelowych. Jej budowa i metabolizm są bardzo dobrze poznane, dzięki czemu pałeczka
okrężnicy jest powszechnie wykorzystywana w badaniach genetycznych. Dzięki E. coli zrozumiano takie
procesy replikacja DNA czy regulacja transkrypcji. Bakteria ta znalazła również zastosowanie w modyfikacjach genetycznych do celów przemysłowych, na przykład do produkcji ludzkiego hormonu – insuliny.
Chorobotwórczość: Bakterie E. coli, nieszkodliwe w jelicie, mogą powodować liczne schorzenia, takie
jak: zakażenia dróg moczowych, zapalenia opon mózgowych u noworodków, zatrucia pokarmowe,
zapalenia płuc czy sepsa. Profilaktyka: Pomimo licznych chorób wywoływanych przez E.coli i często
ciężkiego ich przebiegu, można stosunkowo łatwo się przed nimi obronić. Profilaktyka opiera się głównie
na utrzymywaniu czystości (np. mycie rąk), oddzielaniu ugotowanej żywności od surowej, utrzymywaniu
żywności w odpowiedniej temperaturze i korzystaniu z bezpiecznej wody.
II-2 P | Zjawisko apoptozy granulocytów i limfocytów krwi obwodowej królików zakażonych
wirusem RHD (Rabbit Haemorrhagic Disease)
Adamiak M., Kubiś M., Trzeciak-Ryczek A., Działo J., Tokarz-Deptuła B.
Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet Szczeciński
email: [email protected]
Wstęp: Wirus RHD jest etiologicznym czynnikiem wysoce zakaźnej krwotocznej choroby królików VHD
(viral haemorrhagic disease), w Polsce zwanej pomorem królików. Wśród elementów patogennego
działania RHDV wymienia się między innymi jego zdolność do indukcji apoptozy komórek układu odpornościowego gospodarza. Jak dotychczas badania dotyczące wirusa RHD, wykazały aktywność kaspaz
powodującą indukcję apoptozy granulocytów i limfocytów po zakażeniu królików niehemaglutynogennym
szczepem BS89, Vt97, Pv97, Triptis, Hagenow, Frankfurt, Hartmannsdorf, Rainham, 9905 i Asturias tego
wirusa. Cel pracy: Ocena zjawiska apoptozy granulocytów i limfocytów we krwi obwodowej królików
32
eksperymentalnie zakażonych węgierskimi szczepami (24V/89 i 1147V/94) RHDV. Metody: Detekcję
aktywności ogólnej puli kaspaz: 1,2,3,4,5,6,7,8 i 9 w granulocytach i limfocytach krwi królików wykonano
metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem zestawu odczynników FAM Caspase Activity Kit
w godzinach 0,8,12,24 i 36 po zakażeniu królików RHDV. Wyniki: W zakresie % apoptycznych granulocytów, wartości dla szczepu 24V/89 wynosiły od 19,40 do 93,70, a ich dynamika wykazała wyraźną
tendencję wzrostową przez cały okres badania, istotny statystycznie wzrost zarejestrowano w 12 i 24h po
zakażeniu królików RHDV. Natomiast dla szczepu 1147V/94, wartość % apoptycznych granulocytów
oscylowała między 14,65 a 73,30 i manifestowała się tendencją wzrostową, a statystycznie istotny wzrost
występował w 8 i 12h badania. W zakresie % apoptycznych limfocytów wartości dla szczepu 24V/89
wahały się między 20,58 a 51,96 i wykazywały głównie tendencję wzrostową w godzinach od 8 do 24
w której zarejestrowano spadek wartości tych komórek, zaś dla szczepu 1147V/94 wynosiły one od 25,48
do 65,08, z wyraźną tendencją wzrostową od 12 do 24h badań. Podsumowanie: Zakażenie królików
dwoma szczepami węgierskimi wirusa RHD (24V/89 i 1147V/94) powoduje włączenie apoptozy tak
w granulocytach jak i w limfocytach, z tym że przy szczepie 24V/89 zjawisko to jest intensywniejsze
w granulocytach, a przy szczepie 1147V/94 w limfocytach. Obraz tych zmian wskazuje, że włączenie
i trwanie apoptozy w granulocytach i limfocytach jest związane z rodzajem szczepu wirusa RHD.
II-3 P | Rola cholesterolu w makrofagach ludzkich w pochłanianiu Mycobacterium tuberculosis
Blus E., Klink M., Brzostek A., Kiełbik M., Sułowska Z., Dziadek J.
Instytut Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk
Wstęp: Prątki gruźlicy, oprócz wiązania się ze specyficznymi receptorami makrofagów, mogą również
oddziaływać ze zlokalizowanym w błonie komórkowej cholesterolem. Uważa się zatem, że cholesterol
może odgrywać ważną rolę we wnikaniu mykobakterii do makrofagów oraz w procesie dojrzewania
fagosomu. Kluczowym enzymem bakteryjnym biorącym udział w metabolizmie cholesterolu jest oksydaza cholesterolowa (ChoD). Cel: Celem pracy była ocena czy usunięcie cholesterolu z makrofagów
osłabia zdolność fagocytów do pochłaniana Mycobacterium tuberculosis (Mtb) szczepu dzikiego H37Rv
(MtbH37Rv) i szczepu pozbawionego funkcjonalnego genu kodującego ChoD (Mtb∆ChoD). Oceniano
również, czy cholesterol bierze udział we wnikaniu prątków gruźlicy do makrofagów spoczynkowych
(początkowa faza infekcji) czy makrofagów aktywowanych interferonem-γ - INF-γ (chroniczna faza
infekcji). Metody: Komórki ludzkiej linii monocytarno-makrofagowej (THP1) różnicowano do makrofagów
stymulując je PMA, a następnie aktywowano lub nie IFN-γ. Z aktywowanych i nieaktywowanych makrofagów usuwano cholesterol przy użyciu β-cyklodekstryny. Szczep M. tuberculosis ∆ChoD, bez funkcjonalnego genu kodującego ChoD, uzyskano metodą inaktywacji genu opartą na rekombinacji homologicznej. Oceniano zdolność makrofagów pozbawionych cholesterolu do pochłaniania nieopsonizowanych
i opsonizowanych ludzką surowicą AB prątków: MtbH37Rv i Mtb∆ChoD. Wyniki: Usunięcie z makrofagów 80% cholesterolu wymaga 4-godzinnej inkubacji fagocytów z β-cyklodekstryną. Wykazano, że
pozbawienie makrofagów cholesterolu nie wpływa na ich aktywność metaboliczną, co oceniono testem
redukcji MTT. Nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w odsetku aktywowanych i nieaktywowanych makrofagów pochłaniających MtbH37Rv i Mtb∆ChoD, odpowiednio, z i bez cholesterolu. Podobnie liczba pochłanianych prątków obu szczepów przez badane makrofagi była zbliżona. Wniosek:
Uzyskane wyniki nie potwierdziły doniesień literaturowych odnośnie istotnej roli cholesterolu w pochłanianiu M. tuberculosis.
____________________
Źródła finansowania: „Badania mechanizmów molekularnych na styku organizm ludzki – patogen – czynniki środowiska”
(InterMolMed), POIG.01.01.02-10-107/09.
33
II-4 P | Proteomiczna identyfikacja czynników wirulencji bakterii z rodzaju Staphylococcus
Bonar E., Władyka B., Dubin A.
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński
Wstęp: Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) to groźny, oportunistyczny patogen, wykazujący
ogromne fenotypowe i genotypowe zróżnicowanie, szczególną wirulencję i gwałtownie rosnącą lekooporność stanowiącą poważne zagrożenie zakażeń i chorób jego gospodarzy - ludzi i zwierząt. Oddziaływanie patogennych bakterii na organizm gospodarza, kolonizacja i chorobotwórczość zachodzi poprzez tzw.
specyficzne czynniki wirulencji zlokalizowane na powierzchni komórek bakteryjnych lub wydzielane poza
komórkę do środowiska. Jak dotąd podjęto niewiele prób identyfikacji czynników wirulencji i charakterystyki roli składowych proteomu i jego zmian w procesie kolonizacji i wirulencji. Cel pracy: Założonym
zadaniem jest poznanie zewnątrzkomórkowego proteomu wybranych szczepów S. aureus w celu
porównania ekspresji białek wydzielniczych szczepów bakterii scharakteryzowanych pod względem
genotypowym i fenotypowym, wirulentnych i komensalnych oraz identyfikacja białkowych, gronkowcowych potencjalnych czynników odpowiedzialnych za właściwości wirulentne szczepu. Metody: Techniką
elektroforezy dwuwymiarowej zobrazowano zewnątrzkomórkowy proteom wybranych szczepów
S. aureus i wykonano analizę porównawczą profili białek. W porównywane pary dobierano szczepy
o możliwie najbardziej podobnym i scharakteryzowanym genotypie, częściowo scharakteryzowane
fenotypowo, ale różniące się wirulencją w modelu doświadczalnym. Różnicujące białka w porównywanych parach poddano analizie techniką spektrometrii mas. Wyniki: Otrzymane elektroforogramy wykazały zróżnicowanie wydzielniczego profilu białkowego badanych szczepów. Analiza jakościowych i ilościowych różnic produkowanych białek pozwoliła zidentyfikować białka o udokumentowanej roli w wirulencji
gronkowców jak również wskazała nowych kandydatów mogących mieć udział w tym procesie. Wnioski:
Wirulentny lub niewirulentny fenotyp gronkowca odzwierciedla się w profilu proteomu zewnątrzkomórkowego. Wyniki prowadzonych badań mogą stanowić pierwszy krok na drodze poznania koniecznych
i wystarczających białkowych efektorów determinujących wirulencję szczepów S. aureus.
____________________
Badania częściowo finansowane z projektu: N N303 813340.
II-5 P/O | Rola oksydazy cholesterolowej Mycobacterium tuberculosis w infekcji ludzkich
makrofagów prątkami gruźlicy
Brzezińska M., Klink M., Brzostek A., Kiełbik M., Szulc I., Sułowska Z., Dziadek J.
Wstęp: Prątki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis) metabolizując cholesterol obecny w komórkach
gospodarza mogą wykorzystywać go jako źródło węgla i energii. Istnieją również przesłanki, iż cholesterol ułatwia zakażenie makrofagów przez prątki w infekcji pierwotnej. Kluczowym enzymem bakteryjnym
biorącym udział w metabolizmie cholesterolu jest oksydaza cholesterolowa (ChoD). Cel pracy: Celem
pracy była ocena czy szczep M. tuberculosis H37Rv ze zinaktywowanym genem kodującym ChoD różni
się w zdolności do infekcji makrofagów ludzkich w porównaniu do szczepu dzikiego H37Rv. Metody:
Szczep M. tuberculosis ∆ChoD, bez funkcjonalnego genu kodującego ChoD, uzyskano metodą inaktywacji genu opartą na rekombinacji homologicznej. Oceniano zdolność do fagocytozy i wewnątrzkomórkowego zabijania prątków H37Rv i mutanta ∆ChoD (nieopsonizowanych lub opsonizowanych ludzką
surowicą AB) przez nieaktywowane lub aktywowane interferonem-γ makrofagi ludzkiej linii THP1. Oceniano również produkcję tlenku azotu (NO), reaktywnych form tlenu (RFT) i czynnika martwicy nowotworu
(TNF-α) przez makrofagi zakażone badanymi prątkami gruźlicy. Wyniki: Nie zaobserwowano różnic
34
w liczbie pochłoniętych prątków gruźlicy mutanta ∆ChoD i szczepu dzikiego H37Rv przez aktywowane
i nieaktywowane makrofagi. Aktywność bójcza aktywowanych makrofagów w stosunku do szczepu
dzikiego i jego mutanta była podobna. Zaobserwowano natomiast, że nieopsonizowany mutant ∆ChoD
jest efektywniej zabijany przez makrofagi nieaktywowane w porównaniu do nieopsonizowanego szczepu
dzikiego. Aktywowane makrofagi produkują zbliżone ilości NO w odpowiedzi na zakażenie opsonizowanym i nieopsonizowanym szczepem dzikim i mutantem ∆ChoD. Jedynie nieopsonizowany mutant
∆ChoD pobudza nieaktywowane makrofagi do produkcji NO. Wykazano, że szczepy H37Rv i ∆ChoD
podobnie hamują produkcję RFT w aktywowanych makrofagach. Nieopsonizowany mutant ∆ChoD
znamiennie słabiej hamuje produkcję RFT przez nieaktywowane makrofagi w porównaniu do nieopsonizowanego szczepu dzikiego. Nie zaobserwowano różnic w zdolności aktywowanych makrofagów do
produkcji TNF-α w odpowiedzi na zakażenie obydwoma szczepami. Wnioski: Uzyskane wyniki sugerują,
że pozbawienie M. tuberculosis funkcjonalnego genu kodującego ChoD osłabia zdolność tej bakterii do
infekcji nieaktywowanych makrofagów.
____________________
Źródła finansowania: „Badania mechanizmów molekularnych na styku organizm ludzki – patogen – czynniki środowiska”
(InterMolMed), POIG.01.01.02-10-107/09.
II-6 P | Aktywność biologiczna nowosyntezowanych związków z grupy α-metylideno--laktonów
Budzyńska A.1, Więckowska-Szakiel M.1, Modranka J.2, Janecki T. 2, Różalski M. 3, Krajewska U. 3,
Różalska B. 1
1 Instytut
Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki
Chemii Organicznej, Politechnika Łódzka
3 Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
2 Instytut
Wstęp: Grupa α-metylideno--laktonów, do których należą badane preparaty, zawiera w strukturze
aktywny biologicznie fragment α,β-nienasyconego związku karbonylowego. Substancje o takiej budowie
występują naturalnie w roślinach jako ich metabolity wtórne o aktywności fitoaleksyn (są to np. seskwiterpeny – wernolepina i wernomenina). Znane są liczne właściwości lecznicze tego typu związków: np.
przeciwnowotworowe, przeciwzapalne i przeciwdrobnoustrojowe. Są więc one ciekawym obiektem
badań, stanowiąc wzorzec do syntezy pochodnych o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym. Cel:
Ocena aktywności biologicznej dwu nowosyntezowanych związków z grupy α-metylideno--laktonów
(Modranka i wsp. 2011). Metody: Badane preparaty: 1-butylo-2-metylideno-1H-benzo[f]chromen-3(2H)on (1) i 4-butylo-7-metoksy-3-metylidenochroman-2-on (2); mikroorganizmy docelowe – S. aureus ATCC
6538, kliniczne szczepy S. aureus o fenotypie MRSA (D5, A7, A3), E. faecalis ATCC 29212, E. coli
NCTC 8196, P. aeruginosa NCTC 6749 oraz C. albicans ATCC 10231. Aktywność biostatyczną (MIC)
i biobójczą (MBC) związków badano metodą mikrorozcieńczeń w bulionie (wg rekomendacji CLSI).
Działanie cytotoksyczne związków wobec linii komórek nowotworowych - białaczek ludzkich HL-60
i NALM-6 oraz wobec prawidłowych komórek śródbłonka naczyń krwionośnych - HUVEC, badano testem
redukcji MTT i wyrażano jako współczynnik IC50. Wyniki: Wykazano wysoką aktywność obu związków
wobec bakterii Gram(+) - zakres MIC (1): 3,125-25,0 µg/ml (11,7-93,9 µM), (2): 50,0-200,0 µg/ml (203,0812 µM.). Bakterie Gram(-) i grzyby wykazywały oporność na ich działanie (MIC>400 µg/ml). Związek (1)
działał bakteriostatycznie i bakteriobójczo zarówno na gronkowce MSSA, jak i MRSA (MBC ≥ MIC 2xMIC). Udokumentowano względnie wysoką aktywność cytotoksyczną związku (1) wobec linii komórek
białaczki HL-60 (IC50 wynosił 0,72±0,04 µM) i nieco niższą wobec pozostałych linii (NALM-6 - 2,10±0,03
µM i HUVEC - 3,83±0,27 µM). Wartości IC50 w przypadku (2) wynosiły: 5,39±1,0 µM (HL-60), 6,16±1,15
µM (NALM-6) i 5,10±0,52 µM (HUVEC). Wnioski: Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, iż te nowosyntezowane związki z grupy α-metylideno--laktonów są obiecujące terapeutycznie
35
z uwagi na wysoką aktywność cytotoksyczną wobec komórek nowotworowych i znaczącą skuteczność
przeciwbakteryjną. W kontekście działania przeciwdrobnoustrojowego ważny jest fakt ich działania
bójczego na wielolekooporne szczepy gronkowców MRSA. Mogą być więc rozważane jako potencjalne
produkty terapeutyczne, być może wspomagające działanie antybiotyków. Obecność bardziej rozbudowanego fragmentu aromatycznego związku (1) i prawdopodobnie wyższa lipofilowość tłumaczyć może
jego większą aktywność biologiczną, zarówno w stosunku do mikroorganizmów, jak i do komórek eukariotycznych.
II-7 P | Skryning mikrobiologiczny olejków eterycznych i ich składników
Budzyńska A., Gibus D., Nowak M., Różalska B.
Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Wzrastająca oporność bakterii i grzybów chorobotwórczych dla człowieka na obecnie stosowane
leki sprawia, iż coraz bardziej pilne jest poszukiwanie nowych opcji terapeutycznych. Jedną z nich może
być próba zastosowania olejków eterycznych - naturalnych związków obronnych wytwarzanych przez
rośliny aromatyczne. Ich przydatność w leczeniu przewlekłych zakażeń ran i owrzodzeń, może stać się
nieoceniona. Biorąc pod uwagę, iż terpeny olejków eterycznych wykazują szeroki zakres aktywności
biologicznej, to oprócz efektów przeciwdrobnoustrojowych, można oczekiwać też ich działania przeciwzapalnego i przeciwbólowego. Cel: Ocena aktywności 15 wybranych komercyjnych olejków eterycznych
i 10 składników wobec przedstawicieli 3 grup drobnoustrojów. Metody: Mikroorganizmy docelowe:
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli NCTC 8196, Candida albicans ATCC 10231. Olejki
z: Lavandula angustifolia, Melaleuca alternifolia, Citrus limon, Cymbopogon citratus, Pimpinella anisum,
Pelargonium graveolens, Eugenia caryophyllata, Hyssopus officinalis, Pinus sylvestris, Melissa officinalis,
Mentha piperita, Anthemis nobilis, Thymus vulgaris, Ribes nigrum, Rosmarinus officinalis; składniki:
linalol, octan linalylu, alfa-terpineol, terpinen-4-ol, 1,8- cyneol, cytronelal, cytral, alfa-pinen, alfa/beta-tujon
oraz tymol. Wartość MIC/MBC ustalono zgodnie z rekomendacjami CLSI posługując się standardową
metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, w modyfikacji własnej. Wyniki i Wnioski: Badania wykazały
skuteczność wszystkich olejków eterycznych oraz ich składników wobec zarówno bakterii, jak i grzybów
Candida, chociaż aktywność tych preparatów była zróżnicowana. Większość badanych olejków/składników działała bójczo w stężeniu nie przekraczającym powszechnie przyjętego kryterium
wartości - nie większej niż 4xMIC. Najsilniejszą aktywność bakteriostatyczną i zarazem bójczą wykazały
olejki: geraniowy, cytronelowy i z mięty pieprzowej (zakres stężeń 0,024 - 0,19% v/v) oraz alfa-terpineol
i cytral (zakres stężeń 0,048% - 0,78% v/v). Bakterie Gram-dodatnie S. aureus ATCC 6538 i przedstawiciel grzybów drożdżopodobnych C. albicans ATCC 10231 były bardziej wrażliwe niż Gram-ujemne E. coli
NCTC 8196. Uzyskane wyniki zachęcają do prowadzenia dalszych badań nad działaniem najbardziej
aktywnych olejków eterycznych, z uwzględnieniem większej grupy bakterii oraz grzybów izolowanych
z materiałów klinicznych i wykazujących różny fenotyp wrażliwości na konwencjonalne chemioterapeutyki. Można sądzić, iż zastosowanie w przyszłości olejków/składników w pomocniczej terapii zakażeń
grzybiczych lub bakteryjnych oraz zakażeń o etiologii mieszanej - grzybowo-bakteryjnej, przyniesie
spodziewany efekt leczniczy.
36
II-8 P | Aktywność wybranych olejków eterycznych wobec klinicznych izolatów Candida spp.
Budzyńska A.1, Lipowczan G.2, Nowak M. 1, Gibus D. 1, Macura A.3, Różalska B. 1
1 Instytut
Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki
Pracownia Mikologii, Szpital im. Biegańskiego w Łodzi
3 Zakład Mikologii Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków
2
Wstęp: Pomimo ogromnego postępu w medycynie, zakażenia wywoływane przez grzyby z rodzaju
Candida są wciąż poważnym problemem epidemiologicznym. Coraz częściej dochodzi do ciężkich
zakażeń nie tylko o etiologii C. albicans, ale też gatunkami z grupy Candida non-albicans. Dodatkowo
pojawia się coraz więcej doniesień o rosnącej oporności tych grzybów na powszechnie stosowane leki.
Znany impas antybiotykoterapii tłumaczy skierowanie uwagi na alternatywne sposoby zwalczania „trudnych” zakażeń. Dlatego coraz intensywniej bada się możliwość wykorzystania terapeutycznego naturalnych produktów, np. olejków eterycznych wchodzących w skład układu obronnego roślin, poszukując
takich produktów, które wykazują działanie bójcze i/lub synergizm z chemioterapeutykami. Cel: Ocena
wrażliwości klinicznych szczepów Candida spp. na wybrane olejki eteryczne. Metody: Na podstawie
wcześniejszych badań skryningowych do badań przeznaczono 5 najbardziej aktywnych olejków: goździkowy, geraniowy, cytronelowy, lawendowy i melisowy oraz 5 składników: alfa-terpineol, terpinen-4-ol,
cytral, cytronelal i linalol. Badaniu poddano łącznie 50 klinicznych izolatów: C. albicans (n=20),
C. glabrata (n=14), C. tropicalis (n=6), C. krusei (n=5), C. parapsilosis (n=5). MIC/MBC fitozwiązków
ustalono metodą mikrorozcieńczeń w bulionie (wg. rekomendacji CLSI) w modyfikacji własnej. Wyniki:
Potwierdzono wysoką aktywność grzybostatyczną i grzybobójczą badanych preparatów, uzyskując
podobny zakres wartości MIC/MBC dla szczepów C. albicans, niezależnie od ich profilu lekowrażliwości
i nieco niższą aktywność wobec gatunków C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis i C. parapsilosis. Zakres
stężeń olejków eterycznych hamujących wzrost Candida spp. wynosił 0,006%-1,56% v/v, natomiast ich
składników - 0,003%-0,78% v/v. Najwyższą aktywność wykazały olejki geraniowy i melisowy oraz składniki: terpinen-4-ol, alfa-terpineol i cytral. Szczepy C. albicans oraz większość szczepów C. glabrata były
najbardziej podatne na działanie olejku geraniowego (MIC, odpowiednio: 0,012 - 0,048 % i 0,006 - 0,097
%). Średnią wrażliwością charakteryzowały się C. parapsilosis (MIC 0,048 - 0,19 %) i C. tropicalis (MIC
0,024 - 0,048 %), natomiast najbardziej oporne były szczepy kliniczne C. krusei, MIC ≥ 0,097 %. Wartości MBC badanych fitozwiązków były zazwyczaj równe MIC lub dwukrotnie wyższe. Wnioski: Można
sądzić, iż olejki eteryczne znajdą zastosowanie w medycynie jako pomocnicze czynniki w leczeniu
grzybic, szczególnie tych o charakterze przewlekłych zakażeń miejscowych wywoływanych przez Candida spp. (stopa cukrzycowa, owrzodzenia nowotworowe itp.).
II-9 P | Wpływ inwazji Toxoplasma gondii do ośrodkowego układu nerwowego na zachowanie
myszy
Gatkowska J.1, Wieczorek M.2, Dziadek B.1, Dzitko K.1, Długońska H.1
1 Zakład
2 Zakład
Immunoparazytologii, Uniwersytet Łódzki, 90-237 Łódź, Banacha 12/16,
Neurofizjologii, Uniwersytet Łódzki, 90-236 Łódź, Pomorska 141/143,
Wstęp: Toxoplasma gondii to kosmopolityczny pierwotniak atakujący wiele gatunków zwierząt endotermicznych, w tym także człowieka. Szacuje się, że toksoplazmoza jest jedną z najczęściej występujących
na świecie parazytoz, a zarażenie może dotyczyć nawet 1/3 populacji ludzi. Obecnie coraz częściej
postuluje się istnienie związku pomiędzy nosicielstwem pierwotniaka w ośrodkowym układzie nerwowym
(OUN) a zwiększonym ryzykiem rozwoju poważnych chorób o podłożu nerwowym takich jak schizofrenia
czy choroba Parkinsona. Ponadto stwierdzono, iż pierwotniak wywiera ukierunkowany wpływ na zacho37
wanie żywiciela, aby zwiększyć swoje szanse na transmisję w środowisku. Cel pracy: W pracy podjęto
próbę określenia liczby cyst T. gondii obecnych w hipokampie i ciałach migdałowatych, strukturach
zaangażowanych w kontrolę zachowania i przetwarzanie emocji oraz zbadania wpływu inwazji pasożyta
do OUN na zachowanie. Metody: Badania wykonano u myszy laboratoryjnych z ostrą i przewlekłą
toksoplazmozą. Określone struktury mózgowia homogenizowano, a liczbę obecnych w nich cyst wyrażano na 1 mg tkanki, natomiast zachowanie zwierząt oceniano w teście otwartego pola (OF).Wyniki:
Stwierdzono, że pasożyt zasiedla obie objęte badaniem struktury mózgowia niezależnie od fazy inwazji.
Zanotowano także istotne zmiany w zachowaniu zarażonych zwierząt, w porównaniu do grupy kontrolnej,
obejmujące aktywność lokomotoryczną i eksploracyjną oraz stan emocjonalny. Wnioski: Inwazja
T. gondii skutkuje nosicielstwem pasożyta w OUN i widocznymi zmianami w zachowaniu zwierząt.
____________________
Praca dofinansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (grant N N302 636340) oraz Uniwersytet
Łódzki (grant 545/211).
II-10 P/O | Formy morfologiczne H. pylori i ich przypuszczalna rola w transmisji zakażeń
Graczykowski M., Rudnicka K., Chmiela M.
Wstęp: Ponad połowa światowej populacji ludzkiej jest zakażona Gram ujemną pałeczką Helicobacter
pylori – zasiedlającą żołądek i dwunastnicę człowieka. Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem
(IARC) zalicza H. pylori do karcinogenów klasy I, tj. do czynników indukujących powstawanie nowotworów u człowieka. Jednakże, pomimo trzech dekad badań, nadal nie udokumentowano przeżywalności
H. pylori poza błoną śluzową żołądka. Potencjalną, choć nadal nieudokumentowaną drogą transmisji
H.pylori jest spożycie skażonej fekaliami wody. Cel pracy: Celem niniejsze pracy jest porównanie form
morflogicznych H. pylori, ocena ich właściwości antygenowych oraz zakaźnych, jak również ukazanie
wyników najnowszych badań zmierzających do wykazania lub wykluczenia tezy o przeżywalności form
ziarniakowatych H. pylori poza błona śluzową żołądka człowieka. Wyniki: dwie podstawowe formy
morfologiczne H. pylori to forma pałeczkowa i forma ziarniakowata. Ta ostatnia może przyjmować dwie
postaci: żywą lecz nie hodowalną, tzw. VBnC (ang. viable but non culturable) lub postać degeneratywną
czyli pośmiertną formę resztkową bakterii. Wyniki licznych badań wskazują na brak istnienia białka
charakterystycznego wyłącznie dla danej postaci morfologicznej, jednak wykazano różnice w intensywności ekspresji różnych białek pomiędzy formami morfologicznymi np. ureazy, CagA, Hsp. Poza formami
pojedynczymi, H. pylori posiada zdolność tworzenia społeczności bakteryjnych o charakterze jedno-, lub
wielogatunkowym. Biofilmy H. pylori wyizolowano m.in. z powierzchni rur PCV, stali nierdzewnej i szkła.
Co ciekawe większość bakterii wchodzących w skład takich biofilmów to formy ziarniakowa te. Spekuluje
się że zdolność tworzenia biofilmu środowiskowego w połączeniu z hipotetyczną możliwością przejścia
w stan kokoidalny (i powrotu do formy spiralnej) tłumaczyłaby wysoki odsetek osób zakażonych wśród
osób korzystających z nieuzdatnionej wody pochodzącej ze studni, rzek. Wnioski: Podczas poszukiwań
literaturowych nie znaleziono pracy, bezsprzecznie stwierdzającej możliwość transformacji formy kokoidalnej w formę spiralną. Z próbek wody zawierających formy kokoidalne H. pylori, nie wyhodowano
żywych bakterii. Na modelach zwierzęcych wykazano rozwój reakcji zapalnej w błonie śluzowej żołądka
myszy szczepionych formami kokoidalnymi H. pylori. Nie wyklucza się jednak obecności odsetka formy
spiralnej w inokulum, stosowanym do szczepienia zwierząt. W celu wykazania lub wykluczenia przeżywalności form kokoidalnych w wodzie pitnej oraz ich zdolności zakaźnych niezbędne są kolejne badania,
a przede wszystkim odpowiednia metodyka i zastosowanie najnowszych osiągnięć z dziedziny epidemiologii, genetyki i mikrobiologii.
38
II-11 P | Rola Fas/FasL w regulacji stanu zapalnego błony śluzowej pochwy w przebiegu zakażenia
HSV-2
Gregorczyk K., Grochowska A., Krzyżowska M.
Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
Wstęp: Zakażenie wirusem herpes simplex typu 2 (HSV-2), wywołujące tzw. opryszczkę narządów
płciowych stanowi jedną z najczęstszych chorób przenoszonych drogą płciową. Szacuje się, że latentne
zakażenie wirusowe dotyczy 50% populacji kobiet na całym świecie. Wykazano, iż apoptoza odgrywa
istotną rolę w utrzymaniu homeostazy błon śluzowych, a w szczególności szlak zależny od receptorów
Fas/FasL. Niewiele wiadomo o roli apoptozy i szlaku Fas/FasL w powstawaniu miejscowych zmian
w obrębie nabłonka błony śluzowej pochwy w przebiegu opryszczki narządów płciowych. Cel pracy: Do
określenia roli Fas i FasL Fas/FasL w patogenezie zmian błony śluzowej pochwy oraz w regulacji stanu
zapalnego w przebiegu zakażenia HSV-2 posłużono się mysim modelem herpes genitalis. Przebieg
zakażenia u myszy dzikiego szczepu C57BL porównywano z zakażeniem u myszy z knock-outem genu
Fas i FasL. Metody: Szczepy myszy z mutacją w genie Fas (lpr) i w FasL (gld) oraz szczep dziki C57BL6
zakażano dopochwowo HSV-2 w dawce 104 PFU/mysz. Kontrolę stanowiły myszy niezakażone. Tkankę
pochwy oraz węzły chłonne w 3 i 7 dniu zakażenia wykorzystywano do przygotowania zawiesiny
pojedynczych komórek oraz preparatów histologicznych, które następnie poddawano wykrywaniu komórek apoptotycznych (komórki z aktywną kaspazą 3) oraz immunofenotypowaniu (neutrofile, monocyty).
Dodatkowo, sprawdzano ekspresję białka Bcl-2 oraz Bax. Wyniki: Komórki nabłonka pochwy myszy
dzikich zakażone HSV-2 wykazywały wysoki poziom ekspresji Fas, FasL oraz Bcl-2 i nie ulegały apoptozie, natomiast komórki nabłonka sąsiadujące z miejscami zakażenia charakteryzowały się zwiększoną
ekspresją Fas i ulegały apoptozie. Zakażenie HSV-2 myszy z mutacją Fas i FasL powodowało wzrost
apoptozy komórek zakażonych, ale również silny naciek komórek odpowiedzialnych za stan zapalny
(neutrofilów, monocytów oraz komórek dendrytycznych). Nie stwierdzono różnic w ekspresji Bcl-2 myszy
dzikich oraz myszy z knock-outem Fas lub FasL. Wnioski: Szlak Fas/FasL uczestniczy w rozwoju stanu
zapalnego błony śluzowej pochwy w początkowej fazie zakażenia HSV-2.
____________________
Pracę sfinansowano z grantu MNiSW nr N N401 178839.
II-12 P/O | Izolacja i charakterystyka środowiskowych bakteriofagów wykazujących aktywność
lityczną wobec wielolekoopornych szczepów Klebsiella sp.
Kęsik-Szeloch A.1, Drulis-Kawa Z.1, Kassner J.1, Weber-Dąbrowska B.2
1 Instytut
2 Instytut
Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, Wrocław
Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda, Wrocław
Wstęp: Bakteriofagi (nazywane także fagami) to wirusy zakażające komórki bakteryjne. Występują one
w wodzie, glebie, powietrzu a także są składnikiem mikroflory jelitowej ludzi i zwierząt. Bakteriofagi
charakteryzują się wysoką swoistością w stosunku do komórek gospodarza. Swoistość ta powoduje, iż
konkretne fagi wykazują aktywność lityczną tylko do określonych gatunków bakterii, czy wręcz do poszczególnych szczepów danego gatunku. Cecha ta jest wykorzystywana w celach eliminacji konkretnych
szczepów bakteryjnych (fagoterapia) oraz w typowaniu bakterii w obrębie gatunku (fagotypia), mającego
duże zastosowanie w epidemiologii. Cel pracy: Przedmiotem niniejszej pracy była izolacja i charakterystyka bakteriofagów wykazujących aktywność wobec szczepów Klebsiella pneumoniae ESBL(+) w celu
wykorzystania ich w terapii fagowej w przypadku zakażeń wywołanych przez wielolekooporne szczepy
39
bakteryjne. Metody: Nowowyizolowane bakteriofagi scharakteryzowano na podstawie morfologii wirionów i łysinek oraz zakresu gospodarzy. Morfologię bakteriofagów określono przy wykorzystaniu mikroskopu elektronowego transmisyjnego (TEM). Morfologię łysinek fagowych ustalono z użyciem metody
płytek dwuwarstwowych. Aktywność lityczną wyizolowanych fagów przetestowano wobec 168 szczepów
Klebsiella pneumoniae i 54 szczepów Klebsiella oxytoca z wykorzystaniem metody „spot-test”. Wyniki:
Z ośmiu próbek wód wyizolowano 34 bakteriofagi namnożone na 11 szczepach K. pneumoniae ESBL(+).
Pod względem cech morfologicznych ustalono ich przynależność do trzech rodzin: Myoviridae, Siphoviridae i Podoviridae. Zaobserwowano również istotne różnice w morfologii łysinek fagowych. Ponadto
badania wykazały, że bakteriofagi należące do rodziny Myoviridae cechowały się wyższą skutecznością
i względnie szerszym zakresem aktywności w obrębie szczepów Klebsiella sp. (aktywność wobec 22%
szczepów K. pneumoniae oraz 37% szczepów K. oxytoca). Wnioski: Wyizolowane bakteriofagi wykazują
aktywność bakteriobójczą względem dużej liczby klinicznych wielolekoopornych szczepów K. pneumoniae i K. oxytoca. Przekłada się to na możliwość ich zastosowania w bezpośredniej terapii fagowej jak
i w typowaniu bakterii izolowanych od chorych.
II-13 P | Rola witaminy C w modyfikacji białek błon erytrocytów przeznaczonych do transfuzji
Kontek B., Antosik A., Żbikowska H.M.
Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska
Wstęp: Napromienianie krwi i jej komponentów przed transfuzją jest jedyną skuteczną metodą zapobiegającą reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi (transfusion-associated grft versus host disease; TAGVHD) występującą u pacjentów z obniżoną odpornością immunologiczną. Uszkodzenia limfocytów,
odpowiedzialnych za TA-GVHD przez promieniowanie jonizujące jest powodowane przede wszystkim
przez reaktywne formy tlenu pochodzące z radiolizy wody, głównie rodnik hydroksylowy. Odpowiedź
mniej wrażliwych na promieniowanie jonizujące erytrocytów w postaci peroksydacji i/lub uszkodzenia
struktury białek zależy od stosowanej dawki promieniowania. Antyoksydanty dodawane do płynów
uzupełniających, w których przechowuje się erytrocyty mogą chronić je przed uszkodzeniami poradiacyjnymi. Cel pracy: Prezentowana praca miała na celu zbadanie stopnia uszkodzenia oksydacyjnego białek
błon erytrocytów napromienionych dawkami 50 i 100 Gy oraz określenie wpływu witaminy C na te zmiany. Metody: Zmiany oksydacyjne w białkach określono na podstawie pomiaru ilości grup –SH w napromienionych błonach erytrocytów. Wyniki: Wykazano, że promieniowanie gamma powoduje wzrost ilości
grup –SH w białkach błon erytrocytów (o około 58% i 67%) odpowiednio przy dawce 50 i 100 Gy
w stosunku do prób nienapromienionych, co może świadczyć o częściowej fragmentacji i/lub denaturacji
białek. Zaobserwowano również istotne statystycznie zmniejszenie ilości grup –SH w błonach napromienionych w obecności witaminy C, niezależnie od stosowanego stężenia (5-125 µM), w porównaniu
z błonami napromienionymi bez antyoksydanta. Przy dawkach promieniowania 50 i 100 Gy spadek ilości
grup –SH w próbkach napromienionych w obecności witaminy C wynosił odpowiednio 65% i 50%.
Wnioski: Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że witamina C skutecznie hamuje
procesy oksydacyjne w białkach błon erytrocytów powodowane przez promieniowanie jonizujące
o dawce, stosowanej w transfuzjologii.
____________________
40
II-14 P | Ocena właściwości antyoksydacyjnych koniugatów polifenolowo-polisacharydowych
wybranych roślin rodziny Rosaceae
Kontek B.1, Wlazłowicz E.1, Saluk J.1,2, Wachowicz B.1,2, Pawlaczyk I.2,3, Gancarz R.2,3
1 Katedra
Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/143, 90-236 Łódź, Polska,
Szpital Specjalistyczny, Zintegrowane Centrum Medycyny Sercowo-Naczyniowej,
Kamińskiego 73a, 51-124 Wrocław, Polska
3 Zakład Chemii Medycznej i Mikrobiologii, Politechnika Wrocławska, Łukasiewicza 2, 50-371 Wrocław,
Polska
2 Wojewódzki
Wstęp: Jednym z głównych endogennych czynników wywołujących stres oksydacyjny w układzie krążenia jest nadtlenoazotyn (ONOO-). Powstaje w wyniku gwałtownej reakcji pomiędzy tlenkiem azotu (NO·)
a anionorodnikiem ponadtlenkowym (O2·-). Jest bardzo silnym antyoksydantem. Wywołuje oksydację
wielu biomolekuł komórkowych, m.in. prowadzi do zmian strukturalnych białek (np. nitrowanie reszt
tyrozynowych czy tworzenie grup karbonylowych), co z reguły skutkuje utratą lub zmianą ich funkcji.
Znanych jest już wiele związków polifenolowych obecnych w ekstraktach uzyskanych z roślin leczniczych, które wpływają na zahamowanie wytwarzania czy działania nadtlenoazotynu. Istnieją jednak
rośliny, których wpływ na układ krążenia nie został jeszcze poznany. Cel pracy: Celem pracy była ocena
i porównanie wpływu in vitro ekstraktów polifenolowo-polisacharydowych uzyskanych z roślin należących
do rodziny Rosaceae, tj. jeżyny fałdowanej (Rubus plicatus) oraz krwiściągu lekarskiego (Sanguisorba
officinalis), w stężeniach 50, 100, 200 i 300 µg/ml, na zmiany oksydacyjne białek płytek krwi wywołane
działaniem nadtlenoazotynu. Metody: Stopień zmian w białkach płytek krwi inkubowanych z nadtlenoazotynem w obecności badanych ekstraktów oznaczano poprzez pomiar stężenia 3-nitrotyrozyny (3-NT)
oraz poziomu grup karbonylowych. Wyniki: Ekstrakty polifenolowo-polisacharydowe z badanych roślin
obniżają stężenie 3-NT; już najniższe stężenie – 50 µg/ml spowodowało zahamowanie tworzenia się 3NT o prawie 50%. Wzrost stężenia ekstraktów – 100, 200 i 300 µg/ml – nie wpływał na dalsze hamowanie tworzenia 3-NT. W białkach płytek krwi po inkubacji z różnymi stężeniami badanych ekstraktów
roślinnych nie zaobserwowano zmian w wytwarzaniu grup karbonylowych wywołanych nadtlenoazotynem. Wnioski: Polifenolowe ekstrakty z jeżyny fałdowanej i krwiściąga lekarskiego mają działanie
antyoksydacyjne. Chronią płytki krwi przed zmianami wywołanymi nadtlenoazotynem, który powstaje
w dużych ilościach w układzie krążenia w stanach zapalnych. Mechanizm ochronnego działania nie jest
znany.
____________________
Praca współfinansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810 oraz projektu WROVASC – Zintegrowane Centrum
Medycyny Sercowo-Naczyniowej Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007-2013.
II-15 P | Aktywność kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego w kombinacji wybranymi
antybiotykami przeciwko biofilmom bakteryjnym
Kurek A., Wolska K.I.
Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Wstęp: Narastająca oporność bakterii na antybiotyki jest powodem prowadzenia intensywnych poszukiwań potencjalnych terapeutyków, mogących wspomagać działanie stosowanych powszechnie antybiotyków. Dotychczasowe badania prowadzone w naszym zakładzie wykazały antybakteryjne działanie dwóch
związków pochodzenia roślinnego – kwasu oleanolowego (OA) i kwasu ursolowego (UA), szczególnie
silne wobec bakterii gramdodatnich. Oba badane triterpenoidy pentacykliczne zmieniają morfologię
41
komórek bakteryjnych, indukują ich autolizę, hamują obrót metaboliczny i zmieniają usieciowanie peptydoglikanu [1,2], a więc celem działania tych związków są osłony bakteryjne. Cel pracy: Celem niniejszej
pracy było zbadanie wpływu OA i UA w kombinacji z wybranymi antybiotykami na zdolność do adhezji
i tworzenia biofilmu. Metody: Stosowane szczepy: S. aureus ATCC29213 i S. aureus A3 (MRSA),
S. epidermidis ATCC12228 i S. epidermidis 6756/99 (MRSE), L. monocytogenes PCM2191, P. aeruginosa ATCC10145 and E. coli ATCC23546. Stosowane związki: OA, UA, penicylina G, ampicylina, oksacylina, streptomycyna, rifampicyna. Wyznaczono wartości MIC oraz minimalne stężenie hamujące biofilm
(MBIC). Wpływ OA i UA na hydrofobowość powierzchni osłon oznaczono metodą oddziaływania
z p-ksylenem (BATH). Adhezję i formowanie biofilmu oznaczono poprzez barwienie biomasy biofilmu
fioletem krystalicznym, a żywotność komórek oznaczono barwiąc żywe komórki za pomocą MTT.
Zaburzenia w formowaniu biofilmu na fragmentach cewników zobrazowano barwiąc biomateriały TTC.
Wyniki: Wartości MIC i MBIC dla OA/UA wynosiły odpowiednio 10 – 35 µg/ml i 20 – 70 µg/ml. Wykazano istnienie oddziaływań synergistycznych i addytywnych między OA i UA a antybiotykami. Na szczególną uwagę zasługuje synergizm między antybiotykami β-laktamowymi i OA/UA w działaniu na szczepy
S. aureus i S. epidermidis zwłaszcza wobec biofilmu. Zaobserwowano ok. 4-krotne zmniejszenie MBIC
dla wybranych antybiotyków w obecności OA/UA. Triterpenoidy stosowane samodzielnie zmieniają
stopień hydrofobowości komórek bakteryjnych, wpływając tym samym na poziom adhezji. Wnioski: OA
i UA wykazują antybiofilmową aktywność oraz współdziałają z antybiotykami.
II-16 P | Właściwości adhezyjne bakterii z rodzaju Asaia
Kur-Kowalska K., Kręgiel D.
Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika Łódzka
Wstęp: Bakterie z rodzaju Asaia należą do rodziny bakterii octowych - Acetobacteraceae. Pierwotnym
źródłem izolacji bakterii Asaia sp. są kwiaty i owoce roślin tropikalnych. Izolowane są również w wód
mineralnych z naturalnym aromatem owocowym oraz z linii produkcyjnych do produkcji tych napojów,
gdzie mogą tworzyć biofilmy. Bakterie z rodzaju Asaia należą do pierwszej grupy zagrożenia, mimo to,
mogą wywoływać bakteremie u osób o znacznie obniżonej odporności organizmu. Cel pracy: Celem
pracy była ocena zdolności adhezyjnych bakterii z rodzaju Asaia z uwzględnieniem wybranych warunków środowiskowych i różnych nośników abiotycznych. Metody: Badano dwa szczepy: FMW1 - Asaia
lannaensis, oraz FMW2 - Asaia sp. Z hodowli płynnych zaszczepiano pożywki hodowlane (pożywkę
minimalną, wzbogacona oraz wodę mineralną z aromatem truskawkowym). Zastosowane nośniki: (szkło,
PET, PP) stanowią przykład typowych materiałów opakowaniowych i zostały dopuszczone do kontaktu
z żywnością. Inkubacje prowadzono na wytrząsarce, w temperaturze 23 °C, 7 lub 14 dni. W czasie
hodowli oraz po jej zakończeniu wykonano następujące analizy: pomiar luminometryczny, wysiewy
ilościowe oraz analizę mikroskopową nośnika. Monitorowano zarówno wzrostu szczepów w zawiesinie
hodowlanej jak i zdolności adhezyjne do powierzchni nośników. Wyniki: Komórki bakterii z rodzaju Asaia
w zależności od składu pożywki hodowlanej wykazywały zróżnicowane kształty – od owalnych, prawie
kulistych do bardzo wydłużonych. Bakterie z rodzaju Asaia charakteryzowały się silnymi właściwościami
adhezyjnymi, zależnie od dostępu składników pokarmowych i rodzaju powierzchni. Najwyższy poziom
adhezji uzyskano dla szczepu Asaia sp. FMW2 w pożywkach z glukozą i sacharozą jako źródło węgla.
