Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
Farmaceutyczny
www.fpn.info.pl
Cena 24,50 zł
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH
IC Value - Current 3.66
MNiSW 4
ROK VI (X)
Nr 2/2009 (49)
Scientific Review in Pharmacy
Analiza zrefundowanych recept na antybiotyki
przez Opolski Oddział NFZ w latach 2005 i 2006
u osób powyżej 6-go roku życia objętych
Podstawową Opieką Zdrowotną
Cukrzyca typu 2 – nowoczesne leczenie
Interakcje Dziurawca zwyczajnego
(Hypericum perforatum)
Modyfikacja dostępności farmaceutycznej
piroksykamu z tabletek z udziałem
wybranych solubilizatorów 0
Osłabienie sygnału generowanego
przez receptor β1 integrynowy
oraz ekspresji receptora IGF-I
jest odpowiedzialne za indukowane
przez stres oksydacyjny upośledzenie
biosyntezy kolagenu i wzrostu fibroblastów.
Wpływ stopnia ufosforylowania
bakteryjnych endotoksyn
na ich aktywność biologiczną
Profil ekspresji genów kodujących białka
związane z aktywnościa biologiczną leptyny
w raku endometrium
Rekombinowane wektory wirusowe rAAV
w terapii genowej nowotworów
Badanie zależności pomiędzy strukturą
i działaniem pochodnych benzodiazepiny.
Część I. Nie-nukleozydowe inhibitory
odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-10000
ISSN 1425-5073
Wątrobowy i nerkowy układ monooksygenaz
zależnych od cytochromu P450:
wpływ glikolu etylenowego
i 4-metylopirazolu
1
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Index Copernicus 2,51
Redaktor Naczelny:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Adres redakcji:
41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8
Tel. 500 722 219
Fax. 032/364-11-34
Mail: [email protected]
Spis treści
Konsultacyjna Rada Naukowa
Przewodniczący:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec
Członkowie:
Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok
Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź
Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak -Lublin
Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań
Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin
Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec
Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice
Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa
Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok
Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław
Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin
Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk
Sekretarz Naukowy:
Dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Członkowie Kolegium Redakcyjnego:
Dr n. farm. Paweł Olczyk
Dr n. biol. Małgorzata Kępa
Mgr Anna Szeremeta
Mgr Agnieszka Jura – Półtorak
Wydawca:
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego
Adres Wydawcy:
ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała
tel. (0-33) 817-28-79 fax (0-33)817-36-31
Prezes: dr n. med. Adam Kwieciński
Marketing Manager:
Agnieszka Romańska
[email protected]
Opracowanie graficzne:
Robert Cyganik
Skład:
Jerzy Partyka
Nakład: do 7 000 egz.
Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja
zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe
jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja
nie odpowiada.
przez Opolski Oddział NFZ w latach 2005 i 2006
u osób powyżej 6-go roku życia objętych
Podstawową Opieką Zdrowotną
7
14
Interakcje Dziurawca zwyczajnego
(Hypericum perforatum)
19
Modyfikacja dostępności farmaceutycznej
piroksykamu z tabletek z udziałem
wybranych solubilizatorów 0
24
Osłabienie sygnału generowanego
przez receptor β1 integrynowy
oraz ekspresji receptora IGF-I
jest odpowiedzialne za indukowane
przez stres oksydacyjny upośledzenie
28
Wpływ stopnia ufosforylowania
bakteryjnych endotoksyn
na ich aktywność biologiczną0
35
w raku endometrium0
43
w terapii genowej nowotworów0
48
52
Wątrobowy i nerkowy układ monooksygenaz
zależnych od cytochromu P450:
wpływ glikolu etylenowego
i 4-metylopirazolu
61
Szanowni Państwo,
Koleżanki i Koledzy,
Drodzy Czytelnicy
Serdecznie zapraszam na łamy kolejnego numeru Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. Zawiera on prace
o zróżnicowanej tematyce z zakresu nauk farmaceutycznych, ale i pokrewnych dziedzin biomedycznych. W niniejszym numerze zamieszczamy także krótki, anglojęzyczny
artykuł pod tytułem „Community pharmacy in Turkey”, a to
w związku ze zbliżającym się, 69. Międzynarodowym Kongresem FIP (International Pharmaceutical Federation),
który odbędzie się w Stambule, w dniach 3 – 8 września
bieżącego roku.