Dodatkowo w obrazach mikroskopowych nośników zaobserwowano obecność zewnątrzkomórkowej
substancji, szczególnie w pożywkach z sacharozą. Spośród badanych nośników, najwyższy współczynnik adhezji odnotowano do powierzchni PET. Wnioski: Bakterie z rodzaju Asaia wykazują zdolność
adhezji do powierzchni ciał stałych, charakteryzują się pleomorfizmem. Stopień adhezji zależy zarówno
od rodzaju pożywki, jak i zastosowanego nośnika. Napięcie powierzchniowe na granicy faz: cieczpowietrze może sprzyjać przyleganiu bakterii Asaia sp. do powierzchni nośnika.
42
II-17 P | Wpływ warunków wzrostu na powstawanie komórek typu „persisters” w hodowlach
stacjonarnych E. coli
Leszczyńska D., Matuszewska E., Szczepaniak P., Kuczyńska-Wiśnik D., Laskowska E.
Katedra Biochemii, Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański
Wstęp: Komórki typu „persisters”, które stanowią niewielką część populacji bakteryjnych, charakteryzują
się brakiem wzrostu i tolerancją na działanie czynników antybakteryjnych. Z tego powodu obecność
„persisters” może być poważnym problemem w trakcie zwalczania infekcji bakteryjnych. Bakterie mogą
przechodzić z fazy „persisters” do fazy szybkiego wzrostu i stawać się wrażliwe na antybiotyki. Mechanizmy, które indukują powstanie „persisters” oraz powodują oporność tych komórek na antybiotyki nie są
do końca poznane. „Persisters” mogą pojawiać się zarówno w biofilmie jak i w hodowlach planktonowych,
przede wszystkim podczas stacjonarnej fazy wzrostu. Cel pracy: W prezentowanej pracy badano wpływ
warunków wzrostu na poziom komórek „persisters” w stacjonarnych hodowlach szczepu laboratoryjnego
E. coli MC4100. Metody: W celu izolacji komórek „persisters” hodowle E. coli rozcieńczano (107 CFU/ml)
w pożywce LB (Luria broth) z dodatkiem ampicyliny (200 g/ml) i inkubowano w 30°C przez 6 godzin.
Agregaty białkowe izolowano stosując ultrawirowanie ekstraktów bakteryjnych traktowanych 2% Tritonem
X100 w gradiencie gęstości sacharozy. Wyniki: Prowadzone przez nas badania wykazały, że dostępność tlenu i glukozy w pożywce mają wpływ na poziom „persisters” w stacjonarnych hodowlach szczepu
laboratoryjnego E. coli MC4100. W warunkach tlenowych obecność glukozy w pożywce LB znacznie
obniżała liczbę „persisters”. Odwrotny efekt obserwowaliśmy w przypadku stacjonarnych hodowli beztlenowych, w których glukoza powodowała wzrost poziomu „persisters”. Nasze wcześniejsze doświadczenia
wykazały, że w hodowlach stacjonarnych (tlenowych bez glukozy i beztlenowych z glukozą), w których
stwierdziliśmy podwyższony poziom „persisters”, znajdują się wewnątrzkomórkowe agregaty białek.
Agregaty te zawierają białka, które biorą udział w różnych szlakach metabolicznych (glikoliza, przemiany
puryn i pirymidyn, synteza aminokwasów), białka rybosomalne, stresowe i uczestniczące w translacji.
Przypuszczamy, że agregacja białek utrudnia prawidłowe funkcjonowanie komórek i powoduje zahamowanie ich wzrostu w późnej fazie stacjonarnej. Interesującym było stwierdzenie, że uzupełnienie pożywki
40 mM buforem MOPS pH 7,4 hamowało tworzenie agregatów białkowych i jednocześnie obniżało
poziom komórek „persisters” w hodowlach. Wnioski: Można przypuszczać, że agregacja białek lub
czynnik, który ją wywołuje, indukuje powstawanie komórek „persisters” w hodowlach stacjonarnych
E. coli. Warunki umożliwiające zahamowanie agregacji białek mogą obniżyć poziom „persisters” w
hodowli.
II-18 P | Potencjalna rola przeciwciał przeciwko białkom szoku cieplnego w rozwoju choroby
niedokrwiennej serca
Matusiak A.1, Rechciński T.2, Miszczyk E.1, Rudnicka K.1, Walencka M.1, Rudnicka W.1, Chmiela M.1
1
2
II Klinika Kardiologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Łódź, Polska
Wstęp: Przypuszcza się, iż konserwatywne bakteryjne białka szoku cieplnego inicjujące powstawanie
przeciwciał krzyżowo reagujących z białkami szoku cieplnego gospodarza mogą przyczyniać się do
podtrzymywania reakcji zapalnej u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca, ze współistniejącym
zakażeniem Helicobacter pylori, przyczyniając się do nasilenia procesów patologicznych w środowisku
naczyniowym. Cel: W pracy oceniono częstość i intensywność wytwarzania przeciwciał klasy IgG przeciwko wzorcowemu bakteryjnemu białku grupy Hsp60, jakim jest białko Hsp65 M. bovis (MbHsp65),
a także przeciwko białku Hsp60 H. pylori (HspB) oraz ludzkiemu białku Hsp60 (hHsp60). Metody:
43
Analizie poddano 159 surowic pacjentów z chorobą niedokrwienna serca (ChNS) oraz 55 surowic osób
zdrowych. Częstość i intensywność wytwarzania przeciwciał IgG przeciwko Hsp65 M. bovis oceniono
stosując laboratoryjny test immunoenzymatyczny ELISA, w którym użyto wzorcowe białko szoku cieplnego M. bovis o masie 65 kDa. Częstość i intensywność wytwarzania IgG przeciwko ludzkiemu białku
Hsp60 oceniono z zastosowaniem handlowego testu „Anti-human Hsp60” (Stressgen), w którym do
opłaszczenia nośnika użyto rekombinowane ludzkie białko Hsp60 (rhHsp60). Częstość wytwarzania
przeciwciał klasy IgG przeciwko białku HspB H. pylori oceniono z zastosowaniem handlowego zestawu
Western blot (Viro-Immun Labor-Diagnostika GmbH). Wyniki: Przeciwciała IgG anty-MbHsp65 i antyHspB wykrywane były istotnie częściej w surowicach pacjentów z ChNS niż u osób zdrowych, odpowiednio 89% i 65% oraz 86% i 68%, p<0,05. IgG anty-rhHsp60 obecne były we wszystkich surowicach
badanych. Absorpcja surowic badanych inaktywowanymi termicznie pałeczkami H. pylori spowodowała
znaczne obniżenie poziomu IgG anty-MbHsp65 i anty-rhHsp60. Wnioski: Zakażenia H. pylori mogą
stanowić istotny czynnik ryzyka choroby niedokrwiennej serca, obok czynników klasycznych, na co może
wskazywać indukowanie przez białko HspB H. pylori przeciwciał krzyżowo reagujących z ludzkim białkiem Hsp60, którego poziom u pacjentów z chorobą wieńcową jest istotnie podwyższony, co stwarza
ryzyko patologicznych zmian o podłożu autoimmunologicznym.
____________________
Praca finansowana z grantu MNiSW nr N401 015 136.
II-19 P | Pierwszy przypadek zakażenia psa metycylino-opornym szczepem Staphylococcus
pseudintermedius (MRSP) po zabiegu chirurgicznym
Międzobrodzki J.1 , Polakowska K.1, Kasprowicz A.2, Białecka A.2, Jaworska O.3, Władyka B.4, Dubin A.4
Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński
Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. Dra J. Bobra, Kraków
3 Klinika Weterynaryjna „ALVET”, Kraków
4 Zakład Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński
1
2
Wstęp: Biochemiczna charakterystyka izolatów wyprowadzonych z zakażeń jest podstawą diagnostyki,
a w szczególnych przypadkach konieczna jest także analiza genetyczna. Postępowanie takie miało
miejsce w przypadku zakażenia rany u psa po operacji wstawienia endoprotezy stawu. Była to bardzo
rzadko wykonywana operacja u zwierząt. Powodem jej była postępująca dysplazja stawu u psa rasy
Bergamasco. Cztery dni po operacji rana obficie ropiała. Cel pracy: Celem pracy była biochemiczna
i genetyczna identyfikacja szczepów bakteryjnych powodujących ropne zakażenie rany u psa po zabiegu
chirurgicznym. Metody: Materiał do analizy mikrobiologicznej pobrano trzykrotnie. Analizy mikrobiologiczne wykonane z użyciem standardowych metod wykazały obecność Staphylococcus intermedius,
uzupełniające badania molekularne techniką PCR-RFLP, ocena sekwencji fragmentów 16S rRNA i genu
rpoB wskazały na gatunek S. pseudintermedius oraz obecność jednego, tego samego szczepu we
wszystkich trzech pobranych próbach. Na podstawie wyników pierwszego badania i antybiogramu
zastosowano linezolid (zywoxid). W drugim i trzecim pobraniu materiału uzyskano wzrost pojedynczych
kolonii, po czym nastąpiło wygojenie rany. Zabieg chirurgiczny wraz z celowaną chemioterapią dały
pozytywny wynik. Chemioterapia oparta była na antybiogramie wykonanym techniką E-testu (AB BIODISC) zgodnie z zaleceniami NCCLS. Wyniki: Wyosobniony patogen zakwalifikowano do gatunku Staphylococcus pseudintermedius. Był on oporny na grupy antybiotyków: makrolidy, linkozamidy, streptograminy B i wszystkie beta-laktamowe. Oporność na antybiotyki beta-laktamowe kodowana była na chromosomowej kasecie SCCmec typu III, co stwierdzono metodą MULTIPLEX PCR oraz porównano ze szczepami standardowymi. Wnioski: Wyosobnienie z rany psa szczepu MRSP z kasetą genową typową dla
szpitalnych szczepów S. aureus – MRSA jest niepokojącą informacją. Zjawisko dowodzi transferu genów
oporności pomiędzy szczepami różnych gatunków gronkowców, dodatkowo kolonizujących różne gatunki
gospodarza i może w przyszłości powodować niebezpieczne następstwa kliniczne. Do określenia MRSP
44
konieczne jest stwierdzenie obecności genu mecA. Należy także przypuszczać, że w przyszłości będą
się częściej pojawiać rany pourazowe zakażone wieloopornymi szczepami gronkowców. Wprowadzenie
nowych procedur i schematów diagnostycznych będzie konieczne zarówno w mikrobiologii zakażeń
człowieka jak i w weterynarii.
____________________
Badania finansowane z projektów badawczych MNiSW nr N N303 813340 (B.W.) i N N401 017740 (J.M.).
II-20 P | Specyfika wiązania LPS H. pylori z receptorem DC-SIGN
Miszczyk E., Rudnicka K., Matusiak A., Walencka M., Chmiela M.
Wstęp: Główną przyczyną patogenności Gram-ujemnych pałeczek Helicobacter pylori jest zdolność do
wywołania przewlekłego i długotrwałego zakażenia. Prawdopodobnie bakterie te wykształciły w toku
ewolucji mechanizmy, które pozwalają im na unikanie oraz modulowanie odpowiedzi immunologicznej
gospodarza. Właściwości immunomodulacyjne wykazuje lipopolisacharyd H. pylori. Obecność determinantów Lewis w części O-swoistej LPS, pozwala prawdopodobnie na unikanie przez te bakterie odpowiedzi immunologicznej, co wynika ze zjawiska mimikry antygenowej. W modulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza mogą brać także udział komponenty H. pylori wiązane przez komórki dendrytyczne
przez receptor DC-SIGN. Interakcje takie mogą decydować o ukierunkowaniu adaptacyjnej odpowiedzi
immunologicznej. Cel pracy: Celem pracy była ocena wiązania LPS H. pylori z (Lexy+) lub bez (Lexy-)
determinantów antygenowych Lewis z rekombinowanym receptorem DC-SIGN komórek dendrytycznych.
Podjęto również próbę opracowania modelu komórkowego do badań interakcji pałeczek H. pylori, różniących się ekspresją antygenów typu Lewis, z receptorem DC-SIGN, z wykorzystaniem stabilnej linii
ludzkich monocytów – THP-1. Metody: Specyfika wiązania LPS H. pylori Lexy+ lub Lexy- z rekombinowanym receptorem DC-SIGN komórek dendrytycznych była oceniana za pomocą testu ELISA, z użyciem
następujących inhibitorów: monoklonalnych przeciwciał anty-Lewisx/y, białka wiążącego LPS (LBP),
surowicy odpornościowej skierowanej przeciwko części rdzeniowej LPS oraz galaktozy. Natomiast
ekspresję receptora DC-SIGN-podobnego na powierzchni komórek THP-1 uzyskiwano poprzez stymulację komórek PMA, IL-4 i GM-CSF oraz oceniano ją metodą immunocytochemiczną, z wykorzystaniem
monoklonalnych przeciwciał anty-DC-SIGN. Wyniki: Badania wykazały, że zarówno LPS H. pylori z, jak
i bez determinantów antygenowych Lex/y pośredniczy w wiązaniu bakterii z rekombinowanym receptorem
DC-SIGN komórek dendrytycznych. Wykazano, iż za specyficzność wiązania odpowiedzialne są reszty
fukozy obecne w determinantach antygenowych Lex lub Ley, a także reszty galaktozy obecne w LPS typu
GalE, bez takich determinantów. Stymulacja komórek THP-1 PMA oraz IL-4 i GM-CSF warunkowała
obecność receptora DC-SIGN-podobnego na ich powierzchni. Wnioski: Zaobserwowana interakcja
pałeczek H. pylori z receptorem DC-SIGN może być wykorzystana przez bakterie w warunkach in vivo do
modulowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Natomiast opracowany model hodowli komórek
THP-1, warunkujący ekspresję receptora DC-SIGN-podobnego, może posłużyć do oceny skutków
interakcji pałeczek H. pylori za pośrednictwem tego receptora.
____________________
Praca finansowana ze środków pochodzących z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego o nr N401 015 136.
45
II-21 P | Ocena wpływu wyselekcjonowanej grupy antybiotyków zarówno na proces formowania
jak i na dojrzały 24 godzinny biofilm klinicznych szczepów Providencia stuartii
Ostrowska K., Różalski A.
Zakład Immunobiologii Bakterii, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Providencia stuartii jest Gram - ujemną, perytrychalnie urzęsioną pałeczką będącą fakultatywnym
patogenem człowieka. Zainteresowanie tym patogenem stale wzrasta, zwłaszcza w kontekście szpitalnych zakażeń układu moczowego (ZUM). Wielolekooporność i zdolność do wzrostu tego mikroorganizmu, w postaci niezwykle złożonej, mającej dualistyczny charakter strukturze biofilmu stanowi ogromne
wyzwanie dla współczesnej farmakoterapii. Ponadto mechanizm obrony przed penetracją molekuł
chemioterapeutyków w głąb struktury biofilmu wciąż pozostaje nie do końca wyjaśniony. Cel pracy:
W niniejszej pracy ocenie poddano wpływ grupy sześciu wyselekcjonowanych antybiotyków w zakresie
stężeń 2048 μg/ml - 2μg/ml, zarówno na proces formowania jak i na dojrzały 24 godzinny biofilm, kolekcji
20 szczepów klinicznych Providencia stuartii. Metody: Oceny stopnia wrażliwości na antybiotyki dokonywano na 96 dołkowych płytkach polistyrenowych typu F, dla dwóch układów badawczych : I - formowanie
biofilmu – antybiotyk w określonym stężeniu wraz z zawiesina bakteryjną o odpowiedniej gęstości
dodawano jednocześnie. II - 24 godzinny biofilm – na uprzednio wyhodowany 24 godzinny biofilm bakteryjny nanoszono odpowiednie stężenia antybiotyków. Do wizualizacji uzyskanych wyników zastosowano
metodę barwienia, bazującą na wykorzystaniu 1% wodnego roztworu fioletu krystalicznego. Z uwagi na
nieselektywne działanie tego barwnika dodatkowo wykorzystano metodę z użyciem MTT [3-(4,5dimetylotiazol-2-yl-)-2,5-difenylobromek tetrazoliny]. Wyniki: W przypadku obu układów badawczych
największą skuteczność odnotowano przy zastosowaniu gatifloksacyny oraz ceftriaksonu, które zaaplikowane w stężeniu 256 μg/ml spowodowały ubytek absorbancji ≥ 75% u 50% przebadanych szczepów.
Użycie amikacyny, cefepimu oraz cefotaksymu w badanym zakresie stężeń dla większości przebadanych szczepów, okazało się nie wystarczające do osiągnięcia wymiernych rezultatów. Stężenia hamujące
tworzenie biofilmu, były ponad 2000 razy wyższe niż wartości MIC. Ponadto w przypadku cefaleksyny
odnotowano stymulujący wpływ tego farmaceutyku na proces formowania biofilmu. Wnioski: Biofilmy
wszystkich badanych szczepów Providencia stuartii, okazały się wysoce oporne na zastosowane preparaty. Stężenia działające bójczo, są zbyt wysokie aby mogły być zastosowane in vivo. Prawdopodobnie
jest to związane z licznymi mechanizmami warunkującymi oporność biofilmu na czynniki antybakteryjne.
II-22 P | Aktywność hemolityczna hodowli biofilmowej Staphylococcus aureus
Pakulska J., Pawełkiewicz A., Sadowska B.
Wstęp: Biofilmy drobnoustrojów – wielokomórkowe, przestrzenne struktury, zanurzone w substancji
polimerowej (EPS), stanowią jedną z dwóch podstawowych form bytowania mikroorganizmów. Coraz
bardziej powszechny staje się pogląd, iż biofilmy, pierwotnie uznawane za formy „przetrwałe”, ściśle
odizolowane od środowiska zewnętrznego, wykazują aktywność metaboliczną i uwalniają produkty, które
mogą wchodzić w interakcje z mechanizmami obronnymi makroorganizmu. Cel pracy: Udowodnienie
aktywności metabolicznej hodowli biofilmowych Staphylococcus aureus na podstawie oceny właściwości
hemolitycznych pohodowlanych przesączy tych drobnoustrojów. Metody: Badaniami objęto przesącza
uzyskane po 4 i 24 godz. od wymiany podłoża w prowadzonych in vitro hodowlach biofilmowych (B)
i planktonowych (HP) szczepów referencyjnych S. aureus (8325-4 i Wood 46) oraz szczepów klinicznych
(α11 i α21). Aktywność hemolityczną przesączy oraz możliwość jej blokowania z użyciem swoistych
46
przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemolizynie  (HLA) oceniano metodą spektrofotometryczną
z użyciem erytrocytów owcy. Obecność HLA w badanych przesączach potwierdzano metodą Western
Blot. Wyniki: Wykazano aktywność hemolityczną przesączy uzyskanych z hodowli biofilmowych
S. aureus na poziomie podobnym, a w części układów badanych nawet przewyższającym aktywność
odpowiadających im przesączy z hodowli planktonowych tych drobnoustrojów. Przykładowo dla szczepów laboratoryjnych wartość hemolizy indukowanej 24-godz. przesączami HP mieściła się w zakresie
40,4-94,5%, podczas gdy hemoliza erytrocytów pod wpływem adekwatnych przesączy B osiągnęła
wartości w granicach 43,4-95,0%. Warto podkreślić, iż obserwowana aktywność hemolityczna przesączy
zależała przede wszystkim od rodzaju szczepu i czasu prowadzenia hodowli, w mniejszym zaś stopniu
od jej typu (hodowla planktonowa/biofilmowa). Możliwość blokowania aktywności hemolitycznej przesączy za pomocą swoistych przeciwciał oraz detekcja HLA z zastosowaniem metody Western Blot, wskazały na hemolizynę  jako główny czynnik hemolityczny w badanych przesączach. Wnioski: Dostarczenie
bezpośrednich dowodów na obecność hemolizyny  w przesączach pohodowlanych gronkowców
pozostających w formie biofilmu wskazuje nie tylko na aktywność metaboliczną przynajmniej części
komórek bakteryjnych tworzących formy osiadłe, ale także dowodzi możliwości przenikania metabolitów
drobnoustrojów przez fizyczną barierę EPS. Z uwagi na znaną aktywność modulacyjną wielu składników/metabolitów gronkowców (także badanej hemolizyny) można zakładać interakcję in vivo biofilmów
tych drobnoustrojów z komórkami eukariotycznymi gospodarza. Zatem próby modulacji aktywności
„wydzielniczej” biofilmów bakteryjnych mogą w przyszłości stanowić uzupełniające opcje terapeutyczne
przewlekłych i trudnych do wyleczenia zakażeń z ich udziałem.
II-23 P | Wpływ polifenoli roślinnych na adhezję i tworzenie biofilmu przez szczepy
Staphylococcus aureus
Paszkiewicz M., Sadowska B., Różalska B.
Wstęp: Staphylococcus aureus należy do najbardziej rozpowszechnionych patogenów człowieka,
powodujących szereg zmian patologicznych o różnym stopniu ciężkości. Poważne, trudne do wyleczenia
przypadki były do niedawna głównie problemem placówek medycznych (szczepy HA-MRSA), jednak
obecnie obserwuje się niepokojącą tendencję do pojawiania się szczepów MRSA w środowiskach
pozaszpitalnych (CA-MRSA, FA-MRSA). Niezwykła lekooporność szczepów tego gatunku i trudności
w uzyskaniu trwałej eradykacji u osób zakażonych mogą być częściowo wyjaśnione jego zdolnością do
tworzenia biofilmu. Te złożone struktury wykazują wielokrotnie wyższą oporność na niesprzyjające
czynniki zewnętrzne (w tym stosowane antybiotyki) w porównaniu z formą planktonową. Koniecznym
staje się więc poszukiwanie nowych źródeł leków wspomagających klasyczną antybiotykoterapię. Cel
pracy: Analiza wpływu wybranych związków należących do polifenoli roślinnych na zdolność szczepów
S. aureus do adhezji i tworzenia biofilmu. Metody: Do badania wybrano dwa izolaty kliniczne S. aureus
MRSA (E4, 948/05) oraz szczep referencyjny ATTC 29213 (MSSA) charakteryzujące się zróżnicowaną
produkcją zewnątrzkomórkowego śluzu (test oceny morfologii kolonii na podłożu Congo Red Agar), co
częściowo determinuje ich zdolność do tworzenia biofilmu. Badania wykonano na trzech związkach
komercyjnych (kwas galusowy, tymol, kwas ursolowy) należących do polifenoli roślinnych, wykazujących
silne działanie bakteriostatyczne (niska wartość MIC) i bakteriobójcze (MBC) wobec danych szczepów
drobnoustrojów. Stopień osłabienia adhezji (1 h) i zahamowania tworzenia biofilmu (24 h i 48 h) oceniono
dla stężeń preparatów równych MIC, ½ MIC oraz ¼ MIC, stosując metodę redukcji MTT. Wyniki: Wykazano, iż przebadane związki polifenolowe osłabiały zdolność drobnoustrojów do adhezji we wszystkich
zastosowanych stężeniach. Najsilniejsze działanie wobec wybranych szczepów S. aureus wykazał kwas
47
ursolowy. Tymol działał silniej niż kwas galusowy w przypadku szczepu E4, tymczasem działanie obu
związków wobec szczepów 948/05 i ATCC 29213 było podobne. Natomiast nie zaobserwowano wpływu
wybranych preparatów komercyjnych (w stężeniach sub-MIC) na tworzenie biofilmu przez dane szczepy
S. aureus. Wnioski: Roślinne związki fenolowe wybrane do badania wykazały zdolność osłabiania
adhezji bakterii z gatunku S. aureus, nie wpłynęło to jednak znacząco na tworzenie przez te drobnoustroje biofilmu. Substancje te mimo to stanowią obiecującą grupę alternatywnych czynników przeciwdrobnoustrojowych, które przez potencjalny wpływ na właściwości komórek mikroorganizmów mogą zwiększać
efektywność klasycznych antybiotyków.
II-24 P | Immunomodulacyjne właściwości LPS H. pylori w odniesieniu do produkcji cytokin przez
leukocyty osób zakażonych i niezakażonych tymi bakteriami
Rudnicka K., Miszczyk E. , Włodarczyk M. , Matusiak A., Walencka M., Chmiela M.
Wstęp: Helicobacter pylori jest głównym czynnikiem etiologicznym choroby wrzodowej żołądka. U ok.
15% zakażonych dochodzi do stanu zapalnego błony śluzowej żołądka, nacieku leukocytarnego oraz
produkcji cytokin typu Th1 (IL-2, IL-12, IL-18, TNF-α i IFN-γ). Nadal nie poznano mechanizmów umożliwiających pałeczkom H.pylori na długotrwałe utrzymywanie się w nabłonku żołądka. Możliwe, że w
przewlekłej fazie zakażenia, antygeny bakteryjne modulują odpowiedź immunologiczną prowadząc do jej
wyciszenia. Cel pracy: Celem niniejszej pracy była ocena aktywności sekrecyjnej leukocytów krwi
obwodowej osób zakażonych: H.pylori(Hp+) i niezakażonych: H.pylori(Hp-), w zakresie produkcji: IFN-γ,
IL-12, IL-2 oraz IL-10, po stymulacji lipopolisacharydem (LPS) H. pylori, w odniesieniu do hodowli niestymulowanych lub stymulowanych standardowym LPS E. coli. Metody: 44 ochotników objętych badaniem diagnozowano pod kątem zakażenia H. pylori potwierdzając jego obecność lub brak testem UBT
oraz testem ELISA na obecność przeciwciał IgG anty-H. pylori. Leukocyty krwi obwodowej izolowano
(Histopaque 1077), stymulowano przez 24 godz. LPS H. pylori typu LeXY(+) lub standardowym LPS
E. coli (O55:B5, Sigma). Supernatanty pohodowlane zbadano na obecność cytokin przy użyciu handlowych testów ELISA: IFN-γ i IL-2 (Quantikine ELISA, RnD Systems), IL-12 (Human p70 IL-12 Platinum
ELISA, eBioscience), IL-10 (EliPair Gen Probe, Diaclone). Wyniki: Stężenie IFN-γ w supernatantach
z hodowli prowadzonych w obecności LPS H.pylori było istotnie niże niż w hodowlach niestymulowanych
[Hp+(p=0.00003); Hp-(p=0.00006)] lub stymulowanych LPS E.coli [Hp+(p=0.0002); Hp-(p=0.0002)]. IL-2
nie wykryto ani w hodowlach niestymulowanych, ani po stymulacji LPS H.pylori. Natomiast średni poziom
IL-2 w hodowlach leukocytów stymulowanych LPS E.coli wynosił odpowiednio: Hp+(271 pg/ml) i Hp-(223
pg/ml). W hodowlach stymulowanych LPS H.pylori, wykryto istotnie więcej IL-10 niż w hodowlach niestymulowanych [Hp+(p=0.003); Hp-(p=0.003)] lub stymulowanych LPS E.coli. W żadnej hodowli nie wykryto
IL-12. Nie wykazano różnic istotnych statystycznie w poziomie produkcji badanych cytokin pomiędzy
supernatantami z hodowlami leukocytów osób Hp+ i Hp-. Wnioski: Wyniki uzyskanych badań mogą
sugerować że LPS H.pylori moduluje negatywnie produkcję IL-2 i IFN-γ i nie pobudza produkcji IL-12.
Z drugiej strony stymuluje produkcję IL-10-cytokiny o typowym działaniu przeciwzapalnym. Nie można
wykluczyć, iż właściwości immunomodulujące LPS H.pylori w zakresie wytwarzania cytokin ważnych dla
kształtowania procesów odpornościowych mogą przyczyniać się do ich wyciszenia.
____________________
Praca finansowana ze środków grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego o nr N401 015 136.
48
II-25 P | Ocena ryzyka zakażenia Legionella pneumophila u pacjentów z immunosupresją
Sikora A.1, Kozioł-Montewka M.1,Książek A.2, Grzebalska A.2, Steć A.2, Rudzki S.3, Furmaga J.3,
Paluch-Oleś J.1, Magryś A.1, Wójtowicz M.1, Strzelec-Nowak D.1
1 Katedra
i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie
Katedra i Klinika Nefrologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie
3 I Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Transplantacyjnej i Leczenia Żywieniowego,
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
2
Wstęp: Pacjenci z przewlekłą niewydolnością nerek i pacjenci po transplantacji nerki charakteryzują się
upośledzeniem kluczowych mechanizmów immunologicznych biorących udział w odpowiedzi na zakażenie bakteriami z rodzaju Legionella. Wynika to z obecności toksyn mocznicowych, które ulegają akumulacji w organizmie w miarę progresji niewydolności nerek oraz leczenia immunosupresyjnego. Ryzyko
zakażenia Legionella w tej grupie pacjentów będzie również w znacznym stopniu determinowane przez
charakter i zakres narażenia środowiskowego. W związku z powyższym pacjenci dializowani oraz po
transplantacji nerki zaliczani są do grupy wysokiego ryzyka zakażenia Legionella. Cel pracy: Celem
pracy było zbadanie częstości występowania przeciwciał przeciwko Legionella pneumophila serogrupy
(SG) 1-7 (IgG, IgM) oraz SG 1 (IgG) u pacjentów dializowanych i pacjentów po transplantacji nerki,
a także analiza powszechnie uznanych czynników ryzyka zakażenia u pacjentów z dodatnimi wynikami.
Materiał i metody: Materiałem do badań były próbki surowicy pobrane od 212 pacjentów dializowanych
i 68 pacjentów po transplantacji nerki oraz od 100 zdrowych osób (grupa kontrolna). Obecność specyficznych przeciwciał klasy IgM i IgG określono metodą immunoenzymatyczną z wykorzystaniem komercyjnych zestawów firmy EUROIMMUN i VIRCELLMICROBIOLOGISTS. Wyniki: W badanej grupie dodatnie
wyniki przeciwciał uzyskano u 20 pacjentów (7.14%). Wśród pacjentów dializowanych przeciwciała
przeciwko L. pneumophila SG 1-7 wykryto u 17 badanych (8.01%), z kolei u chorych po transplantacji
nerki u 3 (4,41%). Przeciwciała klasy IgM stwierdzono u 5 pacjentów dializowanych (3.12%). Dwie klasy
przeciwciał IgM i IgG stwierdzono u jednego pacjenta. Również u jednego pacjenta zostały wykryte
przeciwciała przeciwko SG 1. W wyniku przeprowadzonej analizy statystycznej nie stwierdzono istotnych
różnic miedzy pacjentami a grupa kontrolą w zakresie częstości występowania przeciwciał (p=0.54) oraz
między pacjentami z dodatnimi wynikami i potencjalnymi czynnikami ryzyka. Wnioski: 1) dodatnie wyniki
poziomu przeciwciał u badanych chorych wskazują na kontakt z L. pneumophila w tym SG 1 i zdolność
do odpowiedzi immunologicznej, co w tych przypadkach uchroniło pacjentów przed rozwojem legionellozy; 2) biorąc pod uwagę ciężki przebieg i wysoką śmiertelność w chorobie legionistów dodatnie wyniki
przeciwciał, a szczególnie SG 1 powinny skłaniać do poszukiwania źródeł zakażenia w środowisku
pacjentów oraz wykonanie badań określających zdolność do swoistej odpowiedzi komórkowej.
II-26 P | Charakterystyka biochemiczna, biologiczna oraz serologiczna 4 szczepów klinicznych
Proteus sp.
Siwińska M., Sidorczyk Z.
Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Pałeczki Proteus sp., powodują, w sprzyjających warunkach, różnego rodzaju infekcje, głównie
dróg moczowych oraz ran. Najczęściej izolowanym gatunkiem jest P. mirabilis, rzadziej P. vulgaris oraz
P. penneri. Charakterystyczną ich cechą jest zdolność do wzrostu rozpełzłego, która ułatwia bakteriom
kolonizację nowych miejsc. Jednym z istotnych czynników chorobotwórczości tych patogenów jest
lipopolisacharyd. Bakterie posiadające długołańcuchową część O-swoistą LPS uznaje się za bardziej
zjadliwe. Różnorodność budowy struktury łańcucha O-swoistego stanowi podstawę klasyfikacji serolo49
gicznej Proteus sp. i obecnie obejmuje 79 serogrup O. Cel pracy: Celem pracy było określenie przynależności gatunkowej szczepów Proteus sp., zbadanie czy izolaty są formami S czy R, czy mają zdolność
do wzrostu rozpełzłego oraz ustalenie ich przynależności serologicznej do istniejących serogrup O
rodzaju Proteus bądź utworzenie nowych. Metody: Przeprowadzono badania biochemiczne szczepów
przy użyciu testu diagnostycznego API 20E. Wykonano testy S/R - odczyn pseudoaglutynacji w 0,85%
NaCl, test na termostabilność oraz barwienie srebrem po rozdziale w żelu poliakrylamidowym. Zbadano
zdolność badanych szczepów do wzrostu rozpełzłego na stałym podłożu L-bulionowym z dodatkiem
1,5% agaru. Dla wytypowanych do badań serologicznych szczepów otrzymywano LPS, którego reaktywność sprawdzano za pomocą ELISA z zestawem króliczych surowic odpornościowych, skierowanych
przeciwko szczepom, reprezentującym wszystkie opisane dotychczas serogrupy O Proteus sp. Uzyskane
silne reakcje (powyżej miana 1:32.000) potwierdzano wykonując test Western-blot oraz adsorpcję surowic komórkami bakterii, a następnie sprawdzenie ich reaktywności w ELISA. Wyniki: Określono przynależność wszystkich badanych szczepów do gatunku P. penneri. Spośród 4 izolatów, 2 okazały się być
formami S, a 2 formami R, co udowodniono wykonując testy S/R. 2 szczepy, które uznano za formy R,
nie wykazały zdolności do wzrostu rozpełzłego, natomiast szczepy, będące formami S, silnie pełzały po
podłożu stałym, dając wzrost na płytce w postaci 6-8 koncentrycznych kręgów. Formy R zostały wyłączone z dalszych badań, obejmujących typowanie serologiczne, gdyż klasyfikacja serologiczna opiera się na
budowie O-PS, której te izolaty nie posiadają. 2 pozostałe szczepy (S) po przeprowadzeniu szczegółowych badań serologicznych zostały zaklasyfikowane kolejno do serogrupy O17 i O67 rodzaju Proteus.
Wnioski: Serogrupa O17 Proteus sp. jest serogrupą, zawierającą zarówno szczepy P. mirabilis,
P. vulgaris i P. penneri. Serogrupę O67 reprezentują jedynie szczepy należące do gatunku P. penneri.
W skład ich łańcucha O-swoistego LPS wchodzi fosfoetanolamina, której występowanie w tej części LPS
jest unikalne dla rodzaju Proteus.
II-27 P | Występowanie genu kodującego otoczkę alginianową oraz lekowrażliwość szczepów
Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy
Bogiel T., Skalski T., Gospodarek E.
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy
Wstęp: Pałeczki Pseudomonas aeruginosa należą do jednych z najczęściej izolowanych bakterii
z przypadków zakażeń szpitalnych. Naturalna oporność na leki przeciwdrobnoustrojowe oraz nabywanie
oporności na antybiotyki (w tym karbapenemy stosowane jako leki ostatniego rzutu) implikują zaliczenie
tych pałeczek do patogenów alarmowych. W piśmiennictwie pojawiają się informacje o obniżonej zjadliwości szczepów tego gatunku opornych na antybiotyki. Jednym z czynników wirulencji jest otoczka
alginianowa kodowana przez geny w większości zlokalizowane w pozycji 3962825–3964135 operonu
algD chromosomu szczepu P. aeruginosa PAO1. Podstawową jej funkcją jest ochrona komórki przed
fagocytozą. Wykazuje ona szczególne powinowactwo do komórek nabłonkowych płuc i ułatwia szczepom
tworzenie biofilmu. Cel pracy: Ocena lekowrażliwości i częstości występowania genu kodującego otoczkę alginianową u szczepów P. aeruginosa opornych na karbapenemy oraz porównanie częstości jego
występowania u szczepów izolowanych z różnego materiału klinicznego. Materiał i metody: Badaniem
objęto 120 szczepów P. aeruginosa opornych na karbapenemy. Ich lekowrażliwość oceniano i interpretowano zgodnie z zaleceniami KORLD i CLSI, stosując szczep wzorcowy P. aeruginosa ATCC 27853.
W reakcji amplifikacji stosowano DNA wyizolowane z użyciem zestawu Genomic Mini (A&A Biotechnology), zestaw z polimerazą Taq (Solis Biodyne) oraz startery (Integrated DNA Technologies) o sekwencjach 5’→3’, odpowiednio: algD F - ATG CGA ATC AGC ATC TTT GGT - i algD R - CTA CCA GCA GAT
GCC CTC GGC -. Produkty rozdzielano w żelu agarozowym, wybarwiano bromkiem etydyny i oglądano
50
w świetle UV, uznając za wynik dodatni występowanie fragmentu DNA wielkości 1310 pz. Analizę statystyczną częstości wystepowania genu algD u szczepów izolowanych z różnego materiału klinicznego
wykonano testem χ2. Za istotne statystycznie uznano różnice występujące przy poziomie istotności
α≤0,05. Wyniki: Wszystkie szczepy były wrażliwe na kolistynę. Najwyższe odsetki szczepów opornych
stwierdzono wobec karbenicyliny (90,0%), tikarcyliny (89,2%) oraz tikarcyliny z kwasem klawulanowym
(86,7%). Występowanie genu algD wykazano ogółem u 112 (93,9%) badanych szczepów. Notowane
różnice w częstości występowania genu u szczepów izolowanych z różnego materiału klinicznego nie
były istotne statystycznie. Wnioski: Nie wszystkie szczepy P. aeruginosa oporne na karbapenemy
posiadają geny kodujące otoczkę alginianową, przez co nie wszystkie mają możliwość jej wytwarzania.
Różnice w częstości występowania genu algD u pałeczek P. aeruginosa izolowanych z różnego materiału klinicznego nie są istotne statystycznie. W leczeniu zakażeń o etiologii tych drobnoustrojów lekiem
z wyboru może być kolistyna.
II-28 | Badanie przeciwbakteryjnych właściwości wybranych rodzajów miodów pszczelich
Sobczak K., Wieczorkiewicz A., Konieczna O.
Sekcja Mikrobiologiczna Studenckiego Koła Naukowego Biologów, Uniwersytet Łódzki, Łódź
[email protected]
Wstęp: Substancje naturalne od wieków stosowano w medycynie ludowej jako środki lecznicze przeciwko różnym schorzeniom, również o podłożu bakteryjnym. Także dziś ekstrakty z roślin wykorzystuje się
do produkcji leków, suplementów diety czy kosmetyków. Jedną z takich substancji jest miód, który ma
wysoce cenione właściwości lecznicze. Cel pracy: Celem niniejszego projektu jest zbadanie bakteriostatycznej i bakteriobójczej aktywności różnych rodzajów miodów pszczelich. Metody: W badaniach wykorzystano 6 rodzajów miodów pszczelich: z kwiatu pomarańczy, leśny, sosnowy, gryczany, domowy,
naturalny. Zbadano wrażliwość dla 5 gatunków bakterii: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis. Do porównania właściwości
antybakteryjnych miodów stosowano test mikrorozcieńczeń w bulionie, za pomocą którego oceniamy
MIC miodu (minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii). Badanie polegało na zmieszaniu na płytce
polistyrenowej w równej objętości zawiesiny bakteryjnej w podłożu Müellera –Hintona (gęstość 5*105
CFU/ ml) i roztworów miodów rozcieńczonych w różnych stężeniach (v/v) - od 64 % do 0,5 %. Za MIC
uznawano pierwsze stężenie miodu przy którym nie obserwowano wzrostu bakterii. Test umożliwił
również określenie MBC (bakteriobójcze stężenie miodu). Podłoże ze stężeniem MIC i dwa następne
rozcieńczenia przenoszono do podłoża TSB. Po 24 godzinach odczytywano MBC – pierwsze stężenie,
przy którym nie obserwowano wzrostu bakterii. Wyniki: Przeprowadzone badania wykazały, że prawie
wszystkie miody mają właściwości przeciwbakteryjne. Uzyskane wyniki pokazują, że MIC dla 5 z nich
mieści się w granicach 64% - 32%. Najsłabszą aktywność posiada miód z kwiatu pomarańczy, ponieważ
żaden z wykorzystanych w doświadczeniu drobnoustrojów nie był na niego wrażliwy. Spośród badanych
gatunków bakterii to Staphylococcus epidermidis okazał się najbardziej wrażliwy na badane miody. Miód
gryczany okazał się być dla niego najskuteczniejszy - miał właściwości bójcze już w stężeniu 16 µg/ml.
Wnioski: Uzyskane wyniki potwierdzają, iż miód pszczeli posiada składniki wykazujące aktywność
antybakteryjną. Ten fakt ma swoje szerokie zastosowanie w apiterapii, dziedzinie medycyny zajmującej
się leczeniem i profilaktyką schorzeń za pomocą produktów pszczelich.
51
II-29 P/O | Poszukiwanie zwierzęcego rezerwuaru enterokrwotocznych szczepów E. coli (EHEC)
Solecka A., Michałek E., Nawrotek P., Spiżak A., Mól M., Augustyniak A., Fijałkowski K.
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie
Wstęp: Pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) są stałym, naturalnym składnikiem mikroflory jelit ptaków
i ssaków. To pożądane symbionty, współdziałające w utrzymywaniu biologicznej równowagi mikroflory
przewodu pokarmowego. Jednocześnie niektóre spośród nich wywołują schorzenia biegunkowe –
kolibakteriozy. Ze względu na różne mechanizmy zjadliwości związane głównie ze zdolnością do wytwarzania toksyn, patogenne pałeczki E. coli podzielono na grupy, takie jak m.in. enterotoksyczne (ETEC),
enteroagregacyjne (EAEC), czy (jedne z najniebezpieczniejszych) enterokrwotoczne szczepy E. coli
(EHEC), izolowane od zwierząt i ludzi lub z produktów odzwierzęcych. Często też wyosabniane są od
bezobjawowo zakażonych zwierząt. Cel pracy: Celem badań była diagnostyka molekularna ukierunkowana na identyfikację wybranych genetycznych markerów zjadliwości charakterystycznych dla chorobotwórczych pałeczek okrężnicy, ze szczególnym uwzględnieniem patogenów z grupy EHEC. Materiał
i metody: Materiał badawczy stanowiło 45 szczepów E. coli wyizolowanych od 25 kur z kolibakteriozą
oraz 20 zdrowych owiec. Do oznaczenia wybranych markerów charakterystycznych dla analizowanych
pałeczek, zastosowano testy oparte na metodzie multipleks PCR, PCR-RFLP oraz RAPD-PCR. Wyniki:
W następstwie reakcji amplifikacji zbadano występowanie genów enterotoksyn (LTI, STII) i genu enteroagregacyjnej toksyny EAST1 oraz dodatkowo genu uspA kodującego uniwersalne białko stresowe
specyficzne dla gatunku E. coli, potwierdzając jednocześnie jego obecność w przypadku wszystkich
badanych szczepów. Geny eltI i estII występowały w DNA 22 szczepów wyizolowanych od kur, natomiast
u 14  wykryto geny astA. Z kolei, obecność genów shigatoksyn (slt) oznaczono w genomie ośmiu
izolatów pochodzących od zdrowych owiec, natomiast w oparciu o metodę PCR-RFLP zróżnicowano te
geny, a tym samym określono ich potencjalną chorobotwórczość dla człowieka. Ponadto, przeprowadzono analizę filogenetyczną zidentyfikowanych pałeczek EHEC slt (+), metodą RAPD-PCR, ustalając
bliższe relacje klonalne jedynie w przypadku czterech szczepów. Wnioski: Zdrowe klinicznie owce mogą
stanowić ważny rezerwuar szczepów EHEC, natomiast pałeczki ETEC i EAEC  czynnik etiologiczny
kolibakteriozy kur. Badania z użyciem metod molekularnych znacznie ułatwiają identyfikację i analizę
zjadliwości szczepów E. coli izolowanych od zwierzęcych nosicieli.
II-30 P | Ocena immunomodulacyjnych właściwości Mycobacterium bovis BCG na modelu świnek
morskich zakażonych Helicobacter pylori
Walencka M., Stobieniecka D., Kasińska P., Krupińska A., Matusiak A., Rudnicka K., Chmiela M.,
Rudnicka W.
Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź, Polska
e-mail:[email protected]
Wstęp: H.pylori jest powszechnym patogenem człowieka występującym u ludzi na całym świecie. Odsetek zakażeń spowodowanych przez ten patogen w krajach rozwiniętych sięga 20-40%, a w krajach
rozwijających nawet 80-100%. Obecnie w celu eradykacji patogenu stosuje się inhibitory pompy protonowej w połączeniu z dwoma antybiotykami. Jednak przy tak wysokiej częstości występowania zakażeń
H.pylori, cały czas poszukuje się nowych metod leczenia z zastosowaniem preparatów modulujących
odpowiedź immunologiczną gospodarza, które mogłyby wspomagać antybiotykoterapię lub całkowicie ją
zastąpić. Cel pracy: Celem pracy była ocena właściwości immunomodulujących preparatu Mycobacterium bovis BCG Onko (BCG Onko), stosowanego u pacjentów z nowotworem pęcherza na modelu
52
świnek morskich zakażonych pałeczkami Helicobacter pylori. Oceniono kolonizację błony śluzowej
żołądka świnek morskich szczepionych per os H.pylori oraz BCG-Onko i H.pylori. Metody: Spośród
metod zastosowanych do oceny kolonizacji nabłonka żołądka przez pałeczki H. pylori najskuteczniejsze
okazały się metody za pomocą, których oceniano aktywność enzymów: ureazy, oksydazy i katalazy
wytwarzanych przez ten patogen, barwienie preparatów histologicznych śluzówki żołądka z zastosowaniem pierwszorzędowych przeciwciał anty-CagA H.pylori i drugorzędowych przeciwciał znakowanych
HRP oraz chromogenu DAB, a także barwienie pałeczek H.pylori w preparatach tkankowych metodą
pośrednią, z zastosowaniem pierwszorzędowych przeciwciał anty-CagA H.pylori oraz drugorzędowych
przeciwciał znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). W celu stwierdzenia stanu zapalnego
błony śluzowej żołądka badanych zwierząt, wykonywano preparaty cytowirówkowe z treści żołądka
i zeskrobin błony śluzowej żołądka oraz tkankowe preparaty cienkowarstwowe barwione hematoksyliną
Mayera i eozyną. Wyniki: Wykazano obecność pałeczek H.pylori oraz stan zapalny błony śluzowej
żołądka zarówno u zwierząt zakażanych per os H pylori oraz otrzymujących BCG Onko i H. pylori.
Jednakże wykazano, że podanie zwierzętom, przed zakażeniem ich H.pylori, szczepionki BCG-Onko,
spowodowało osłabienie kolonizacji nabłonka żołądka przez pałeczki H.pylori. U takich zwierząt zaobserwowano także mniejsze uszkodzenie nabłonka żołądka wskutek rozwoju reakcji zapalnej. Wnioski:
Opracowano model zwierzęcy, który można zastosować w ocenie właściwości immunomodulacyjnych
preparatu M. bovis BCG Onko, w przebiegu zakażenia H.pylori.
____________________
Praca wykona w ramach Grantu KBN nr NN 303451738.
II-31 P | Apoptoza i autofagia – mechanizmy i metody detekcji
Szczęsna E., Rudnicka K., Miszczyk E., Mikołajczyk-Chmiela M.
Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Zakład Gastroimmunologii, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Apoptoza, przez dekady uważana za jedyny rodzaj programowanej śmierci komórki, pełni
kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy organizmu. Wyniki badań, prowadzonych w ostatnich latach,
dowodzą, że w zależności od typu komórki, rodzaju czynnika szkodliwego i jego intensywności komórka
może być kierowana na drogę apoptozy lub ulegać innym, stosunkowo niedawno poznanym typom
programowanej śmierci, np. autofagii. Cel pracy: W oparciu o przegląd najnowszego piśmiennictwa
naukowego z tego zakresu, w niniejszej pracy przedstawiono krótką charakterystykę typów programowanej śmierci komórkowej, ze szczególnym uwzględnieniem apoptozy i autofagii. Analizie poddano mechanizmy oraz metody detekcji tych procesów. Rozpatrzono także potencjalne powiązania pomiędzy programowaną i nieprogramowaną śmiercią komórki. Wyniki: Zgodnie z wytycznymi Komitetu do spraw
Nazewnictwa Śmierci Komórkowej – NCCD (Nomenclature Committee on Cell Death), wśród mechanizmów obumierania komórek, poza apoptozą, wyróżniono między innymi autofagię, katastrofę mitotyczną,
anoikozę, paraptozę, degenerację Walleriana, entozę oraz keratynizację. Apoptoza to proces zależny od
kaspaz, charakteryzujący się fragmentacją DNA oraz powstawaniem ciałek apoptotycznych. W warunkach ograniczonej dostępności substancji pokarmowych autofagia funkcjonuje jako mechanizm przetrwania komórki, jednak w wyniku nasilenia warunków stresowych, proces ten może funkcjonować jako
mechanizm śmierci komórki. Autofagia jest z reguły procesem niezależnym od kaspaz, charakteryzującym się powstawaniem autofagosomów. Metodyka wykrywania typów śmierci komórkowej opiera się na
technikach mikroskopowych, służących do obserwacji charakterystycznych zmian morfologicznych oraz
na metodach genetycznych i biochemicznych, umożliwiających wykrycie odpowiednio genetycznych lub
białkowych markerów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych. Wnioski: Pomimo dostępności licznych metod
badawczych, rozróżnienie poszczególnych rodzajów śmierci komórkowej zarówno programowanej, jak
i nieprogramowanej, nadal przysparza trudności. NCCD zaleca stosowanie co najmniej dwóch metod
53
identyfikacji obumarłych komórek, np. mikroskopii i metod biochemicznych, umożliwiających ocenę
różnych markerów danego procesu.
II-32 P | Genotypowanie i identyfikacja czynników wirulencji uropatogennych szczepów
Escherichia coli
Szemiako K., Krawczyk. B.
Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, Gdańsk
Wstęp: Escherichia coli są czynnikiem etiologicznym częstych infekcji pozajelitowych. Ponad 80% z nich
jest wywoływana przez uropatogenne szczepy Escherichia coli (UPEC), które mogą doprowadzić do
bakteriemii bądź sepsy. Cel pracy: Charakterystyka genetyczna szczepów E.coli izolowanych od
pacjentów z urosepsą pod względem występowania czynników wirulencji: fimbrie typu: P, S, 1, Dr,
cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący (CNF1), bakteriocyna Usp, α hemolizyna w celu określenia ich
patogenności oraz typowanie genetyczne izolatów w celu zbadania ich transmisji z moczu do łożyska
krwionośnego. Metody: Przebadano pulę 111 izolatów E. coli pochodzących od 29 pacjentów
Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego, hospitalizowanych w Klinice Nefrologii, Transplantologii i Chorób
Wewnętrznych oraz Poradni Nefrologicznej. U pacjentów tych stwierdzono sepsę o etiologii E.coli. Izolaty
były pozyskiwane z moczu oraz z łożyska krwionośnego pacjentów. Badania prowadzono
z wykorzystaniem nowoczesnych metod biologii molekularnej opartych o amplifikację techniką PCR
w układzie pojedynczej („simplex PCR”) i złożonej reakcji PCR („multiplex PCR”). Przeprowadzono
również genotypowanie izolatów pochodzących od indywidualnych pacjentów za pomocą techniki PCR
MP (ang. Melting Profile) w celu określenia ich klonalnej dyspersji z moczu do łożyska krwionośnego.
Unikalne wzory „fingerprinting” posłużyły do określenia prawdopodobnego źródła pochodzenia sepsy.
Wyniki: Wszystkie izolaty pochodzące od jednego pacjenta posiadały identyczny wzór „fingerprinting”.
U ponad 94% wszystkich izolatów występował, co najmniej jeden czynnik wirulencji. Najwięcej z nich
posiadało geny odpowiedzialne za produkcję bakteriocyny Usp (80,18 %), najmniej zaś zdolnych było do
syntezy cytotoksycznego czynnika nekrotyzującego (36,94%). U pacjentów po przeszczepie nerki
stwierdzono, że wszystkie izolaty posiadały takie czynniki wirulencji jak: fimbrie typu P i S oraz
bakteriocynę Usp. Izolaty, które zostały określone jednym genotypem (wśród izolatów pochodzących od
jednego pacjenta) w większości przypadków charakteryzowały się identycznym profilem czynników
wirulencji. Wnioski: U wszystkich pacjentów za wyjątkiem jednego doszło do transmisji bakterii z układu
moczowego do krwi. Analizowane czynniki wirulencji są charakterystyczne dla szczepów UPEC,
ponieważ ponad 90% z nich posiadało przynajmniej jeden z badanych czynników. Najczęściej
występującym czynnikiem wirulencji była bakteriocyna Usp, zaś czynnik nekrotyzujący CNF1 występował
w najmniejszej populacji izolatów. Nie można natomiast znaleźć wyraźnych korelacji pomiędzy odsetkiem
występowania poszczególnych czynników wirulencji u kobiet i mężczyzn oraz pomiędzy izolatami
pochodzącymi z krwi oraz z moczu.
II-33 P | Rola systemów naprawy DNA Mycobacterium tuberculosis w infekcji ludzkich
makrofagów prątkami gruźlicy
Szulc I., Klink M., Brzostek A., Kiełbik M., Brzezińska M., Sułowska Z., Dziadek J.
Wstęp: Podwójne pęknięcia nici DNA są niebezpieczne dla integralności genomu i jeśli nie są naprawione prowadzą do śmierci komórki. W naprawach podwójnych pęknięć DNA głównie zaangażowane są
54
dwa systemy: łączenie niehomologicznych końców DNA (NHEJ – non-homological end jojning) oraz
rekombinacja homologiczna. Podstawowymi białkami systemu NHEJ są białko Ku i ligaza D. W rekombinacji homologicznej kluczową rolę odgrywa białko RecA. Cel pracy: Celem pracy była ocena czy
mutant (∆KuDRec) z nieaktywnym systemem naprawy podwójnych pęknięć nici DNA różni się w zdolności do infekcji ludzkich makrofagów w porównaniu do szczepu dzikiego Mycobacterium tuberculosis
H37Rv. Metody: Przygotowano szczep M. tuberculosis H37Rv ze zinaktywowanymi genami kodującymi
białka Ku, LigD i RecA z wykorzystaniem rekombinacji homologicznej polegającej na wymianie natywnego genu na gen zmutowany. Komórki linii monocytarno-makrofagowej (THP1), nieaktywowane lub
aktywowane interferonem-γ, zakażano prątkami gruźlicy szczepu dzikiego H37Rv lub jego mutantem
∆KuDRec (nieopsonizowanymi lub opsonizowanymi ludzką surowicą AB). Oceniano fagocytozę i wewnątrzkomórkowe zabijanie bakterii oraz produkcję tlenku azotu (NO), reaktywnych form tlenu (RFT)
i czynnika martwicy nowotworu (TNF-α) przez makrofagi. Wyniki: Aktywowane i nieaktywowane makrofagi znamiennie mniej pochłaniają mutanta ∆KuDRec w porównaniu do szczepu dzikiego zarówno
w przypadku bakterii opsonizowanych jak i nieopsonizowanych. Wykazano również, że mutant ∆KuDRec
jest efektywniej niż szczep dziki zabijany przez makrofagi. Opsonizowany i nieopsonizowany mutant
∆KuDRec, podobnie jak szczep dziki, stymuluje aktywowane i nieaktywowane makrofagi do produkcji
NO. Zaobserwowano, że badane szczepy hamują produkcję RFT w aktywowanych makrofagach na
zbliżonym poziomie. Wykazano natomiast, że nieopsonizowany mutant ∆KuDRec znamiennie słabiej
hamuje produkcję RFT przez nieaktywowane makrofagi w porównaniu do nieopsonizowanego szczepu
dzikiego. Nie zaobserwowano różnic w zdolności aktywowanych makrofagów do produkcji TNF-α
w odpowiedzi na zakażenie szczepem dzikim i jego mutantem. ∆KuDRec znamiennie słabiej stymulował
nieaktywowane makrofagi do produkcji TNF-α w porównaniu do H37Rv. Wnioski: Uzyskane wyniki
sugerują, że M. tuberculosis z nieaktywnym systemem naprawy podwójnych pęknięć DNA ma osłabioną
zdolność infekcji makrofagów ludzkich.
____________________
Źródła finansowania: „Badania mechanizmów molekularnych na styku organizm ludzki – patogen – czynniki środowiska
(InterMolMed)”, POIG.01.01.02-10-107/09.
II-34 P | Limfocyty T regulatorowe w przebiegu zakażenia ECTV-MOS u myszy BALB/c
Szulc L., Martyniszyn L., Boratyńska A., Niemiałtowski M.
Zakład Immunologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,
Wstęp: Limfocyty T regulatorowe (Treg) są niejednorodną fenotypowo grupą komórek, odgrywającą
kluczową rolę w supresji i modulacji mechanizmów odpowiedzi immunologicznej. Wykazują ekspresję
cząsteczek CD25, CD122, CD27, a przede wszystkim czynnika transkrypcyjnego FoxP3 (forkhead box
3), który reguluje transkrypcję genów związanych z aktywnością immunoregulacyjną limfocytów. U myszy
czynnik FoxP3 występuje w limfocytach Treg CD4 + i CD8+. Stymulowanie wytwarzania Treg obserwuje
się w licznych zakażeniach wirusowych, np. wirusem krowianki (VACV) oraz wirusem grypy typu A,
w wyniku czego dochodzi do hamowania aktywności cytotoksycznej limfocytów T CD8 +. Cel pracy:
Celem niniejszej pracy była ocena udziału limfocytów Treg o fenotypie CD4 +CD25+FoxP3+
i CD8+CD25+FoxP3+ w supresji komórkowych mechanizmów efektorowych u myszy BALB/c (H-2d)
podczas zakażenia szczepem Moscow wirusa ektromelii (ECTV-MOS). Metody: Myszy BALB/c zakażano dostopowo wysoce patogennym ECTV-MOS w dawce 50 PFU (jednostek łysinkotwórczych)/mysz.
W 7, 14 i 21 dniu po zakażeniu (d.p.z.) pobierano od myszy drenujące węzły chłonne (DLN) oraz śledziony i przygotowywano zawiesinę pojedynczych komórek. Do wykrywania czynnika transkrypcyjnego
FoxP3 w limfocytach T CD4+ i T CD8+ użyto zestawu Mouse FoxP3 Buffer Set (BD Pharmingen) zgodnie
55
z zaleceniami producenta. Komórki znakowano fluorescencyjnie za pomocą przeciwciał anty-CD4-FITC
lub anty-CD8-FITC, anty-CD25-PerCP-Cy5.5 oraz anty-FoxP3-PE, zaś trójkolorową analizę przeprowadzono przy użyciu cytometru przepływowego FacsCalibur (Becton Dickinson). Wyniki: W 7 d.p.z. ECTVMOS nie obserwowano statystycznie istotnych różnic w odsetku komórek T CD4 + i T CD8+ wykazujących
ekspresję CD25+FoxP3+ w DLN oraz śledzionie myszy BALB/c w porównaniu do wartości uzyskanych
u niezakażonych zwierząt kontrolnych. W 14 d.p.z. odnotowano statystycznie istotne (p ≤ 0,05) zmniejszenie odsetka komórek CD25+FoxP3+ w populacji komórek T CD4+ izolowanych z DLN oraz śledzion
myszy BALB/c (odpowiednio 5,62% i 5,47%) w porównaniu do wartości kontrolnych (odpowiednio 7,27%
i 7,71%). Wnioski: We wczesnej fazie zakażenia ECTV-MOS myszy BALB/c limfocyty Treg nie uczestniczą w supresji swoistej odpowiedzi komórkowej, co wskazuje na możliwość istnienia innego mechanizmu
regulacyjnego.
II-35 P | Aktywność cytotoksyczna i przeciwwirusowa olejków eterycznych: goździkowego,
jałowcowego, tymiankowego i herbacianego
Kamińska T.1, Paduch R.1, Szuster-Ciesielska A.1, Kandefer-Szerszeń M.1, Żurek A.1, Woźniak A.2
1 Zakład
2
Wirusologii i Immunologii UMCS, Lublin
Katedra i Klinika Okulistyki Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Wstęp: Ciągłe zagrożenia chorobami wirusowymi, pojawianie się opornych szczepów wirusowych,
a także nieliczna grupa substancji przeciwwirusowych, zwykle o wąskim spektrum działania, powodują że
wciąż poszukuje się nowych leków przeciwwirusowych. Jeden nurt badań obejmuje syntezę nowych
chemioterapeutyków lub pochodnych już istniejących leków; drugi - to badanie związków pochodzenia
naturalnego, uzyskiwanych głównie z roślin. Cel pracy: Ocena aktywności cytotoksycznej i przeciwwirusowej olejków eterycznych: goździkowego, jałowcowego, tymiankowego i z drzewa herbacianego wobec
wirusów: HHV-1 (Human Herpes Virus-1), VSV (Vesicular Stomatitis Virus) i EMCV (Encephalomyocarditis Virus). Metody: Ocenę toksyczności różnych stężeń olejków eterycznych wykonano metodami MTT
oraz NR (Neutral Red). Badania przeprowadzono na komórkach ludzkiej rogówki (pRSV-T) (ATCC No.
CRL-11515). Wirusobójczą aktywność nietoksycznych stężeń olejków badano metodą in vitro w hodowlach ludzkich fibroblastów, w ludzkiej nowotworowej linii SiHa ( EEAA ) oraz komórkach linii L929. Wyniki: Zastosowano stężenia olejków od 0,001% do 2%. Stwierdzono, że olejek z drzewa herbacianego
(IC50=0,46 – MTT; IC50=0,24 – NR) był najmniej toksyczny dla komórek. Wyższą toksyczność wykazał
olejek goździkowy (IC50=0,019 – MTT; IC50=0,013 – NR), zaś najbardziej toksyczny dla badanych komórek był olejek tymiankowy (IC50=0,0047 – MTT; IC50=0,0095 – NR).Aktywność wirusobójcza badanych
olejków zależna jest od ich stężenia. Najsilniejsze działanie wirusobójcze wobec HHV-1 i VSV wykazywał olejek goździkowy, który w stężeniu 1% i 0,5% inaktywował je całkowicie w ciągu jednej godziny
inkubacji w temperaturze pokojowej. Żaden z badanych olejków nie inaktywował EMCV (wirus bez
osłonki); natomiast wszystkie olejki działały w różnym stopniu, zależnym od stężenia, na wirusy osłonkowe HHV-1 i VSV. Wnioski. Przypuszczamy, że substancje wchodzące w skład badanych olejków eterycznych inaktywują wirusy w wyniku oddziaływania na ich osłonki.
56
II-36 P | Aktywności alpha amylazy pochodzenia grzybowego w przewodzie pokarmowym
młodych świń z zewnątrzwydzielniczą niewydolnością trzustki
Szwiec K.1, Świeboda P.1, Kruszewska D.2,3
1 Wydział
Biologii Uniwersytetu Lund, Szwecja
Uniwersytet Lubelski imienia Jana Pawła II, Lublin, Polska
3 Instytut Medycyny Wsi, Lublin, Polska
2 Katolicki
Wstęp: Alpha amylaza jest jednym z najważniejszych enzymów trawiennych. Naturalnie występuje
oprócz pokarmu w ślinie, a najwięcej enzymu jest wydzielane przez trzustkę do światła dwunastnicy,
gdzie alfa amylaza osiąga maksymalną aktywność. W przypadku braku lub upośledzonej aktywności alfa
amylazy następuje zaburzenie trawienia węglowodanów. Cel: Celem pracy było określenie odzysku
wprowadzonej doustnie alpha amylazy izolowanej z Aspergillus oryzae (AoA) w próbkach treści przewodu pokarmowego świń z chirurgicznie wywołaną zewnątrzwydzielniczą niewydolnością trzustki (EPI).
Metody: Do badań użyto 6 EPI świń oraz 2 zdrowych zwierząt. Wszystkim zwierzętom wprowadzono
kaniule do przetok utworzonych w dnie żołądka, dwunastnicy, jelicie czczym oraz jelicie biodrowym.
Zwierzęta karmiono przez tydzień 2 razy dziennie paszą podstawową wzbogaconą tłuszczem. Ósmego
dnia z kaniul pobrano próbki treści, a następnie podano AoA w paszy wyłącznie EPI świniom, zdrowe
prosiaki karmiono bez dodatku enzymu. Po 5 minutach po podaniu paszy, pobrano drugą próbkę treści
od wszystkich zwierząt, trzecią próbkę natomiast po pół godzinie od rozpoczęcia karmienia. Pozostałe
6 próbek treści pobierano w odstępach godzinnych. W próbkach określano aktywność alfa amylazy
metodą Younga. Wyniki: Najwyższą aktywność alfa amylazy wykryto u EPI zwierząt w próbce z dwunastnicy i żołądka po 5 min od podania AoA z paszą. Po 4 godzinach po karmieniu zaobserwowano
znaczący wzrost aktywności alfa amylazy w próbkach z jelita biodrowego, co świadczy o stabilności AoA.
U zwierząt zdrowych wysoką aktywność alfa amylazy stwierdzono w dwunastnicy po 5 minutach od
rozpoczęcia karmienia świń. W pozostałych segmentach przewodu pokarmowego wykryto niewielką
aktywność enzymu. Wnioski: Zaobserwowano wysoką aktywność AoA w dwunastnicy, obszarze działania trzustkowej alfa amylazy. AoA wykazała wysoką stabilność i aktywność, w zróżnicowanym co do
odczynu, środowisku przewodu pokarmowego. Proponowany model z użyciem enzymu pochodzenia
grzybowego może być wykorzystany do testowania potencjalnych preparatów w zastępczej EPI terapii.
II-37 P | Wstępna ocena czystości mikrobiologicznej miodów pszczelich dostępnych na rynku
polskim, europejskim i światowym
Śliwińska A., Przybylska A., Bazylak G.
Katedra i Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera
w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Jagiellońska 13, 85-067 Bydgoszcz
Wstęp: Profil mikrobiologiczny stanowi ważne kryterium oceny jakości miodu pszczelego. Pierwotnie
w miodzie występują drożdże i spory bakterii przetrwalnikujących, należących głównie do rodzaju Bacillus
i Clostridium. W miodzie mogą się również znajdować zarodniki grzybów pleśniowych tj.: Aspergillus czy
Penicillium. Źródłem pierwotnych zanieczyszczeń mikrobiologicznych są przede wszystkim pszczoły,
pyłek kwiatowy i nektar. Miód może także zostać zanieczyszczony drobnoustrojami na etapie jego
odbierania i przetwarzania, a nieprzestrzeganie odpowiednich warunków sanitarnych może być przyczyną kontaminacji miodu m.in. bakteriami z rodzaju Escherichia czy Salmonella. Cel pracy: Celem podjętych przez nas badań była wstępna ocena jakości mikrobiologicznej wybranych miodów pszczelich
dostępnych na rynku polskim, która obejmowała oznaczenie liczby drobnoustrojów tlenowych (LDT) oraz
liczby drożdży i pleśni (LiDP). Celem pracy było także porównanie wyników badań własnych z publiko57
wanymi dotychczas wynikami analiz mikrobiologicznych miodu dostępnego na rynku polskim, europejskim i światowym. Metody: Liczbę drobnoustrojów tlenowych oznaczono poprzez posiew na jałowe płytki
Petriego zawiesiny próbek miodu oraz jej dziesięciokrotnych rozcieńczeń. Płytki zalano agarem PCA
i inkubowano w temperaturze 30ºC przez 72 h. W celu oznaczenia liczby drożdży i pleśni wykonano
posiew powierzchniowy zawiesiny wyjściowej i jej dziesięciokrotnych rozcieńczeń na podłoże DG. Płytki
inkubowano w 25ºC przez 120 h. Wyniki: Wykazano, że LDT wahała się od <10 jtk/g w przypadku miodu
spadziowego i faceliowego do 7,0×102 jtk/g w przypadku miodu wielokwiatowego. Według danych
literaturowych wartość LDT wynosiła od <10 jtk/g (portugalski miód kwiatowy) do 4,6×10 5 jtk/g (miód
akacjowy). Oznaczona LiDP była niewielka i stanowiła mniej niż 10 jtk/g, a w przypadku miodów opisanych w literaturze od <10 jtk/g do 9,0×102 jtk/g (miód rzepakowy). Wnioski: Na podstawie uzyskanych
danych można przypuszczać, że jakość mikrobiologiczna analizowanych miodów dostępnych w Polsce
jest zadowalająca. Problem ten wymaga wykonania dalszych szczegółowych i selektywnych analiz,
szczególnie dotyczących bakterii rodzaju Bacillus i Clostridium, które pozwolą na pełną ocenę profilu
mikrobiologicznego badanych miodów.
II-38 P | Badania rozwoju hiperoksalurii z możliwością zatrzymania i odwrócenia procesu powstawania kamienia zakażonego w nowym modelu zwierzęcym
Świeboda P.1, Szwiec K.1, Rola B.1, Kruszewska D.2
1 Wydział
Biologii, Uniwersytet w Lund, Szwecja
Przyrodniczy, Katolicki Uniwersytet Lubelski, Polska
2 Wydział Matematyczno
Wstęp: Jedną z najczęstszych przyczyn infekcji układu moczowego są zakażenia bakteryjne wywołane
głównie przez bakterie ureolityczne. W wyniku zakażenia może dochodzić do przesycenia moczu szczawianami, fosforanami, moczanami i rozwoju kamicy nerkowej. Cel pracy: Celem badań było ustalenie
modelu powstawania odwracalnej hiperoksalurii u rosnących świń w wyniku stosowania diety wzbogaconej w hydroksyprolinę. Użyta do badań trans-4-hydroksy-prolina (HP) jest fizjologicznym prekursorem
szczawianów, pochodną proliny i składnikiem kolagenu. Metody: Dwunastu świniom podawano HP
w diecie w zróżnicowanych dawkach, w stosunku do dziennej porcji paszy. Przez pierwsze 5 dni świnie
otrzymywały HP w stężeniu od 1 do 3%. Następnie przez kolejne 7 dni ich dieta zawierała 4 % HP. W 13
dniu badania zwierzęta podzielono na dwie grupy. Jedna z nich indukowana była nadal przez kolejne
dwa tygodnie 4% HP. Pozostałym sześciu świniom zaprzestano podawania HP.W trakcie doświadczenia
określono poziom szczawianów w moczu i we krwi świń, przy użyciu testu Trinity Biotech (Irlandia)
według Robertson, 1965. Wyniki: W grupie stale karmionej dodatkiem HP wykazano narastanie poziomu
szczawianów w moczu w przebiegu badań. Najwyższe stężenie szczawianów 135 ± 74 mg/24 h wykryto
w moczu w 27 dniu doświadczenia. W grupie świń, której od 13 dnia doświadczenia usunięto HP z diety
odnotowano od tego dnia spadek poziomu szczawianów w moczu. Poziom szczawianów w osoczu był
stabilny i nie różnił się istotnie u zwierząt obydwu grup doświadczalnych. W grupie zwierząt stale indukowanych HP wykryto przekrwienia i jamistości w miąższu nerek oraz stwierdzono obecność piasku
i kamieni o zróżnicowanej wielkości. Wnioski: W nowym modelu odwracalnej hyperoksalurii 7 dniowa
ekspozycja zwierząt na 4 % HP nie powoduje trwałych zmian w budowie i aktywności nerki, ponieważ
kolejne dwutygodniowe zaprzestanie podawania HP hamuje i cofa proces dysfunkcji nerki. Ustalenie
nowego modelu odwracalnego rozwoju hiperoksalurii z możliwością zatrzymania i odwrócenia procesu
powstawania kamienia zakażonego może być przydatne do oceny terapii przeciwzakaźnej.
58
II-39 P | Badanie wybranych cech biologicznych kolekcji szczepów klinicznych z rodzaju Proteus
Stańczyk J., Olek J., Konieczna E., Bawej E., Zabłotni A., Siwińska M., Drzewiecka D.
Zakład Mikrobiologii Ogólnej Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii UŁ
Wstęp: Bakterie z rodzaju Proteus zaliczane są do rodziny Enterobacteriaceae – pałeczek jelitowych. Te
Gram-ujemne bakterie są drobnoustrojami warunkowo chorobotwórczymi. P. mirabilis jest gatunkiem
najczęściej izolowanym z zakażeń wywoływanych przez rodzaj Proteus (70-90% infekcji). Bakterie te
najczęściej wywołują zakażenia dróg moczowych, zakażenia uszu, oczu, ran pooperacyjnych i pooparzeniowych. Bakterie z rodzaju Proteus wykształciły różne czynniki chorobotwórczości, dzięki którym
kolonizują wyższy organizm i wywołują w dalszej kolejności proces chorobowy. Do jednych z najważniejszych czynników należą m. in. rzęski oraz lipopolisacharyd. Cel pracy: W pracy oceniano zdolność do
wzrostu rozpełzłego oraz częstość występowania formy R i S wśród 165 klinicznych szczepów z rodzaju
Proteus, izolowanych od chorych z regionu łódzkiego. Metody: Zdolność do wzrostu rozpełzłego oceniano na płytkach L-bulionowych z dodatkiem 1,5 % agaru. Płytki posiewano centralnie, płynną hodowlą
szczepu i mierzono promień wzrostu. Formy S i R oceniono na podstawie pseudoaglutynacji w soli
fizjologicznej i testu termostabilności w temp. 100˚C w czasie 2,5 h. Wyniki: Analiza źródła izolacji
badanych szczepów klinicznych z rodzaju Proteus wykazała, że izolowano je głównie z moczu – 44,2%
(73 osoby) oraz ran – 13,3% (22 osoby), rzadziej z ucha, nosa, ujścia z cewnika, odbytu, odleżyn,
nasienia, pochwy czy ran martwiczych stopy. Częściej, bo w 58,9% (96 osób) izolowano te drobnoustroje
od kobiet. Mężczyźni stanowili 41,1% (67 osób) pacjentów. Wśród badanych chorych było 95 osób
powyżej 50 lat i 29 dzieci do 18 roku życia. Gatunkiem najczęściej izolowanym był P. mirabilis – 89,6%
(147 osób), znacznie rzadziej izolowano gatunki P. vulgaris – 4,9% (8 osób) i P. genomospecies 5,5% (9
osób). Wśród badanych szczepów bardzo dobrze pełzało 129 szczepów, słabiej 30 szczepów, a brak
wzrostu rozpełzłego odnotowano u 6 badanych szczepów. Formy S stanowiły 97% (160 szczepów),
formy R tylko 1,2% (2 szczepy), formy „R-wątpliwe” – 1,8% (3 szczepy). Wnioski: Zdecydowana większość przebadanych szczepów wykazywała intensywny wzrost rozpełzły, cechę charakterystyczną dla
drobnoustrojów z rodzaju Proteus. W większości szczepy te także wytwarzają LPS z rozbudowaną
częścią O-swoistą.
II-40 P | Lekooporne szczepy w mikroflorze odchodów kolonii gawronów
Turska-Szewczuk A.1, Urbanik-Sypniewska T.1, Palusińska-Szysz M.1, Kutkowska J.1, Kucharczyk H.2,
Wasyluk A.1, Zalewska J.1
1 Zakład
2 Zakład
Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej
Zoologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej
Wstęp: Dziko żyjące ptaki stanowią rezerwuar mikroorganizmów potencjalnie chorobotwórczych dla
ludzi. Największe zagrożenie epidemiologiczne jest związane z ich odchodami, w których przeżywają
bakterie wywołujące schorzenia układu pokarmowego. Ostatnio zaobserwowano wzrost liczby przypadków zakażeń o ciężkim przebiegu, wywołanych lekoopornymi szczepami enterokoków, w których geny
warunkujące wieloraką oporność na antybiotyki są zlokalizowane w integronach. Zagrożenie transmisji
wśród ludności wydaje się realne z uwagi na udowodnioną możliwość przenoszenia tych bakterii między
ptactwem a ludźmi. Cel pracy: W pracy przeprowadzono identyfikację bakterii w odchodach gawronów
(Corvus frugilegus) żerujących na terenie Lublina i 6 innych miejscowości. Badano czy w próbkach
odchodów gawronów pobranych w miejscach zanieczyszczonych odpadkami komunalnymi oraz poza
obszarami synantropijnymi występują szczepy potencjalnie chorobotwórcze i/lub noszące geny lekooporności. Metody: do selekcji użyto podłoża: Hektoen – różnicujące Enterobacteriaceae, HiCrome i Slanetz59
Bartley wybiórcze dla Enterococcus, Chapman - różnicujące dla Staphylococcus oraz Campylosel –
selektywne dla Campylobacter. Do określania fenotypu oporności na metycylinę, wankomycynę oraz
teikoplaninę zastosowano test dyfuzji krążkowej. Wybrane na podstawie fenotypowania szczepy gronkowców oporne na metycylinę oraz enterokoków opornych na jeden lub oba antybiotyki glikopeptydowe
badano metodą PCR ze starterami specyficznymi dla genów: mecA (produkty 527 i 310 pz), vanA
(produkt 732 pz) oraz vanB (produkt 647 pz). Wyniki: Badania wykazały, że mikroflora odchodów gawronów jest niezwykle różnorodna. W próbkach najczęściej identyfikowano bakterie z rodzajów Campylobacter, Enterococcus, E. coli i koliformy. W ponad 95% izolatów Staphylococcus opornych na metycylinę
wykryto produkty PCR dla genu mecA. Tak dużej korelacji nie stwierdzono dla glikopeptydoopornych
enterokoków ze względu na większą zmienność genów van. W 130 próbkach pobranych z kolonii lęgowych gawronów identyfikowano w zależności od miejsca od 10 do 30% szczepów gronkowców i enterokoków opornych na metycylinę lub wankomycynę/teikoplaninę. Wnioski: Odchody powstające w koloniach gawronów żerujących na obszarach zaludnionych i poza nimi są potencjalnym zagrożeniem
oportunistycznymi patogenami bakteryjnymi ze znacznym udziałem szczepów noszących geny wielorakiej oporności na antybiotyki aminoglikozydowe i glikopeptydowe.
II-41 P | Wytwarzanie biofilmu przez wieloleokooporne i wielolekowrażliwe szczepy Proteus
mirabilis
Wiśniewska M., Więckowska E., Kwiecińska-Piróg J., Jachna-Sawicka K., Gospodarek E.
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja
Kopernika w Toruniu
Wstęp: Pałeczki Proteus mirabilis należą do oportunistycznych patogenów człowieka. Są odpowiedzialne
za zakażenia przede wszystkim w obrębie układu moczowego. Dysponują wieloma czynnikami wirulencji,
m. in. zdolnością tworzenia biofilmu. Biofilm baterii ureazo-dodatnich ma specyficzną strukturę, gdyż
zawiera kryształy struwitu. Film bakteryjny uformowany na biomateriałach wprowadzonych do dróg
moczowych może doprowadzić do zamknięcia światła cewnika, czego konsekwencją jest zastój moczu,
sprzyjający groźnym powikłaniom u chorego. U wielu gatunków drobnoustrojów stwierdzono różnice
w tworzeniu biofilmu pomiędzy szczepami wielolekowrażliwymi (MDS) i wielolekoopornymi (MDR).
Natomiast niewiele jest informacji na temat biofilmu P. mirabilis. Cel pracy: Celem pracy było porównanie tworzenia biofilmu przez MDS i MDR szczepy P. mirabilis. Metody: Materiał do badań stanowiło 50
szczepów P. mirabilis z kolekcji Katedry i Zakładu Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera
w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Lekowrażliwość oznaczono zgodnie z rekomendacjami KORLD i CLSI. Szczepy oporne na trzy lub więcej grup leków przeciwdrobnoustrojowych
włączono do grupy MDR. Biofilm P. mirabilis tworzono w 96-dołkowych płytkach polistyrenowych. W celu
oceny ilościowej zastosowano wybarwianie chlorkiem trifenylotetrazoliowym (TTC), który jest metabolizowany do barwnego formazanu. Natężenie barwy formazanu oceniano spektrofotometrycznie przy
długości fali 490 nm. Dla każdego szczepu wykonano 6 powtórzeń. Kontrolę dodatnią stanowił szczep
Escherichia coli ATTC 25922. Otrzymane wyniki zakwalifikowano do jednej z pięciu kategorii: brak
tworzenia biofilmu, słabe, średnie, silne i bardzo silne tworzenie biofilmu. Przedziały pomiędzy kategoriami wyznaczono na podstawie średniej dla próby ślepej wraz z odchyleniami standardowymi oraz
wielokrotności otrzymanej wartości. Wyniki: Wszystkie szczepy MDS tworzyły biofilm. Bardzo silne
tworzenie biofilmu wykazano u 21 szczepów MDS i 5 MDR. Spośród 25 szczepów MDR, trzy nie tworzyły
biofilmu. Wykazano istotną statystycznie różnicę w tworzeniu biofilmu między szczepami MDS a MDR
(p=0,0002). Wnioski: Szczepy P. mirabilis MDS silniej tworzą biofilm w porównaniu do szczepów MDR.
60
II-42 P | Działanie bójcze wybranych związków polifenolowych
Więckowska-Szakiel M., Sadowska B., Bartnicka M., Budzyńska A., Różalska B.
Wstęp: Polifenole to klasa związków posiadających w cząsteczce jeden lub wiele pierścieni aromatycznych, zawierających liczne grupy hydroksylowe. Związki o takiej budowie występują powszechnie jako
metabolity wtórne roślin o znaczeniu ochronnym. Wśród nich ważną grupę stanowią produkty o charakterze fenoli, fenolokwasów oraz flawonoidy. Wiele z nich posiada właściwości antyoksydacyjne, przeciwzapalne i przeciwdrobnoustrojowe. Założono w niniejszych badaniach wyszukanie wśród dostępnych
komercyjnie preparatów reprezentujących różne klasy polifenoli tych o największej aktywności mikrobójczej. Cel pracy: Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej wybranych polifenolowych preparatów
komercyjnych wobec bakterii: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli NCTC 8196 i grzybów Candida albicans ATCC 10231. Weryfikacja parametrów metodycznych. Metody: Wybrane związki
(n=14) poddano skryningowi mikrobiologicznemu, równolegle trzema metodami jakościowo-ilościowymi:
„spot”, dyfuzyjno-krążkową oraz metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, wg rekomendacji CLSI. Każdą
z powyższych metod wcześniej zmodyfikowano w celu dostosowania jej parametrów do charakteru
fizyko-chemicznego fitozwiązków. Wyniki: Z grupy badanych preparatów największą aktywnością
stwierdzoną w metodzie dyfuzyjno-krążkowej charakteryzowały się tymol i karwakrol (w stęż. 20, 10
mg/ml strefa zahamowania wzrostu > 30 mm). Kemferol, chlorek pelargonidyny, naringenina, kwas
rozmarynowy, resweratrol wykazywały średniowysoką lub niską aktywność jedynie w stężeniu 20 mg/ml.
W ocenie aktywności biostatycznej fitozwiązków metodą mikrorozcieńczeń w bulionie najsilniejszą
aktywność wykazały kemferol, kwas oleanolowy, kwas ursolowy, karwakrol i tymol. Zakres ich stężeń
skutecznych przeciwdrobnoustrojowo (MIC) wynosił 31,2 -150 g/ml. Wnioski: Spośród badanych
związków najsilniejsze działanie przeciwdrobnoustrojowe wobec szczepów referencyjnych, oceniane
zarówno metodą jakościową (dyfuzji, „spot”), jak i metodą mikrorozcieńczeń, wykazywały kwas ursolowy,
kwas oleanolowy, kemferol, tymol, karwakrol. Część z tych związków skierowano do dalszych badań
mikrobiologicznych mających na celu ocenę aktywności przeciwadhezyjnej i przeciwbiofilmowej. Analiza
otrzymanych wyników wskazuje, iż niezwykle ważna w ocenie skuteczności mikrobójczej produktów
naturalnych tego typu, jest optymalizacja i standaryzacja stosowanych metod badawczych. Obejmuje ona
użycie odpowiedniego rozcieńczalnika związków polifenolowych zapewniającego maksymalny stopień
ich rozpuszczalności, wystandaryzowanie wielkości inokulum drobnoustrojów (nie mniejszego niż stosowane w ocenie skuteczności działania antybiotyków) oraz uwzględnienie interferencji barwy badanych
produktów w interpretacji zastosowanych metod pomiarowych.
II-43 P | Badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej ekstraktów roślinnych bogatych
w polifenole
Więckowska-Szakiel M.1, Sadowska B.1, Paszkiewicz M.1, Bartnicka M.1, Podsędek A.2, Dudzińska D.3,
Klepacka A.3, Różalska B.1
1 Katedra
Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki
Biochemii Technicznej, Politechnika Łódzki
3Zakład Zaburzeń Krzepnięcia, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
2 Instytut
Wstęp: Znane z doświadczeń etnomedycyny złożone preparaty, takie jak wyciągi i ekstrakty otrzymywane z różnych części roślin, stają się aktualnie coraz częstszym obiektem badań naukowych. Dominującą
w ich składzie kategorię związków stanowią polifenole, charakteryzujące się szerokim zakresem aktyw61
ności: antyoksydacyjną, przeciwalergiczną, przeciwzapalną, przeciwnowotworową, przeciwmiażdżycową.
Badania z ostatnich lat wykazują jeszcze inne ich właściwości, w tym przeciwdrobnoustrojowe. W tym
kontekście, istotnymi zaletami większości związków naturalnych jest ich zwykle niska toksyczność
w stosunku do komórek eukariotycznych oraz działanie mikrobójcze niezależne od profilu lekowrażliwości
patogenów. Tym samym, ekstrakty roślinne mogą mieć potencjalną wartość terapeutyczną w leczeniu
zakażeń, szczególnie jeśli wykażą synergizm z klasycznymi chemioterapeutykami lub w sposób pośredni
przyczynią się do podniesienia odporności przeciwzakaźnej makroorganizmu. Cel pracy: Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej 23 ekstraktów uzyskanych z różnych części roślin użytkowych rodzimego
pochodzenia. Metody: Badania skryningowe aktywności mikrobójczej ekstraktów naturalnych prowadzono równolegle metodą dyfuzyjno-krążkową, metodą „spot” i metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, zgodnie
z rekomendacjami CLSI. Organizmy docelowe: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli
NCTC 8196, Candida albicans ATCC 10231. Wyniki: Wykazano, iż największą wrażliwością na działanie
ekstraktów roślinnych charakteryzowały się S. aureus, a najmniejszą C. albicans. Preparaty uzyskane
z liści rokitnika i borówki czernicy, ziela rozmarynu oraz łusek cebuli żółtej wykazywały wysoką aktywność wobec S. aureus ATCC 6538, w zakresie stężeń MIC 0,97-1,58 mg/ml. Równie silnym działaniem
wobec E. coli NCTC 8196 charakteryzowały się jedynie ekstrakty z owoców jarząbu górskiego, których
MIC oszacowano na poziomie 2,83 mg/ml. Spośród wszystkich ekstraktów tylko nieliczne, w tym preparat
z ziela rokitnika wykazały aktywność przeciwgrzybiczą wobec C. albicans (MIC=15,57 mg/ml). Wnioski:
Wyniki badań wskazują na zróżnicowaną aktywność przeciwdrobnoustrojową ekstraktów roślinnych
wzbogaconych w związki polifenolowe - wyższą wobec drobnoustrojów Gram-dodatnich niż Gramujemnych. Najmniejszą wrażliwością na działanie zbadanych naturalnych preparatów „polifenolowych”
cechowały się grzyby drożdżoidalne. Ekstrakty o najwyższej aktywności przeciwbakteryjnej przeznaczono do dalszych badań nad wypracowaniem standardów alternatywnego leczenia określonych typów
zakażeń. Badana jest efektywność kombinacji klasycznych chemioterapeutyków z takimi naturalnymi
preparatami o aktywności biobójczej, niegenerującymi oporności patogenów.
II-44 P | Przeciwdrobnoustrojowe działanie ekstraktów z Physalis ixocarpa
Więckowska-Szakiel M.1, Bergier K.2., Budzyńska A.1, Skłodowska M.2, Różalska B.1
1 Katedra
2 Katedra
Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki
Fizjologii i Biochemii Roślin, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Znany impas antybiotykoterapii sprawia, iż wzrasta zainteresowanie roślinnymi związkami
naturalnymi, które mogłyby mieć zastosowanie zarówno w profilaktyce, jak i w leczeniu zakażeń oportunistycznych. Jedną z roślin, której różnorodne właściwości lecznicze cenione są od wieków jest Physalis
ixocarpa (miechunka pomidorowa). Przedstawiciele rodzaju Physalis są bogatym źródłem metabolitów
wtórnych, takich jak witanolidy, fyzaliny, alkaloidy tropanowe i nortropanowe, które charakteryzuje aktywność biologiczna o niezwykle szerokim spektrum działania, w tym także aktywność przeciwdrobnoustrojowa. Cel pracy: Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej ekstraktów otrzymanych z korzeni, kwiatów, liści i owoców miechunki pomidorowej wobec wybranych gatunków bakterii Gram-dodatnich Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis; Gram-ujemnych Pseudomonas
aeruginosa i grzybów Candida albicans. Metody: W badaniach wykorzystano metanolowe ekstrakty
z różnych organów Physalis ixocarpa L. Po odparowaniu metanolu z homogenatu tkanek, suchą pozostałość rozpuszczano w wodzie z dodatkiem alkoholu doprowadzając do stężenia 600 mg/ml. Biostatyczną
aktywność (MIC) uzyskanych preparatów oceniono metodą mikrorozcieńczeń w bulionie wg CLSI (pomiar spektrofotometryczny), natomiast działanie bakterio- i grzybobójcze (MBC) ekstraktów sprawdzono
metodą ilościowego wysiewu na odpowiednie podłoża hodowlane (po inkubacji inokulum z badanym
preparatem). Wyniki: Wykazano zróżnicowaną aktywność ekstraktów pozyskanych z korzeni, liści,
62
kwiatów i owoców Physalis ixocarpa. Ekstrakt z liści miał działanie hamujące wzrost bakterii w stężeniu
37,5 mg/ml, a wzrost Candida w stężeniu 18,75 mg/ml. Podobną aktywność wykazywał ekstrakt z kwiatów, MIC w zakresie stężeń 37,5 - 75,0 mg/ml. Ekstrakty z korzenia i owoców miechunki były natomiast
mniej aktywne - zakres wartości MIC wynosił 75-300 mg/ml. Stężenie ekstraktów z liści i z kwiatów
Physalis ixocarpa wykazujące działanie bakteriobójcze/grzybobójcze było równe wartości MIC lub dwukrotnie wyższe od stężenia opisującego MIC. Wnioski: Spośród przebadanych preparatów najlepsze
działanie bakteriobójcze i grzybobójcze wykazywały ekstrakty z liści miechunki. Ustalone stężenia
aktywne przeciwdrobnoustrojowo uznano za stosunkowo wysokie, chociaż zachęcające do kontynuacji
badań. Warto byłoby bowiem dokonać frakcjonowania ekstraktów z liści w celu wydzielenia i identyfikacji
produktów o najwyższej aktywności. Możliwe, że obserwowana stosunkowo niska skuteczność mikrobójcza nierozdzielanych ekstraktów Physalis ixocarpa częściowo wynika z przypuszczalnie niewielkiej
zawartości steroli i flawonoidów, znanych ze swojej aktywności w tym zakresie (Agata i wsp., 2010).