Artykuł pokrótce omawia sytuację społeczno – polityczną w Turcji, oczekującej od 1999 roku na przyjęcie
w poczet członków Unii Europejskiej, i na tym tle – sytuację farmaceutów – pracowników aptek ogólnodostępnych,
także w aspekcie obecnego i prognozowanego zatrudnienia. Zamieszcza informacje na temat wybranych zagadnień
prawa farmaceutycznego, wskazuje najważniejsze zmiany
w przeddyplomowym kształceniu farmaceutów, odnosząc
się także do kwestii kształcenia techników farmaceutycznych. Warto przeczytać ten syntetyczny opis najważniejszych problemów nurtujących farmaceutów w Turcji, kwestii wcale nie tak odległych od tych, które napotykamy na
co dzień i u nas. Autor artykułu wyraża nadzieję, iż nadcho-
dzący Kongres stanie się sposobnością do żywej dyskusji
na temat wszystkich problemów nurtujących środowisko
farmaceutów na całym świecie, do wymiany doświadczeń,
a nie wykluczone – i sformułowania propozycji dobrych
rozwiązań, jak i ich wdrożenia tam, gdzie w oparciu o doświadczenia innych można je zastosować.
Szanowni Państwo, 69. Międzynarodowy Kongres FIP,
to nie jedyne międzynarodowe wielkie wydarzenie o charakterze naukowym i edukacyjnym. Znacznie wcześniej
bowiem, w dniach 18 – 20 czerwiec bieżącego roku, odbędzie się coroczna konferencja Europejskiego Stowarzyszenia Wydziałów Farmaceutycznych – EAFP (European
Association of Faculties of Pharmacy), w Oslo, a poświęcona będzie ona nowym zagadnieniom w szkoleniu podyplomowym farmaceutów. Informację na ten temat przedstawię
w kolejnym numerze naszego FPN.
A tymczasem, tradycyjnie, zachęcam Państwa do nieustawania w publikowaniu prac w Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym, dla dobra nas wszystkich – i czytelników i autorów.
Życząc fascynującej lektury oraz twórczego natchnienia;
serdecznie pozdrawiam.
Redaktor Naczelny
Prof. dr hab. n. med. Krystyna Olczyk
��
�
��
��
��
��
��
��
�
��
��
�
��
��
��
�
�� FACTS & FIGURES
��
��
��
��
��
��
��
��
�
��
��
��
��
��
�
��
��
��
��
��
��
��
��
��
A photo taken at the “That’s Enough!”
Pharmacy Demonstration on December 21,
��
2009 in Ankara, Turkey
��
(Courtesy of the Turkish Pharmacists
Association)
��
��
��
��
��
��
�
Register at www.fip.org/istanbul2009
�
��
��
��
��
��
��
�
��
��
��
�
��
��
�
��
��
��
�
��
��
��
�
��
��
��
�
��
��
�
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
�
�
�
�
�
�
��
�
Register at www.fip.org/istanbul2009
Farm Przegl Nauk, 2009,2, 7-13
przez Opolski Oddział NFZ w latach 2005 i 2006 u osób
powyżej 6-go roku życia objętych Podstawową Opieką Zdrowotną
An analysis of the refunded prescriptions for antibiotics by the
Department of National Foundation of Health, Region Opole
(Opolski Oddział NFZ), in the years of 2005 and 2006, in individuals
above 6-year of age, in the Primary Care settings (POZ)
Krystian Adamik1, Adam Tomczyk1, Robert Janiec2, Witold Lukas1, Witold Drzastwa1,
Elżbieta Mizgała1, Kazimierz Łukawiecki3, Roman Kolek3, Lech Panasiuk4
1
Katedra i Zakład Medycyny Rodzinnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego
2
Katedra Farmacji Społecznej, Zakład Farmakoekonomiki, Wydział Farmaceutyczny
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego
3
Opolski Odział Wojewódzki Narodowego Funduszu Zdrowia
4
Instytut Medycyny Wsi w Lublinie
Katedra i Zakład Medycyny Rodzinnej ŚUM – prof. dr hab. n. med. Witold Lukas
Wstęp. Nadużywanie antybiotyków w leczeniu ostrych
stanów zapalnych dróg oddechowych w POZ jest istotnym problemem zdrowia publicznego. Celem pracy
była analiza nawyków preskrypcyjnych lekarzy POZ
dotyczących antybiotyków w dwóch grupach wiekowych pacjentów: 7-65. i powyżej 65. r.ż. z uwzględnieniem klasyfikacji chemiczno-terapeutycznej oraz
porównanie ich w poszczególnych jednostkach administracyjnych województwa opolskiego w latach 2005
i 2006. Materiał i metody. Przeprowadzono analizę
702 417,35 zrefundowanych opakowań antybiotyków (332 263,57 w roku 2005 i 370 154.78 opakowań
w roku 2006) podzielonych na 14 grup chemiczno-terapeutycznych w określonych obszarach administracyjnych województwa opolskiego dotyczących dwóch
grup wiekowych pacjentów: 7-65. r.ż. i powyżej 65. roku
życia. Porównano nawyki preskrypcyjne lekarzy POZ pracujących w środowisku miejskim i pozamiejskim. Wyniki. W grupie wiekowej 7-65. r.ż najczęściej przepisywano
penicyliny o szerokim spektrum działania, cefalosporyny i ich pochodne oraz makrolidy a najrzadziej fluorochinolony, linkozamidy oraz połączenia sulfonamidów
z trimetoprimem. W grupie wiekowej powyżej 65. r.ż. dominują pochodne nitrofuranu oraz cefalosporyny i ich pochodne. Stwierdzono istotnie statystyczny wzrost średnich ilości
zrefundowanych opakowań antybiotyków, przypadających
na jednego podopiecznego w obu analizowanych grupach
wiekowych w 2006 w porównaniu do roku poprzedniego.
Omówienie wyników. Zwraca uwagę odmienność
profilu stosowanych antybiotyków w analizowanych
grupach wiekowych, zwiększanie się ilości przepisywanych antybiotyków na jednego mieszkańca oraz
różnice przepisywalności antybiotyków w powiecie
w porównaniu do miasta.
Wnioski. 1. W obserwowanym okresie 2005-2006
stwierdzono w województwie opolskim istotny wzrost
ilości przepisywanych opakowań antybiotyków przypadających na jednego mieszkańca. 2. Stwierdzono
znamiennie większą przepisywalność antybiotyków
w populacji osób powyżej 65. r.ż. w porównaniu do pacjentów z grupy 7-65. r.ż.. 3.Obserwowano odmienność
profilu stosowanych antybiotyków z dominacją pochodnych nitrofuranu, w grupie powyżej 65. r.ż. w porównaniu do grupy 7-65. r.ż..
Introduction. Overuse of antibiotics in treatment of the
acute inflammations of the respiratory tract, in the Primary Care settings (POZ), represents an important problem of the public health system. Objective. The purpose of this study was an analysis of the prescribing habits
of the Primary Care (POZ) physicians, related to the use
antibiotics in patients within the two age groups: 7-65
year-old and above 65 year-old, considering the ATC
(anatomical-therapeutic-chemical) classification (according to WHO), and their comparison in all the particular
administrative units of the region “opolskie”, in the year
of 2005 and 2006. Material and Methods. An analysis
of 702 417, 35 of the refunded boxes of antibiotics was
conducted (332 263, 57 boxes - in the year of 2005, and
370 154,78 boxes - in the year of 2006), divided into
14 ATC groups, according to the specific administrative units of the region “opolskie”, with relation to the
two age groups: 7-65 year-old and above 65 year-old.