II-45 P | Aktywność przeciwbakteryjna dendrymerów polipropylenoiminowych (PPI)
w skojarzonym działaniu z norfloksacyną
Wrońska N.1, Jankowicz A.2, Golaska M.2, Appelhans D.3, Lisowska K.1
1 Katedra
Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki
Koło Biotechnologiczno-Mikrobiologiczne (SKN Bio-Mik)
3 Leibniz Institute of Polymer Research Dresden, Germany
2 Studenckie
Wstęp: Norfloksacyna należy do grupy antybiotyków fluorochinolowych, powszechnie stosowanych
w lecznictwie. Obecnie poszukuje się alternatywnych metod leczenia, które pozwoliłyby na zmniejszenie
terapeutycznej dawki tych antybiotyków. Nową klasą polimerów o obiecujących właściwościach przeciwbakteryjnych są dendrymery. Dendrymery polipropylenoiminowe (PPI) są to małe, silnie rozgałęzione,
sferyczne nanopolimery zawierające na powierzchni trzeciorzędowe grupy alkiloamonowe. Cel pracy:
Określenie właściwości przeciwbakteryjnych skojarzonego działania dendrymeru PPI z norfloksacyną
w stosunku do referencyjnych szczepów bakterii: Staphylococcus aureus ATCC 6538 i Escherichia coli
ATCC 25922. Metody: Aktywność przeciwbakteryjną dendrymeru i badanego antybiotyku oznaczano
zmodyfikowaną metodą mikrorozcieńczeń w bulionie, zgodnie z normą NCCLS (National Committee for
Clinical Laboratory Standards). Analiza polegała na pomiarze spektrofotometrycznym gęstości optycznej
hodowli drobnoustrojów z seryjnymi rozcieńczeniami badanych związków na płytkach titracyjnych. Układ
kontrolny stanowiła hodowla bakterii, bez dodatku analizowanych związków. Wyniki: W przeprowadzonych doświadczeniach dendrymer PPI dodawano w stałym stężeniu (50 µM), natomiast norfloksacyna
stosowana była w kilku wariantach stężeń (0,01-1 µg/ml). W badaniach skojarzonego działania dendrymeru PPI i norfloksacyny wobec E. coli wykazano wyższą aktywność przeciwbakteryjną, w porównaniu
z układem zawierającym sam antybiotyk lub sam dendrymer. Wysoki stopień zahamowania wzrostu
zaobserwowano w każdym z analizowanych stężeń norfloksacyny, jednak efekt był najbardziej widoczny
w przypadku najniższych stężeń antybiotyku. Powyższej zależności nie zaobserwowano dla Gram
dodatniego gronkowca S. aureus. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują, że jednoczesne podanie dendrymeru i niskich stężeń badanego antybiotyku powoduje wzrost aktywności przeciwdrobnoustrojowej
badanego układu.
63
II-46 P | Określenie aktywności antybakteryjnej anionowego dendrymeru fosforanowego oraz
dendrymeru w skojarzonym działaniu z ciprofloksacyną
Zawadzka K.1, Felczak A.2, Appelhans D.3, Lisowska K.2
1 Studenckie
Koło Naukowe Biotechnologiczno-Mikrobiologiczne, Uniwersytet Łódzki
Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki
3 Leibniz Institute of Polymer Research Dresden, Dresden, Germany
2
Wstęp: Nanotechnologia jest jedną z najdynamiczniej rozwijających się gałęzi nauki. Zajmuje się opracowaniem struktur rzędu wielkości kilku nanometrów, wśród których wyróżnia się dendrymery – makromolekuły o regularnej, silnie rozgałęzionej strukturze i kształcie zbliżonym do kuli. Ze względu na swoje
specyficzne właściwości dendrymery znalazły zastosowanie w medycynie m.in. jako nośniki środków
farmakologicznie aktywnych oraz kwasów nukleinowych. Niewiele natomiast wiadomo na temat właściwości przeciwdrobnoustrojowych wspomnianych makromolekuł. Większość publikacji w tej dziedzinie
dotyczy dendrymerów kationowych, niewielkim zainteresowaniem cieszą się dendrymery anionowe, które
charakteryzują się znacznie niższą toksycznością. Ciprofloksacyna należy do powszechnie stosowanych
antybiotyków fluorochinolowych, o szerokim spektrum działania wobec bakterii gram-ujemnych. Wzmocnienie działania antybakteryjnego ciprofloksacyny poprzez podanie jej z dendrymerem mogłoby umożliwić obniżenie stosowanej dawki antybiotyku. Cel pracy: Ocena aktywności antybakteryjnej anionowego
dendrymeru fosforanowego generacji trzeciej oraz dendrymeru w skojarzonym działaniu z ciprofloksacyną wobec referencyjnych szczepów bakterii E. coli, P. vulgaris i S. aureus. Metody: Aktywność antybakteryjną dendrymeru fosforanowego oraz dendrymeru i ciprofloksacyny zbadano zmodyfikowaną metodą
seryjnych rozcieńczeń w podłożu LB, zgodnie z normą National Committee for Clinical Laboratory Standards, polegającą na pomiarze spektrofotometrycznym gęstości optycznej hodowli drobnoustrojów
z seryjnymi rozcieńczeniami badanych związków. W badaniach wykorzystano stężenia dendrymeru
mieszczące się w zakresie od 0 do 150 μM oraz stałe stężenia ciprofloksacyny odpowiadające dawce
LD50. Wyniki: Przeprowadzone badania wykazały, iż dodatek dendrymeru fosforanowego do hodowli
S. aureus powodował ograniczenie wzrostu badanego szczepu o 20%-30%, w porównaniu do kontroli
biotycznych nie zawierających omawianego związku. W przypadku szczepu P. vulgaris inhibicja wzrostu,
niezależnie od stosowanego stężenia dendrymeru wynosiła 10%. Natomiast w hodowlach E. coli największe zahamowanie wzrostu drobnoustroju wynosiło ok. 15 %. Jednoczesne zastosowanie antybiotyku
i dendrymeru fosforanowego pozwoliło na zwiększenie aktywności antybakteryjnej testowanych związków, przy czym efekt ten był najlepiej widoczny w układach zawierających najniższe stężenia dendrymeru. W hodowlach zawierających ciprofloksacynę oraz dendrymer w stężeniu 1 μM wzrost szczepów
S. aureus i E. coli był ograniczony odpowiednio o 75% oraz 70%. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują,
że jednoczesne podanie bardzo niskich stężeń dendrymeru fosforanowego i ciprofloksacyny wzmacnia
działanie przeciwdrobnoustrojowe obu związków, co umożliwiałoby obniżenie dawki terapeutycznej
badanego antybiotyku.
64
Sesja III
Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki
w biotechnologii i mikrobiologii
środowiskowej
65
66
Wykład plenarny
Pozytywne i negatywne skutki aktywności degradacyjnej drobnoustrojów w środowisku
Długoński J.
Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii
Uniwersytetu Łódzkiego, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź
Rozwój cywilizacyjny ostatnich dwóch stuleci doprowadził do daleko idących zmian w otaczającym nas
środowisku. Wytwarzamy coraz więcej różnych produktów, które chcielibyśmy zabezpieczyć przed
destrukcyjnym wpływem drobnoustrojów. Jednocześnie staramy się pozbyć, z możliwie jak najmniejszym
nakładem kosztów, rzeczy już niepotrzebnych, jak i zanieczyszczeń towarzyszących naszej działalności.
Z punktu widzenia obiegu pierwiastków w przyrodzie, są to te same przemiany materii, zachodzące z
udziałem drobnoustrojów. Wyróżniamy tutaj trzy zasadnicze grupy procesów: rozkład substancji pochodzenia naturalnego, biodegradacja szeroko rozumianych ksenobiotyków, przemiany związków nieorganicznych. W każdym z tych obszarów można znaleźć wiele gatunków drobnoustrojów odznaczających
się szczególnie wysoką aktywnością metaboliczną, z jednej strony często niepożądaną (korozja mikrobiologiczna), z drugiej z powodzeniem wykorzystywaną w procesach przemysłowych, czy ochronie
środowiska. Przykładem mogą być liczne gatunki mikroorganizmów z rodzajów Bacillus, Aspergillus,
Penicillium odpowiedzialne za psucie się żywności oraz wykorzystywane do produkcji amylaz, proteaz,
pektynaz, a także rozkładu ksenobiotyków, czy bakterie Leuconostoc mesenteroides stanowiące poważne zagrożenie w przemyśle cukrowniczym oraz stosowane do produkcji dekstranu klinicznego. Poznanie
czynników i mechanizmów warunkujących aktywność metaboliczną drobnoustrojów, a tym samym
zdolność do opanowania środowiska, pozwala zarówno na zabezpieczenie się przed ich niepożądaną
działalnością, jak i umożliwia optymalne wykorzystanie mikroorganizmów w różnych dziedzinach działalności człowieka. Zagadnienia te zostaną bliżej omówione w trakcie prezentacji.
III-1 P | Występowanie endosymbiotycznych bakterii w komórkach boczniaka (Pleurotus (Fr.) P.
Kumm)
Adamski M., Pisarska K., Pietr S.J.
Zakład Mikrobiologii Rolniczej, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Wstęp: Endosymbionty bakteryjne w komórkach grzybów opisano dla kilku gatunków. Opisywane
bakterie to obligatoryjne endosymbionty, próby ich hodowli na podłożach kończyły się niepowodzeniem
lub były ograniczone czasowo. Wewnątrzkomórkowe bakterie zasiedlające grzyby są opisywane jako
organizmy mające zdolność wiązania wolnego azotu. Zaopatrują w ten sposób gospodarza w przyswajalne związki azotowe i wspomagają jego rozwój. Cel pracy: Celem niniejszej pracy była izolacja endosymbiotycznych bakterii zasiedlających komórki boczniaka, analiza zróżnicowania, oraz ocena ich
potencjalnej zdolności do wiązania wolnego azotu. Metody: Przebadano 9 linii boczniaka pochodzących
z kolekcji Katedry Technologii Owoców, Warzyw i Grzybów Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie.
W celu stwierdzenia obecności endosymbiontów komórki grzybów wybarwiono znacznikiem fluorescencyjnym (Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Bacteria, Biotium) i obserwowano przy użyciu mikroskopu
florescencyjnego. W celu izolacji endosymbiontów grzybnia została roztarta w 0,85% NaCl. Zawiesiną
inokulowano zmodyfikowane podłoże TSB zawierające 50 ppm nystatyny. Izolaty poddano analizie
molekularnej z wykorzystaniem technik PCR. Wykorzystano primery SMY-F511 i SMY-F1382 dla
67
markera 16S rDNA oraz PolF i PolR dla genu nifH. Dodatkowo przeprowadzono próbę hodowli izolatów
na różnych podłożach. Wyniki: W obrazie mikroskopowym stwierdzono obecność bakterii wewnątrz
komórek wszystkich linii boczniaka. Z każdej linii uzyskano jeden homogenny izolat. Pośród 9 izolatów
endosymbiontów wyróżniono 6 różnych wielkości produktu PCR (862pz – 2 izolaty, 839pz – 2 izolaty,
809pz – 2 izolaty, 829pz – 1 izolat, 819pz – 1 izolat, 799pz – 1 izolat). Badania z markerem genu nifH we
wszystkich przypadkach dały wynik negatywny. Pojedyncze kolonie endosymbiontów obserwowano
jedynie na podłożu TSA w obecności grzybów lub ekstraktu z grzybni. Wnioski: Obserwowany wzrost
endosymbiontów jedynie w obecności żywej grzybni lub ekstraktów wskazuje na ich bezwzględnie
endosymbiotyczną naturę. Różne wielkości uzyskanego fragmentu 16S rDNA mogą sugerować zróżnicowanie badanych izolatów w poszczególnych liniach boczniaka. Brak genu nifH u badanych endosymbiontów nie potwierdza ich roli w udostępnianiu tego składnika pokarmowego boczniakowi.
III-2 P | Czeremcha amerykańska zmniejsza stopień porażenia liści dębu bezszypułkowego przez
patogenicznego grzyba Microsphaera alphitoides
Bielinis E.1, Robakowski P.1, Kruk M.1, Behnke-Borowczyk J.2, Wiatrowska B.3
1 Katedra
Hodowli Lasu, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu,
Fitopatologii Leśnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu,
3 Katedra Przyrodniczych Podstaw Leśnictwa, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
2 Katedra
Wstęp: Czeremcha amerykańska konkuruje w naszych lasach z rodzimymi gatunkami roślin. Dzięki
dynamicznym przyrostom wysokości szybko osiąga przewagę nad sąsiadami. Na siedliskach boru
mieszanego świeżego i lasu mieszanego świeżego rośnie razem z siewkami dębu bezszypułkowego pod
okapem sosny. Sąsiedztwo czeremchy może hamować rozwój wolniej rosnących siewek dębu, a właściwości allelopatyczne mogą dodatkowo obniżać ich żywotność. W literaturze i w praktyce hodowli lasu nie
znaleziono przykładów pozytywnych interakcji między siewkami czeremchy amerykańskiej a rodzimymi
gatunkami drzew. Cel: Liście dębu są często atakowane przez patogenicznego grzyba Microsphaera
alphitoides. Grzyb ten najczęściej nie powoduje obumierania całych siewek, ale powtarzające się infekcje
mogą znacznie osłabić ich kondycję. W doświadczeniu kontrolowanym przetestowano hipotezę, że
bliskie sąsiedztwo siewek czeremchy oraz liście tego gatunku dodawane do substratu doniczkowego nie
będą wpływać na stopień porażenia siewek dębu bezszypułkowego przez Microsphaera alphitoides.
Wyniki: Zwiększanie liczby siewek czeremchy amerykańskiej sadzonych w doniczkach razem z siewkami dębu bezszypułkowego spowodowało istotną redukcję liczby siewek oraz liści porażonych przez
Microsphaera alphitoides. Najwięcej siewek z mączniakiem stwierdzono w wariancie z trzema siewkami
dębu (56%), a w wariancie trzy siewki dębu + sześć siewek czeremchy + liście czeremchy było ich
najmniej (3%). Proporcja zarażonych dębów malała wraz z rosnącą liczbą siewek czeremchy w doniczce.
Podobnie zmieniała się proporcja porażonych liści. Najwięcej (35%) było ich w wariancie z trzema
siewkami dębu, a najmniej (6%) w wariancie trzy siewki dębu + sześć siewek czeremchy + liście czeremchy. Między pośrednimi wariantami (trzy siewki dębu + liście czeremchy, trzy siewki dębu + trzy siewki
czeremchy i trzy siewki dębu + trzy siewki czeremchy + liście) różnice pod względem procentu porażonych siewek i liści były mniejsze. Wnioski: Porażenie siewek dębu bezszypułkowego przez Microsphaera alphitoides było mniejsze w obecności siewek i liści czeremchy. Mogło to być spowodowane pogorszeniem się warunków świetlnych pod okapem siewek czeremchy. Nie można jednak wykluczyć oddziaływania allelochemicznego lotnych związków emitowanych przez liście tego gatunku.
68
III-3 P | Technika dot-blot we wczesnej detekcji zmian w populacji bakterii nitkowatych w osadzie
czynnym
Błaszczyk D.1, Bednarek I.1., Sołtysik D.1., Machnik G.2
1 Zakład
Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Farmakologii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
2 Katedra
Wstęp: Celem nowoczesnej prewencji pęcznienia osadu czynnego jest działanie na etapie pojawiania
się pierwszych oznak zachwiania równowagi ekosystemu, niedostrzegalnych w standardowo stosowanych metodach analizy oraz wczesne podjęcie odpowiednich czynności minimalizujących ewentualne
straty w wydajności pracy oczyszczalni ścieków. Duża różnorodność i okresowa zmienność w składzie
mikrobiologicznym osadu czynnego wyklucza stworzenie uniwersalnych technik detekcji. Metody molekularne, m.in. hybrydyzacja DNA, dają możliwość dokładnej analizy eliminującej morfologiczne podobieństwo drobnoustrojów nitkowatych przy ich genetycznej odmienności oraz wykrycia takich zmian w biocenozie osadu, które znacząco wpływają na stan i funkcjonowanie osadu. Cel pracy: Wczesna detekcja
modyfikacji składu gatunkowego biocenozy osadu czynnego, monitorowanego sezonowo, ze szczególnym uwzględnieniem bakterii nitkowatych z rodzaju Chloroflexi, których zmiana liczebności może prowadzić do pęcznienia osadu. Materiały i metody: Hybrydyzacja genomowego DNA z prób osadu czynnego
(prawidłowego i spęczniałego) z sondą molekularną, znakowaną w czasie PCR, specyficzną wobec
bakterii z rodzaju Chloroflexi, stworzoną na bazie analizy porównawczej in silico zsekwencjonowanych
fragmentów genu 16S rRNA bakterii z osadu czynnego. Kolorymetryczna detekcja sond znakowanych
biotyną. Wyniki: Klonowanie amplimerów 16S rRNA w układzie prokariotycznym oraz poznanie ich
sekwencji umożliwiło analizę porównawczą i wyodrębnienie sekwencji konsensusowej, występującej
w próbach pochodzących ze spęczniałego osadu czynnego i w nielicznych próbach osadu prawidłowego.
Sekwencja, specyficzna względem bakterii z rodzaju Chloroflexi, posłużyła do otrzymania sondy
o długości 304 pz, użytej w dalszym teście hybrydyzacji. Sygnał detekcji sond hybrydyzujących do
fragmentu genu 16S rRNA dla prób osadu spuchniętego wykazywał znacznie większą intensywność,
w porównaniu z osadem prawidłowym, przy czym jego natężenie różniło się pomiędzy próbami spęczniałego osadu. Wnioski: Bakterie z rodzaju Chloroflexi charakteryzuje okresowa zmiana liczebności
w osadzie czynnym, a ich obfite występowanie związane jest z jego puchnięciem. Opracowanie specyficznych sond oraz optymalnych warunków hybrydyzacji i detekcji daje możliwość interwencyjnej analizy
prób osadu czynnego pod kątem pojawiania się wczesnych oznak pęcznienia osadu oraz modyfikacji
pracy oczyszczalni ścieków dla uzyskania lepszej wydajności procesu.
III-4 P | Mycobacterium frederiksbergense IN 53: środowiskowy izolat zdolny do równoczesnego
degradowania węglowodorów alifatycznych i aromatycznych
Brzeszcz J.1, Steliga T.2, Kaszycki P.3, Kapusta P.1
1 Zakład
Mikrobiologii, Instytut Nafty i Gazu, Kraków
Technologii Eksploatacji Płynów Złożowych, Instytut Nafty i Gazu, Krosno
3 Katedra Biochemii, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
2 Zakład
Wstęp: Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), stanowią poważne zagrożenie tak dla
środowiska naturalnego, jak i zdrowia ludzkiego. Jakkolwiek zagadnienia biologicznego oczyszczania
gleb skażonych węglowodorami alifatycznymi są dobrze zbadane, a technologie oparte na zastosowaniu
wyspecjalizowanych mikroorganizmów stosowane od szeregu lat, to skuteczna biodegradacja WWA jest
wciąż sporym wyzwaniem. Ponieważ substancje ropopochodne stanowią z reguły mieszaninę różnego
rodzaju węglowodorów, niejednokrotnie nawet aktywne i zróżnicowane konsorcja mikroorganizmów nie
są w stanie zneutralizować wszystkich zanieczyszczeń. Rozwiązaniem o dużym potencjale wykorzystania w technologiach bioremediacyjnych wydaje się być poszukiwanie takich mikroorganizmów, które
będą posiadały szlaki metaboliczne umożliwiające równoczesne degradowanie węglowodorów alifatycznych i aromatycznych. Cel pracy: Celem niniejszej pracy było poszukiwanie, izolacja ze środowiska
69
skażonego substancjami ropopochodnymi oraz identyfikacja bakterii wykazujących zdolność do równoczesnej degradacji węglowodorów alifatycznych i aromatycznych. Otrzymane izolaty oceniano pod kątem
ich przydatności i możliwości wykorzystania w konsorcjach mikroorganizmów przeznaczonych do likwidacji zanieczyszczeń ropopochodnych w glebie. Metody: Izolacja szczepów prowadzona była na podłożach minimalnych z dodatkiem mieszanin wybranych węglowodorów alifatycznych oraz aromatycznych
jako jedynych źródeł węgla. Identyfikacji bakterii dokonywano na podstawie analizy sekwencyjnej genu
16S rRNA oraz standardowych testów biochemicznych. Badano zdolności wzrostu w obecności rozmaitych węglowodorów. Jakościowe i ilościowe oznaczanie sumy substancji ropopochodnych (TPH), identyfikacja węglowodorów oraz ilościowe i jakościowe oznaczanie zawartości węglowodorów alifatycznych
i aromatycznych prowadzono metodą chromatografii gazowej z detektorem FID. Ocena stopnia biodegradacji substancji ropopochodnych dokonywana była przy użyciu biomarkera 17α(H),21α(H)-hopan.
Wyniki: Wyizolowano i zidentyfikowano szczep bakteryjny Mycobacterium frederiksbergense IN53, który
efektywnie rozkładał zarówno węglowodory alifatyczne, jak i aromatyczne. Szczep posiada zdolności
wykorzystywania jako jedynego źródła węgla nC10-nC22 oraz węglowodorów aromatycznych: antracenu,
bifenylu i naftalenu. Obecność szczepu w konsorcjum mikroorganizmów wpłynęła korzystnie na proces
usuwania węglowodorów alifatycznych i aromatycznych w glebie skażonej substancjami ropopochodnymi. Wnioski: Uzyskane wyniki świadczą o celowym dla biotechnologii środowiska, poszukiwaniu szczepów mikroorganizmów, posiadających aktywne szlaki metaboliczne degradacji węglowodorów alifatycznych i aromatycznych.
III-5 P | Wytwarzanie enzymów celulolitycznych, proteolitycznych i chitynolitycznych przez
myksobakterie wyizolowane z gleby leśnej
Brzezińska A.J., Dahm H.
Zakład Mikrobiologii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej,
Uniwersytet Mikołaja Kopernika, ul. Gagarina 9, 87-100 Toruń
Wstęp: Myksobakterie to mikroorganizmy charakteryzujące się wieloma niezwykłymi cechami, które
sprawiają, że są one najbardziej skomplikowanymi prokariota spośród dotychczas poznanych. Wykazują
one aktywność enzymatyczną szczególnie w rozkładzie biologicznych makromolekuł. Niektóre z tych
organizmów rozkładają celulozę, inne są drapieżcami - żywią się atakując inne mikroorganizmy (eubakterie, drożdże, grzyby strzępkowe) za pomocą tzw. „taktyki wilków”. Atakują ofiary poprzez wydzielenie
przez duże grupy komórek związków dyfuzyjnych, które zabijają i rozkładają ofiary znajdujące się w ich
sąsiedztwie. Ze względu na wysoką aktywność enzymatyczną, która wpływa na regulację jakościowo ilościową populacji różnych mikroorganizmów, myksobakterie odgrywają znaczącą rolę w przyrodzie.
Wzbudzają coraz większe zainteresowanie jako producenci enzymów litycznych, proteaz, celulaz oraz
bakteriocyn i lektyn. Cel pracy: Celem niniejszej pracy było zbadanie aktywności enzymatycznej (celulolitycznej, proteolitycznej i chitynolitycznej) trzydziestu szczepów myksobakterii wyizolowanych z gleby
leśnej, wyselekcjonowanie z tej grupy myksobakterii szczepów o wysokiej aktywności enzymatycznej
i wykorzystanie ich do dalszych badań. Metody: Aktywność celulolityczna myksobakterii zbadano wg
metody Cai i in. (1994). Aktywność chitynolityczna myksobakterii zbadano metodą Jyh-Ping Chen i MawShyan Lee (1994). Aktywność proteolityczna myksobakterii zbadano metodą wg Hazena (1965). Wyniki:
Dotychczas wykazano, że zbadane szczepy myksobakterii nie wytwarzały enzymów chitynolitycznych.
Syntetyzowały natomiast, w większości przypadków, celulazy i proteinazy.
70
III-6 P | Skrining różnych gatunków drożdży pod względem zawartości polisacharydów ściany
komórkowej o właściwościach funkcjonalnych
Bzducha-Wróbel A., Błażejak S.
Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności, SGGW w warszawie
Wstęp: Polisacharydy izolowane ze ściany komórkowej drożdży, takie jak β(1,3)-/ β(1,6)- glukan i mannoproteiny, wykazują szereg właściwości funkcjonalnych, zarówno pod względem prozdrowotnym, jak
i technologicznym. Proponowane są jako suplement diety, przede wszystkim ze względu na stymulację
odpowiedzi immunologicznej w organizmie ludzi i zwierząt. Prozdrowotne oddziaływanie tych polimerów
polega także na wiązaniu szkodliwych substancji chemicznych i aktywności przeciwdrobnoustrojowej.
Ponadto stanowią naturalny błonnik pokarmowy o charakterze prebiotycznym. Prowadzone są również
badania nad ich właściwościami hydrokoloidowymi. Obecnie najdokładniej poznanym gatunkiem pod
względem budowy ściany komórkowej są drożdże Saccharomyces cerevisiae, podstawowe źródło
otrzymywania polisacharydów drożdżowych na skalę przemysłową. Cel pracy: Z powyższych względów
podjęto badania, których celem było określenie zawartości i przybliżonego składu polisacharydów ściany
komórkowej różnych gatunków drożdży. Metody: Materiałem badawczym było siedem szczepów drożdży, tj. Saccharomyces cerevisiae R9, Saccharomyces boulardii, Candida utilis (ATTC9950 i KKP 344),
Yarrowia lipolytica (KKP 322 i KKP 379 oraz Kluyveromyces fragilis R11. Preparaty ścian komórkowych
uzyskiwano na drodze autolizy komórek drożdży. Poddawano je następnie frakcjonowaniu w warunkach
alkalicznych na poszczególne polisacharydy. Frakcje nierozpuszczalne w zasadach trawiono enzymatycznie celem oddzielenia β(1,6)-glukanu od β(1,3)-glukanu. Uzyskane frakcje hydrolizowano, oznaczając
następnie cukry redukujące metodą kolorymetryczną z odczynnikiem DNS. Wyniki: Badane szczepy
drożdży charakteryzowały się podobną zawartością ściany komórkowej (ok. 30% suchej biomasy drożdży). Zawartość cukrów ogółem w badanych preparatach stanowiła 30 - 57%, odpowiednio w przypadku
Kluyveromyces fragilis R11 i Yarrowia lipolytica KKP 379. Najwyższy sumaryczny udział β-glukanów
wykazały drożdże Saccharomyces cerevisiae R9 (ok. 71%) oraz Yarrowia lipolytica KKP 322 i KKP 379
(tj. ok. 55 i 58%). Jednocześnie dwa ostatnie gatunki odznaczały się najwyższą zawartością β(1,6)glukanu we frakcji polimerów β-D-glukopiranozy, co świadczy o wyższym stopniu rozgałęzienia łańcuchów β-glukanu.Najbogatsze w mannoproteiny okazały się preparaty otrzymane z drożdży Candida utilis
(ok. 74% dla obu badanych szczepów), Kluyveromyces fragilis (ok. 72%) oraz Saccharomyces boulardii
(ok. 68%). Wnioski: Badane drożdże mogą stać się nowym źródłem polisacharydów o przemysłowym
i medycznym znaczeniu. Dalsze prace powinny być ukierunkowane na przeprowadzenie dokładniejszej
charakterystyki izolowanych polimerów, określenie aktywności prozdrowotnej i próbę intensyfikacji ich
biosyntezy.
III-7 P | Ocena wpływu wybranych szczepów drożdży Saccharomyces cerevisiae na fermentację
hydrolizatów lignocelulozowych
Dziekońska U., Patelski P.
Zakład Technologii Spirytusu i Drożdży, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka
Wstęp: W ostatnich latach coraz większe zainteresowanie wzbudzają biopaliwa, zwłaszcza biopaliwa II
generacji, wytwarzane m.in. z surowców lignocelulozowych. W celu przeprowadzenia celulozy zawartej
w surowcu do cukrów prostych stosuje się rożne rodzaje hydrolizy, głównie z zastosowaniem agresywnych odczynników chemicznych. Otrzymane w ten sposób hydrolizaty zawierają poza cukrami fermentowanymi przez drożdże także związki będące produktami rozkładu kompleksu lignocelulozowego, które
wpływają hamująco na fermentację alkoholową. Dobór drożdży, zdolnych do efektywnej fermentacji
71
hydrolizatów wydaje się być kluczowym etapem w produkcji bioetanolu II generacji z surowców lignocelulozowych. Cel pracy: Celem podjętych badań była ocena przydatności wybranych szczepów drożdży
Saccharomyces cerevisiae do wydajnej fermentacji hydrolizatów lignocelulozowych. Metody: W badaniach wykorzystano szczepy drożdży Saccharomyces cerevisiae D 2, M6, M2 oraz Bc-16 pochodzące
z kolekcji Zakładu Technologii Spirytusu i Drożdży PŁ. Czyste kultury drożdży przeszczepiono ze skosu
do płynnego podłoża YPG (48h/30ºC), przeniesiono następnie do 3x150ml YPG, hodowlę prowadzono
na wytrząsarce przez 48h w 30ºC. Po tym czasie biomasę odwirowano, przemyto dwukrotnie sterylną
solą fizjologiczną i zawieszono w 100ml soli fizjologicznej. Tak otrzymane mleczko drożdżowe służyło do
zaszczepienia hydrolizatów. Hydrolizaty lignocelulozowe otrzymano przez zastosowanie hydrolizy
kwasowej oraz hydrolizy enzymatycznej (z wykorzystaniem komercyjnego preparatu celulolitycznego)
poprzedzonej wstępną obróbką kwasową. Po fermentacji oznaczono zawartość alkoholu, wykorzystanie
cukrów oraz wydajność procesu. Fermentacje prowadzono przez 5 dni w temperaturze 30ºC, kontrolując
ubytki masy poszczególnych prób w celu oznaczenia dynamiki. Po zakończonej fermentacji oznaczono
zawartość alkoholu w próbach, oraz obliczono wydajność fermentacji Wyniki: Wióry brzozowe odznaczały się zawartością celulozy na poziomie 51,39% s.s. Zastosowanie hydrolizy kwasowej doprowadziło do
uwolnienia 12,36g/l cukrów redukujących, natomiast hydroliza enzymatyczna z zastosowaniem preparatu
Accellerase 1500, poprzedzona wstępną obróbką kwasową doprowadziła do uwolnienia 23,31 g/l substancji redukujących. Najlepszą, blisko 80%, efektywność procesu zaobserwowano po fermentacji
hydrolizatu kwasowo-enzymatycznego z użyciem szczepu M6. Najniższą efektywność odnotowano
w przypadku szczepu D2 po fermentacji hydrolizatu otrzymanego metodą kwasową: wykorzystane
zostało jedynie 53% cukrów. Testowane szczepy kończyły fermentacje w czasie do 120 godzin, najkrótszym okresem zafermentowania odznaczał się szczep M6 (25 godzin), dla pozostałych szczepów czas
potrzebny na zafermentowanie wynosił około 30 godzin. Wnioski: Wykazano, że badane szczepy
wykazywały niezbyt wysoką efektywność w fermentacji hydrolizatów lignocelulozowych, co mogło być
spowodowane obecnością substancji toksycznych. Najlepsze wyniki uzyskano dla szczepu M 6, dla
którego zarówno wydajność alkoholu jak i wykorzystanie cukrów były najwyższe.
III-8 P | Analiza morfologiczna komórek Candida albicans poddanych działaniu ekstraktu
z pelargonii (Pelargonium zonale)
Fiołka M.1, Chromy K.1, Ptaszyńska A.2, Wydrych J.3
1 Zakład
Immunologii Bezkręgowców,
Botaniki i Mykologi,i
3 Zakład Anatomii Porównawczej i Antropologii, Instytut Biologii UMCS, Lublin, Polska
2 Zakład
Wstęp: Powszechne stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum, w terapii chorób bakteryjnych, może
prowadzić do zaburzeń w organizmie i pojawienia się grzybicy. Kandydoza, zwana również drożdżycą
jest najczęściej wywoływana przez grzyby z rodzaju Candida (C. albicans, C. glabrata, C. crusei,
C. parapsilos, C. tropicalis), ale głównie przez Candida albicans. Szacuje się, że w krajach rozwiniętych
na tę chorobę cierpi powyżej 30% populacji, a obecnie tego typu infekcje są 15 razy częstsze niż 15 lat
temu. Wzrosła również śmiertelność z powodu zachorowania na drożdżycę w grupie osób wysokiego
ryzyka (chorujących na białaczkę, zespół zaburzeń odporności, AIDS oraz noworodków zakażonych
przez matkę). Stosowane w leczeniu antybiotyki, oprócz bakterii chorobotwórczych, eliminują bakterie
które spełniają pozytywną rolę w organizmie. Efektem tego jest zaburzenie równowagi między korzystnymi bakteriami, a grzybami z rodzaju Candida, co prowadzi do groźnej choroby jaką jest kandydoza. Cel
pracy: Rozwój nowych strategii zapobiegania i leczenia grzybic jest jednym z najważniejszych wyzwań,
jakie stawia się współczesnej nauce. Dlatego istotne jest poszukiwanie nowych, naturalnych źródeł
aktywności przeciwgrzybowej. Do takich źródeł zalicza się ekstrakty z pelargonii, które od dawna stoso72
wane są przez afrykańskich uzdrowicieli w leczeniu kaszlu, biegunek, gruźlicy, a także wielu innych
dolegliwości. W ostatnich latach odkryto także działanie przeciwgrzybowe ekstraktów z korzeni pelargonii, głównie przeciwko C. albicans, C. glabrata oraz C. crusei. Metody: Ekstraktem z pelargonii (Pelargonium zonale) działano na komórki C. albicans (szczep dziki). Morfologię komórek obserwowano
w mikroskopie konfokalnym bez barwienia (stosowano laserowy skan dwuwymiarowy w technice kontrastu Nomarskiego) oraz z zastosowaniem fluorochromu Calcofluor- white. Ponadto przeprowadzano
obserwacje przy użyciu mikroskopu skaningowego Tescan Vega oraz analizę aktywności metabolicznej
komórek testem LIVE/DEAD Yeast Viability Kit. Wyniki: Po inkubacji C. albicans z ekstraktem (16 μg/ml
białka) przez 48 godzin w 37°C obserwowano zwiększone zdolności adhezyjne komórek, tworzenie
agregatów wielokomórkowych z wyraźnie pogrubioną ścianą w miejscu połączenia komórek, tworzenie
dużej ilości pseudostrzępek różnej grubości, często występujące formy filamentowe
z charakterystycznymi pączkami oraz komórki olbrzymie. Aktywność metaboliczna C. albicans była
obniżona. Wnioski: Ekstrakt z pelargonii zawiera bioaktywne komponenty o działaniu przeciwgrzybowym. Wykazuje aktywność przeciwko Candida albicans zmieniając morfologię komórek. Jest obiecującym źródłem pozyskania preparatu przeciwgrzybowego.
III-9 | Charakterystyka wybranych właściwości mikrobiologicznych osadu z oczyszczalni ścieków
mleczarskich
Frąc M., Oszust K., Rutkowska A.
Instytut Agrofizyki Polskiej Akademii Nauk, ul. Doświadczalna 4, 20-290 Lublin 27
Wstęp: Utrzymanie równowagi w funkcjonowaniu agroekosystemu i zapewnienie odpowiedniego poziomu produkcji rolnej wymaga oceny zachodzących zmian właściwości mikrobiologicznych i biochemicznych gleb, ale również ciągłego monitorowania właściwości odpadów, zwłaszcza osadów ściekowych,
wprowadzanych do środowiska glebowego. Osady ściekowe mogą być źródłem różnego typu ksenobiotyków, czynników inhibujących, toksycznych oraz drobnoustrojów potencjalnie chorobotwórczych. Dlatego też ocena stanu mikrobiologicznego odpadów wprowadzanych do gleb, jak również ich składu chemicznego jest niezwykle istotna biorąc pod uwagę aspekty zdrowotne, jakość plonów oraz ochronę
środowiska. Cel pracy: Celem przeprowadzonych badań była ocena wybranych właściwości mikrobiologicznych osadu, pochodzącego z oczyszczalni ścieków mleczarskich oraz charakterystyka zdolności
metabolicznej osadu pod kątem wykorzystania różnorodnych substratów węglowych. Metody: Badaniami
objęto osad ściekowy, pochodzący z oczyszczalni ścieków mleczarskich w Krasnymstawie. Badania
obejmowały ocenę wybranych właściwości mikrobiologicznych osadu: aktywność dehydrogenaz –
metodą Thalmanna, aktywność respiracyjną metodą Grewelinga i Peecha oraz ogólną liczebność bakterii
i grzybów strzępkowych metodą wysiewu rozciańczeń, stosując odpowiednie podłoża mikrobiologiczne.
W niniejszych badaniach oceniono również stan sanitarny odpadów, zidentyfikowano rodzaje dominujących grzybów oraz scharakteryzowano skład chemiczny odpadów. Identyfikację grzybów przeprowadzono w oparciu o ocenę makroskopową i mikroskopową szczepów w mikrokulturach. Ocena zdolności
metabolicznej osadów została określona z wykorzystaniem systemu BIOLOG Ecoplates. Jako kontrolę
zastosowano sterylny osad ściekowy. Wnioski: W badanym osadzie nie stwierdzono obecności bakterii
z rodzaju Salmonella oraz jaj pasożytów przewodu pokarmowego (ATT). Zawartość metali ciężkich
kształtowała się na bardzo niskim poziomie, istotnie niższym w porównaniu do obowiązujących norm.
Aktywność dehydrogenaz, respiracyjna oraz liczebność bakterii i grzybów strzępkowych kształtowała się
na wysokim poziomie w badanym osadzie. Grzyby wyodrębnione z badanego odpadu należały do
następujących rodzajów: Penicillium sp., Candida sp., Trichophyton sp. oraz Aspergillus sp.
____________________
Praca naukowa finansowana ze środków budżetowych na naukę w latach 2010-2013 jako projekt badawczy.
73
III-10 P | Aktywność enzymatyczna ektomikoryz Pinus sylvestris i Picea abies na podłożu
bogatym w metale toksyczne
Janik P.1, Kowalski S.2, Turnau K.1
1Instytut
Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński, Kraków
Fitopatologii Leśnej, Uniwersytet Rolniczy, Kraków
2Katedra
Wstęp: Ektomikoryza, rodzaj symbiozy mutualistycznej roślin z grzybami, nie tylko zapewnia roślinie
dostateczną ilość związków mineralnych, ale także chroni je przed patogenami, suszą czy metalami.
Z tego względu, symbioza ta jest szczególnie istotna na obszarach o podwyższonej zawartości metali
ciężkich. Gatunki i szczepy grzybów mikoryzowych różnią się pod względem tolerancji/oporności na
metale toksyczne. Niezbędna jest zatem selekcja odpowiednich symbiontów mikoryzowych w celu
opracowania skutecznych metod fitoremediacji. Cel pracy: W ramach niniejszej pracy porównano
aktywność enzymatyczną mikoryz utworzonych przez cztery szczepy ektomikoryzowe (Hebeloma
crustuliniforme, Suillus lutues, Paxillus involutus oraz Rhizopogon roseolus) oraz witalność aparatu
fotosyntetycznego Picea abies oraz Pinus sylvestris na podłożu z hałdy ołowiowo-cynkowej oraz na
piasku (kontrola). Metody: Pomiar aktywności enzymatycznej ektomikoryz (enzymów: fosfatazy,
-glukozydazy i chitynazy) wykonano metodą mikropłytkową wg. Pritsch et al. (2005, 2011), natomiast
pomiar fluorescencji chlorofilu a oraz ocenę parametrów aparatu fotosyntetycznego przy użyciu aparatu
Handy PEA i analizę testu OJIP. Wyniki: Analizy wykazały, że zarówno w przypadku aktywności enzymatycznej jak i fotosyntetycznej, u niemal wszystkich badanych gatunków istnieją statystycznie istotne
różnice w zależności od podłoża. Zaobserwowano negatywny wpływ podłoża hałdowego na aktywność
enzymatyczną grzybów i witalność roślin. Wyjątek stanowił układ Pinus sylvestris/Hebeloma crustuliniforme. Tylko w tym przypadku, zarówno pomiar fotosyntezy, jak analiza enzymatyczna wykazały wyższe
wartości na podłożu zawierającym metale toksyczne niż w warunkach kontrolnych. Dodatkowo, wartości
enzymu fosfatazy były cztero- do siedmiokrotnie wyższe w porównaniu z pozostałymi gatunkami i enzymami. Wnioski: Przeprowadzone badania potwierdzają przydatność H. crustuliniforme w fitoremediacji
hałd Zn-Pb. Analiza enzymatyczna mikoryz i pomiar fluorescencji chlorofilu stanowią dobry test selekcji
odpowiednich partnerów symbiozy.
III-11 P | Gleba z terenu byłych zakładów produkcji barwników „Boruta” w Zgierzu jako źródło
grzybów dekoloryzujących barwniki przemysłowe
Jasińska A.1, Pieniak A.2, Zawada I.2, Paraszkiewicz K.1, Długoński J.1
1 Katedra
Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii Uniwersytetu Łódzkiego
Koło Biotechnologiczno-Mikrobiologiczne „SKN Bio-Mik” BiOŚ UŁ
2 Studenckie
Wstęp: Barwniki dostające się do środowiska naturalnego w postaci ścieków przemysłowych stanowią
zagrożenie dla wszystkich organizmów. Szczególnie niekorzystne są barwniki azowe, ponieważ powstające pochodne często działają toksycznie i mutagennie. Zazwyczaj do eliminacji barwników stosowane
są metody fizykochemiczne. Jednakże coraz większym powodzeniem cieszą się efektywne i tanie
techniki biologiczne. Cel pracy: Celem pracy było określenie zdolności do eliminacji barwników przemysłowych przez grzyby strzępkowe wyizolowane z gleby pochodzącej z terenu zakładu „Boruta” w Zgierzu.
Metody: Zbadano zdolność 4 szczepów grzybowych: IM 6471, IM 6480, IM 6482 oraz IM 6491 do
dekoloryzacji 5 barwników oznaczonych symbolami: AO7, BB9, BV10, DB22, DB86. Wstępną ocenę
przeprowadzono podczas wzrostu grzybów na podłożu stałym Czapek–Dox z dodatkiem 50 mg/l danego
barwnika. Po 14 dniach inkubacji mierzono średnicę kolonii oraz średnicę strefy przejaśnienia wokół
74
grzybni. W kolejnym etapie oceniano przebieg eliminacji barwników (10 mg/l) podczas wzrostu w podłożu
płynnym Czapek-Dox. Po 96 godzinach hodowli próby wirowano, biomasę grzybni suszono i ważono.
W uzyskanych płynach pohodowlanych mierzono absorbancję przy długości fali właściwej dla danego
barwnika. Dekoloryzację (D) roztworów barwnika obliczono według wzoru: D[%]=[(A0–At)/A0]*100%,
gdzie: At – absorbancja próby badanej, A0 – absorbancja kontroli abiotycznej. Wyniki: Wszystkie badane
grzyby podczas wzrostu na podłożu stałym charakteryzowały się wysoką tolerancją wobec użytych
barwników. Największe ograniczenie wzrostu (około 40%) wyznaczono dla szczepu IM 6482 hodowanego w obecności barwników: AO7 oraz BB9. Wykazano, że izolaty IM 6480, IM 6482 oraz IM 6491 zdolne
są dekoloryzacji wszystkich barwników. Do kolejnego etapu wybrano 2 grzyby: IM 6480 oraz IM 6491,
zdolne do całkowitej eliminacji przynajmniej 3 barwników. W hodowlach płynnych szczep IM 6480 dekoloryzował z wydajnością >80% tylko 1 barwnik. Równie wysoką efektywność w stosunku do 3 barwników
wyznaczono dla szczepu IM 6491. Stwierdzono także, że szczep IM 6491 usuwa z wysoką wydajnością
(>50%) oba badane barwniki azowe: AO7 i DB22. Obserwacja widm absorbancji nie wykazała obecności
dodatkowych maksimów pochłaniania światła, co wskazuje na eliminację barwników bez wytworzenia
barwnych pochodnych. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują na duży potencjał szczepu IM 6491 do
dekoloryzacji barwników, w tym opornych na mikrobiologiczną degradację barwników azowych. Dalsze
badania będą zmierzać do opracowania nowej, efektywnej metody eliminacji tej grupy związków ze
ścieków.
III-12 P | Izolacja glebowych szczepów z rodzaju Bacillus zdolnych do produkcji biosurfaktantów
Jasińska A.1, Rudnicka K.2, Cichocka O.3, Gawłowska M.3, Janowski A.3, Ponichtera M.3,
Paraszkiewicz K.1
1 Katedra
Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii Uniwersytetu Łódzkiego
Gastroimmunologii Uniwersytetu Łódzkiego
3 Studenckie Koło Mikrobiologiczno –Biotechnologiczne „SKN Bio-Mik” BiOŚ UŁ
2 Zakład
Wstęp: Biosurfaktanty to związki powierzchniowo czynne, pochodzenia biologicznego. Wykazują zdolność do obniżania napięcia powierzchniowego, ułatwiają tworzenie emulsji i pian, a jednocześnie
w porównaniu do syntetycznych odpowiedników są mniej toksyczne i łatwiej ulegają biodegradacji.
Szczepy wielu gatunków Bacillus są zdolne do syntezy biosurfaktantów, głównie cyklicznych lipopeptydów. Do takich związków należy m.in.: surfaktyna, iturin i fengicyna. Związki te często wykazują działanie
przeciwdrobnoustrojowe. Cel pracy: Celem projektu była izolacja glebowych szczepów Bacillus zdolnych
do syntezy związków powierzchniowo czynnych oraz opracowanie schematu postępowania z wykorzystaniem szybkich metod izolacji drobnoustrojów środowiskowych zdolnych do produkcji biosurfaktantów.
Metody: Badaniu poddano glebę pobraną w z terenu parku im. J. Matejki w Łodzi. Zawiesinę gleby
w roztworze soli fizjologicznej wytrząsano z jałowymi perełkami szklanymi w temp. 80C przez 20 minut.
Próby z rozcieńczeń 10-3 i 10-4 wysiewano na płytki z 5% dodatkiem krwi owczej. Hodowle prowadzono
przez 72 godziny w temp. 28C. Czyste kultury izolowano z dużych, płaskich kolonii otoczonych strefą
hemolizy. Wyizolowane szczepy poddano analizie mikroskopowej stosując barwienie met. Grama oraz
badano z wykorzystaniem testów biochemicznych w celu wykluczenia obecności szczepów B. anthracis.
Zdolność szczepów do produkcji biosurfaktantów oceniono stosując płyny pohodowlane otrzymane z 72godzinnych hodowli płynnych. W badaniach wykorzystano szczep referencyjny B. subtilis DSM 3257
zdolny do produkcji surfaktyny, 5% roztwór SDS (syntetyczny surfaktant), mineralny olej silnikowy oraz
kerosen. Porównano szybkość wykonania i precyzję odczytu wyników 4 testów do wykrywania obecności
biosurfaktantów: oil spreading technique, aktywność emulsyfikacji, drop collapsing test oraz microplate
test. Wyniki: Wyizolowano 59 kolonii bakteryjnych hemolizujących. Badanie mikroskopowe potwierdziło,
że 22 szczepy to przetrwalnikujące laseczki Gram-dodatnie. Na podstawie testów biochemicznych
75
potwierdzono przynależność szczepów do rodzaju Bacillus oraz wykluczono izolację Bacillus anthracis.
Za najbardziej przydatny do wstępnego wykrywania biosurfaktantów uznano tzw. microplate test. Dla
siedmiu szczepów uzyskano przynajmniej 1 dodatni wynik w testach aktywności powierzchniowej, w tym
dla 2 szczepów (oznaczonych symbolami IM B47 oraz IM B54) aktywność ta była wyższa, w odniesieniu
do szczepu referencyjnego oraz roztworu syntetycznego surfaktanta. Wnioski: Efektem powyższej pracy
było opracowanie schematu badania przesiewowego w kierunku środowiskach szczepów bakterii
z rodzaju Bacillus, zdolnych do produkcji związków czynnych powierzchniowo. Ponadto, wykazano, że
dwa spośród 22 izolatów środowiskowych posiadają zdolność produkcji biosurfaktantów.
III-13 P | Właściwości antagonistyczne drożdży killerowych Willopsis saturnus wobec wybranych
patogenów roślin
Jaworski S.
Samodzielny Zakład Biologii Mikroorganizmów SGGW
Wstęp: Drożdże killerowe są mikroorganizmami, które wydzielają glikoproteinowe lub białkowe toksyny,
które zabijają wrażliwe komórki tego samego lub pokrewnego gatunku. Optymalna temperatura biosyntezy większości białek killerowych mieści się w przedziale 20-24°C, a optymalnym pH dla ich aktywności
jest przedział 4,2-5,0. Produkcja substancji o charakterze toksyn związana jest z obecnością wewnątrz
ich komórek wirusów, prionów, transpozonów plazmidów.Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono
aktywność antagonistyczną drożdży Willopsis saturnus na wybrane patogeny roślin uzyskane z Instytutu
Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Młochowie i SZBM SGGW. Metody: Oznaczenia aktywności antagonistycznej W. saturnus w stosunku do bakteryjnych szczepów testowych wykonano metodą dyfuzyjną –
stucienkową. Płytki inkubowano w temp. 30o C przez 24 godziny. Po tym czasie obserwowano pojawienie
się stref zahamowania wzrostu. W przypadku ich obecności zmierzono wielkość strefy hamowania przy
użyciu miarki milimetrowej.Dla grzybów z rodzaju Fusarium i Phytophtora wykonano oznaczenie ilości
suchej masy grzyba po okresie 14 w dni hodowli stacjonarnej. Hodowla każdego z gatunków prowadzona
była w trzech kombinacjach: a) pożywka zawierająca 5% objętościowych supernatantu z dwudniowej
hodowli Willopsis saturnus na podłożu YPG; b) pożywka zawierająca 10% objętościowych supernatantu
z dwudniowej hodowli Willopsis saturnus na podłożu YPG; c) kontrola bez supernatantu (czysta pożywka). Wyniki: Przeprowadzone badania pozwoliły stwierdzić, że bakterie tj. Klebsiella pneumoniae oraz
Pseudomonas aeruginosa pozostają obojętne na toksynę wytwarzaną przez W. saturnus. Wrażliwość
wykazują na nią jednak patogeny roślin : Pectobacterium carotoworum, Pectobacterium atrosepticum,
odpowiadające za mokrą zgniliznę ziemniaka, a także Erwinia chrysanthemii. Przy badaniu wrażliwości
szczepów na toksynę udowodniono również, że nie ma istotnej różnicy statystycznej w zależności czy
dodajemy hodowlę drożdży, czy sam płyn pohodowlany. Wnioski: W oparciu o własne doświadczenia
oraz dane literaturowe można wyciągnąć nastepujące wnioski: a) drożdże W. saturnus produkują toksynę
killerową w fazie logarytmicznego wzrostu, b) toksna killerowa traci aktywność w podwyższonej
temperaturze (ponad 25° C), c) zdecydowana większość badanych szczepów bakterii oraz izolatów
grzybowych okazała się wrażliwa na toksynę, co stwarza możliwość jej praktycznego wykorzystania
w procesach biokontroli.
76
III-14 P/O | Nanosrebro w kosmetykach i produktach chemii gospodarczej – fakt czy chwyt
marketingowy?
Juś K., Kujawa E., Mocek M., Piechocka J.
Katedra Biochemii i Mikrobiologii, Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu
Wstęp: Nanotechnologia jest obecnie najbardziej obiecującym polem do tworzenia nowych rozwiązań
technologicznych. Ze wszystkich nanoproduktów to właśnie nanosrebro wydaje się najbardziej interesującym ze względu na swoje właściwości. Po rozdrobnieniu srebra do rozmiarów 1- 5 nm, jego cząstki
nabywają bakterio- i grzybobójcze właściwości. Srebro posiada zdolność do wiązania się z grupami
tiolowymi, co hamuje oddychanie bakterii, ograniczając przez to możliwość ich namnażania i przeżywania. Prostota zastosowania tych właściwości oraz stosunkowo niska cena zaowocowała coraz częstszą
i powszechniejszą obecnością nanosrebra w życiu codziennym. Cel pracy: Celem przeprowadzonych
doświadczeń była ocena właściwości bakterio- i grzybobójczych wybranych produktów zawierających
nanosrebro wobec drobnoustrojów skórnych. Metody: W doświadczeniach wykorzystano sześć produktów zawierających nanosrebro: żel pod prysznic, szampon, mydło, płyn do dezynfekcji blatów kuchennych, płyn do impregnacji tkanin i płyn do zwalczania przykrego zapachu obuwia. Wymienione produkty
pochodziły od różnych producentów. Przeciwdrobnoustrojowe właściwości produktów oznaczano metodą
studzienkową i krążkową. Dla poszczególnych preparatów wyznaczono również wartość MIC (Minimal
Inhibitory Concentration) wobec badanych drobnoustrojów metodą seryjnych rozcieńczeń z rezazuryną
jako wskaźnikiem metabolicznej aktywności mikroorganizmów. Wyniki: Najszersze spektrum bakterioi grzybobójcze wykazał preparat do butów, hamujące rozwój C. albicans, B. megaterium, S. aureus oraz
S epidermidis. Szampon oraz żel wykazywał najsilniejszą aktywnosć względem B. megaterium,
P. aeruginosa i C. albicans. Mydło w niewielkim stopniu hamowało wzrost B. megaterium i S. aureus.
Pozostałe badane preparaty tj. płyn do dezynfekcji blatów i płyn do impregnacji tkanin nie wykazywały ani
antybakteryjnego ani antygrzybicznego działania wobec testowanych mikroorganizmów. Wyniki takie
uzyskano zarówno stosując metodę studzienkową jak i krążkową. Wnioski: Przeprowadzone obserwacje
potwierdziły, że nanosrebro posiada właściwości bakteriobójcze i grzybobójcze. Większość badanych
preparatów hamowała w największym stopniu wzrost bakterii Bacillus megaterium oraz grzyba Candida
albicans. Bardzo istotny jest wybór metody badania, ponieważ, jak wykazały przedstawione doświadczenia, wyniki uzyskiwane za pomocą różnych metod nie zawsze są porównywalne.
III-15 P | Immunomodulujące i tolerogenne właściwości mlecznych produktów fermentowanych
Kaliszewska A., Wróblewska B., Świątecka D., Chudzik-Kozłowska J., Ogrodowczyk A.
Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie
Wstęp: Alergia pokarmowa na białka mleka krowiego jest najczęstszą postacią alergii pokarmowej.
Występowanie w początkowej fazie życia IgE-zależnej reakcji alergicznej na białka mleka krowiego
zwiększa ryzyko wystąpienia utrwalonej postaci alergii pokarmowej, może być przyczyną rozwoju następczych reakcji nadwrażliwości pokarmowej i kontaktowej, a także reakcji ze strony układu oddechowego. Dotychczas jedynym sposobem zapobiegawczym jest usunięcie z diety alergika mleka i jego
przetworów, co wiąże się bezpośrednio ze zubożeniem diety w ważne źródło wapnia i białka. Stąd też
istotne jest „nauczenie” organizmu tolerowania białek zawartych w mleku, czyli pobudzenie naturalnego
układu odpornościowego w kierunku prawidłowego regulowania odpowiedzi immunologicznej organizmu.
Cel pracy: Podstawowym celem badań była weryfikacja hipotezy czy mleczne produkty fermentowane
(jogurt i kefir), charakteryzujące się obniżoną immunoreaktywnością oznaczoną in vitro posiadają zdolność modulowania wybranych mechanizmów immunologicznych u osobników z alergią pokarmową na
77
białka mleka krowiego. Metody: Badania przeprowadzono z użyciem modelu zwierzęcego (myszy), które
wprowadzano w potencjalny stan alergii pokarmowej na białka mleka krowiego. Zwierzęta otrzymywały
analizowane produkty tolerogenne w określonej dawce. Po zakończeniu doświadczenia izolowano
komórki ze śledziony i oznaczano, metodą EliSpot, komórki wydzielające IgA oraz IgG, ponadto po
stymulacji komórek antygenami mleka, w mediach oznaczano testem ELISA, mediatory wzbudzania
mechanizmów stanów alergicznych oraz tolerancji. Wyniki: Uzyskane wyniki wykazały zróżnicowane
możliwości wzbudzania odpowiedzi immunologicznej w zależności od zastosowanego fermentowanego
produktu mlecznego, głównie od kompozycji szczepionek mleczarskich, jak i obecności różnych peptydów i innych metabolitów wynikających z aktywności bakterii fermentacji mlekowej. Wnioski: Zastosowanie mlecznych produktów fermentowanych wydaje się być zasadne u osobników z alergią pokarmową
na białka mleka krowiego, z uwagi na obecność w nich hydrolizowanych białek, o obniżonej immunoreaktywności. Ponadto, prawdopodobnie dochodzi do stymulacji komórek regulujących odpowiedź układu
odpornościowego z komponentami ścian komórkowych drobnoustrojów. Niezbędna jest kontynuacja
badań opierająca się między innymi o analizę aktywacji komórek regulatorowych i sprawdzenie obecności w jelitach bakterii kultur starterowych.
____________________
Autor otrzymał stypendium współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
III-16 P | Konsorcja drobnoustrojów, przeznaczone do poprawy jakości surowców ceramicznych
Kaszycki P.1, Kłapkowska P.1, Kasprowicz A.2, Białecka A.2, Wyszomirski P.3, Międzobrodzki J.4
1 Katedra
Biochemii, Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie,
Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. dr Jana Bobra w Krakowie
3 Katedra Technologii Ceramiki i Materiałów Ogniotrwałych, Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki,
Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie
4 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński
2 Centrum
Wstęp: Występowanie zanieczyszczeń organicznych w surowcach ilastych jest problemem, stanowiącym poważne ograniczenie w przemyśle ceramicznym. Objawia się głównie negatywnym wpływem na
takie właściwości wypalonego produktu, jak wytrzymałość mechaniczna i występowanie nieestetycznych,
ciemnych przebarwień. Aby uzyskać poprawę jakości materiałów i dostosować je do wymagań przemysłowych, stosuje się szereg zabiegów chemicznych i fizycznych. Ostatnio proponuje się wykorzystanie
aktywnych mikroorganizmów, zdolnych do skutecznej biodegradacji frakcji organicznej w surowcach
ceramicznych. Cel pracy: Celem badań było wykazanie przydatności wielogatunkowych, bioróżnorodnych konsorcjów drobnoustrojów pro- i eukariotycznych do mikrobiologicznego wzbogacania surowców
ilastych. Na skutek silnej presji selekcyjnej w środowisku iłów zaszczepiona mikroflora podlegała adaptacji, a biomasa drobnoustrojów rozwijała się dzięki przyswajaniu ksenobiotyków. Metody: Doświadczenie
prowadzono w skali laboratoryjnej, z wykorzystaniem zwilżonych iłów umieszczonych w specjalnych
pojemnikach. Próby surowca zaszczepiano aktywnymi mikroorganizmami wariantowo, wykorzystując trzy
różne typy konsorcjów: (1) biopreparat ZB-01, wytworzony w Katedrze Biochemii i zawierający wyspecjalizowane drobnoustroje środowiskowe zdolne do bioremediacji skażeń organicznych, (2) konsorcja
wyhodowane na bazie autochtonów wyizolowanych bezpośrednio z surowców ilastych oraz (3) biopreparat hybrydowy, powstały przez zintegrowanie mikroorganizmów obu wymienionych biocenoz. Test trwał
14 tygodni, podczas których monitorowano skład i liczebność mikroflory oraz analizowano zawartość fazy
organicznej w iłach. Wyniki: Potwierdzono możliwość wykorzystania biocenoz drobnoustrojów allochtonicznych i autochtonicznych do wzbogacania surowców ceramicznych. W każdej z prób, po zaszczepieniu, liczebność drobnoustrojów była wyższa, niż w testach kontrolnych, wskazując na przyswajanie
i bioremediację ksenobiotyków. Analizy zawartości substancji organicznej w wybranych próbach pokaza78
ły, że biopreparat ZB-01 posiadał najwyższą zdolność degradacji zanieczyszczeń (spadek o ok. 60%),
mniejszym potencjałem charakteryzował się biopreparat hybrydowy (spadek o 27%), najmniejszym zaś
(10%) - biopreparat autochtoniczny. Wnioski: Konstrukcja i hodowla aktywnych biocenoz z wykorzystaniem wyspecjalizowanych drobnoustrojów środowiskowych otwiera możliwość opracowania nowatorskich
biotechnologii pozwalających zwiększyć przemysłową przydatność ilastych surowców ceramicznych
poprzez biologiczny rozkład frakcji organicznej. Uzyskane wyniki uzasadniają pogląd, że nowe metody
mikrobiologicznego wzbogacania iłów będą konkurencyjne w porównaniu z dotychczas stosowanymi
konwencjonalnymi sposobami przeróbki.
III-17 P/O | Wpływ czynników Nod na kiełkowanie i wzrost wyki oraz wydajność symbiozy
w układzie Rhizobium leguminosarum bv. viciae – Vicia villosa cv. Wista
Kidaj D., Wielbo J., Skorupska A.
Department of Genetics and Microbiology, M. Curie-Sklodowska University, Lublin, Poland
Wstęp: Symbioza roślin motylkowatych z rizobiami, wiążącymi N2, zapewnia roślinom dodatkowe źródło
azotu uniezależniając ich uprawę od stosowania sztucznego nawożenia azotowego. W procesie symbiozy rizobia zakażają system korzeniowy roślin motylkowatych, tworzą brodawki, wewnątrz których redukują niedostępny dla roślin azot atmosferyczny do amoniaku. Interakcja roślina motylkowata – rizobia jest
specyficzna. Określone gatunki roślin nawiązują symbiozę tylko z wybranymi gatunkami rizobiów. Partnerzy rozpoznają się wymieniając specyficzne sygnały molekularne. Roślinne flawonoidy aktywują transkrypcję rizobiowych genów nod w wyniku czego syntetyzowane są chitolipooligosacharydy, zwane
czynnikami Nod. Sekrecja czynników Nod powoduje aktywację roślinnych białek (nodulin), syntezę nici
infekcyjnych, indukcję podziałów komórek kory korzenia oraz powstawanie zawiązków brodawek. Cel
pracy: Celem pracy było zbadanie możliwości przyspieszenia procesu nawiązania symbiozy między
wyką (Vicia villosa cv. Wista) a R. leguminosarum bv. viciae GR09 przez traktowanie nasion i siewek
wyki mieszaniną rizobiów z izolowanymi czynnikami Nod lub wyłącznie czynnikami Nod. Metody: I)
Izolowane czynniki Nod, syntetyzowane przez szczep RvGR09, podano w różnych stężeniach (10-9 – 1013 M ) na nasiona wyki. Badano wpływ swoistego czynnika Nod na kiełkowanie nasion i długość kiełkującego korzenia. II) Zbadano wpływ czynników Nod na wzrost i brodawkowanie wyki w warunkach konkurencji z bakteriami autochtonicznymi w glebie. Doświadczenie przeprowadzono w Instytucie Uprawy
Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach. Nasiona wyki moczono w roztworze czynników Nod ( 10-10 M)
i zakażano szczepem RvGR09 znakowanym plazmidem pJB21Tc z genem gusA. Po 6 tygodniach
rośliny ważono i liczono brodawki korzeniowe. Korzenie barwiono na obecność β-glukuronidazy. Wyniki:
I) Zaobserwowano istotny statystycznie wpływ swoistego czynnika Nod w stężeniu 10-10 – 10-12 M na
kiełkowanie nasion i długość kiełkującego korzenia.II) Statystycznie istotnie wzrosła biomasa oraz liczba
brodawek w grupie roślin traktowanych czynnikiem Nod. Traktowanie nasion wyki czynnikami Nod nie
zwiększyło konkurencyjności szczepu RvGR09 względem autochtonów. Wnioski: Korzystne jest zastosowanie w uprawie wyki, zamiast mało konkurencyjnych żywych rizobiów, bionawozu zawierającego
specyficzny izolowany czynnik Nod.
79
III-18 P | Charakterystyka mikroflory autochtonicznej występującej w ceramicznych surowcach
ilastych
Kłapkowska P.1, Kaszycki P.1, Białecka A.2, Kasprowicz A.2, Wyszomirski P.3
1 Katedra
Biochemii, Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. dr Jana Bobra w Krakowie
3 Katedra Technologii Ceramiki i Materiałów Ogniotrwałych, Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki,
Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie
2 Centrum
e-mail: kla[email protected]
Wstęp: Szeroko stosowane w ceramice surowce ilaste są rozpowszechnione w przyrodzie, w tym na
terenie naszego kraju. Ich charakterystyczną cechą jest obecność substancji organicznej, pochodzącej
głównie z rozkładu szczątków roślinnych i składającej się z różnorodnych związków węglowodorowych
m.in. o budowie aromatycznej i heterocyklicznej. Frakcja organiczna jest odpowiedzialna na ogół za
obniżenie wartości technologicznej surowca i dlatego podejmuje się próby jej eliminacji. Jednocześnie,
substancja ta może stanowić źródło węgla dla wyspecjalizowanych, zaadaptowanych drobnoustrojów
autochtonicznych. Cel pracy: Badania prowadzono w celu stwierdzenia obecności w próbkach badanych
iłów mikroflory autochtonicznej. Wyizolowane szczepy poddawano charakterystyce mikrobiologicznej
oraz identyfikacji rodzajowej i gatunkowej. Badano możliwość hodowli konsorcjów mikroorganizmów
utworzonych z pozyskanych izolatów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Metody: Izolację
drobnoustrojów autochtonicznych prowadzono z wykorzystaniem trzech wyselekcjonowanych iłów
bogatych w substancję organiczną. Rozdrobniony surowiec zawieszano w jałowej wodzie, wytrząsano
(4-24 h), a następnie wykonywano posiewy w seriach rozcieńczeń geometrycznych na podłoża wzbogacone. Analizy identyfikacyjne przeprowadzono z wykorzystaniem standardowych technik fenotypowego
oznaczania drobnoustrojów na podłożach selekcyjnych i z użyciem odpowiednich testów. Między innymi
stosowano: barwienie metodą Grama, system API Coryne oznaczania bakterii z grupy coryneform,
zestaw ID32GN przeznaczony do automatycznej identyfikacji pałeczek gramujemnych oraz testy krążkowo–dyfuzyjne dla form kulistych. Wodne zawiesiny surowców posłużyły również do hodowli biopreparatów zawierających autochtoniczne drobnoustroje. Wyniki: Stwierdzono występowanie złożonej mikroflory, której głównymi składnikami były bakterie należące do grupy maczugowców. Wykazano stabilność tej
mikroflory w czasie przechowywania próbek w stanie suchym. Wyizolowane mikroorganizmy zostały
scharakteryzowane i zidentyfikowane. Na bazie autochtonów wyhodowano bioróżnorodne konsorcja –
biopreparaty, przeznaczone do bioaugmentacji procesu rozkładu ksenobiotyków w iłach. Wnioski:
Wyniki doświadczeń sugerują występowanie w badanym materiale bogatej mikroflory, osiągającej dużą
liczebność, rzędu 105 jtk/g. Autochtoniczne drobnoustroje, wyspecjalizowane i zaadaptowane do środowiska iłów mogą zostać wykorzystane do celów poprawy jakości surowców ceramicznych. Posiadają one
bowiem rzadkie aktywności enzymatyczne pozwalające im na przyswajanie źródeł węgla występujących
w iłach jako organiczna frakcja zanieczyszczająca surowiec.
III-19 P | Wpływ streptomycyny na mikroflorę układu pokarmowego karaczana madagaskarskiego
(Gromphadorhina portentosa)
Kukla M., Piotrowska-Seget Z.
Department of Microbiology, University of Silesia Katowice, Poland
Wstęp: Karaczany madagaskarskie (Gromphadorhina portentosa) mogą przenosić wiele groźnych dla
ludzi mikroorganizmów. Są plagą w niektórych domach mieszkalnych i szpitalach, gdzie zagrażają
pacjentom będąc wektorem wielolekoopornych szczepów bakterii. U tych owadów mikroflora układu
pokarmowego jest ważnym czynnikiem warunkującym ich prawidłowy wzrost i rozwój. Nową strategią
80
walki z owadzimi szkodnikami jest eliminacja ich endosymbiontów przewodu pokarmowego, co zaburza
funkcjonowanie owada i prowadzi do jego śmierci. Cel pracy: Ocena wpływu streptomycyny na liczebność i bioróżnorodność mikroflory różnych kompartymentów jelita środkowego karaczana madagaskarskiego. Metody: Liczebność bakterii tlenowych i beztlenowych oznaczano metodą płytek tartych na
podłożach: bulion odżywczy oraz TSA z odwłóknioną krwią baranią. Identyfikację dominujących gatunków przeprowadzono metodą MIDI-MIS z wykorzystaniem chromatografu gazowego oraz bazy danych
Sherlock 5.0. Do określenia aktywności enzymatycznej wyizolowanych bakterii wykorzystano test api
Zym (bioMerieux). Oznaczano także oporność tych szczepów na streptomycynę. Wyniki: Badania
wykazały znaczne różnice w ogólnej liczebności bakterii tlenowych i beztlenowych w różnych kompartymentach jelita środkowego karaczana madagaskarskiego intoksykowanego antybiotykiem, w porównaniu
z owadami kontrolnymi (nie intoksykowanymi antybiotykiem). Wśród dominujących gatunków oznaczono
Bacillus cereus, Photorhabdus luminescens, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca, Citrobacter
freundi, Klebsiella pneumoniae. Testem api ZYM potwierdzono zdolność badanych szczepów do wytwarzania enzymów glikolitycznych i proteolitycznych. Klebsiella oxytoca oraz Citrobacter freundii wykazały
oporność na streptomycynę w stężeniu 50 μg/ml. Wnioski: Streptomycyna w istotny sposób zmieniała
liczebność i bioróżnorodność mikroflory jelita środkowego karaczana madagaskarskiego. W przyszłości
zjawisko to można wykorzystać do walki z owadami zagrażającymi zdrowiu człowieka. Aktywność
proteolityczna i glikolityczna bakterii potwierdza ich udział w procesach trawiennych zachodzących
w jelicie środkowym.
III-20 P | Stymulacja aktywności bakterioplanktonu Jeziora Parnowo
Lewicka K., Łaryonowicz M., Szlachciak M., Wawrzonkowski J., Wójcik A., Wasiniewska M., Czubek E.,
Pikuła K.
Katedra Biologii Środowiskowej, Politechnika Koszalińska, Koszalin
Wstęp: Jezioro Parnowskie położone jest na Równinie Białogardzkiej w północno-zachodniej Polsce.
Pod względem administracyjnym przynależy do gminy Biesiekierz. Jest zbiornikiem śródpolnym, otoczonym polami uprawnymi i łąkami, charakteryzującym się bardzo wysoką podatnością na degradację.
Położenie jeziora oraz nieprawidłowe użytkowanie w przeszłości przyczyniło się do przyspieszenia
procesu eutrofizacji, co znajduje odzwierciedlenie w III klasie jakości wód (stan umiarkowany). Próbki do
badań pobierane były z trzech stanowisk, pierwsze zlokalizowane było w okolicy głęboczka, drugie –
w centralnym punkcie zatoki północnej sąsiadującej z Cieszynem, trzecie – w zatoce południowowschodniej od strony Parnowa. Na pierwszym stanowisku, woda pobrana została z: warstwy powierzchniowej, z głębokości 4 m i warstwy naddennej (8 m). W przypadku stanowisk drugiego i trzeciego, wodę
pobrano z warstwy powierzchniowej i z głębokości 3 m z uwagi na zbliżoną głębokość w profilu tych
stanowisk. Cel pracy: Celem przeprowadzonego eksperymentu było wykazanie wpływu łatwo przyswajalnych substratów organicznych na aktywność metaboliczną i fizjologiczną bakterioplanktonu Jeziora
Parnowo. Metody: Próbki wody jeziornej, po usunięciu z niej frakcji fito- i zooplanktonu, inkubowano 24 h
w butelkach typu OxiTop w temperaturze 200C w dwóch wariantach: z dodatkiem peptonu i bez suplementacji. W badanych próbkach określano: ilość komórek z aktywnym transportem elektronów (ETS+) na
podstawie reakcji z chlorkiem tetrazolowym CTC oraz liczbę komórek z aktywną membraną (MEM+) za
pomocą testu LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit Molecular Probes. Wyniki: Suplementacja
peptonem spowodowała wzrost procentowego udziału komórek z aktywnym transportem elektronów
(ETS+). W próbkach inkubowanych bez sztucznego substratu obserwowano obniżenie udziału komórek
z aktywnymi dehydrogenazami. Dodatek peptonu nie spowodował wzrostu odsetku komórek ze sprawną
membraną (MEM+).Wnioski: Można przypuszczać, że wzrost koncentracji łatwo przyswajalnych związków organicznych jest czynnikiem kształtującym aktywność metaboliczną bakterioplanktonu Jeziora
81
Parnowo, natomiast nie wpływa na ich stan fizjologiczny. Może to sugerować, że bakterie te są przystosowane przede wszystkim do degradacji labilnych związków organicznych. Jednak obecność nawet
niewielkich ilości labilnych form substratów może pozwolić bakteriom utylizować allochtoniczne związki
trudno rozkładalne. Zjawisko to ma istotne znaczenie w naturalnych procesach samooczyszczania wód
zbiornika.
III-21 P | Wpływ biostymulacji na strukturę bakterioplanktonu Jeziora Parnowo
Lewicka K., Massopust H., Białous I., Nadzieja N., Łozowska A., Pikuła K.
stanowisk. Cel pracy: Celem przeprowadzonego eksperymentu było wykazanie wpływu łatwo przyswajalnych substratów organicznych na strukturę morfologiczną i wielkościową bakterioplanktonu Jeziora
Parnowo. Metody: Próbki wody jeziornej, po usunięciu z niej frakcji fito- i zooplanktonu, inkubowano 24 h
w butelkach typu OxiTop w temperaturze 200C w dwóch wariantach: z dodatkiem peptonu i bez suplementacji. W badanych próbkach określano ogólną liczbę bakterii (OLB), średnią objętość komórek (SOK)
i biomasę bakteryjną (BB) za pomocą metody bezpośredniego liczenia bakterii w mikroskopie fluorescencyjnym z zastosowaniem fluorochromu DAPI. Wyniki: Stymulacja peptonem spowodowała wzrost
ogólnej liczby i biomasy bakterii. Obserwowano również wzrost średniej objętości komórek oraz procentowego udziału dużych form w grupach rozmiarowych bakterioplanktonu. Wnioski: Przeprowadzone
badania potwierdziły doniesienia licznych badaczy, że struktura związków tworzących pule pokarmowe
bakterii wpływa na tempo rozwoju bakterii oraz ilościowe i jakościowe parametry bakteriocenoz.
III-22 P | Dynamika mikrobiologicznej destrukcji materii organicznej w Jeziorze Parnowo
Lewicka K., Miszczyszyn M., Murawska A., Szeglewska K., Pikuła K.
82
stanowisk. Cel pracy: Celem przeprowadzonego eksperymentu było wykazanie wpływu łatwo przyswajalnych substratów organicznych na aktywność oddechową bakterioplanktonu Jeziora Parnowo. Metody:
Próbki wody jeziornej, po usunięciu z niej frakcji fito- i zooplanktonu, inkubowano 24 h w butelkach typu
OxiTop w temperaturze 200C w dwóch wariantach: z dodatkiem peptonu i bez suplementacji. Na podstawie ilości zużytego tlenu wyznaczono: współczynnik aktywności heterotroficznej WA h mikroflory bakteryjnej oraz tempo rozkładu węgla organicznego – destrukcję materii organicznej przy założeniu że 1 mg O2
utlenia 0,29 mg C. Wyniki: Badania wykazały, że bakterie występujące w wodach powierzchniowych
charakteryzowały się wyższymi wartościami współczynnika aktywności heterotroficznej w stosunku do
wód przydennych. Ponadto suplementacja peptonem spowodowała wzrost aktywności oddechowej
bakterii, a tym samym wzrost tempa rozkładu węgla organicznego w badanych próbkach. Wnioski:
Można przypuszczać, że bakterioplankton Jeziora Parnowo charakteryzuje wysoki potencjał aktywności
oddechowej, natomiast tempo destrukcji materii organicznej jest uwarunkowane głównie liczbą aktywnych metabolicznie komórek.
III-23 P | Dynamika rozwoju mikroorganizmów w serze dojrzewającym typu szwajcarskoholenderskiego
Mikš-Krajnik M., Babuchowski A.
Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski
Wstęp: Sery dojrzewające typu szwajcarsko-holenderskiego są serami produkowanymi z zastosowaniem
paciorkowców fermentacji mlekowej: Lactococcus sp., Leuconostoc sp. oraz pałeczek propionowych
Propionibacterium sp. Procesy biotechnologiczne zachodzące w matrycy sera dojrzewającego w warunkach przemysłowych zależą głównie od stanu fizjologicznego zastosowanych drobnoustrojów. Metabolizm komórek bakterii nadaje kierunek prowadzonym w środowisku przemianom biochemicznym i enzymatycznym, kształtując tym samym pożądane cechy produktu. Cel pracy: W niniejszej pracy zastosowano techniki fluorescencyjne i chromatograficzne celem monitorowania dynamiki zmian stanu fizjologicznego i metabolizmu populacji bakterii Lactococcus sp. i Propionibacterium sp. w serze typu szwajcarsko-holenderskiego dojrzewającym w warunkach przemysłowych. Metody: W trzech warstwach próbek
sera dojrzewającego oznaczano: liczbę bakterii wykazujących aktywność niespecyficznych wewnątrzkomórkowych esteraz (CFDA), liczbę żywych i martwych komórek w populacji (LIVE/DEAD ® BacLightTM),
liczbę paciorkowców mlekowych i pałeczek propionowych (metoda płytkowa), zawartość lotnych związków organicznych (HS-GC-FID) oraz kwasowość czynną (pH). Do opisu metabolizmu wykorzystano
wyniki analizy składowych głównych PCA (STATISTICA 8.0, Statsoft). Wyniki: W pierwszym etapie
dojrzewania (12°C) obniżyła się zarówno liczba komórek LIVE jak i CFDA. Zmalała również zdolność
paciorkowców mlekowych do wzrostu na podłożach syntetycznych. W tym samym okresie liczba bakterii
Propionibacterium sp. zdolnych do wzrostu na podłożach stałych wzrosła. W drugim etapie dojrzewania,
w temperaturze 21°C, wzrosła zarówno liczba komórek LIVE jak i CFDA. Zaobserwowano przyrost liczby
paciorkowców zdolnych do wzrostu na podłożach stałych. Analiza PCA, której poddano siedem lotnych
metabolitów, pozwoliła wyodrębnić składowe główne, z których pierwsza wyjaśniała 68,36%, a druga
14.97% obserwowanej zmienności. Czynnik pierwszy budowały następujące związki: diacetyl, acetoina
oraz krótko-łańcuchowe kwasy tłuszczowe C2, C3, C4, C5izo. Drugi czynnik tworzył alkohol etylowy. Zaobserwowano występowanie 3 skupień, które tworzyły próbki sera: po soleniu i po 7 dniach dojrzewania
(w 12ºC), z 14-ego dnia dojrzewania oraz po 21 dniu dojrzewania (w 21ºC). Wnioski: W czasie dojrzewania sera stwierdzono: brak homogeniczności dojrzewania w całej objętości euro-bloku, który wyrażał
się niższym udziałem bakterii fermentacji mlekowej i propionowej, barwionych SYTO®9 i CFDA oraz
83
wzrastających na podłożach syntetycznych, w zewnętrznej warstwie euro-bloku oraz niższym stężeniem
związków lotnych w zewnętrznej warstwie sera.
III-24 P | Ocena skuteczności konserwacji nanosrebrem na przykładzie wybranych produktów
kosmetycznych
Napierała M., Nitka E., Nowak A.
Studenckie Koło Naukowe INVENTUM, Katedra Biochemii i Mikrobiologii,
Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu; opiekun: dr inż. Daniela Gwiazdowska
Wstęp: Nanosrebro jest obecnie często stosowanym komponentem przy produkcji kosmetyków ze
względu na swoje właściwości bakterio- oraz grzybobójcze, dzięki czemu może hamować rozwój niepożądanej mikroflory. Cel pracy: Celem badania była ocena skuteczności konserwacji kosmetyków
z nanosrebrem na działanie wybranych drobnoustrojów. Metodyka: Weryfikację skuteczności konserwacji przeprowadzono za pomocą testu Farmakopei Europejskiej 6.0, który polega na kontrolowanym,
jednorazowym wprowadzeniu szczepów testowych do próbek zakonserwowanego produktu. Jego
zadaniem jest symulowanie wtórnego zakażenia, jakie może powstać podczas użytkowania produktu
przez konsumenta. Kosmetyki zakażono następującymi drobnoustrojami: Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans. Wprowadzone mikroorganizmy zostały wybrane, ponieważ
są najpospolitszymi patogenami człowieka i stanowią częste zanieczyszczenia kosmetyków. Wyniki: Na
podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że liczba bakterii, co prawda zmniejszyła się już po
2 dniach testu, w stosunku do wartości wyjściowej, jednak po upływie kolejnych 7, 14 oraz 28 dni, spadek
ilości drobnoustrojów nie był już tak intensywny lub w niektórych przypadkach pozostawał bez zmian.
Dużą wrażliwość na działanie środka konserwującego wykazały tylko drożdże Candida albicans. Natomiast w stosunku do wszystkich badanych mikroorganizmów, żaden z testowanych produktów kosmetycznych nie spełnił kryterium konserwacji A ani B według testu Farmakopei Europejskiej 6.0. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić również, że oddziaływanie badanych kosmetyków zależy
przede wszystkim od rodzaju mikroorganizmów. Wnioski: Testowane produkty kosmetyczne wykazały
dość zróżnicowane działanie konserwujące na badane drobnoustroje. Żaden z nich nie spełnił wymaganego według testu Farmakopei Europejskiej 6.0. kryterium A, jednak kryterium B, akceptowane tylko
w uzasadnionych przypadkach ( np. z przyczyn zwiększonego ryzyka działań niepożądanych) zostało
spełnione tylko odnośnie bakterii Pseudomonas aeruginosa we wszystkich badanych kosmetykach.
W stosunku do mikroorganizmu Staphylococcus aureus nie zostało spełnione żadne z kryteriów testu
Farmakopei. W badanych próbach nie stwierdzono natomiast rozwoju drobnoustroju Candida albicans.
III-25 P/O | Biosynteza nanocząstek srebra z wykorzystaniem grzybów w warunkach in vitro
Ogar A.1, Zapotoczny S.2, Turnau K.1
1 Instytut
2 Zakład
Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński
Chemii Fizycznej i Elektrochemii, Uniwersytet Jagielloński
Wstęp: Najnowsze badania naukowe wskazały istotny potencjał mikroorganizmów, w tym grzybów
w procesie biosyntezy nanocząstek. W płynnych hodowlach grzybów stwierdzono ich wewnątrzkomórkową lub/i zewnątrzkomórkową redukcję jonów srebra i formowanie się nanocząstek srebra. Stwarza to
możliwość wykorzystania grzybów w eko-przyjaznej metodzie produkcji nanocząstek, eliminując konieczność wykorzystania niebezpiecznych czy toksycznych związków chemicznych. Cel pracy: Optymalizacja warunków procesu hodowli grzybów jest istotnym etapem w procesie biologicznej syntezy, którego
84
celem jest otrzymanie nanocząstek o określonym geometrycznym kształcie i rozmiarze. Wielkość nanocząstek srebra otrzymywanych na drodze „ekologicznej syntezy” wynosi od kilku do 100 nanometrów, co
czyni grzyby doskonałymi „biofabrykami” nanocząstek o różnej wielkości i kształcie (sferyczny, trójkątny).
Metody: Dwa gatunki grzybów Cladosporium cladosporoides i Ulocladium sp. hodowano w dwóch
rodzajach płynnych pożywek z dodatkiem AgNO3, o stężeniu 10-3 M i 10-2 M. Filtrat, który otrzymano po
hodowli grzybów poddano analizie spektrofotometrycznej. Wyniki: Filtrat z hodowli C. cladosporoides
zarówno przy stężeniu 10-3 M jak i 10-2 M AgNO3 dał silne pasmo absorpcyjne w zakresie 380-450 nm,
z maksimum przy 420 nm oraz 408 nm. Poddany analizie filtrat z hodowli Ulocladium sp. dał pasmo
absorpcji w zakresie 380-470 nm. Wykorzystując do hodowli Ulocladium sp. otrzymano intensywne
widmo o maksimum 424 nm przy stężeniu 10-3 M AgNO3. Wnioski: Otrzymanie widm absorpcji w zakresie długości fali 360-500 nm świadczy o tym, że badane szczepy grzybów (C. cladosporoides i Ulocladium sp.) mają zdolność do zewnątrzkomórkowej syntezy nanocząstek srebra z azotanu srebra. Ulocladium sp. powiększa listę mikroorganizmów zdolnych do produkcji nanocząstek. Otrzymanie różnych
pasm/maksimów absorpcji, może być związane z występowaniem w roztworze różnej wielkości nanocząstek, które nakładając się na siebie dają inne obrazy widm.
III-26 P | Zastosowanie techniki fluorescencyjnej do określania przeżywalności szczepów
Propionibacterium spp. w środowisku substancji bakteriostatycznych.
Olszewska M., Łaniewska-Trokenheim Ł.
Wstęp: Bakterie fermentacji propionowej PAB (propionic acid bacteria) to grupa drobnoustrojów, której
znaczenie technologiczne odgrywa coraz większą rolę. Dlatego też, wzrost zainteresowania konsumentów żywnością funkcjonalną prowadzi do koncentracji badań w kierunku zastosowania PAB do produkcji
nowych wyborów żywności, także wykorzystania pałeczek Propionibacterium jako probiotyków. Potencjał
wydaje się być obiecujący, jednak wymagane są dalsze badania w celu wyselekcjonowania szczepów
o ściśle określonych właściwościach prozdrowotnych. Poza zapewnieniem satysfakcji konsumentów,
należy określić niepatogenność takich szczepów oraz poznać ich profile antybiotykooporności. Są to
cechy uwzględniane w trakcie oceny bezpieczeństwa stosowania szczepów jako bakterii potencjalnie
probiotycznych. Cel pracy: Celem pracy było określenie przydatności techniki epifluorescencyjnej
w badaniach przeżywalności szczepów Propionibacterium spp. w warunkach obecności substancji
antybiotycznych. Metody: Określono antybiotykooporność badanych szczepów na wybrane substancje
oraz założono modele doświadczalne z dodatkiem antybiotyków. Okresowo monitorowano liczebności
3 szczepów pałeczek fermentacji propionowej, oznaczając ich liczbę z zastosowaniem techniki epifluorescencyjnej CFDA/PI (dioctan karboksyfluoresceiny/jodek propidyny) oraz metody płytkowej. Wyniki:
Wykazano, że szczep Propionibacterium freudenreichii C08 charakteryzował się wrażliwością na cefotaksym oraz opornością na doksycylinę i rifampicynę. Szczepy Propionibacterium acidipropionici 78 i 79
wykazywały wrażliwość na wszystkie trzy antybiotyki. Stwierdzono, że liczebność komórek w czasie
długotrwałej hodowli oznaczana metodą epifluorescencyjną była większa od liczebności komórek oznaczanej metodą płytkową. Analiza statystyczna otrzymanych wyników wykazała istotne różnice między
porównywanymi technikami, które odnosząc się do różnych wyznaczników aktywności komórek wskazują
na wielowymiarowy wpływ substancji bakteriostatycznych na fizjologię PAB. Liczebność komórek aktywnych esterolitycznie oznaczana metodą CFDA była większa od liczby komórek zdolnych do reprodukcji
średnio o 1 log kom./ml. Wnioski: Metoda CFDA/PI pozwoliła na monitorowanie zmian w liczbie
i procentowym udziale komórek żywych i martwych w modelach doświadczalnych. Metoda CFDA/PI
umożliwiła także oznaczanie całkowitej liczby komórek w badanych próbach. Zastosowanie techniki
85
fluorescencyjnej pozwala na monitorowanie zmian stanu fizjologicznego i morfologicznego w niekorzystnych dla rozwoju pałeczek Propionibacterium spp. warunkach.
III-27 P | Charakterystyka profilu metabolicznego gleby nawożonej osadem z oczyszczalni
ścieków mleczarskich
Frąc M., Oszust K., Lipiec J.
Wstęp: Mikroorganizmy glebowe odgrywają kluczową rolę w podtrzymywaniu produktywności gleby,
uczestniczą w obiegu pierwiastków, ale z drugiej strony są niezwykle czułe na zmiany środowiska spowodowane czynnikami antropogenicznymi. Dlatego też ocena stanu mikrobiologicznego gleby jest
jednym z istotnych parametrów z punktu widzenia ochrony środowiska. Zaproponowane w ostatnich
latach rolnicze zastosowanie osadów z oczyszczalni ścieków mleczarskich, polegające na ich wykorzystaniu jako nawóz organiczny wydaje się pozytywnie wpływać na metaboliczny profil gleby (CLPP),
zmieniając populację bytujących w tym środowisku mikroorganizmów, ich aktywność enzymatyczną,
a tym samym aktywności fizjologiczną gleby. Cel pracy: Celem przeprowadzonych badań była ocena
wpływu nawożenia gleby osadem z oczyszczalni ścieków mleczarskich na jej mikrobiologiczny profil
metaboliczny oraz jego porównanie z profilami metabolicznymi gleb poddanych nawożeniu mineralnemu.
Metody: Doświadczenie zostało założone na glebie brunatnej, wytworzonej z utworu pyłowego ilastego.
Zastosowano dwie znacznie różniące się dawki nawożenia osadem z oczyszczalni ścieków mleczarskich
i dwie nawożenia mineralnego. Kontrolę stanowiła gleba bez dodatku nawozu organicznego i mineralnego. Obiekty doświadczalne obsiano pszenicą ozimą. Analizy przeprowadzono z wykorzystaniem systemu
BIOLOG ECO-plates, który opierając się na procesie katabolizmu oksydacyjnego 31 różnych substratów
węglowych, między innymi aminokwasów, węglowodorów i kwasów karboksylowych, umożliwił ocenę
stanu metabolicznego badanej gleby. Mikrobiologiczną aktywność poszczególnych obiektów doświadczalnych wyrażano za pomocą takich parametrów jak: średnia gęstość optyczna (OD) 31 zastosowanych
substratów (AWCD- Average Well-Collor Development), współczynnik R (Richeness), opisywany jako
liczba zmetabolizowanych oksydatywnie substratów węglowych oraz współczynnik Shannon-Weaver (H)
opisujący zarazem jednoznaczność odpowiedzi w postaci stopnia zmetabolizowania danego substratu
(granicę pozytywnej odpowiedzi przyjęto na poziomie 0,25 OD). Wymienione wyżej współczynniki analizowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji (ANOVA). Wnioski: Profile metaboliczne gleb
po zastosowaniu zaproponowanych rodzajów i dawek nawożenia różniły się miedzy sobą. Zanotowano
jednocześnie korzystny wpływ wzbogacenia gleby osadem ścieków mleczarskich na jej równowagę
mikrobiologiczną, o czym świadczy większa ilość metabolizowanych źródeł węgla i intensywność tego
procesu.
III-28 P | Ocena czystości mikrobiologicznej opakowań do żywności wykonanych z papieru
i tektury
Guzińska K., Owczarek M.
Instytut Biopolimerów i Włókien Chemicznych, Łódź
Wstęp: Opakowania tekturowe i papierowe mają bardzo długą historię stosowania w przemyśle spożywczym, gdzie są wykorzystywane często do bezpośredniego kontaktu z żywnością, np. torebkach do
herbaty, papierze do pieczenia, opakowaniach na cukier i cukierki czy też filtrach do kawy. Papier
i tektura mają również szerokie spektrum zastosowań jako opakowania zbiorcze do transportu i dystrybu86
cji. Cel pracy: Celem badań było określenie poziomu zanieczyszczeń mikrobiologicznych (bakterii
i grzybów) w różnego rodzaju papierowych i tekturowych materiałach opakowaniowych. Ponadto celem
badania był wybór najbardziej optymalnej metody ilościowego badania poziomu zanieczyszczenia
bakteriami i grzybami tektury i papieru. Metody: Badania zostały przeprowadzone trzema metodami:
metodą rozwłókniania (zgodnie z normą ISO 8784.1), metodą zalewnia agarem (zgodnie z niemiecką
normą DIN 54378) oraz metodą wymazową (w oparciu o normy PN-ISO 18593 i ISO 8784.1). Wyniki:
Wyniki badania zanieczyszczenia mikrobiologicznego próbek papieru (opakowania na cukier, papierki
z cukierków typu „krówka”) wykazały niski poziom zanieczyszczeń, który nie stwarza ryzyka dla konsumentów. Wyższy poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego zaobserwowano w przypadku tektury
(opakowanie na pizzę, opakowanie na czekoladki, opakowanie zbiorcze do jajek). Wnioski: Na podstawie badań stwierdzono, że metoda rozwłókniania jest najbardziej odpowiednia do ilościowego oznaczenia skażenie próbek papierowych i tekturowych. Metoda ta pozwala na precyzyjne oznaczenie poziomu zanieczyszczenia mikrobiologicznego wyrażonego w jednostkach tworzących kolonie (jtk) na gram
próbki zarówno bardzo czystej jak i silnie skażonej. Metoda zalewania agarem nie jest czasochłonna, ale
pozwala tylko na orientacyjny odczyt poziomu zanieczyszczenia ze względu na zlewny wzrost kolonii
trudność w odczycie. Natomiast metoda wymazowa nie jest właściwa do oznaczania ogólnej liczby
bakterii i grzybów próbkach papieru i tektury ze względu na ich porowatą strukturę. Badania wykazały, że
poziom skażenia niektórych opakowań tekturowych mających kontakt z żywnością, przy jednoczesnym
braku przepisów prawnych zmuszających producentów do potwierdzania bezpiecznego poziomu skażenia opakowań tekturowych, stwarza ryzyko dla zdrowia konsumentów.
III-29 P | Właściwości antygrzybicze i antybakteryjne szczepów Streptomyces sp. izolowanych
z ziemi i podłoży ogrodniczych
Peitler D., Fijałkowski K., Nawrotek P.
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Szczecin
Wstęp: Rodzaj Streptomyces tworzą Gram-dodatnie bakterie tlenowe, których naturalnym miejscem
występowania jest gleba i woda. Morfologią i sposobem rozmnażania bakterie te przypominają grzyby
strzępkowe. Komórki Streptomyces występują w grupach, tworzących nitkowate, rozgałęziające się
łańcuszki. Bardzo charakterystyczną cechą bakterii z rodzaju Streptomyces są ich produkty wtórne
metabolizmu. Bakterie te produkują ponad dwie trzecie używanych obecnie w medycynie antybiotyków.
Mogą syntetyzować również: pestycydy, insektycydy, fungicydy oraz związki przeciwwirusowe. Cel
pracy: Celem niniejszej pracy była izolacja oraz ocena właściwości antygrzybiczych i antybakteryjnych
bakterii z rodzaju Streptomyces izolowanych z różnych rodzajów ziemi oraz podłoży ogrodniczych.
Materiał i metody: Szczepy Streptomyces izolowano z ziemi i podłoży ogrodniczych różniących się
parametrami fizykochemicznymi oraz składem komponentowym. Po izolacji i wstępnej identyfikacji
wyhodowanych bakterii, oznaczano ich właściwości antygrzybicze i antybakteryjne. W tym celu izolaty
Streptomyces posiewano na podłoża BHI oraz Sabourauda i inkubowano w temperaturze pokojowej
przez 14 dni. Następnie na podłoże BHI prostopadle do wcześniejszego posiewu Streptomyces posiewano cztery różne rodzaje bakterii (S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli), natomiast na podłoże
Sabourauda cztery różne rodzaje grzybów (Alternaris sp., Rhizopus sp., Acremonium sp. oraz Candida
sp.). Podłoża inkubowano następnie przez 14 dni oceniając wzrost mikroorganizmów. Wyniki: Z 10
próbek ziemi wyizolowanych zostało 11 szczepów zakwalifikowanych do rodzaju Streptomyces. Wszystkie szczepy charakteryzowały się wytwarzaniem substancji hamujących wzrost i rozwój użytych
w doświadczeniach bakterii i grzybów. Przy czym, poszczególne szczepy różniły się pod względem
właściwości antybakteryjnych i antygrzybiczych. Największy wpływ na uzyskiwane wyniki, oprócz użytego
87
w teście szczepu testowego, miał czas jego inkubacji z badanymi szczepami Streptomyces. Wnioski: Na
podstawie uzyskanych w badaniach wyników można stwierdzić, że ziemia ogrodnicza stanowić może
cenne źródło bakterii z rodzaju Streptomyces charakteryzujących się dużym potencjałem antybakteryjnym i antygrzybiczym.
III-30 P | Mikrobiologiczna degradacja bisfenolu A
Piątek M.A., Słaba M., Długoński J.
Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Bisfenol A czyli 2,2-bis(p-4-hydroksyfenylo)propan (BPA) jest związkiem zaliczanym do substancji zaburzających działanie układu dokrewnego, gdyż reaguje z receptorami estrogenowymi, zakłócając
równowagę hormonalną organizmu. Wykazuje także działanie toksyczne dla organizmów wodnych
(dawka EC lub LC 50 dla ryb i skorupiaków morskich lub słodkowodnych wynosi od 1 do 10 mg/l).
Pierwotnie BPA miał służyć do hormonalnej terapii zastępczej jako syntetyczny estrogen. Obecnie jest
wykorzystywany jako katalizator przy produkcji poliwęglanu, przezroczystego i sztywnego plastiku, oraz
żywic epoksydowych, a także jako przeciwutleniacz w kosmetykach i artykułach spożywczych. Poliwęglanowe tworzywa sztuczne cechują się wysoką wytrzymałością oraz plastycznością, dlatego służą one
do produkcji cyfrowych środków przekazu, sprzętu elektrycznego i elektronicznego oraz do wytwarzania
opakowań na żywność i butelek, w tym butelek do karmienia niemowląt. Cel pracy: Celem pracy jest
przedstawienie zagrożeń dla zdrowia ludzi, wynikających z powszechnego używania materiałów zawierających dodatek BPA oraz mikroorganizmów zdolnych do jego degradacji. Metody: Zawartość BPA
w próbach środowiskowych, materiałach biologicznych i hodowlach drobnoustrojów oznacza się metodami chromatografii gazowej lub cieczowej. Wyniki: Najwięcej danych literaturowych o bakteryjnej
degradacji tego ksenoestrogenu, podobnie jak wielu innych toksycznych ksenobiotyków, dotyczy aktywności mikroflory autochtonicznej ze skażonych środowisk oraz szczepów z rodzaju Pseudomonas.
W literaturze opisywane są również grzyby strzępkowe jako organizmy zdolne do efektywnej biodegradacji bisfenolu A ze środowiska wzrostu. Najczęściej wymieniane są grzyby białej zgnilizny drewna, ze
względu na obecność ligninaz, zaangażowanych w rozkład różnych toksycznych zanieczyszczeń.
Znacznie mniej wiadomo o mechanizmie rozkładu BPA przez mikroskopowe grzyby nieligninolityczne,
aktywne w tym procesie. Grzyb należący do Zygomycota - Cunninghamella elegans ATCC36112 - tworzy
hydroksylowane pochodne z udziałem cytochromu P-450, jednak główna pula metabolitów to produkty
sprzęgania z glukozą. Wśród Ascomycota najczęściej wymieniane są grzyby z rodzajów Aspergillus
i Fusarium jako zdolne do degradacji BPA, na drodze oksydacyjnego rozerwania wiązania pomiędzy
2 atomami węgla i wytworzeniem 4-izopropenylofenolu jako głównego produktu rozkładu. Wnioski:
Rozkład mikrobiologiczny tego związku zazwyczaj prowadzi do detoksykacji środowiska, czasem jednak
eliminacja BPA może powiększać efekt toksyczny lub estrogenny.
III-31 P | Jakość mikrobiologiczna powietrza klimatyzowanej i nieklimatyzowanej sali wykładowej
Pietruk M.
Katedra Mikrobiologii Środowiskowej, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski
Wstęp: Jakość powietrza wewnętrznego w dużym stopniu zależy od powietrza atmosferycznego, usytuowania budynku, liczby jego użytkowników, a także od systemów wentylacyjnych i klimatyzacyjnych
w budynkach. Systemy te stosowane są w celu zapewnienia świeżego powietrza i usunięcia zanieczyszczeń z pomieszczeń. Dostępne dane literaturowe wykazują, że przewody powietrzne mogą stanowić
88
siedlisko mikroorganizmów. Zakumulowany kurz i mikroorganizmy w kanale nawiewnym mogą być
źródłem zanieczyszczenia powietrza w pomieszczeniach oraz wpływać na zdrowie ludzi. Cel pracy:
Oceniano stopień bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza wewnątrz dwóch sal wykładowych:
klimatyzowanej i nieklimatyzowanej, w zależności od pory roku i liczby użytkowników sal. Metody: Próbki
powietrza analizowano pod kątem liczebności bakterii heterotroficznych, oraz bakterii hemolizujących.
Powietrze do badań pobierano w cyklu rocznym, dwukrotnie w ciągu dnia: przed rozpoczęciem zajęć i po
ich zakończeniu. Próbki powietrza pobierane były metodą zderzeniową na 3 stanowiskach zlokalizowanych wewnątrz sal, a także na 1 stanowisku w korytarzach przed salami. Kontrolnie pobierano próbki
powietrza atmosferycznego przed budynkami, w których znajdują się badane sale wykładowe. Wyniki:
Odnotowano różnice w liczebnościach badanych grup drobnoustrojów w zależności od pory roku, sposobu wymiany powietrza oraz liczby użytkowników sal. Największe liczebności bakterii heterotroficznych
w powietrzu obu badanych sal występowały w sezonie jesiennym i kształtowały się na poziomie 102 – 103
jtk m-3. Bakterie hemolizujące w tym okresie stanowiły od 67 do 84% ogólnej liczby bakterii heterotroficznych, odpowiednio w powietrzu sali nieklimatyzowanej i klimatyzowanej. Stwierdzono spadek liczebności
wszystkich badanych grup drobnoustrojów w próbkach powietrza pobranych po zakończeniu zajęć w sali
klimatyzowanej. Wnioski: Zgodnie z zaleceniami Górnego i na podstawie uzyskanych wyników badań,
stan środowiska wewnętrznego w obu badanych salach wykładowych można ocenić jako dobry. Spadek
liczebności badanych grup drobnoustrojów po zakończeniu zajęć, pomimo dużej liczby użytkowników
w klimatyzowanej sali wykładowej, świadczy o tym, iż właściwie użytkowana klimatyzacja może znacząco
poprawiać jakość powietrza pomieszczeń.
III-32 P | Identyfikacja wybranych cech bakterii endofitycznych z rodzaju Pseudomonas
zasiedlających kukurydzę (Zea mays L.)
Pisarska K., Adamski M., Pietr S.J.
Department of Plant Protection, Division of Agriculture Microbiology,
Wroclaw University of Environmental and Life Science, Poland
Wstęp: Drobnoustroje endofityczne to mikroorganizmy, które bytują we wnętrzu rośliny i nie powodują
choroby swojego gospodarza. Izolowane są z wnętrza tkanek roślinnych po ich wcześniejszej powierzchniowej dezynfekcji. Wśród drobnoustrojów zasiedlających tkanki roślin kukurydzy stwierdza się liczne
bakterie z rodzaju Pseudomonas. Drobnoustroje z tego rodzaju stanowią źródło potencjalnych biologicznych środków ochrony roślin. Przypisuje im się również zdolność do wiązania wolnego azotu i produkcji
sideroforów. Wśród składników soków komórkowych związki fenolowe wykazują największe właściwości
bakterio oraz grzybobójcze i stanowią naturalne źródło ochrony przed patogenami. Zdolność drobnoustrojów do tolerowania takich substancji stanowi istotny czynnik selekcjonujący potencjalnych kandydatów jako narzędzia biologicznej ochrony. Cel pracy: Celem niniejszej pracy była identyfikacja wybranych
cech bakterii z rodzaju Pseudomonas pozyskanych z tkanek liści sześciu odmian kukurydzy (KB1902,
KB1903, KB2704, KRÓL, KOSMO230, CYRKON) uprawianych w dwóch lokalizacjach. Metody: Bakterie
z rodzaju Pseudomonas wyizolowano z 6 odmian kukurydzy uprawianych na polach doświadczalnych
w Kobierzycach i Smolicach, Polska. Izolacji bakterii z rodzaju Pseudomonas dokonano na podłożu
Gould'a. Przebadano zdolność endofitów z rodzaju Pseudomonas do wykorzystywania jako jedynego
źródła węgla i energii kwasów fenolowych i alkoholu koniferylowego. Określono również zdolności do
produkcji sideroforów oraz zdolność do wiązania wolnego azotu z wykorzystaniem markera dla genu
nifH. Wyniki: Z 6 odmian kukurydzy uprawnej wyizolowano łącznie 42 szczepy bakterii z rodzaju Pseudomonas, z czego 3 izolaty nie wykazywały fluorescencji na podłożu typu Gould. Tylko 19% izolatów nie
wykazywało zdolności do wykorzystywania kwasów fenolowych (kwasu chlorogenowego, ferulowego,
p-kumarowego i o-kumarowego) oraz alkoholu koniferylowego jako jedynego źródła węgla i energii.
89
Wzrost szczepów, które nie wykorzystywały wyżej wymienionych związków, nie był hamowany w stężeniach nawet czterokrotnie wyższych niż stwierdzane w sokach komórkowych. Alkohol koniferylowy
w stężeniu czterokrotnie większym od występującego w sokach komórkowych (0,5%) hamował wzrost
tylko trzech izolatów. Dwa izolaty posiadały gen nifH odpowiedzialny za wiązanie wolnego azotu.
III-33 P | Niejednoznaczność identyfikacji gatunkowej bakterii z rodzaju Staphylococcus
izolowanych od drobiu
Polakowska K.1, Białecka A.4, Kasprowicz A.4, Król J.3, Wieliczko A.3, Dubin A.2, Władyka B.2,
Międzobrodzki J.1
1 Zakład
2 Zakład
Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, Kraków
Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński,
Kraków
3 Wydział Weterynarii, Uniwersytet Przyrodniczy, Wrocław
4 Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. Dr J. Bobra, Kraków
Wstęp: W ostatnich latach opracowano wiele metod (fenotypowych i genetycznych) identyfikacji izolatów z rodzaju Staphylococcus. Konwencjonalna identyfikacja gatunków gronkowców oparta jest na
właściwościach fizjologicznych, biochemicznych oraz charakterystyce morfologicznej. Rezultaty otrzymywane za pomocą komercyjnych testów opartych na profilach biochemicznych i immunologicznych
obarczone są pomyłkami z powodu zmiennej ekspresji niektórych cech fenotypowych i dwuznaczności
w interpretacji wyników. Sytuację tę komplikuje potwierdzenie odrębności genetycznej szczepów ludzkich
i zwierzęcych oraz ogromna, zarówno fenotypowa jak i genotypowa zmienność tych bakterii, co odzwierciedla się powstawaniem coraz to nowych szczepów. Cel pracy: Pomimo wzrastającej świadomości
odrębności szczepów ludzkich i zwierzęcych oraz wzrostu zainteresowania w medycynie weterynaryjnej,
badania dotyczące szczepów izolowanych od zwierząt są słabiej zaawansowane. Dlatego celem niniejszej pracy była izolacja oraz ocena wiarygodności i skuteczności testów fenotypowych w oznaczaniu
izolatów pochodzących od zwierząt w odniesieniu do analizy genetycznej. Metody: Przeprowadzono
standardowe testy diagnostyczne: w kierunku katalazy, wolnej koagulazy, aglutynacji lateksowej,
z podłożami chromogennymi Staphylococcus select, test biochemiczny ID 32 STAPH. Spośród molekularnych metod taksonomicznych zastosowano: PCR-RFLP z użyciem genu gap i trawienia enzymem
AluI, analizę sekwencyjną genu kodującego 16S rRNA oraz innych genów - rpoB, tuf, sodA, kodujących
wysoce konserwatywne białka. Wyniki: Metody fenotypowe nie pozwoliły na jednoznaczną identyfikację
gatunkową 3 spośród 40 szczepów, jednak pozwoliły zaklasyfikować je do rodzaju Staphylococcus.
Biochemiczy test ID 32 STAPH wskazał prawdopodobieństwo identyfikacji do 10% - stanowi to wynik nie
do zaakceptowania. W przypadku genu sodA nie otrzymano produktu PCR. Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (PCR-RFLP) nie potwierdziła jednoznacznie przynależności gatunkowej
w obrębie rodzaju Staphylococcus. Z kolei analiza sekwencji genu rpoB wskazała na odmienny gatunek
gronkowca w stosunku do wyników z analizy sekwencji genów tuf oraz 16S rRNA. Wnioski: Ustalenie
zróżnicowania taksonomicznego w obrębie rodzaju Staphylococcus nie jest łatwe, zwłaszcza w przypadku badania szczepów zwierzęcych. Na podstawie uzyskanych wyników wskazane jest dalsze prowadzenie badań mających na celu poszerzenie wiedzy na temat charakterystyki fenotypowej i genetycznej
szczepów izolowanych od zwierząt, a także ich odrębności w stosunku do szczepów ludzkich oraz
szybkiej i dokładnej identyfikacji gatunkowej gronkowców.
____________________
Badania finansowane z grantów MNiSW: nr N N303 813340 (B. W.) oraz N N401 017740 (J. M.).
90
III-34 P | Mikologiczna charakterystyka osadu czynnego z oczyszczalni ścieków
Rutkowska A., Frąc M., Lipiec J.
Wstęp: Oczyszczanie ścieków w ostatnim czasie stanowi bardzo istotny problem związany z ochroną
środowiska. Jednym ze sposobów oczyszczania ścieków jest metoda osadu czynnego. Osad czynny
stanowi mieszaninę mikroorganizmów, jednak jego skład mikologiczny nie jest do końca poznany.
Dlatego też wydaje się celowe podjęcie badań dotyczących oceny populacji grzybów występujących
w osadzie czynnym. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono liczebność grzybów strzępkowych w osadzie czynnym oraz zidentyfikowano dominujące szczepy mikrogrzybów. Badania obejmowały również
określenie wybranych właściwości metabolicznych izolatów. Metody: Osad czynny wykorzystany
w badaniach pochodził z oczyszczalni ścieków komunalnych w Nałęczowie. Liczebność grzybów określono metodą wysiewu rozcieńczeń na podłożu Martina z różem bengalskim. Badania obejmowały
określenie dominujących gatunków grzybów oraz scharakteryzowanie ich wybranych właściwości metabolicznych. Identyfikacja grzybów została przeprowadzona w oparciu o analizę genu D2 LSU z wykorzystaniem analizatora genetycznego. Poszczególne etapy badań obejmowały: ekstrakcję DNA z grzybni,
amplifikację fragmentu D2 oraz jego sekwencjonowanie. Identyfikację gatunkową przeprowadzono
z wykorzystaniem systemu MicroSEQ, opierając się na porównaniu otrzymanej sekwencji z bazą danych
sekwencji grzybowych. Właściwości fizjologiczne określono w oparciu o zdolność metabolizowania
różnych substratów węglowych z wykorzystaniem systemu BIOLOG. Wnioski: Przeprowadzone badania
pozwoliły na zidentyfikowanie dwóch dominujących szczepów grzybów (Penicillium spinulosum oraz
Beauveria felina) wyodrębnionych z osadu czynnego.
III-35 P | Skrining uzdolnień dekoloryzacyjnych wyselekcjonowanych grzybów glebowych wobec
błękitu alizaryny
Rybczyńska K., Korniłłowicz-Kowalska T.
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Katedra Mikrobiologii Środowiskowej,
Pracownia Mikologiczna 20-069, Leszczyńskiego 7
Wstęp: Barwne ścieki przemysłowe powstają głównie w przemyśle włókienniczym i celulozowopapierniczym. Wzrastająca skala produkcji ścieków z tych sektorów przemysłowych przy niedostatecznym ich odbarwianiu sprawia, że do środowiska przedostaje się od 2-50% substancji barwnych zależnie
od ich charakteru chemicznego. Do najgroźniejszych, z uwagi na właściwości mutagenne i karcinogenne,
oraz najodporniejszych na biodegradację substancji barwnych zaliczane są barwniki antrachinonowe.
Zalegając w środowisku wodnym stanowią one zagrożenie dla ludzi i zwierząt oraz przyczyniają się do
zaburzania równowagi biologicznej ekosystemów wodnych. Konwencjonalne metody dekoloryzacji oparte
na procesach fizyko-chemicznych nie dają trwałego i pełnego odbarwienia ścieków przemysłowych.
W związku z tym poszukuje się innowacyjnych rozwiązań z wykorzystaniem mikroorganizmów, które
będą dawały efektywną dekoloryzację. Cel pracy: Celem prezentowanej pracy była ocena uzdolnień
dekoloryzacyjnych wyselekcjonowanych szczepów grzybów glebowych wobec barwników antrachinonowych oraz zbadanie aktywności enzymatycznej zewnątrzkomórkowych fenolooksydaz tych drobnoustrojów. Materiał i metody: Użyte do badań szczepy grzybów glebowych (45) zidentyfikowane jako: Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, G. roseum, Trichoderma viride i Aspergillus sp. wyodrębniono
metodą pułapek, stosując ligninę po-przemysłową jako substrat. Zebrany materiał grzybowy został
wstępnie przetestowany na zagaryzowanym podłożu selektywnym z 0,06% błękitem alizaryny. Kryterium
selekcji szczepów stanowiło tempo odbarwiania błękitu alizaryny. Dalsze badania prowadzono w stacjo91
narnych hodowlach płynnych stosując 50cm3 podłoża mineralnego z 0,03% dodatkiem błękitu alizaryny
(28˚C, 14 dni). Okresowo oznaczano stopień dekoloryzacji oraz aktywność fenolooksydaz obejmujących
peroksydazy i lakazę. Wyniki: Stwierdzono, że badane grzyby wykazywały uzdolnienia dekoloryzacyjne
wobec 0,03% roztworu błękitu alizaryny. Tempo dekoloryzacji tego barwnika w płynnych hodowlach
stacjonarnych było zależne od szczepu grzyba. Dekoloryzacja zachodziła na drodze enzymatycznej
i sprzężona była z syntezą jednej lub kilku zewnątrzkomórkowych peroksydaz: manganozależnej (MnP),
ligninowej (LiP), podobnej do chrzanowej (HRP-like), uniwersalnej (VP) lub lakazy. Wnioski: Aktywność
dekoloryzacyjna poszczególnych szczepów była uwarunkowana rodzajem produkowanej fenolooksydazy. Przeprowadzone badania wskazują na możliwość stosowania grzybów mikroskopowych w dekoloryzacji barwników antrachinonowych.
III-36 P | Wpływ rasy drożdży Saccharomyces cerevisiae na przebieg i wskaźniki fermentacji
etanolowej żytnich zacierów gorzelniczych
Sapińska E., Stanisz M., Pielech-Przybylska K., Balcerek M., Szopa J.
Zakład Technologii Spirytusu i Drożdży, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii,
Wstęp: Fermentację zacierów gorzelniczych prowadzi się najczęściej z udziałem suszonych drożdży
gorzelniczych gatunku Saccharomyces cerevisiae. Ułatwia to prowadzenie procesu, gdyż umożliwia
likwidację działu propagacji drożdży w gorzelni, ograniczając tym samym koszty produkcji. Jednocześnie
w dowolnym czasie można rozpocząć fermentację, bez potrzeby przygotowania matki drożdżowej
i przycierka. Większość ras drożdży wykorzystywanych w procesie gorzelniczym charakteryzuje się m.in.:
odpornością na działanie alkoholu (rasy D2, As4 do 12% obj.; Ethanol Red do 18% obj.), podwyższoną
tolerancją na ciśnienie osmotyczne oraz zwiększoną energią zafermentowania zacierów i dużą prędkością właściwą wytwarzania etanolu. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniano wpływ rasy drożdży
S. cerevisiae, D2 oraz As4 na przebieg i wskaźniki fermentacji etanolowej żytnich zacierów gorzelniczych.
Metody: Zaciery przygotowywano metodą bezciśnieniowego uwalniania skrobi (BUS) oraz ciśnieniowotermiczną, z żyta odmiany Amilo, z wykorzystaniem preparatów enzymatycznych zawierających
α-amylazę i amyloglukozydazę. Fermentację prowadzono systemem trzydobowym w temperaturze
28÷30°C, przy wykorzystaniu suszonych drożdży gorzelniczych S. cerevisiae, rasy D2 oraz As4 (dawka
0,3 g s.s/dm3 zacieru słodkiego), z dodatkiem pożywki (NH4)2HPO4. Po zakończeniu procesu pobrano
próbki zacierów odfermentowanych i wykonano analizy w celu określenia prawidłowości przebiegu
procesu. Oznaczano ekstrakt pozorny i rzeczywisty, zawartość alkoholu w zacierze, a także cukry:
redukujące, ogółem i dekstryny. Wyniki: Badania wykazały, że zaciery otrzymane w wyniku obróbki
ciśnieniowo-termicznej fermentowały szybciej przy użyciu drożdży rasy As4 (faza zafermentowania trwała
ok. 6 h, a czas trwania procesu wynosił ok. 30 h). Natomiast zaciery przygotowane metodą BUS fermentowały dynamicznej z udziałem drożdży rasy D2, proces zakończył się już po ok. 45 h. Na podstawie
otrzymanych wyników stwierdzono, iż rasa drożdży wykorzystanych do fermentacji zacierów żytnich
istotnie wpłynęła na skład fizyko-chemiczny zacierów odfermentowanych. Najwyższą wydajność etanolu 87,28% wydajności teoretycznej, uzyskano dla drożdży D2, w zacierze przygotowanym metodą BUS.
Wnioski: Fermentacja żytnich zacierów gorzelniczych otrzymanych metodą BUS, z udziałem drożdży
rasy D2 przebiegała dynamiczniej oraz charakteryzowała się wyższymi wskaźnikami procesu, w stosunku do As4. Natomiast zaciery otrzymane w wyniku obróbki ciśnieniowo-termicznej fermentowały efektywniej przy użyciu drożdży rasy As4.
92
III-37 P | Wskaźniki zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza w wybranych środowiskach
pracy
Skóra J., Gutarowska B., Rembisz D., Zduniak K., Śnioszek A.
Institute of Fermentation Technology and Microbiology, Technical University of Lodz, Poland
Wstęp: Zagrożenie zawodowe ze strony mikroorganizmów zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia
z dn. 22.04.2005 (Dz.U.2005, Nr 81, poz.716 ze zmianami: Dz.U.2008, Nr 48, poz.288) dotyczy pracy
w zakładach produkujących żywność; w rolnictwie; w służbie zdrowia; w laboratoriach, w zakładach
gospodarki odpadami; przy oczyszczaniu ścieków i innych. Dlatego istotne jest wyznaczenie wskaźników
zanieczyszczeniach mikrobiologicznego, które pozwoliłyby na szybką ocenę stopnia zanieczyszczenia
drobnoustrojami i zagrożenia dla pracowników. Cel pracy: Niniejsza praca miała na celu ocenę zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza wybranych miejsc pracy: muzea, archiwa i biblioteki, garbarnie, kompostownie oraz wytypowanie drobnoustrojów wskaźnikowych w tych środowiskach. Metody:
Czystość mikrobiologiczną powietrza oznaczano metodą zderzeniową. Identyfikację grzybów prowadzono na podstawie obserwacji makro- i mikroskopowych przy pomocy kluczy taksonomicznych. Identyfikację bakterii przeprowadzono przy pomocy testów diagnostycznych API. Wyniki: Zanieczyszczenie
mikrobiologiczne powietrza w pomieszczeniach Archiwum i Biblioteki kształtowało się na poziomie:
2,1x102 jtk/m3 dla ogólnej liczby drobnoustrojów. W Muzealnych wynosiło 9,5x102 jtk/m3. W pomieszczeniach tych dominowały bakterie z rodzaju Micrococcus, Staphylococcus i Bacillus oraz grzyby z rodzaju:
Peniclillium, Cladosporium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor. Na stanowiskach pracy w garbarni stężenie
mikroorganizmów w powietrzu wynosiło 2-3x103 jtk/m3, dominowały gatunki: Bacillus, Micrococcus,
Staphylococcus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria. W powietrzu zakładu produkującego kompost
stężenie bakterii i grzybów przekraczało 5,3x104 jtk/m3. Drobnoustroje wyizolowane z powietrza kompostowni należały głównie do grzybów: Penicillium, Cladosporium, Aspergillus, Rhizopus oraz bakterii
z rodzajów Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, wyizolowano również promieniowce. Wnioski:
Grzyby strzępkowe wyizolowane w powietrzu archiwów, bibliotek i muzeów z rodzajów: Penicillium,
Aspergillus, Cladosporium mogą być wskaźnikami zanieczyszczenia mikrobiologicznego w tego typu
obiektach. Stwierdzono w tych pomieszczeniach obecność gatunków potencjalnie chorobotwórczych:
Aspergillus fumigatus (BSL 2), Aspergillus flavus (BSL 2), Peacilomyces variotii (BSL 2). W powietrzu
garbarni zdiagnozowano liczne gatunki bakterii z rodzaju Bacillus, które mogą być wskaźnikiem mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza w tych środowiskach. Wyizolowano również bakterie: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis należące do 2 grupy zagrożenia zdrowotnego. Promieniowce termofilne
zostały uznane za dobry wskaźnik zanieczyszczenie mikrobiologiczne powietrza w kompostowniach. Nie
stwierdzono obecności bakterii patogennych w tym środowisku pracy.
III-38 P | Dobór warunków biosyntezy drożdżowego SCP z wykorzystaniem wybranych produktów
ubocznych przemysłu cukrowniczego
Stanisz M.1, Patelski P.2, Antczak A.1, Gruska R.1, Sapińska E.2
Politechnika Łódzka, ul. Wólczańska 171/173, 90-924 Łódź
1 Instytut Chemicznej Technologii Żywności, Zakład Cukrownictwa
2 Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Zakład Technologii Spirytusu i Drożdży
Wstęp: Liście buraczane są jednym z produktów ubocznych przemysłu cukrowniczego i związanej z nim
uprawy buraków cukrowych. Obecnie, bezpośrednio po zbiorze buraków, liście najczęściej wykorzystywane są jako pasza. Ten sposób zagospodarowania sprawia, że niewykorzystana część liści ulega
zepsuciu i zniszczeniu (nadmierna ilość liści w stosunku do trzody chlewnej). Cel pracy: W celu podnie93
sienia efektywności wykorzystania liści buraków cukrowych podjęto badania oceny liści jako surowca do
produkcji drożdży paszowych. Metody: W celu zwiększenia puli cukrów dostępnych dla drożdży zastosowano trzy warianty obróbki zmielonych liści buraków cukrowych: hydrolizę enzymatyczną, hydrolizę
chemiczno-termiczną (z kwasem siarkowym) oraz hydrolizę łączoną – enzymatyczną, po wstępnej
obróbce chemicznej. W hydrolizie enzymatycznej wykorzystano preparaty celulolityczne, znane pod
nazwami handlowymi AlternaFuel 200P, CeluStar XL, CeluStar Plus oraz Accellerase 1500. Hydrolizaty
liści sączono (0,45µm), regulowano pH (pH=5) i wzbogacano solami mineralnymi (N, P, K, Mg). Otrzymaną pożywkę szczepiono drożdżami Trichosporon cutaneum lub Candida tropicalis lub Kluyveromyces
marxianus, które pochodziły z kolekcji Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki
Łódzkiej. Hodowle wstrząsane prowadzono w ciągu 48h, w temperaturze 30±1 oC. W podłożach przed
hodowlą, jak i w odciekach pohodowlanych oznaczono zawartość węglowodanów metodą chromatografii
jonowej. Określono również namnożenie biomasy metodą wagową. Wyniki: Najbardziej wydajnie (niezależnie od wariantu hydrolizy liści) przebiegała biosynteza drożdży Trichosporon cutaneum. Największe
namnożenie (17.6±0.2 g s.s./dm3) uzyskano dla tego szczepu po skojarzonej hydrolizie chemicznoenzymatycznej. Ten wariant przygotowania surowca, okazał się najkorzystniejszy również w przypadku
hodowli dwóch pozostałych szczepów - uzyskano 13.1±0.2 g s.s./dm3 dla drożdży Kluyveromyces
marxianus oraz 12.3±0.2 g s.s./dm3 w przypadku biomasy Candida tropicalis. Najsłabsze namnożenie
stwierdzono w podłożach przygotowanych bez hydrolizy enzymatycznej. W stosunku do hydrolizatów
otrzymanych skojarzoną metodą chemiczno-enzymatyczną zaobserwowano spadki namnożenia
o 20.9%, 44.4% i 53.5% odpowiednio dla drożdży Trichosporon cutaneum, Candida tropicalis i Kluyveromyces marxianus. Wnioski: Wykonane badania potwierdzają możliwość zastosowania zhydrolizowanych enzymatycznie liści buraków cukrowych jako surowca do produkcji białka SCP.
III-39 P | Przeciwdrobnoustrojowa aktywność folii pullulanowych wzbogaconych w wodnoetanolowy ekstrakt z bazylii wonnej (Ocinum basilicum L.)
Synowiec A.1, Gniewosz M.1, Przybył J.2, Bączek K.2
1 Zakład
Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Wydział Nauk o Żywności
Roślin Leczniczych i Warzywnych, Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu,
2 Katedra
Wstęp: Na całym świecie prowadzone są badania dotyczące powłok, które w swoim składzie zawierałyby substancje hamujące wzrost drobnoustrojów. Jedną z substancji jakie można wykorzystać do tworzenia takich powłok jest pullulan mający zdolność do tworzenia lepkich cieczy, które po wyschnięciu mogą
tworzyć przezroczyste błony pozbawione smaku i zapachu. Wprowadzając do takiej błony ekstrakty
roślinne, mające działanie przeciwdrobnoustrojowe możemy ograniczyć niekorzystny wpływ mikroflory na
produkt. Cel pracy: Celem tych badań było określenie właściwości przeciwbakteryjnych filmów pullulanowych wzbogaconych w wodno-etanolowy ekstrakt z ziela bazylii. Metody: Ekstrakt z bazylii wonnej
przygotowano metodą ekstrakcji periodycznej jednostopniowej. Jako rozpuszczalnika użyto 40% roztworu etanolu. Surowiec ekstrahowano utrzymując temperaturę 70°C przez 2 godziny. Ekstrakt surowy
zagęszczono w wyparce do zawartości suchej masy równej: 0,35 g/cm 3. W skład filmów pullulanowych
wchodził [g/100cm3]: pullulan 5,0; białko serwatkowe 3,75; ekstrakt z bazylii w zakresie 3-15% s.s,
glicerol 4-9,5%, woda destylowana do 100 cm3. Aktywność przeciwbakteryjną filmów zawierających
ekstrakty z ziela bazylii badano metodą płytkowo–dyfuzyjną. Z gotowych filmów wycinano krążki
o średnicy 12 mm. Po inkubacji mierzono średnicę strefy zahamowania wzrostu wokół krążków. Wynik
podawano w mm, po odjęciu średnicy krążka (12 mm). Jako mikroorganizmy testowe wykorzystano:
Aspergillus niger ATTC 9142, Rhizopus arrhizus ATCC 11145, Penicilium expansum ATTC 7861,
Saccharomyces cerevisiae rasy Bingen, Saccharomycopsis fibuliger E.ang , Bacillus sublilis ATCC 6633,
Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis 14a PZH, Salmonella Enteritidis ATCC 13076, Staphylo94
coccus aureus ATCC 25923. Wyniki: Filmy pullulanowe z dodatkiem wyciągu z ziela bazylii wonnej
wykazały działanie hamujące w stosunku do trzech testowych szczepów bakteryjnych: Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Bacillus sublilis ATCC 6633, Proteus mirabilis 14a PZH, Salmonella Enteritidis
ATCC. Pozostałe szczepy nie były hamowane przez badany ekstrakt. Wnioski: Uzyskane wyniki wykazały, że zastosowanie w filmie ekstraktu z bazylii wonnej może mieć potencjalne zastosowanie w opakowalnictwie żywności, zwłaszcza przeciwko zanieczyszczeniom wywołanym bakteriami gramdodatnimi.
III-40 P/O | Zastosowanie wielowarstwowych nanorurek węglowych do ekstrakcji patuliny z soków
jabłkowych metodą SPE
Śliwińska A., Przybylska A., Bazylak G.
Katedra i Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera
w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Jagiellońska 13, 85-067 Bydgoszcz
Wstęp: Patulina to mikotoksyna będąca produktem metabolizmu wtórnego niektórych szczepów grzybów
należących do rodzaju Penicillium i Aspergillus. W krajach Unii Europejskiej najwyższe dopuszczalne
stężenie patuliny w sokach i nektarach owocowych nie może przekraczać 50.0 μg/kg, a w produktach
przeznaczonych dla niemowląt i małych dzieci 10.0 μg/kg. Patulina zaliczana jest do tzw. naturalnie
występujących zanieczyszczeń żywności, co oznacza że jej całkowita eliminacja z owocowych produktów
spożywczych często nie jest możliwa. Cel pracy: Celem badań było określenie wydajności procesu
wyodrębniania patuliny z krajowych soków jabłkowych metodą ekstrakcji w fazie stałej - SPE, w której
zastosowano wielowarstwowe nanorurki węglowe różniące się stopniem oczyszczenia, cechami morfologicznymi, strukturą molekularną i średnicą nanoporów. Celem pracy było także porównanie efektywności opracowanej metody ze stosowanymi dotychczas procedurami ekstrakcji patuliny w warunkach SPE.
Metody: W badaniach stosowano system Baker-spe12G i membranową pompę próżniową. Uzyskane
ekstrakty SPE zatężano w temp. 22-65°C w strumieniu helu i analizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach HPTLC. Chromatogramy rozwijano w planarnej komorze chromatograficznej
DS II stosując fazę ruchomą toluen-octan etylu-kwas mrówkowy (5+4+1,v/v/v), a uzyskane pasma
obserwowano w świetle lampy UV przy dł. fali 254 oraz 365 nm. Dodatkowo płytki HPTLC spryskiwano
0.5 % wodnym roztworem chlorowodorku 3-metylo-2-benzotiazalinonu (MBTH), a następnie ogrzewano
w temp. 100 °C przez 30 min w celu uzyskania zabarwionego na zółto produktu reakcji z patuliną.
Wyniki: W metodzie SPE-HPTLC granica detekcji patuliny w soku jabłkowym wynosi 5 ng per spot czyli
50 μg/kg. Oprócz patuliny w ekstraktach SPE z soku jabłkowego stwierdzono obecność
5-hydroksymetylofurfuralu, kwercetyny, kwasu askorbowego oraz insektycydów takich jak fenitrotion,
chlorpirifos i cypermetryna. Największy odzysk patuliny (98 %) z soków fortyfikowanych na poziomie
20-100 mg/L uzyskano po ekstracji SPE na kolumienkach Speedisc H2O. Najwyższą selektywność
ekstrakcji SPE patuliny z fortyfikowanego soku jabłkowego zapewnia kolumienka MultiSep 228 oraz
kolumienka zawierająca wielowarstwowe nanorurki węglowe o niskiej średnicy (2-6 nm). W żadnej
z badanych próbek krajowych soków jabłkowych nie stwierdzono obecności patuliny przy zastosowaniu
proponowanej metody. Wnioski: Badania wykazały wysoką przydatność wielowarstwowych nanorurek
węglowych jako wypełnienia kolumienek SPE do selektywnej i szybkiej ekstrakcji śladowych ilości
patuliny z soków jabłkowych.
95
III-41 P | Wpływ mikoryzacji na aktywność enzymów antyoksydacyjnych i syntezę flawonoidów
u odmian Allium cepa
Wężowicz K.1, Świadek M.1, Rąpała-Kozik M.2, Anielska T.1, Turnau K.1
1 Instytut
Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński,
Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński
2 Wydział
Wstęp: Cebula (Allium cepa) jest jednym z najczęściej konsumowanych warzyw i jednocześnie stanowi
źródło licznych bioaktywnych substancji o działaniu terapeutycznym. Zawarte w niej flawonoidy wykorzystywane są jako naturalne leki w leczeniu schorzeń układu krwionośnego, oddechowego i pokarmowego.
Cebula jest rośliną uprawiana na terenach stosunkowo ubogich w związki mineralne i do prawidłowego
rozwoju i jakości oferowanego produktu wymaga obecności grzybów mikoryzowych. Inokulacja roślin
arbuskularnymi grzybami mikoryzowymi często okazuje się pomocna w produkcji rolnej. Cel pracy:
W niniejszej pracy oceniono przydatność grzybów mikoryzowych w uprawach polskich odmian cebuli
poprzez oznaczenie stężenia flawonoidów oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych u cebuli inokulowanej i nieinokulowanej Glomus intraradices. Metody: Po 3 miesiącach uprawy w sterylnym podłożu
komercyjnym, mikoryzowe i niemikoryzowe rośliny zważono i zhomogenizowano w metanolu przy użyciu
moździerza. Stężenie flawonoidów w cebuli zmierzono metodą chromatografii gazowej. Dla odmian
Wolska i Ishikura oznaczono aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) stosując fotochemiczną
redukcję NBT do formazanu. Oznaczenie aktywności syntazy TMP i pirofosfokinazy tiaminy wykonano
przy zastosowaniu rozdziału analizowanych próbek techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC) sprzężonej z postkolumnową detekcją fluorescencyjną. Stopień mikoryzacji korzeni cebuli
oceniono za pomocą metody Trouvelot. Wyniki: Badania wykazały, że największy przyrost biomasy
zaobserwowano u roślin inokulowanych G. intraradices, w szczególności u odmian Wolska, Kuba,
Kristine i Karmen. Ostatnie dwie odmiany nie przeżyły bez inokulacji. Wykazano znaczące różnice
w stężeniach kwercetyny, kemferolu i apigeniny u mikoryzowej odmiany Wolska w porównaniu z niemikoryzowymi roślinami. Ponadto istotne różnice zaobserwowano w stężeniu flawonoidów u odmian Kuba
i Sochaczewska. Wykazano również wzrost aktywności SOD, syntazy TMP i pirofosfokinazy tiaminy
u mikoryzowych roślin. Wnioski: Inokulacja grzybami mikoryzowymi powoduje znaczący wzrost biomasy
i okazuje się niezbędna dla przeżycia niektórych odmian (Kristine i Karmen). Ponadto, obecność grzybów
mikoryzowych powoduje wzrost produkcji flawonoidów oraz aktywności SOD, syntazy TMP oraz pirofosfokinazy tiaminy w porównaniu z roślinami nieinokulowanymi.
III-42 P | Zastosowanie grzybów mykoryzowych w komercyjnej uprawie storczyków gruntowych
Wojtczak G.
Instytut Nauk o Środowisku, Uniwersytet Jagielloński
Wstęp: Storczyki (Orchidaceae) stanowią jedną z najliczniejszych gatunkowo rodzin roślin naczyniowych. Jedyną synapomorfią w tej grupie roślin jest stadium protokormu, w pełni zależne od symbiozy
z grzybami mykoryzowymi. Protokorm rozwija się bezpośrednio z nasion storczyków, zawierających
znikome ilości substancji odżywczych. Udział grzybów mykoryzowych polega więc przede wszystkim na
dostarczeniu związków węgla mykotroficznym siewkom. W latach dwudziestych poprzedniego stulecia
opracowano asymbiotyczne metody in vitro otrzymywania siewek storczyków. Metody te jednakże,
pozwoliły na komercyjną uprawę stosunkowo niewielkiej liczby spośród ponad 25 tysięcy opisanych
gatunków storczyków. Jednocześnie obligatoryjny charakter symbiozy mykoryzowej naziemnych storczyków spowodował niemal całkowity brak tych gatunków w ofercie sklepów ogrodniczych. Cel pracy:
Celem niniejszej pracy było zoptymalizowanie metod otrzymanie czystych kultur symbiontów mykoryzo96
wych, efektywnych w komercyjnej produkcji naziemnych storczyków, a także identyfikacja wyizolowanych
szczepów przy użyciu metod molekularnych. Metody: Mikroorganizmy izolowano ze sterylizowanych
powierzchniowo korzeni storczyków Dactylorhiza majalis, Ophrys apifera, Oph. insectifera, Orchis pallens. Całe fragmenty korzeni lub zwoje grzybni wyjmowane z pojedynczych komórek kory pierwotnej
inkubowano na podłożach PDA, FIM, OAT z dodatkiem lub bez dodatku kombinacji różnych antybiotyków. Symbionty oznaczono poprzez porównanie otrzymanych sekwencji nukleotydów fragmentu rybosomalnego DNA z sekwencjami zgromadzonymi w ogólnodostępnych bazach za pomocą algorytmu
BLAST. Wyniki: Badania wykazały, że izolacja grzybów z całych fragmentów kory pierwotnej prowadzi
do otrzymania endofitów niezdolnych do stymulowania kiełkowania nasion storczyków. Symbiontami tymi
były głównie gatunki z rodzaju Fusarium. Z kolei izolacja symbiontów z pojedynczych zwojów jest utrudniona ze względu na zjawisko plazmolizy towarzyszące przenoszeniu delikatnych strzępek na sztuczne
podłoża mikrobiologiczne. Mimo podobnych trudności udało się otrzymać właściwe symbionty mykoryzowe, stymulujące kiełkowanie nasion gatunków storczyków z których je izolowano. Na podstawie analiz
molekularnych, większość z tych symbiontów zaliczono do rodzaju Tulasnella; pozostała część, choć
bezpośrednio spokrewniona z tym rodzajem, posiadała unikalną sekwencję analizowanego fragmentu
DNA, porównywalną z nielicznymi sekwencjami zgromadzonymi w bazach NCBI. Wnioski: Korzenie
naziemnych storczyków skrywają ogromną różnorodność symbiotycznych mikroorganizmów, której
poznanie jest kluczowe dla wprowadzenia tych roślin na rynek sprzedaży. Jednakże tylko niektóre
symbionty mają znaczenie komercyjne, a metody molekularnej identyfikacji grzybów są niezawodne
w doborze odpowiednich szczepów.
____________________
Projekt finansowany w ramach programu Ventures Fundacji na rzecz Nauki Polskiej ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego Unii Europejskiej.
III-43 P | Mikrobiologiczne oczyszczanie ścieków zanieczyszczonych estrogenami.
Włodarczyk M., Schmidt M.
Studenckie Koło Naukowe SKN Bio-Mik, koordynatorzy: dr S. Różalska, prof. dr hab. J. Długoński
Wstęp: Estrogeny są to pochodne steranu, o budowie wielopierścieniowej, zaliczane do steroidowych
hormonów płciowych. Najważniejszymi, a zarazem najczęściej występującymi w ściekach estrogenami
są 17 α-etynyloestradiol, (EE2), estradiol (E1), oraz 17β-estradiol (E2) pochodzące głównie ze źródeł
odzwierzęcych. Związki te charakteryzują się wysoką aktywnością biologiczną, pomimo, iż w ściekach
występują na poziomie ppm. Hormony te tylko w nieznacznym stopniu są usuwane w oczyszczalniach
ścieków przez osad czynny, co sprawia, że są uwalniane do rzek, gleby oraz wód gruntowych, gdzie
bezpośrednio oddziałują na żyjące tam organizmy. Cel pracy: W niniejszej pracy zwracamy uwagę na
problem zwiększania się ilości estrogenów w zbiornikach wodnych oraz płynące z tego zagrożenie.
Wskazujemy także na możliwości mikrobiologicznej degradacji i biotransformacji tych związków. Metody: Do opracowania niniejszej prezentacji wykorzystaliśmy najnowsze dane literaturowe dotyczące
mikrobiologicznej degradacji estrogenów, zawarte w następujących publikacjach naukowych: Cajthaml T,
Kresinová Z, Svobodová K, Sigler K, Rezanka T. Microbial transformation of synthetic estrogen 17-alphaethinylestradiol. Environ Pollut. 2009; 157 (12): 3325-35. M. Muller, D. Patureau, J. Godon, J.P.
Delgenès, G. Hernandez-Raquet. Molecular and kinetic characterization of mixed cultures degrading
natural and synthetic estrogens. Appl Microbiol Biotechnol 2010; 85: 691–701. Wyniki: Na podstawie
informacji pozyskanych z naukowych publikacji, możemy stwierdzić że na dzień dzisiejszy brak jest
metody całkowicie eliminującej estrogeny ze ścieków, a co za tym idzie ze środowiska. Jednakże istnieją
metody, oparte na zastosowaniu konsorcjów szczepów bakteryjnych, które częściowo eliminują te
związki poprzez przekształcenie ich do związków o niższej aktywności biologicznej. Wnioski: Obecność
97
estrogenów w ściekach oraz brak metod całkowicie ich eliminujących, jest dużym problemem ekologicznym, wpływającym w znaczny sposób na organizmy żywe. Poszukiwania określonych szczepów drobnoustrojów degradujących te hormony stwarzają nadzieje na skuteczne rozwiązanie problemu w najbliższej
przyszłości.
III-44 P | Nowy szczep bakterii Bacillus pumilus o aktywności przeciwprątkowej przeciwko
Mycobacterium smegmatis wyizolowany ze ściany jelita dżdżownicy Dendrobaena veneta
Fiołka M.1, Zagaja M.2, Wielbo J.3 , Wydrych J.4
Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie,
1 Zakład Immunologii Bezkręgowców,
2 Zakład Zoologii,
3 Zakład Genetyki i Mikrobiologii,
4 Zakład Anatomii Porównawczej i Antropologii
Wstęp: Ewolucja pierścienic odbywała się w stałym kontakcie z mikroorganizmami saprofitycznymi
i patogennymi, pasożytami oraz zmiennymi warunkami fizyko-chemicznymi, w wyniku czego zwierzęta te
wykształciły skuteczne mechanizmy obronne. Odporność humoralna u Annelida związana jest z obecnością układu hemolitycznego i hemaaglutynacyjnego płynu jamy ciała, zwłaszcza cytolizyn i białek
o właściwościach lizozymu. Aktywność przeciwbakteryjna i przeciwgrzybowa typu lizozymu może pochodzić w organizmie dżdżownicy z różnych źródeł: płynu celomatycznego, celomocytów, kokonów oraz
jelita. Aktywność typu lizozymu wykrywa się i oznacza względem bakterii indykatorowej Micrococcus
luteus. Cel pracy: Ekstrakt ze ścian jelita wykazywał silną aktywność przeciw M. luteus i dlatego podjęto
poszukiwania mikroorganizmów związanych ściśle ze ścianą jelita a, nie z jego treścią. W związku
z niedostatkiem skutecznych i nietoksycznych preparatów przeciwprątkowych podjęto poszukiwania
aktywności przeciwko Mycobacterium w naturalnym środowisku eliminującym te mikroorganizmy jakim
jest jelito dżdżownicy. Metody: Ze ścian jelita środkowego dżdżownicy Dendrobaena veneta wyizolowano bakterie o aktywności typu lizozymu, który zidentyfikowano przy użyciu metod biochemicznych
i molekularnych. Do wykrywania aktywności stosowano metodę dyfuzyjną Fredericka oraz test LIVE
/DEAD, którym oznaczano przeżywalność prątków oraz analizę morfologiczną, komórek mykobakterii
w mikroskopie świetlnym i elektronowym skaningowym, po inkubacji z ekstraktem z bakterii wyizolowanego szczepu. Wyniki: Wyizolowany szczep zidentyfikowano jako Bacillus pumilus. Bakterie z rodziny
Bacilli, stanowią znaczną część jelitowych mikroorganizmów u glebowych bezkręgowców. Pomagają one
w trawieniu pokarmu, produkują witaminy i chronią swoich gospodarzy przed patogenami. Szczep
wyizolowany charakteryzuje się aktywnością przeciwprątkową skierowaną przeciwko Mycobacterium
smegmatis. Zaobserwowano efekt lityczny M. smegmatis pod wpływem metabolitów B. pumilus, istotne
obniżenie przeżywalności badanych prątków oraz tworzenie owalnych i skróconych form morfologicznych
komórek M. smegmatis po inkubacji z ekstraktem z wyizolowanego szczepu, co świadczy
o bakteriobójczym działaniu nowego szczepu B. pumilus. Wnioski: Zarówno ekstrakt jak i płyn pohodowlany wyizolowanego szczepu B. pumilus wykazywał aktywność przeciwko M. smegmatis obniżając
istotnie przeżywalność i zmieniając morfologię komórek prątków. Można przypuszczać, że metabolity
nowego szczepu B. pumilus będą dogodnym źródłem pozyskania białek o działaniu przeciwprątkowym,
w tym na prątki gruźlicy.
98
III-45 P | Efektywne mikroorganizmy w ochronie środowiska
Czaiński T.
Instytut Przemysłu Skórzanego w Łodzi
Celem opracowania było przedstawienie praktycznych możliwości zastosowania Efektywnych Mikroorganizmów w ochronie środowiska, w aspektach rolnictwa, gospodarstwa domowego, utylizacji odpadów
oraz oczyszczania wód. Efektywne Mikroorganizmy (EM) są mieszanką odpowiednio dobranych rodzajów bakterii, grzybów i promieniowców wykazującą właściwości regeneratywne i antyutleniające. Część
z nich jest tlenowa, a część beztlenowa. Bakterie te poprzez korzystną wymianę i magazynowanie
substancji pokarmowych zdolne są do symbiotycznej koegzystencji. Badania opisane w literaturze
wykazały zdolność EM do rozkładania wszelkiej materii organicznej, szkodliwych gazów (głównie H2S)
i materiałów pierwotnie organicznych. EM emitują korzystne drgania własne i na drodze rezonansu
oddziaływają z materia zewnętrzną. Dzięki zdolności do przeżywania w temperaturach rzędu 10000C,
wypalone w materiale ceramicznym, rozkładają dioksyny (z jednoczesną absorpcją chloru) emitowane
w procesie spalania oraz pestycydy. Fermentowane z udziałem EM osady ściekowe (eliminacja higienizacji wapnem), odpady organiczne i zwierzęce służą jako cenny nawóz w postaci idealnej próchnicy.
Bakterie fotosyntetyczne redukują skutki radioaktywności poprzez wykorzystywanie promieni Gamma
jako źródła energii. Szerokie spektrum działania EM daje wiele różnych możliwości ich praktycznych
zastosowań w ochronie środowiska, m. in. jako środki ochrony i kondycjonowania roślin, wspierania
zdrowia zwierząt, środki do odświeżania i utrzymywania czystości, stabilizacji osadów ściekowych
i skratek oraz jako preparaty regenerujące i wzmacniające.
99
100
Sesja IV
Nowe zagadnienia z zakresu genetyki,
biochemii i biologii molekularnej
mikroorganizmów
101
102
Wykład plenarny
Poszukiwania nowych „tarcz” dla leków przeciwdrobnoustrojowych
Dziadek J.
Instytut Biologii Medycznej, Polska Akademia Nauk, Łódź
IV-1 P/O | Kasety DIY – podstawa do konstrukcji nowych narzędzi genetycznych dla
Alphaproteobacteria
Adamczuk M., Dziewit Ł., Bartosik D.
Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Wstęp: Bakterie z klasy Alphaprotoebacteria charakteryzuje bardzo duże zróżnicowanie metaboliczne.
Ze względu na swoje właściwości (np. zdolność do rozkładu ksenobiotyków i substancji toksycznych oraz
przenoszenia DNA do komórek roślinnych) znajdują zastosowanie w biotechnologii i inżynierii genetycznej. Zakres prowadzonych badań jest jednak często limitowany brakiem odpowiednich narzędzi genetycznych, specyficznych dla tej grupy bakterii. Aby dostarczyć takich narzędzi skonstruowano kasety
genetyczne, które mogą być wykorzystane do tworzenia wektorów wahadłowych. Cel pracy: Celem
niniejszej pracy była konstrukcja serii plazmidów, stanowiących źródło kaset genetycznych DIY (Do It
Yourself), użytecznych do tworzenia wektorów wahadłowych Escherichia coli/Alphaprotoebacteria.
Metody: Do konstrukcji poszczególnych kaset i wektorów zastosowano metody molekularne powszechnie wykorzystywane podczas pracy z DNA, jak również szereg standardowych technik mikrobiologicznych. Wyniki: Skonstruowano ponad 50 kaset DIY o różnym stopniu złożoności i odmiennych właściwościach. Wszystkie powstały w oparciu o moduły plazmidowe Paracoccus aminophilus JCM 7686, funkcjonalne w 9 szczepach Alphaprotoebacteria (przedstawiciele rzędów Caulobacterales, Rhizobiales
i Rhodobacterales). Najprostsze kasety zawierają jedynie systemy replikacyjne (REP). Bardziej złożone
niosą moduły REP z dołączonymi do nich różnego typu systemami stabilizującymi. Część kaset wyposażono również w: (i) geny opornościowe (Kmr lub Tcr), (ii) region MOB wraz z origin transferu plazmidu
RK2 (zapewnia mobilizację do transferu koniugacyjnego do szczepów Alphaproteobacteria z ominięciem
bariery restrykcyjnej) oraz (iii) różnego typu polilinkery, ułatwiające ich przeklonowanie do plazmidów
docelowych. Wybrane kasety wykorzystano do konstrukcji wektorów wahadłowych z serii pALPHA,
zawierających systemy replikacyjne specyficzne dla E. coli (typu pMB1 lub pSC101) i polilinkery
w obrębie lacZ’, co umożliwia selekcję z zastosowaniem α-komplementacji. Wnioski: Kasety DIY mogą
być wykorzystane do konstrukcji mobilizowalnych wektorów wahadłowych (np. seria pALPHA), które
umożliwiają przeprowadzanie manipulacji genetycznych w E. coli, a następnie wprowadzanie zrekombinowanego plazmidu do Alphaprotoebacteria. Ponieważ kasety DIY powstały na bazie replikonów koegzystujących w jednej komórce (naturalne plazmidy P. aminophilus JCM 7686), możliwe jest ich zastosowanie przy projektowaniu układów wieloplazmidowych.
103
IV-2 P | Zastosowanie metagenomiki w badaniu różnorodności grzybów gleb leśnych
Behnke-Borowczyk J.1, Kwaśna H.1, Bielinis E.2, Wiatrowska B.3
1 Katedra
Fitopatologii Leśnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu,
Hodowli Lasu, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu,
3 Katedra Przyrodniczych Podstaw Leśnictwa, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
2 Katedra
Wstęp: Współczesna wiedza na temat składu i funkcji zbiorowisk grzybów glebowych jest bardzo ograniczona. Wynika z niedoskonałości metodyki stosowanej do izolacji i identyfikacji mikroorganizmów.
Metody klasyczne stosowane dotychczas pozwalały na poznanie gatunków hodowalnych in vitro. Metody
molekularne stosowane od niedawna pozwalają na detekcję i identyfikację również gatunków niehodowalnych in vitro. Metagenomika to kierunek nowoczesnej mikrobiologii. Opiera się na klonowaniu DNA
pozyskiwanego bezpośrednio z naturalnych środowisk i sekwencjonowaniu bibliotek genomowych.
Umożliwia analizowanie całych populacji mikroorganizmów danego środowiska, bez konieczności ich
hodowli in vitro. Pozwala na odkrycie nowych dla nauki gatunków bakterii i grzybów. Rewolucjonizuje
rozumienie i postrzeganie świata mikrobiologii. Umożliwia poznanie mikrobiologicznej bioróżnorodności
wielu środowisk. Sprzyja adaptacji i optymalizacji wielu procesów mikrobiologicznych stosowanych
w celu poprawy egzystencji człowieka. Metody: Całkowity (środowiskowy) DNA z gleby ekstrahowano
przy użyciu PowerSoil DNA Kit (Mo Bio). Specyficzny fragment rDNA grzybowego (ITS 1/2) amplifikowano z zastosowaniem starterów specyficznych dla grzybów. Zamplifikowany fragment DNA poddano
klonowaniu z wykorzystaniem pGEM-T Easy Vector System (Promega). Przeprowadzone selekcję
wstępną uzyskanych kolonii (wybierano kolonie białe na pożywce z X-gal). Utworzono bibliotekę klonów
obejmującą 81 klonów grzybowych. Klony poddano selekcji wtórnej polegające na badaniu polimorfizmu
długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) przy użyciu enzymów HhaI oraz BsuRI. Reprezentacyjne
klony wybrano do sekwencjonowania odcinka rDNA ITS1/2. Otrzymane sekwencje porównano z sekwencjami zdeponowanymi wcześniej w NCBI. Wykonano analizę filogenetyczną badanych sekwencji.
Wyniki: W badanej glebie stwierdzono obecność następujących gatunków grzybów: Cadophora finlandica, Cenococcum geophilum, Gongylonema macrocystis, Phialocephala fortinii, Piloderma olivaceum,
Piloderma sp., Rhizoscyphus ericae, Ascomycota spp. (włączając gatunki z podgromady Pezizomycotina). Stwierdzono również obecność organizmów o sekwencjach niezdeponowanych dotychczas w EMBL
oraz jednego gatunku rośliny, tj. kapusty (Brassica oleracea). Wnioski: Zastosowanie metody molekularnej polegającej na ekstrakcji glebowego DNA, amplifikacji grzybowego DNA, klonowaniu, selekcji klonów
i sekwencjonowaniu klonów reprezentacyjnych pozwoliło stwierdzić obecność kilku gatunków grzybów
niehodowalnych w standardowych warunkach laboratoryjnych i nierozpoznawanych przez klasyczne
metody izolacji i identyfikacji mikroorganizmów. Stwierdzenie w glebie leśnej obecności rośliny, tj. kapusty (Brassica oleraca) po zastosowaniu starterów ogólnie przyjętych jako specyficzne dla grzybów
sugeruje, że dotychczas stosowane startery są mało specyficzne dla grzybów gleb leśnych.
IV-3 P | Występowanie genu kodującego egzoenzym S u wielolekowrażliwych (MDS) i wielolekoopornych (MDR) szczepów Pseudomonas aeruginosa
Bogiel T., Deptuła A., Gospodarek E.
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy,
Wstęp: Pałeczki Pseudomonas aeruginosa są jednymi z najczęściej izolowanych drobnoustrojów, będąc
częstą przyczyną zakażeń szpitalnych. W piśmiennictwie pojawiają się informacje o obniżonej zjadliwości
wielolekowrażliwych szczepów tego gatunku. Jednym z czynników zjadliwości występujących u szcze104
pów P. aeruginosa jest egzoenzym S. Jest on toksyną kodowaną w pozycji 4303141–4304502 chromosomu szczepu P. aeruginosa PAO1. Cel pracy: Ocena obecności genu kodującego egzoenzym S
u szczepów P. aeruginosa i porównanie częstości jego występowania w grupie szczepów wielolekowrażliwych i wielolekoopornych. Materiał i metody: Badaniem objęto 148 szczepów P. aeruginosa (83 MDS
i 65 MDR). Ich lekowrażliwość oceniano i interpretowano zgodnie z zaleceniami KORLD i CLSI, stosując
szczep wzorcowy P. aeruginosa ATCC 27853 i uznając za MDR szczepy oporne na wszystkich przedstawicieli co najmniej dwóch grup leków przeciwbakteryjnych (beta-laktamów, aminoglikozydów, fluorochinolonów). W reakcji amplifikacji stosowano DNA wyizolowane z użyciem zestawu Genomic Mini (A&A
Biotechnology), zestaw z polimerazą Taq (Solis Biodyne) oraz startery exoS F i exoS R (Integrated DNA
Technologies) o sekwencjach 5’→3’, odpowiednio: -CTTGAAGGGACTCGACAAGG-i –TTCAGGTCCGCGTAGTGAAT-. Produkty rozdzielano w żelu agarozowym, wybarwiano bromkiem etydyny i oglądano w
świetle UV, uznając za wynik dodatni występowanie fragmentu DNA wielkości 504 pz. Analizę statystyczną występowania genu exoS w grupie szczepów wielolekowrażliwych i wielolekoopornych wykonano testem χ2. Za istotne statystycznie uznano różnice przy poziomie istotności α≤0,05. Wyniki: Występowanie genu exoS stwierdzono ogółem u 72 (48,7%) badanych szczepów, z czego 44 (53,0%)
u szczepów MDS i 28 (43,1%) MDR. Obserwowane różnice nie były istotne statystycznie. Wnioski: Nie
wszystkie szczepy P. aeruginosa posiadają geny kodujące egzoenzym S, przez co nie wszystkie mają
możliwość jego wytwarzania. Obecność u pałeczek P. aeruginosa genu exoS stwierdza się częściej
wśród szczepów MDS niż wśród MDR, jednak nie są to różnice istotne statystycznie.
IV-4 P| Specyficzność sekwencyjna endorybonukleazy PemKSa należącej do systemu toksynaantytoksyna kodowanego w plazmidzie niesionym przez szczep Staphylococcus aureus CH91
Bukowski M.1, Łyżeń R.2, Szalewska-Palasz A.2, Ilczyszyn W.3, Dubin A.1, Władyka B.1
1 Zakład
Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński
Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański
3 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński
2 Katedra
Wstęp: Fizjologiczna rola systemów toksyna-antytoksyna (TA) jest przedmiotem ciągłej dyskusji. Niemniej w obliczu wyników trwających ponad dekadę badań wyłania się coraz bardziej ugruntowany
wniosek o ich charakterze jako regulatorów metabolizmu aktywowanych w odpowiedzi na warunki
stresowe. Aktywność systemów TA może być również istotna w przypadku szczepów patogennych, gdzie
systemy te są w stanie modulować formowanie się biofilmów oraz lekooporność bakterii. Cel pracy:
W niniejszej pracy określono specyficzność sekwencyjną endorybonukleazy PemK Sa, poddano bioinformatycznej analizie sekwencje kodujące znajdujące się w genomie jednego ze szczepów posiadających
operon pemIKSa pod kątem występowania tej sekwencji oraz pokazano w modelu in vitro różnicujący
wpływ aktywności badanej endorybonukleazy na ekspresję wybranych genów. Metody: Specyficzność
sekwencyjną określono z wykorzystaniem metody primer extension do sekwencjonowania końców 5’
fragmentów RNA faga MS2 powstałych w wyniku trawienia przez endorybonukleazę PemK Sa. W oparciu
o dane z bazy Genbank, na podstawie opracowanego modelu matematycznego, wytypowano geny
o statystycznie istotnej nadreprezentacji i niedoreprezentowaniu rozpoznawanej sekwencji. Wpływ
aktywności endorybonukleazy PemKSa na produkcję białek bakteryjnych badano w układzie heterologicznym, którym był laboratoryjny szczep Escherichia coli BL21(DE3), na drodze koekspresji genu pemK
i genów poddawanych analizie, które zostały umieszczone w wektorach plazmidowych pod kontrolą
fagowego promotora T7. Wyniki: Endorybonukleaza PemKSa charakteryzuje się wysoką specyficznością
sekwencyjną hydrolizując łańcuch RNA w obrębie tetranukeotydowej sekwencji UAUU. Analiza bioinformatyczna pozwoliła wytypować dwie grupy genów, których ekspresja może być ściśle powiązana
z aktywnością endorybonukleazy PemKSa. Ponadto na wybranych genach wykazano oporność transkryp105
tów mRNA na endorybonukleolityczną aktywność białka PemKSa i możliwość ich ekspresji w hodowli
bakteryjnej pomimo ogólnego zahamowania wzrostu. Wnioski: Bakteriostatyczna aktywność endorybonukleazy PemKSa, wynikająca z zahamowania syntezy większości białek bakteryjnych, może stanowić
odpowiedź na stres środowiskowy zwiększającą zdolność adaptacyjną szczepów, które w swoim genomie posiadają operon systemu pemIKSa. Jednocześnie geny, których transkrypty nie posiadają rozpoznawanej przez nią sekwencji, mogą ulegać niezaburzonej ekspresji. Analiza sekwencji kodujących
w obrębie genomu jednego ze szczepów niosących plazmid z operonem pemIKSa pozwala przypuszczać,
że endorybonukleaza PemKSa może powodować kierunkowe zmiany w metabolizmie oraz w interakcji
komórki bakteryjnej z otaczającym środowiskiem.
____________________
Praca częściowo finansowana z projektu MNiSW nr N N303 813340.
IV-5 P | Zastosowanie mutagenezy transpozonowej do identyfikacji genów zaangażowanych
w syntezę karotenoidów w bakterii Brevundimonas sp. LM18
Czarnecki J., Bartosik D.
Zakład Genetyki Bakterii, Uniwersytet Warszawski
e-mail: jakub- [email protected]
Wstęp: Karotenoidy są wytwarzane przez organizmy fotosyntetyzujące oraz niektóre niefotosyntetyzujące bakterie i grzyby. Związki te chronią komórki przed reaktywnymi formami tlenu, powstającymi zarówno
w procesie fotosyntezy, jak i obecnymi w środowisku. Karotenoidy znajdują zastosowanie w przemyśle
jako antyoksydanty i barwniki. Poznanie genów zaangażowanych w biosyntezę karotenoidów jest ważnym etapem w drodze do konstrukcji szczepów bakteryjnych wydajnie wytwarzających te związki. Cel
pracy: Celem pracy była konstrukcja nowej kasety służącej do mutagenezy transpozonowej w Alphaproteobacteria oraz jej wykorzystanie do identyfikacji genów zaangażowanych w biosyntezę karotenoidów
w bakterii Brevundimonas sp. LM18. Metody: Stosowano standardowe metody inżynierii genetycznej
i mikrobiologii. Do analiz produkowanych przez bakterie karotenoidów wykorzystano HPLC (WATERS
600). Miejsca insercji kasety transpozycyjnej określono metodą odzyskania plazmidu (ang. plasmid
rescue) i sekwencjonowania DNA. Analizy bioinformatyczne przeprowadzono z wykorzystaniem programów z pakietu BLAST oraz ORF Finder (NCBI). Wyniki: Skonstruowano kasetę do mutagenezy transpozonowej w Alphaproteobacteria, która zawierała (i) mobilną sekwencję insercyjną ISPmar4, (ii) gen
oporności na kanamycynę (selekcję mutantów) i (iii) origin replikacji R6K (szybka identyfikacja miejsc
transpozycji metodą „odzyskiwania plazmidów”). Kasetę sklonowano w plazmidzie samobójczym, który
wprowadzono do komórek Brevundimonas sp. LM18. Wyselekcjonowano pulę mutantów o zmienionym
zabarwieniu kolonii (inaktywacja genów zaangażowanych w produkcję barwników). Kilka z nich niosło
kasetę wbudowaną w obrębie genów crtI i crtB, odpowiedzialnych za końcowe etapy biosyntezy karotenoidów. W innych mutantach stwierdzono mutacje (i) genu odpowiedzialnego za syntezę prekursorów
izoprenoidów, (ii) genów, których funkcja w szlaku biosyntezy karotenoidów nie została dotąd opisana.
Wnioski: Uzyskane wyniki pozwoliły na poznanie ścieżki biosyntezy karotenoidów w Brevundimonas sp.
LM18. Bakteria ta niesie zespół genów crt odpowiedzialnych za końcowe etapy szlaku biosyntezy dicyklicznych karotenoidów. Synteza prekursorów zachodzi ścieżką fosforanu metyloerytrolu. Mutacje
w genach odpowiedzialnych za syntezę puryn obniżają wydajność produkcji karotenoidów. Zidentyfikowano również gen, którego funkcji nie wiązano dotąd z syntezą karotenoidów, a którego inaktywacja
prowadzi do całkowitej utraty zdolności wytwarzania tych związków.
106
IV-6 P/O | Zastosowanie metody RAPD w oparciu o sekwencje mikrosatelitarne do różnicowania
szczepów M. canis izolowanych od ludzi i zwierząt w Polsce
Dębska J., Ciesielska A., Jaworski A.
Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Badania dermatofitów z wykorzystaniem metod molekularnych ujawniły duże genetyczne zróżnicowanie w obrębie poszczególnych gatunków tych grzybów. Na tym tle zoofilny gatunek Microsporum
canis bardzo się wyróżnia. Dotychczasowe wyniki badań prowadzonych na świecie sugerują brak zróżnicowania klonalnego w przypadku tego dermatofita. Wyjątek stanowią dwie prace: Cano i wsp., w której
zastosowano z powodzeniem starter (ACA)5 do zróżnicowania 24 izolatów M. canis pochodzących
z 7 hiszpańskich miast oraz praca zespołu Gräser w oparciu o startery McGT13 oraz McGT17 użyte do
zbadania struktury klonalnej 101 szczepów dermatofitów. Cel pracy: Zbadanie stopnia zróżnicowania
struktury klonalnej szczepów M. canis, izolowanych od ludzi i zwierząt w Polsce przy zastosowaniu
metody RAPD (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA) w oparciu o sekwencje mikrosatelitarne.
Metody: Całkowity genomowy DNA badanych szczepów dermatofitów wyizolowano za pomocą zmodyfikowanej metody Liu i wsp. Wyizolowany DNA posłużył jako matryca w reakcji RAPD w oparciu o wybrane sekwencje starterowe - (ACA)5, McGT13 oraz McGT17. Wyniki: W wyniku zastosowania metody RAPD
w oparciu o starter (ACA)5 nie wykazano zróżnicowania w obrębie badanej kolekcji szczepów M. canis
(otrzymano jeden wspólny profil A). Taki sam rezultat otrzymano również w przypadku zastosowania
starterów McGT13 i McGT17. Wnioski: Uzyskane wstępne wyniki wskazują na brak zróżnicowania klonalnego szczepów M. canis izolowanych od ludzi oraz od zwierząt w Polsce, co stanowi kontrast co wyników uzyskanych przez zespół Cano oraz zespół Gräser.
____________________
Niniejsze badania są współfinansowanie przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, Grant promotorski
N303568938, a także ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego i Budżetu Państwa w ramach Działania 2.6
Zintegrowanego Programu Operacyjnego Rozwoju Regionalnego, w związku z realizacją Projektu p.n. „Stypendia
wspierające innowacyjne badania naukowe doktorantów” oraz w ramach Podziałania 8.2.1 Programu Operacyjnego
Kapitał Ludzki, w związku z realizacją Projektu „Doktoranci – Regionalna Inwestycja w Młodych naukowców – Akronim DRIM, II edycja”
IV-7 P | Determination of putative biological function of extracellular cell wall covalently anchored
protein from Leuconostoc mesenteroides
Dybka K., Walczak P.
Institute of Fermentation Technology and Microbiology, Technical University of Lodz
Introduction: Genetic analysis of dextran biosynthesis region of Leuconostoc mesenteroides ATCC
8293 by two dextransucrases LEUM_1747 and LEUM_1752 resulted with discovery of atypical gene
LEUM_1748 with unkonown biological function. LEUM_1748 encodes an extracellular protein linked to
bacterial envelope by sortase B recognizing C-terminal sorting motif LPKTNG. Correction of LEUM_1748
sequence (Walczak, 2008) revealed that 1381 amino acid sequence consists of following domains: signal
sequence, variable region, enzymatic domain, collagen-like region, transmembrane region with cell wall
anchoring motif LPKTNG. Proximity of two dextransucrases and presence of putative sucrose binding
boxes within enzymatic activity region sequence characteristic for inulosucrases or levansucrases may
suggest biological activity of LEUM_1748. Aim: The goal of the experiment was to analyse extracellular
protein from selected Leuconostoc mesenteroides strains and to demonstrate their biological function.
Methods: Leuconostoc mesenteroides cultures were grown in MRS medium. Simultaneously bacteria
107
were grown in MRS medium supplemented with hydroxylamine hydrochloride, which makes extracellular
protein containing LPXTG motif, recognized by sortase, being released to the culture medium. Protein
were precipitated with acetone 1:1 (v/v) or ammonium sulfate 1:1 or 1:2 (v/v). Obtained protein precipitates were analysed with PAGE-SDS in polyacrylamide gel. Dextransucrase, levansucrase and inulosucrase activities of protein, were detected by enzymatic reaction with sucrose as a substrate and gel
embedded enzymes with subsequent periodoc acid-Schiff staining method (PAS). Results: It was
showed that the addition of hydroxylamine to the growth medium resulted with increased amount of
certain protein being released to the environment. Moreover, it was found that effectiveness of protein
isolation was better for ammonium sulfate precipitant comparing to acetone. It was discovered that
among obtained extracellular protein, beside LEUM_1747 and LEUM_1752 protein (with analysed in
silico molecular weights ~ 170 kDa and ~166 kDa respectively), LEUM_1748 (~ 140 kDa) was showed. It
was noticed that only one protein produced extracllularly by Leuconostoc mesenteroides Cyr21 possessed enzymatic activity leading to formation of polysaccharides from sucrose. Conclusion: Estimated
molecular weight of obtained protein (~ 140 kDa) with enzymatic activity may suggest that it is a product
of LEUM_1748 gene.
IV-8 P | Charakterystyka genu LEUM_1748 w wybranych szczepach Leuconostoc mesenteroides
Dybka K., Otlewska A., Walczak P.
Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika Łódzka
Wstęp: Kolageny są jednymi z najbardziej rozpowszechnionych białek. Dotychczas uważano, iż są
typowe tylko dla organizmów eukariotycznych, jednakże zastosowanie technik in silico w analizie genomów dostępnych w bazach danych potwierdziło obecność charakterystycznych motywów Gly-X-Y
u wirusów i bakterii, a w tym bakterii fermentacji mlekowej. W kolagenach zwierzęcych w pozycji X
najczęściej występuje prolina a w pozycji Y hydroksyprolina. Bakterie produkujące białka kolagenopodobne pozbawione są hydroksylazy prolinowej (EC 1.14.11.2) i w wyniku braku obróbki postranslacyjnej
ich białka nie zawierają hydroksyproliny. Cel pracy: Badania miały na celu detekcję genu LEUM_1748
i jego charakterystykę w 21 szczepach Leuconostoc mesenteroides wyizolowanych ze środowiska
naturalnego. Metody: Chromosomalne DNA wyizolowano metodą Andersona i McKay’a (1983), fragmenty genu LEUM_1748 zamplifikowano techniką PCR wykorzystując primery zaprojektowane w oparciu
o sekwencję LEUM_1748 Ln. mesenteroides ATCC 8293 (CP000414), a następnie analizowano w 1 %
żelu agarozowym. Wybrane produkty PCR poddano sekwencjonowaniu i analizie porównawczej. Wyniki:
Obecność genu LEUM_1748 została potwierdzona we wszystkich badanych szczepach. Zaobserwowano
niewielkie różnice w sekwencjach amplikonów obejmujących początkowy fragment genu LEUM_1748.
W wyniku amplifikacji regionu kolagenopodobnego genu LEUM_1748 otrzymano produkty PCR o długości około 1000 pz, krótsze od analogicznego fragmentu w szczepie ATCC 8293 o około 600 pz. Analiza
porównawcza sekwencji aminokwasowych domeny kolagenopodobnej białka LEUM_1748 badanych
szczepów wykazała, iż zawierały one 33,1 % glicyny, nie stwierdzono natomiast obecności proliny,
treoniny i argininy. Różnice w ilości poszczególnych aminokwasów, w domenie kolagenopodobnej
LEUM_1748 badanych szczepów, wynosiły maksymalnie 2,8 %, a zawartość aminokwasów egzogennych wahała się od 26,3 % do 26,7 %. Wnioski: Początkowy fragment genu LEUM_1748 charakteryzował się wysokim stopniem homologii z analogicznym regionem w szczepie ATCC 8293. Liczba powtórzeń tripletu Gly-X-Y domeny kolagenopodobnej białka LEUM_1748 wydaje się być cechą szczepową.
Skład aminokwasowy kolagenopodobnego białka produkowanego przez badane szczepy był zbliżony do
homologicznego białka szczepu Ln. mesenteroides ATCC 8293. Kolagenopodobne białko LEUM_1748
może być źródłem aminokwasów egzogennych.
108
IV-9 P | MSMEG 4305 nie jest niezbędny dla przeżywalności M. smegmatis
Górna A.1,2, Dziadek J.1
1
2
Instytut Biologii Medycznej PAN, Łódź
Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź
Wstęp: Stosowana obecnie farmakoterapia gruźlicy, określonej przez Światową Organizację Zdrowia
jako jedna z najpoważniejszych chorób zakaźnych naszych czasów, wymaga od pacjenta długotrwałego
przyjmowania kilku leków równocześnie. Rosnąca liczba szczepów lekoopornych i wielolekoopornych
oraz krótka lista dostępnych związków przeciwgruźliczych zmuszają do poszukiwania nowych tarcz
molekularnych, w które mogłyby być skierowane leki przeciwprątkowe. Atrakcyjnym celem dla nowych
chemoterapeutyków wydają się być enzymy niezbędne dla procesów warunkujących przeżywanie
patogenu podczas infekcji, takich jak replikacja DNA. Do enzymów tego rodzaju zaliczana jest RNaza H
odpowiedzialna za usuwanie starterów RNA podczas replikacji DNA. U organizmu modelowego dla
rodzaju Mycobacterium, M. smegmatis, istnieją 3 geny kodujące białka wykazujące aktywność RNazy HMSMEG2442, MSMEG5562, MSMEG4305. Cel pracy: W niniejszej pracy określono rolę genu
MSMEG4305 dla przeżywalności M. smegmatis. Metody: W celu uzyskania ukierunkowanego mutanta
M. smegmatis pozbawionego funkcjonalnej kopii genu MSMEG4305 wykorzystano metodę wymiany alleli
na drodze rekombinacji homologicznej. W tym celu skonstruowano rekombinowany plazmid zawierający
sekwencje flankujące generowaną delecję, który następnie wprowadzono do komórek mykobakteryjnych
na drodze elektroporacji. Obecność wygenerowanej delecji w genomie M. smegmatis potwierdzono
metodą PCR. Wyniki: Uzyskano mutanta M. smegmatis pozbawionego funkcjonalnej kopii genu
MSMEG4305. Wnioski: W genomie M. smegmatis zidentyfikowano 3 geny, których produkt może
zawierać w swojej strukturze potencjalną domenę RNazy H. Można zatem przypuszczać, że brak produktu genu MSMEG4305 w komórkach M. smegmatis jest rekompensowany dzięki obecności tych białek.
IV-10 P | Modyfikacja bakteryjnego systemu dwuhybrydowego ograniczająca wyniki fałszywie
pozytywne
Górna A.1,2, Dziadek J.1
1
2
Instytut Biologii Medycznej PAN, Łódź
Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź
Wstęp: Bakteryjny system dwuhybrydowy jest metodą identyfikacji oddziaływań pomiędzy białkami.
Konstruuje się plazmidy zawierające sekwencję analizowanego peptydu oraz plazmidy zawierające
sekwencję peptydów potencjalnie oddziałujących- przykładowo fragmenty biblioteki genomowej. Tak
przygotowane plazmidy wprowadza się do komórek bakteryjnych i identyfikuje oddziaływania pomiędzy
produktami ich ekspresji na podłożach selektywnych. Metoda ta charakteryzuje się wysokim odsetkiem
wyników fałszywie pozytywnych. Mylnie identyfikowane mogą być klony wzrastające na obrzeżach płytek
oraz zawierające w strukturze białka domeny transbłonowe lub wiązania ATP lub GTP. Cel pracy:
Modyfikacja bakteryjnego systemu dwuhybrydowego w celu ograniczenia wyników fałszywie pozytywnych. Metody: Wykorzystano rekombinowane plazmidy bakteryjnego systemu dwuhybrydowego pUT18 i
pUT18C zawierające domenę prymazową ligazy D M. tuberculosis H37Rv oraz plazmidy pKT25 zawierające fragmenty biblioteki genomowej M. tuberculosis H37Rv. Plazmidy wprowadzono do komórek E. coli
BTH101 i wysiewano po około 300 kolonii na płytkę lub w formie murawy na podłoże LB z dodatkiem
IPTG i XGal. Oddziaływania identyfikowano na podstawie aktywności genu lacZ'. Oddziałujące klony
przesiewano na podłoże selekcyjne eliminując fałszywie pozytywne oddziaływania wynikające z rozmieszczenia klonów na płytce. Z wyselekcjonowanych klonów izolowano plazmidy i sekwencjonowano
109
fragment biblioteki genomowej. Oddziaływania potwierdzano poprzez ponowną transformację mieszaniną
plazmidów komórek E. coli BTH101. Wyniki: Zanalizowano w przybliżeniu po 30 000 klonów wysiewając
komórki na podłoże w postaci pojedynczych kolonii lub w formie murawy. Analiza mutantów wysiewanych
w formie kolonii wskazała 25 klonów. Zidentyfikowano 23 sekwencje- 19 pojawiło się jednokrotnie (12 ze
zidentyfikowanych białek zawierało w swojej strukturze domeny transbłonowe) oraz dwie dwukrotnie (oba
białka zawierały domeny transbłonowe). Analiza mutantów wysiewanych w formie murawy wskazała 16
klonów. Zidentyfikowano osiem sekwencji- sześć pojawiło się jednokrotnie (cztery białka z domeną
transbłonową oraz dwa zawierające miejsca wiązania ATP, GTP), jedna trzykrotnie (z domeną transbłonową) i jedna siedmiokrotnie. Oddziaływania potwierdzono jedynie w przypadku sekwencji zidentyfikowanej siedmiokrotnie. Wnioski: Modyfikacja metody w postaci wysiewania bakterii w formie murawy
ogranicza ilość wyników fałszywie pozytywnych.
IV-11 P | Interakcje HtpG - DnaA u Escherichia coli, badania in vivo i in vitro
Grześ K., Grudniak A.M.
Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Wstęp: Bakteryjne białko HtpG (ang. high temperature protein G) to najsłabiej scharakteryzowany
przedstawiciel rodziny białek Hsp90. Należy ono do grupy białek opiekuńczych biorących udział
w ochronie komórek przed działaniem niekorzystnych warunków środowiska. Pełnione przez HtpG
funkcje, jak dotąd, nie zostały dobrze poznane. Kluczowym aspektem określenia roli tego białka
w komórce bakteryjnej jest między innymi poznanie jego zdolności do tworzenia kompleksów z innymi
cząsteczkami białkowymi. DnaA jest białkiem niezbędnym w procesie inicjacji replikacji chromosomowego DNA w komórkach bakteryjnych. Cel pracy: W niniejszej pracy badano interakcje pomiędzy białkami
HtpG i DnaA w układzie in vivo przy pomocy bakteryjnego systemu dwuhybrydowego, jak również in vitro
z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody “pull down” oraz reakcji sieciowania z udziałem oczyszczonych białek. Metody: Oddziaływania między białkami identyfikowano z wykorzystaniem systemu dwuhybrydowego zaproponowanego w 2001 roku przez Di Lallo i wsp. [1]. Białka HtpG i DnaA oczyszczono
metodą chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego pET-28a, dzięki dołączonym domenom polihistydynowym na C-końcu każdego z białek. W układzie in vitro badanie oddziaływań prowadzono z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody “pull down” [2] oraz reakcji sieciowania
białek za pomocą aldehydu glutarowego i z udziałem DSP [ang. dithiobis(succinimidylpropionate)].
Wyniki: Badania z wykorzystaniem bakteryjnego systemu dwuhybrydowego wykazały istnienie silnych
oddziaływań między białkami HtpG i DnaA. Analizy w układzie in vitro z wykorzystaniem chromatografii
metalopowinowactwa na kolumnie z Ni-NTA agarozą potwierdziły występowanie wspomnianych interakcji
między HtpG i DnaA. Kompleksy obu białek identyfikowano bez względu na obecność czynników indukujących (tj. ADP lub ATP). Wyniki otrzymane w reakcjach sieciowania białek również potwierdziły wspomniane oddziaływania. Wnioski: Białko szoku cieplnego HtpG oddziałuje z DnaA, białkowym inicjatorem
replikacji DNA chromosomowego, w układzie in vivo i in vitro. Może to wskazywać na pośredni udział
bakteryjnego przedstawiciela Hsp90 w inicjacji replikacji chromosomu E. coli.
____________________
[1] Di Lallo i wsp., 2001, Microbiol. 147:1651-1656.
[2] Kedzierska i wsp., 2005, Arch. Biochem. Biophis. 444:61-65.
110
IV-12 P | Konstrukcja rekombinowanego szczepu Pichia pastoris z nadekspresją antygenu SAG1
Toxoplasma gondii
Grzybowski M.1, Dziadek B.1, Dziadek J.2, Gatkowska J.1, Dzitko K.1, Długońska H.1
1
2
Zakład Immunoparazytologii, Uniwersytet Łódzki, Łódź
Instytut Biologii Medycznej, Polska Akademia Nauk, Łódź
Wstęp: Toksoplazmoza będąca wynikiem zarażenia pierwotniakiem Toxoplasma gondii jest jedną
z najbardziej rozpowszechnionych na świecie antropozoonoz. Przebiegające na ogół skąpoobjawowo
zarażenie T. gondii stanowi poważne zagrożenie dla kobiet w ciąży, ze względu na możliwość transmisji
pasożyta do płodu, a także dla osób z niesprawnym lub osłabionym układem immunologicznym, jak
zakażeni HIV czy biorcy przeszczepów. Co więcej, wysoka częstość zarażeń wśród zwierząt hodowlanych, takich jak owce, przyczynia się do znacznych strat ekonomicznych. Brak skutecznych metod
eradykacji T. gondii stwarza potrzebę opracowania skutecznej szczepionki ochronnej. Dostępny
w nielicznych krajach preparat Toxovax®, oparty na atenuowanym szczepie S48 T. gondii, jest stosowany
wyłącznie w weterynarii, a ponadto nie zapewnia pełnej ochrony przed inwazją pasożyta. Obiecującą
alternatywą są szczepionki nowej generacji, w tym szczepionki podjednoskowe, zawierające ściśle
wyselekcjonowane antygeny wyprodukowane drogą inżynierii genetycznej. Wśród potencjalnych antygenów szczepionkowych, jednym z najlepiej poznanych jest główny antygen powierzchniowy tachyzoitów –
silnie immunogenne białko SAG1 (p30). Cel pracy: Sklonowanie genu sag1 T. gondii RH oraz uzyskanie
wysokiego stopnia ekspresji tego genu w komórkach metylotroficznych drożdży Pichia pastoris. Materiały i metody: Na matrycy genomowego DNA T. gondii RH zamplifikowano fragment genu kodującego
białko SAG1 o długości 882 pz i poddano ligacji z wektorem pJET1.2/blunt. Następnie wytrawioną
wstawkę klonowano w wektorze ekspresyjnym pPICZ A, a uzyskanym konstruktem transformowano
komórki P. pastoris X-33 metodą elektroporacji, wykorzystując przy tym mechanizm homologicznej
rekombinacji z genomem gospodarza. Nadekspresję rekombinowanego białka indukowano na podłożu
minimalnym z metanolem, a supernatanty uzyskane po lizie zebranych komórek analizowano metodą
SDS-PAGE oraz Western Blot. Wyniki: Otrzymano transformanty P. pastoris produkujące wewnątrzkomórkowo rekombinowane białko SAG1 T. gondii RH. Wnioski: System ekspresyjny P. pastoris umożliwia
wydajną produkcję rekombinowanego antygenu SAG1 – pierwszego komponentu opracowywanej
podjednostkowej szczepionki przeciw toksoplazmozie.
____________________
Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego oraz ze środków Uniwersytetu Łódzkiego w ramach dofinansowania badań młodych naukowców (grant nr 545/266).
Człowiek – najlepsza inwestycja
111
IV-13 P | Wpływ gronkowcowego układu toksyna-antytoksyna pemIKSa na dziedziczenie plazmidu
oraz wzrost populacji bakteryjnej
Ilczyszyn W.M.2, Bukowski M.1, Międzobrodzki J.2, Dubin A.1, Władyka B.1
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego
1Zakład Biochemii Analitycznej
2Zakład Mikrobiologii
Wstęp: Operon pemIKSa odkryty w szczepie Staphylococcus aureus CH-91 jest jedynym do dzisiaj
znanym przykładem kodowanego plazmidowo gronkowcowego układu toksyna-antytoksyna. Składa się
on z dwóch elementów: stabilnej toksyny PemKSa i labilnej antytoksyny PemISa. Badania wykazały, iż
toksyna PemKSa jest endorybonukleazą - interferazą mRNA, rozpoznającą specyficzną sekwencję
w obrębie bakteryjnego mRNA. W przypadku utraty plazmidu zahamowanie ekspresji genu antytoksyny
prowadzi do aktywacji toksyny a tym samym do wejścia komórki w stan bakteriostazy. Postuluje się, iż
mechanizm ten odgrywa ważną rolę w stabilnym utrzymywaniu się w populacji pozachromosomowych
elementów genetycznych. Cel pracy: Celem pracy była charakterystyka funkcjonalna operonu toksynaantytoksyna odkrytego w plazmidzie szczepu Staphylococcus aureus CH-91. Materiały i metody:
Przeprowadzono test stabilności dziedziczenia systemu heterologicznej ekspresji białek PemI i PemK
otrzymanego w systemie pETDuet/pACYCDuet w populacji bakteryjnej Escherichia coli DH5α. Klonowanie operonu pem do wektora pALC/P2/GFP pozwoliło na uzyskanie wektora z koekspresją układu
toksyna-antytoksyna pemIK i białka zielonej fluorescencji (GFP). Test stabilności otrzymanego konstruktu
pALC/P2/GFP/pemIK przeprowadzono w populacji bakteryjnej S. aureus RN4220. Wpływ ekspresji
toksyny PemKSa na dynamikę wzrostu populacji bakterii E. coli BL21 analizowano w hodowlach bakteryjnych na płytkach 96-dołkowych wykonując pomiary gęstości optycznej w odstępach 10 minutowych.
Żywotność komórek bakeryjnych sprawdzano zestawem LIVE/DEAD® BacLight™ Bacteria Viability Kit
(Invitrogen). Wyniki: Wykazano przy użyciu metody replik, iż w szczepie E. coli DH5α plazmid kodujący
antytoksynę był stabilnie dziedziczony w populacji niosącej plazmid z genem toksyny przez miesiąc,
pomimo braku czynników selekcyjnych. Konstrukt pALC/P2/GFP/pemIK był utrzymywany w populacji
S. aureus RN4220 znacznie dłużej niż plazmid kontrolny w podłożu płynnym bez dodatku antybiotyków.
Indukcja ekspresji toksyny PemKSa hamowała wzrost populacji bakteryjnej przy równoczesnym braku
spadku żywotności komórek. Wnioski: Uzyskane wyniki potwierdzają funkcjonowanie elementów kodowanych przez gronkowcowy operon pemIKSa w roli układu toksyna-antytoksyna i sugerują ich potencjalny
wpływ na stabilne dziedziczenie plazmidu pCH91, a także na zdolność modulacji dynamiki wzrostu
populacji bakteryjnej.
____________________
Praca częściowo finansowana z projektu MNiSW nr N N303 813340.
IV-14 | Ocena stabilności wzoru molekularnego szczepów Mycobacterium tuberculosis complex
wyhodowanych na przestrzeni 7 lat od osób blisko spokrewnionych
Kozińska M., Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E.
Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa
Wstęp. W trakcie rozprzestrzeniania się zakażenia gruźlicą, prątki wydalane są z kaszlem przez chorego
i dostają się do organizmu innej osoby. Do chwili rozwoju aktywnej gruźlicy u osoby zakażonej, w okresie
latencji mogą mieć miejsce zmiany w genomie transmitowanego szczepu. Różnice we wzorze molekularnym szczepów izolowanych w różnym odstępie czasu spowodowane są najczęściej rearanżacjami
genowymi, na które przede wszystkim wpływa charakter choroby, czas jej trwania, leczenie, a także
112
zmiana gospodarza w czasie transmisji. Niewielkie różnice we wzorach DNA nie wykluczają pokrewieństwa szczepów i pozwalają przypuszczać, że są one powiązane klonalnie i pochodzą ze wspólnego
źródła.Badania nad dynamiką zmian profili DNA sugerują, że szybkość rearanżacji nie jest wartością
stałą i uzależniona jest od zegara molekularnego badanego markera oraz osiąga różne tempo w różnych
regionach geograficznych. W przypadku metody IS6110-RFLP wiąże się także z liczbą kopii sekwencji
IS6110.Celem pracy była ocena stabilności wzoru molekularnego szczepów M. tuberculosis complex
wyizolowanych na przestrzeni 7 lat od chorych blisko spokrewnionych – ojca i siedmiorga dzieci. Materiały i metody. W analizie oceniono stabilność profilu DNA 11 szczepów wyhodowanych od chorych
w latach 2003-2010. Szczepy pochodziły od wielodzietnej rodziny, a której na gruźlicę chorował ojciec
i 12 dzieci. DNA genomowe poddawano analizie molekularnej obejmującej 4 metody typowania: spoligotyping, IS6110-Mtb1-Mtb2 PCR, MIRU-VNTR oraz IS6110-RFLP. Wyniki. W analizie spoligotyping,
IS6110-Mtb1-Mtb2 PCR oraz MIRU-VNTR szczepy były identyczne i tworzyły jeden klaster molekularny.
Typowanie IS6110-RFLP podzieliło badaną pulę szczepów na 2 rodziny molekularne (3 i 8 szczepów)
różniące się 1 prążkiem. Wnioski. Szczepy M. tuberculosis complex wyizolowane od 8 członków rodziny,
na przestrzeni 7 lat zachowały stabilną budowę DNA w regionie DR oraz w obrębie loci MIRU-VNTR.
Zaobserwowane zmiany we wzorze IS6110-RFLP szczepów nie wykluczają ich bliskiego pokrewieństwa
i przynależności do wspólnego łańcucha transmisji. Można przypuszczać, że pojawienie się dodatkowej
sekwencji IS6110 w genomie 3 szczepów wiąże się z długotrwałym okresem latencji u chorych, wielokrotnymi kursami leczenia (ojciec chorował 5-krotnie) oraz częstą zmianą gospodarza. Biorąc pod uwagę
fakt, że rearanżacje genomowe zaobserwowano jedynie w typowaniu IS6110-RFLP, wykluczenie tej
metody z algorytmu molekularnych badań epidemiologicznych w gruźlicy uniemożliwia obserwację
pojawiania się zmian we wzorach DNA szczepów.
IV-15 P/O | Charakterystyka mykobakteryjnej primazy DnaG jako miejsca docelowego dla nowych
leków przeciwgruźliczych
Kuroń A., Korycka-Machała M., Dziadek J.
Instytut Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk, Lodowa 106, Łódź
Wstęp: Primaza DnaG jest kluczowym enzymem uczestniczącym w replikacji DNA, będącej centralnym
procesem w podziałach komórkowych. Jest to specyficzna polimeraza RNA zależna od DNA, która
posiada zdolność syntezy de novo krótkich 5 – 10 nukleotydowych fragmentów RNA, pełniących rolę
primerów. Primaza, kodowana przez gen dnaG, występuje jedynie w komórkach bakteryjnych, zaś
u eukariontów aktywność primazy posiada jedna z podjednostek polimerazy DNA. Różnica w występowaniu genu dnaG oraz fakt, że jest to gen niezbędny dla funkcjonowania organizmów stała się podstawą
do rozpoczęcia badań nad możliwością wykorzystania mykobakteryjnej primazy DnaG jako potencjalnego miejsca docelowego dla nowych tuberkulostatyków. Cel pracy: Oprócz bakteryjnej primazy DnaG
w komórkach mykobakterii zidentyfikowano jeszcze 3 białka o aktywności primazy. Dlatego celem pracy
było przygotowanie modelu pozwalającego na weryfikację niezbędności primazy DnaG w komórkach
prątków po przez możliwość zastąpienia funkcjonalnego białka DnaG przez inne primazy mykobakterii
w warunkach ich nadprodukcji. Metody: Niezbędność genu dnaG oceniano wykorzystując system
homologicznej rekombinacji, który pozwala na selekcję pojedynczych (SCO) i podwójnych (DCO) krzyżowych rekombinantów. Uzyskane mutanty SCO komplementowano plazmidami integracyjnymi, zawierającymi geny badanych primaz znajdujących się pod kontrolą promotora acetamidowego. Białko DnaG
poddano również nadprodukcji w komórkach E. coli a następnie oczyszczono metodą chromatografii
powinowactwa i wykorzystano dla otrzymania swoistej surowicy odpornościowej. Wyniki: Przeprowadzone analizy wykazały, że DnaG jest niezbędna dla przeżycia komórek mykobakterii nawet w warunkach
nadprodukcji innych białek o aktywności primazy. Uzyskano warunkowe mutanty M. smegmatis, gdzie
113
jedyna funkcjonalna kopia genu dnaG (z M. smegmatis i M. tuberculosis) znajdowała się pod kontrolą
chemicznie regulowanego promotora. Poziom DnaG w komórkach szczepu dzikiego i mutantów monitorowano z wykorzystaniem uzyskanej poliwalentnej surowicy odpornościowej. Wnioski: Przeprowadzone
badania jednoznacznie wykazały, że obecność białka DnaG jest niezbędna dla przeżycia mykobakterii
i może ono być rozważane jako potencjalne miejsce docelowe dla nowych leków przeciwgruźliczych.
IV-16 P | Analiza genomiczna plazmidu p62BP1 szczepu Psychrobacter sp. 62B
Lasek R., Bartosik D.
Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Wstęp: Bakterie z rodzaju Psychrobacter występują powszechnie w regionach polarnych oraz na obszarach wiecznej zmarzliny (ponad 25% powierzchni Ziemi). Nasza wiedza o ruchomych elementach genetycznych tych bakterii jest fragmentaryczna. Obiektem niniejszych badań jest plazmid pochodzący ze
szczepu Psychrobacter sp. 62B wyizolowanego na wyspie Spitsbergen z guana arktycznych ptaków –
traczyków lodowych (Alle alle). Cel pracy: Przeprowadzono kompleksową analizę bioinformatyczną
sekwencji nukleotydowej plazmidu p62BP1 (34 467 bp) w celu wyodrębnienia i zdefiniowania poszczególnych modułów genetycznych tego replikonu. Metody: Do wyznaczenia otwartych ramek odczytu użyto
programów Artemis, ORF Finder i Clone Manager. Analizę porównawczą sekwencji z danymi zdeponowanymi w bazie GenBank przeprowadzono przy pomocy programów BLAST. Przyrównania sekwencji
(alignments) wykonano w programie MUSCLE. Do pozostałych analiz wykorzystano narzędzia dostępne
on-line. Wyniki: W p62BP1 zidentyfikowano moduł replikacyjny (REP), system partycyjny (PAR), moduł
fenotypowy oraz dwa systemy restrykcji-modyfikacji (R-M). Białka modułów REP i PAR są homologiczne
z białkami kodowanymi w znanych replikonach Psychrobacter spp. oraz innych Gammaproteobacteria.
Organizacja miejsca origin replikacji wykazuje podobieństwo strukturalne do oriV plazmidu pPS10. Geny
modułu fenotypowego, potencjalnie tworzące operon, kodują enzymy szlaku przemian reszt alkilowych
siarczanów organicznych do acylo-CoA. Jednym z możliwych wyjściowych substratów jest dodecylosiarczan sodu (SDS). Ekspresja genów operonu potencjalnie może być zależna od aktywności regulatora
transkrypcji z rodziny AraC/XylS. Enzymy systemów R-M, specyficzne wobec sekwencji 5’-CCNGG-3’,
wykazują wzajemne podobieństwo na poziomie 99% (C5-metylotransferazy, MT) i 96% (endonukleazy
restrykcyjne, EN). Geny MT i EN ułożone są w obu przypadkach w przeciwnej orientacji transkrypcyjnej
(rzadko spotykanej w systemach R-M), w taki sposób, że ich kodony STOP zachodzą na siebie. Wnioski:
W badanym plazmidzie występują – oprócz modułów odpowiedzialnych za jego replikację i stabilność
(REP, PAR, prawdopodobnie także R-M) – również geny enzymów szlaku metabolicznego o potencjalnym znaczeniu przystosowawczym. Na podstawie analiz porównawczych można zaproponować modele
regulacji ekspresji genów zidentyfikowanych modułów genetycznych. Wyniki niniejszej pracy stanowią
punkt wyjścia do dalszych badań eksperymentalnych.
IV-17 P/O | Izolacja aktywności przeciwdrożdżowych i przeciwprątkowych z endosymbiotycznych
dla dżdżownicy Dendrobaena veneta bakterii Raoultella ornithinolytica
Pernach K.1, Nowak A.1, Grzywnowicz K.1, Fiołka M.2
1Zakład
2Zakład
Biochemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Lublin,
Immunologii Bezkręgowców, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Lublin
Wstęp: Pierścienice (Annelida), w tym dżdżownice, rozwinęły różne mechanizmy odporności przed
zainfekowaniem ich przez mikroorganizmy. Są organizmami o stosunkowo dużej długości życia i stosun114
kowo dobrze przebadanymi, pod kątem immunologii porównawczej, bezkręgowcami. W środowisku
naturalnym dżdżownice odżywiają się substratami zawierającymi duże ilości mikroorganizmów, w tym
grzybów i bakterii, a nie wszystkie z nich są trawione. Zawartość przewodu pokarmowego dżdżownic ma
w związku z tym selektywne aktywności supresyjne, przeciw różnym mikroorganizmom dostającym się
do niego, w tym patogenom. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono aktywność przeciwdrożdżową
i przeciwprątkową izolatów z supernatantu kultur bakterii endosymbiotycznych Raoultella ornithinolytica.
Próbowano także określić właściwości biochemiczne i enzymologiczne wyizolowanych preparatów oraz
ich subfrakcji. Metody: Ze ściany jelita Dendrobaena veneta wyizolowano bakterie Raoultella ornithinolytica, wykazujące między innymi aktywność przeciwdrożdżową i przeciwprątkową. Przy pomocy ultrafiltracji podzielono supernatant kultury bakterii na frakcje 14-50, 50-100 i powyżej 100 kDa. Następnie dokonano izolacji subfrakcji przy pomocy chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Otrzymywane izolaty
poddawano analizie na aktywność przeciwdrożdżową (przeciw Candida albicans) i przeciwprątkową
(przeciw Mycobacterium tuberculosis), a także pod kątem typu aktywności zawartych w nich substancji
biologicznie aktywnych (aktywność lizozymu, proteolityczna, poziom inhibitorów proteaz, glikoprotein
oraz lipoprotein). Wykonano również analizy elektroforetyczne. Wyniki: Badania wykazały, że frakcja
wysokocząsteczkowa (powyżej 100 kDa) dzieliła sie na anionicie na trzy subfrakcje o różnych właściwościach biochemicznych, enzymologicznych i antybiotycznych. Zawierająca najwięcej białka frakcja po
chromatografii jonowymiennej wykazywała podział na dwa piki w trakcie filtracji żelowej. Frakcja średniocząsteczkowa (50-100 kDa) wykazywała jeden pik w chromatografii na anionicie. Pik ten dzielił się na
trzy subfrakcje w trakcie filtracji żelowej. W przypadku frakcji średniocząsteczkowej również występowały
różnice we właściwościach. Frakcja niskocząsteczkowa (14-50 kDa) nie dała na razie zadowalających
rozdziałów. Wnioski: Można przypuszczać, że po dopracowaniu techniki izolacji/oczyszczania uda się
otrzymać z supernatantu kultur bakterii endosymbiotycznych Raoultella ornithinolytica frakcje substancji
biologicznie aktywnych, o konkretnych właściwościach antybiotycznych (przeciwdrożdżowe lub przeciwprątkowe) oraz zdefiniowanym składzie biochemicznym.
IV-18 P | Występowanie genów biosyntezy petrobaktyny u bakterii z grupy Bacillus cereus.
Pietraszek P., Ołtuszak-Walczak E., Walczak P.
Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Zakład Mikrobiologii Technicznej, Politechnika Łódzka
Wstęp: Żelazo jest mikroelementem odgrywającym kluczową rolę w podstawowych procesach biologicznych każdej żywej komórki. Stężenie tego pierwiastka w środowisku naturalnym waha się od 10-9 do 10-18
mol/l. Podobnie przedstawia się sytuacja w płynach ustrojowych organizmów wyższych, co uwarunkowane jest wiązaniem żelaza przez takie białka jak laktoferyna, transferyna czy ferrytyna. Bakterie patogenne
pokonując bariery ochronne gospodarza syntetyzują cząsteczki zwane sideroforami wiążące żelazo
z bardzo wysoką swoistością i powinowactwem przez co zwiększają jego biodostępność i zapewniając
sibie korzystne warunki rozwojowe. Bakterie reprezentujące grupę Bacillus cereus podobnie jak inne
organizmy tlenowe i względnie beztlenowe w warunkach „głodu” żelazowego syntetyzują jonofory jonów
żelaza: bacillibaktynę i petrobaktynę. Pierwsza z nich syntetyzowana jest przez wiele gatunków należących do rodzaju Bacillus, podczas gdy petrobaktyna produkowana jest głównie przez bakterie z grupy
cereus, a co więcej uważana jest za czynnik wzmagający ich wirulencję. Cel pracy: Badania sprowadzały się do opracowania metody umożliwiającej jednoczesne wykrywanie w genomie bakterii należących
do grupy Bacillus cereus operonu kodującego biosyntezę petrobaktyny wraz z poprzedzającym go
promotorem. Metody: Zaplanowane badania wymagały zaprojektowania uniwersalnych primerów do
reakcji PCR komplementarnych do DNA w rejonie pierwszego genu strukturalnego petrobaktyny asbA
(primery P2 i P3) oraz w rejonie poprzedzającego go promotora (primer P1). W tym celu wykorzystano
sekwencje operonów asb ze szczepów B. cereus (9), B. anthracis (4) oraz B. thuringensis (2) z bazy
115
danych (GeneBank). Analizie poddano 45 szczepów bakterii należących do grupy Bacillus cereus wyizolowanych z żywności i środowiska naturalnego, w tym B. cereus, B. thuringensis oraz B. mycoides.
Zastosowanie pary starterów P2-P3 pozwalało na stwierdzenie obecności genu asbA, a zaangażowanie
pary P1-P3 umożliwiało wykrycie promotora tego genu. Wyniki: Wykazano, iż większość z badanych
szczepów, tj. 36 z 45, zawiera pierwszy gen operonu asb (asbA, w tym również szczepy B. mycoides),
a dodatkowo 34 z nich zawierają poprzedzający go region promotorowy. Wnioski: Otrzymane wyniki
wskazują, że operon biosyntezy petrobaktyny występuje u wszystkich gatunków bakterii należących do
grupy cereus. Cecha ta jest szeroko rozpowszechniona i jej występowanie nie ogranicza się jedynie do
chorobotwórczych szczepów B. anthracis i B. cereus, występuje też u uznanych za nie patogenne
szczepów B. mycoides.
IV-19 P | Oznaczanie poziomu uszkodzeń alkilacyjnych DNA u chorych na nowotwory głowy i szyi
przy użyciu białek MutS, MutL oraz MutH
Rusin P.1, Majsterek I.2
1 Katedra
2
Genetyki Molekularnj, Uniwersytet Łódzki
Zakład Chemii i Biochemii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Wstęp: Rozwój choroby nowotworowej może być związany z obniżeniem wydajności naprawy uszkodzeń DNA oraz wzrostem wrażliwości na mutageny środowiskowe. Wśród czynników związanych ze
zwiększoną częstością występowania płaskonabłonkowych nowotworów głowy i szyi (HNSCC) szczególna uwagę zwraca się na dym tytoniowy oraz inne czynniki powodujące alkilację DNA. Alkilacja, najczęściej metylacja i acetylacja, prowadzi do powstania różnych pochodnych zasad azotowych. Czynniki
alkilujące mogą zatem doprowadzić do błędnego sparowania zasad, utraty zasad azotowych bądź
pęknięć DNA. Cel pracy: Celem naszych badań było określenie poziomu alkilacyjnych uszkodzeń
endogennych w komórkach pochodzących od pacjentów z nowotworami głowy szyi. Metody: W badaniach zastosowalno modyfikacje alkaicznej wersji testu kometowego (comet assay). Uszkodzenia alkilacyjne oceniano poprzez wzrost ilości pęknięć dwuniciowych po zastosowanie białek naprawy błędnie
sparowanych zasad (MMR, ang. mismatch repair) – MutS, MutL oraz MutH. Wyniki: Zaobserwowano iż
poziom uszkodzeń alkilacyjnych był wyższy w badanych komórkach pacjentów z HNSCC w porównaniu
do poziomu w komórkach pochodzących od osób zdrowych. Wnioski: Uzyskane wyniki wskazują na to,
że podwyższony poziom uszkodzeń alkilacyjnych może odgrywać znaczącą rolę w mechanizmie kancerogenezy oraz może stanowić marker rozwoju nowotworów głowy i szyi.
____________________
Projekt współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
IV-20 P | Analiza ekspresji OmpR-zależnych genów regulonu rzęskowego Y. enterocolitica O:9
w poszukiwaniu bodźców środowiskowych aktywujących szlak sygnałowy EnvZ/OmpR
Skorek K., Raczkowska A., Brzostek K.
Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Wstęp: Yersinia enterocolitica jest ludzkim enteropatogenem - czynnikiem etiologicznym jersiniozy, która
po campylobakteriozie i salmonellozie jest najczęściej występującą w UE zoonozą. Dwuskładnikowe
systemy transdukcji sygnału w komórkach bakteryjnych umożliwiają regulację ekspresji odpowiednich
genów i efektywną adaptację do zmieniających się warunków środowiskowych. Dotychczasowe badania
sugerują, że dwuskładnikowy szlak sygnałowy EnvZ/OmpR Y. enterocolitica koordynuje ekspresję genów
wirulencji – w tym genów regulonu rzęskowego, w odpowiedzi na bodźce pochodzące z organizmu
116
gospodarza. Cel pracy: W pracy postanowiono zbadać wpływ różnorodnych czynników środowiskowych
na ekspresję OmpR-zależnych genów regulonu rzęskowego kodujących: FlhDC – nadrzędny aktywator
regulonu, FliA – alternatywny czynnik 28 oraz YplA – fosfolipazę A, w celu potwierdzenia hipotezy
o skoordynowanej, kaskadowej regulacji ekspresji OmpRFlhD/FlhCFliAYplA. Celem tych analiz
było także wskazanie bodźców aktywujących szlak EnvZ/OmpR. Metody: W badaniach wykorzystano
szczepy niosące fuzje transkrypcyjne promotorów genów regulonu rzęskowego: flhDC, fliA oraz yplA
z genem reporterowym lacZ, skonstruowane w szczepie dzikim Ye9 oraz izogenicznym mutancie
ompR. Aktywność promotorów badano w różnej temperaturze, pH oraz w obecności związków potencjalnie aktywujących szlak sygnałowy EnvZ/OmpR, m.in. NaCl, prokainy oraz indolu. Wyniki: Badania
z zastosowaniem reporterowych fuzji transkrypcyjnych wykazały wpływ warunków środowiskowych na
poziom ekspresji genów flhDC, fliA oraz yplA. Podwyższenie temperatury z 26 °C do 37 °C w znacznym
stopniu zmniejszyło aktywność wszystkich analizowanych fuzji zarówno w szczepie dzikim, jak
i w mutancie ompR. Maksimum ekspresji badanych genów obserwowano w pH 7,0, a podwyższenie
oraz obniżenie pH miało hamujący wpływ na aktywność promotorów bez względu na obecność OmpR.
Podobny efekt obserwowano w warunkach zwiększonej osmolarności (dodanie NaCl). Indol, związek
zakłócający funkcjonowanie błony zewnętrznej, wyraźnie zwiększał aktywność analizowanych promotorów w szczepie dzikim. Efekt ten był zniesiony w szczepie nie syntetyzującym białka OmpR. Wnioski:
OmpR jest pozytywnym regulatorem ekspresji wszystkich analizowanych genów regulonu rzęskowego
zgodnie z przyjętą wcześniej hipotezą. Termoregulacja oraz osmoregulacja ekspresji badanych genów
jest niezależna od aktywności regulatora OmpR. Jedynym induktorem szlaku transdukcji sygnału
EnvZ/OmpR kontrolującym analizowane geny jest indol.
IV-21 P | Badanie aktywności antybakteryjnej pochodnych tiosemikarbazydów
Strzelczyk A., Stączek P.
Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii,
Uniwersytet Łódzki, Łódź
Wstęp: Systematycznie rosnąca liczba szczepów bakterii opornych na antybiotyki jak np. oporny na
metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA), wielolekooporne pałeczki Pseudomonas czy wankomycynooporne szczepy Enterococcus stanowi ogromny problem, a jednocześnie wyzwanie dla mikrobiologów
i lekarzy zajmujących się antybiotykoterapią. Dlatego też, większość badań skierowanych jest na znalezienie nowych, syntetycznych związków celujących w podstawowe procesy życiowe bakterii. Jedną
z klas enzymów stanowiących dogodny cel dla chemioterapii są topoizomerazy typu IIA zaangażowane
w regulację poziomu superskręcenia chromosomu, replikację, transkrypcję i rekombinację. Cel pracy:
Celem niniejszej pracy była wstępna selekcja pochodnych tiosemikarbazydów pod kątem ich zdolności
do działania przeciwbakteryjnego oraz określenie wpływu wybranych w ten sposób związków na aktywność topoizomeraz klasy IIA, pochodzących zarówno z drobnoustrojów gramujemnych jak i gramdodatnich. Metody: Wykorzystując zalecany przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów zestaw szczepów bakteryjnych, poszerzony o dwa szczepy z rodzaju Proteus i jednego
grzyba mikroskopowego Candida albicans dla badanych związków wyznaczono najniższe stężenie
hamujące wzrost drobnoustrojów (MIC, ang. Minimal Inhibitory Concentration) metodą mikrorozcieńczeń
w płytkach titracyjnych oraz zmierzono strefy zahamowania wzrostu metodą dyfuzyjno-krążkową. Oznaczono także zdolność do hamowania aktywności gyrazy i topoizomerazy IV z E. coli i S. aureus poprzez
określenie wartości współczynnika IC50. Wyniki: Największą aktywność hamującą wzrost drobnoustrojów wykazywały związki 27 i 33, szczególnie wobec bakterii gramdodatnich przy stężeniach 5 µM dla
związku 27 i 30 µM dla związku 33. Żaden z przebadanych związków nie wykazywał wyższej aktywności
117
hamującej gyrazę E. coli od novobiocyny, która hamuje ten enzym w stężeniu 0,5 µM. Najbardziej
skuteczne okazały się związki TT i 8P w stosunku do gyrazy i topoizomerazy IV S. aureus (IC50 ≈ 30 µM
dla gyrazy i IC50 ≈ 8 µM dla topoizomerazy IV). Wnioski: Otrzymane wyniki wskazują, że niektóre nowe
pochodne tiosemikarbazydów wykazują aktywność antybakteryjną wykorzystując mechanizm hamowania
aktywności topoizomeraz typu IIA. Konieczne jest przeprowadzanie dalszych badań mających na celu
zbadanie m.in. mutagenności, genotoksyczności i cytotoksyczności badanych związków.
IV-22 P | Transformacja szczepów A. tumefaciens z zastosowaniem wektorów pRF-HUE oraz
pRF-HU2E
Wypyszczak K., Dębska J.
Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki, Łódź
Wstęp: Metoda ATMT (ang. Agrobacterium Tumefaciens Mediated Transformation) stosowana powszechnie do transformacji roślin, znalazła również zastosowanie w przypadku transformacji wielu
gatunków grzybów strzępkowych. Zastosowanie odpowiednio skonstruowanego wektora oraz wprowadzenie go do komórki A. tumefaciens umożliwia klonowanie genów w docelowych genomach. Cel pracy:
Konstrukcja stabilnych transformantów szczepów A. tumefaciens niosących wektory pRF-HUE oraz pRFHU2E do zastosowania w transformacji dermatofitów za pomocą metody ATMT (ang. Agrobacterium
Tumefaciens Mediated Transformation). Metody: Transformację szczepów A. tumefaciens przeprowadzono za pomocą procedury, która obejmowała przygotowanie wektorów plazmidowych oraz elektrokompetentnych komórek A. tumefaciens, elektroporację szczepów bakteryjnych oraz hodowlę transformantów. Stabilność transformantów sprawdzono metodą hodowli płytkowej do 4 pokolenia na podłożu z
dodatkiem antybiotyku selekcyjnego oraz bez dodatku antybiotyku, przeprowadzając analizę restrykcyjną
pDNA izolowanego z kolejnych pokoleń. Wyniki: Uzyskano transformanty A. tumefaciens niosące
wektory plazmidowe pRF-HUE oraz pRF-HU2E, których obecność potwierdzono na drodze analizy
restrykcyjnej endonukleazą EcoRI pDNA izolowanego z kolejnych pokoleń hodowli bakteryjnych. Wnioski: Zastosowane wektory pRF-HUE oraz pRF-HU2E pozwoliły na transformację wybranych szczepów
A. tumefaciens i uzyskanie stabilnych układów. Uzyskane transformanty wykazywały dużą stabilność
nawet w przypadku ich hodowli na podłożu pozbawionym selekcyjnego antybiotyku. Otrzymane układy
A. tumefaciens - wektor plazmidowy mogą znaleźć zastosowanie w metodzie ATMT do transformacji
wybranych szczepów dermatofitów.
IV-23 | Opracowanie metody izolacji białek z grzybów strzępkowych
Soboń A., Szewczyk R., Długoński J.
Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki
Wstęp: Z uwagi na złożoną budowę ściany komórkowej grzybów strzępkowych, której efektem jest
utrudniona ekstrakcja białek, badania proteomu tych mikroorganizmamów nie są prowadzone na szeroką
skalę. Po latach nacisku na badania genetyczne, coraz większa uwagę naukowców przykuwa proteomika. Pod pojęciem proteomiki rozumie się badania nad ekspresją wszystkich białek występujących
w komórce w określonym czasie. Kluczowymi etapami wydajnej izolacji białek jest opracowanie skutecznej metody homogenizacji biomasy i późniejszej ekstrakcji białek. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono skuteczność wypracowanej metody izolacji białek pochodzących od różnych gatunków grzybów
strzępkowych. Metody: W zależności od badanego szczepu grzyba strzępkowego, nastawiono hodowle
bezpośrednio z zawiesiny zarodników bądź z zastosowaniem prekultury w celu wytworzenia homogennej
118
hodowli wgłębnej. Po dwudniowej hodowli, biomasę poddawano mechanicznej homogenizacji, otrzymane
białka precypitowano przy pomocy kwasu trichlorooctowego, a następnie osad poddawano działaniu 0,2
M NaOH, a następnie rozpuszczano w standardowym buforze rozpuszczającym. Uzyskane frakcje
białkowe rozdzielano przy pomocy elektroforezy 1D-SDS-PAGE. Wyniki: Opracowana przez nas metoda
doskonale nadaje się do izolacji białek pochodzących od różnych gatunków grzybów strzępkowych.
Zastosowana preparatyka pozwala na uzyskanie oczyszczonych roztworów białkowych w stężeniach od
10 ng/ml do 1 mg/ml . Różnice w profilach białkowych poszczególnych mikroorganizmów są dobrze
widoczne na żelach 1-D, także w przypadku różnych szczepów należący do tego samego gatunku
(Trichoderma sp.). Wnioski: Zastosowana przez nas metodyka izolacji białek pochodzących od grzybów
strzępkowych jest skuteczna w porównywaniu proteomów badanych mikroorganizmów.
119
120
Alfabetyczny
indeks autorów
121
122
A
Adamczuk M.
Adamczyk M.
Adamiak M.
Adamski M.
Agier J.
Anielska T.
Antczak A.
Antosik A.
Appelhans D.
Augustyniak A.
Augustynowicz-Kopeć E.
103
32
32
67, 89
18
96
93
40
63, 64
52
12, 112
B
Babuchowski A.
Balcerek M.
Bartnicka M.
Bartosik D.
Bawej E.
Bazylak G.
Bączek K.
Bednarczyk-Drąg A.
Bednarek I.
Behnke-Borowczyk J.
Bergier K.
Białecka A.
Białous I.
Bielinis E.
Blus E.
Błaszczyk D.
Błażejak S.
Bogiel T.
Bogut A.
Bonar E.
Boratyńska A.
Borkowska D.
Brzeszcz J.
Brzezińska A.J.
Brzezińska M.
Brzostek A.
83
92
61
103, 106, 114
59
57, 95
94
22
69
68, 104
62
44, 78, 80, 90
82
68, 104
33
69
71
50, 104
23
34
55
12
69
70
34, 54
33, 34, 54
Brzostek K.
116
Budzyńska A. 12, 13, 35, 36, 37, 61, 62
Bukowski M.
105, 112
Bzducha-Wróbel A.
71
C
Chajęcka-Wierzchowska W.
14
Chmiela M.
38, 43, 45, 48, 52, 53
Chromy K.
72
Chudzik-Kozłowska J.
77
Cichocka O.
75
Cichy W.
21
Ciesielska A.
107
Czaiński T.
99
Czarnecki J.
106
Czernek U.
18
Czubek E.
81
D
Daczkowska-Kozon E.G.
22
Dahm H.
70
Dąbrowski W.
22
Deptuła A.
104
Dębska J.
107, 118
Długońska H.
11, 37, 111
Długoński J.
67, 74, 88, 118
Drobińska-Janiszewska B.
25
Drulis-Kawa Z.
39
Druszczyńska M.
25
Drzewiecka D.
59
Dubin A.
34, 44, 90, 105, 112
Duda K.A.
20
Dudzińska D.
61
Dybka K.
107, 108
Dziadek B.
37, 111
Dziadek J.
33, 34, 54, 109, 111, 113
Działo J.
32
Dziekońska U.
71
Dziewit Ł.
103
Dzitko K.
37, 111
F
Felczak A.
Fijałkowski K.
Fiołka M.
Frąc M.
Furmaga J.
Ilczyszyn W.M.
64
25, 26, 52, 87
72, 98, 114
73, 86, 91
49
G
Gajek A.
Gałęcka M.
Gamian A.
Gancarz R.
Gatkowska J.
Gawłowska M.
Gernand A.
Gibus D.
Gniewosz M.
Golaska M.
Gorzkiewicz M.
Gospodarek E.
Górna A.
Graczykowski M.
Gregorczyk K.
Grochowska A.
Grudniak A.M.
Gruska R.
Grzebalska A.
Grześ K.
Grzybowski M.
Grzywnowicz K.
Gutarowska B.
Guzińska K.
15
21
16
41
37, 111
75
16
36, 37
94
63
32
50, 60, 104
109
38
39
39
110
93
49
110
111
114
93
86
H
Hirnle L.
16
I
Ibran J.
Ilczyszyn W.
124
18
105
112
J
Jachna-Sawicka K.
Janecki T.
Janik P.
Jankowicz A.
Janowski A.
Jarząb A.
Jasińska A.
Jaworska O.
Jaworski A.
Jaworski S.
Jeziorski A.
Juś K.
60
35
74
63
75
16
74, 75
44
107
76
18
77
K
Kaliszewska A.
22, 77
Kamińska T.
56
Kandefer-Szerszeń M.
56
Kapusta P.
69
Kasińska P.
52
Kasperkiewicz K.
20
Kasprowicz A.
44, 78, 80, 90
Kassner J.
39
Kaszycki P.
69, 78, 80
Kędzierska M.
18
Kęsik-Szeloch A.
39
Kidaj D.
79
Kielnierowski G.
25
Kiełbik M.
33, 34, 54
Klepacka A.
61
Klink M.
33, 34, 54
Kłapkowska P.
78, 80
Kłębukowska L.
14
Konieczna E.
59
Konieczna O.
51
Kontek B.
17, 18, 40, 41
Korniłłowicz-Kowalska T.
91
Korycka-Machała M.
113
Kowalski S.
74
Kozińska M.
Kozioł-Montewka M.
Krajewska U.
Krawczyk. B.
Kręgiel D.
Król J.
Kruk M.
Krupińska A.
Kruszewska D.
Krzyżowska M.
Książek A.
Kubala N.
Kubiś M.
Kucharczyk H.
Kuczyńska-Wiśnik D.
Kuder P.
Kujawa E.
Kukla M.
Kulifer A.
Kurantowicz N.
Kurek A.
Kur-Kowalska K.
Kuroń A.
Kutkowska J.
Kwaśna H.
Kwiecińska-Piróg J.
112
23, 49
35
54
42
90
68
52
57, 58
39
49
18
32
59
43
19
77
80
17
20
41
42
113
59
104
60
L
Lasek R.
Laskowska E.
Leszczyńska D.
Lewandowska M.
Lewicka K.
Li C-M.
Lipiec J.
Lipowczan G.
Lisowska K.
Lubudzisz Z.
114
43
43
15
81, 82
20
86, 91
37
63, 64
21
Ł
Łaniewska-Trokenheim Ł.
14, 85
Łaryonowicz M.
Łozowska A.
Łukasik M.
Łyżeń R.
81
82
20
105
M
Machnik G.
Macura A.
Magryś A.
Majsterek I.
Malinowska M.
Martyniszyn L.
Massopust H.
Matusiak A.
Matuszewska E.
Mazurczyk M.
Mądrzak K.
Michałek E.
Micota B.
Międzobrodzki J.
Mikš-Krajnik M.
Mikucka A.
Miller E.
Miszczyk E.
Miszczyszyn M.
Mocek M.
Modranka J.
Moryl M.
Mól M.
Mroczyńska M.
Murawska A.
69
37
49
116
18
55
82
43, 45, 48, 52
43
18
18
52
18
44, 78, 90, 112
83
24
17
43, 45, 48, 53
82
77
35
18
52
21
82
N
Nadzieja N.
Napierała M.
Nawrotek P.
Niedźwiadek J.
Niemiałtowski M.
Nitka E.
Nowak A.
Nowak M.
82
84
25, 26, 52, 87
23
55
84
84, 114
36, 37
125
O
Ogar A.
Ogrodowczyk A.
Olas B.
Olek J.
Olszewska M.
Ołtuszak-Walczak E.
Ostrowska K.
Oszust K.
Otlewska A.
Owczarek M.
Przybył J.
Ptaszyńska A.
84
22, 77
18
59
85
115
46
73, 86
108
86
P
Paduch R.
Pakulska J.
Pali M.
Paluch-Oleś J.
Palusińska-Szysz M.
Paraszkiewicz K.
Paszkiewicz M.
Patelski P.
Pawełkiewicz A.
Pawlaczyk I.
Peitler D.
Pernach K.
Piątek M.A.
Piechocka J.
Piekarski J.
Pielech-Przybylska K.
Pieniak A.
Pietr S.J.
Pietraszek P.
Pietruk M.
Pikuła K.
Piotrowska-Seget Z.
Pisarska K.
Podsędek A.
Polakowska K.
Ponichtera M.
Potemski P.
Przybylska A.
126
56
46
18
49
59
74, 75
13, 47, 61
71, 93
46
41
87
114
88
77
18
92
74
67, 89
115
88
81, 82
80
67, 89
61
44, 90
75
18
57, 95
94
72
R
Rabsztyn K.
20
Raczkowska A.
116
Radziejewska-Lebrecht J.
20
Rąpała-Kozik M.
96
Rechciński T.
43
Rembisz D.
93
Robakowski P.
68
Rola B.
58
Roszak D.
21
Różalska B. 12, 13, 31, 35, 36, 37, 47,
61, 62
Różalski A.
46
Różalski M.
35
Rudnicka K. 38, 43, 45, 48, 52, 53, 75
Rudnicka W.
25, 43, 52
Rudzki S.
49
Rusin P.
116
Rutkowska A.
73, 91
Rybczyńska K.
91
S
Sadowska B.
Saluk J.
Sapińska E.
Schmidt M.
Seifert K.
Sekret J.
Sidorczyk Z.
Sierpińska M.
Sikora A.
Siwińska M.
Skalski T.
Skłodowska M.
Skorek K.
Skorupska A.
Skóra J.
Skurnik M.
13, 18, 31, 46, 47, 61
41
92, 93
97
22
18
49
14
23, 49
49, 59
50
62
116
79
93
20
Słaba M.
Sobczak K.
Soboń A.
Solecka A.
Sołtysik D.
Spiżak A.
Stanisz M.
Stanuch M.
Stańczyk J.
Stączek P.
Steć A.
Steliga T.
Stobieniecka D.
Strzelczyk A.
Strzelec-Nowak D.
Sułowska Z.
Synowiec A.
Szachta P.
Szalewska-Palasz A.
Szczepaniak P.
Szczęsna E.
Szeglewska K.
Szejbach A.
Szemiako K.
Szewczyk R.
Szkudlarek J.
Szlachciak M.
Szopa J.
Szostko B.
Szponar B.
Szulc I.
Szulc L.
Szuster-Ciesielska A.
Szwiec K.
Szydłowska-Pazera K.
88
51
118
52
69
52
92, 93
18
18, 59
117
49
69
52
117
23, 49
33, 34, 54
94
21
105
43
18, 53
82
24
54
118
16
81
92
16
19
34, 54
55
56
57, 58
18
Ś
Śliwińska A.
Śnioszek A.
Świadek M.
Świątecka D.
Świeboda P.
57, 95
93
96
77
57, 58
T
Tokarz-Deptuła B.
Trzeciak-Ryczek A.
Turnau K.
Turska-Szewczuk A.
32
32
74, 84, 96
59
U
Urbanik-Sypniewska T.
59
W
Wachowicz B.
17, 18, 41
Walczak P.
107, 108, 115
Walencka M.
43, 45, 48, 52
Wasilewska E.
22
Wasiniewska M.
81
Wasyluk A.
59
Wawrzonkowski J.
81
Weber-Dąbrowska B.
39
Wężowicz K.
96
Wiatrowska B.
68, 104
Wieczorek M.
37
Wieczorkiewicz A.
51
Wielbo J.
79, 98
Wieliczko A.
90
Więckowska E.
60
Więckowska-Szakiel M.
35, 61, 62
Wiśniewska M.
60
Witkowska D.
16
Wlazłowicz E.
41
Władyka B.
34, 44, 90, 105, 112
Własak A.
25
Włodarczyk M.
25, 48, 97
Wojtczak G.
96
Wolska K.I.
41
Woźniak A.
56
Wójcik A.
81
Wójtowicz M.
49
Wrońska N.
63
Wróblewska B.
22, 77
Wydrych J.
72, 98
127
Wypyszczak K.
Wyszomirski P.
118
78, 80
Z
Zabłotni A.
Zadernowska A.
Zagaja M.
Zakrzewska M.
Zalewska J.
Zapotoczny S.
Zawada I.
128
59
14
98
22
59
84
74
Zawadzka J.
Zawadzka K.
Zduniak K.
Zwolska Z.
25
64
93
12, 112
Ż
Żakowska Z.
Żbikowska H.M.
Żurek A.
Żywicka A.
16
40
56
26

Ksiąka konferencyjna 2011 (plik do pobrania)

Transkrypt

Podobne dokumenty

XRB Komunikat - Zamknij Drzwi Zakażeniom Szpitalnym

Leczenie antybiotykowe w zakaŜeniach skórnych i

vidacell