Prescribing habits of Primary Care (POZ) physicians,
working in the urban settings vs. non- urban settings
(e.g.: suburban or rural) were compared. Results. In the
age group of 7-65 years, the most commonly prescribed
antibiotics included: penicillins with the broad spectrum
7
Farm Przegl Nauk, 2009,2
of action, cephalosporins and their derivatives, and macrolides. The least commonly prescribed antibiotics in
this group included: fluorochinolones, linkozamides,
and combinations of sulfonamides and trimethoprim. In
the age group above 65 years, the derivatives of nitrofurantoin, as well as cephalosporins and their derivatives
were predominant. A statistically significant increase
of the mean amount of the refunded boxes of antibiotics “per capita” in both of the analyzed age groups in
the year of 2006, in comparison with the previous year
was noted. Discussion. A different profile of the used
antibiotics in the analyzed age groups, an increase of
the amount of prescribed antibiotics “per capita”, and
differences in the pattern of prescribing antibiotics were
noted between urban vs. non- urban settings. Conclusions. 1.During the observed period 2005-2006, in the
„opolskie” region, a statistically significant increase of
the amount of prescribed boxes of antibiotics “per capi-
WSTĘP
Nadużywanie antybiotyków w leczeniu ostrych stanów zapalnych dróg oddechowych w POZ jest istotnym
problemem zdrowia publicznego. Antybiotyki stanowią
12% spośród wszystkich leków zlecanych przez lekarzy
POZ [1,2]. W porównaniu do całego systemu opieki zdrowotnej, ponad 80% terapii antybiotykowej jest zlecanych
w POZ, a nie ma wskazań do ich stosowania aż w 50%.
Systematyczny przegląd piśmiennictwa wskazuje na małą
skuteczność antybiotykoterapii w leczeniu stanów zapalnych dróg oddechowych. Jest to uzasadnione, ponieważ
przepisywanie antybiotyków w przypadku przeziębienia,
zapalenia gardła, ostrego zapalenia oskrzeli, biorąc pod
uwagę ich najczęstszą (70-80%) etiologię wirusową, daje
marginalne efekty lecznicze. Związek pomiędzy narastaniem oporności bakterii a nadmiernym stosowaniem antybiotyków jest dobrze udokumentowany [3,4,5]. Szczególnie ważnym problemem jest narastanie oporności bakterii
wskutek stosowania antybiotyków o szerokim spektrum
działania. Zgodnie z rekomendacjami europejskimi jak
i polskimi, antybiotyki o szerokim spektrum działania nie powinny być stosowane w POZ jako leki pierwszego rzutu [6].
Dobrze rozpoznany jest problem nadużywania antybiotyków
u niemowląt i małych dzieci do 6. roku życia oraz osób dorosłych w aspekcie następstw klinicznych wynikających
z nasilenia oporności, modyfikacji flory bakteryjnej oraz indukowania schorzeń alergicznych, natomiast zdecydowanie
mniej badań dotyczy przepisywania antybiotyków w wieku
podeszłym [3,4,5,]. Wpływ na podjęcie decyzji stosowania
antybiotyków u osób powyżej 65. r.ż. ma szereg czynników
w tym wielochorobowość, rodzaj schorzeń przewlekłych np.
cukrzyca typu 2, zaburzenia procesów poznawczych, oczekiwania rodzin i opiekunów czy też poczucie bezpieczeństwa lekarza leczącego. W USA, w krajach europejskich jak
również ostatnio w Polsce podjęto działania zmierzające do
racjonalizacji stosowania antybiotyków zarówno u dzieci
jak i dorosłych. Problemem otwartym jest skuteczność podejmowanych interwencji, czy to na szczeblu populacyjnym
czy w warunkach praktyki POZ. Dobrym przykładem w tej
8
ta” was found. 2. A considerable increase of the prescribing pattern of antibiotics in the population above 65
years, in comparison to patients from the age group of
7-65 years was also noted. 3. A different profile of the
used antibiotics, including a predominance of the nitrofurantoin derivatives, in the group above 65 years, in
comparison with the age group 7-65 years was observed
as well.
Słowa kluczowe:
Nawyki preskrypcyjne; wiek podeszły; lekarz rodzinny;
antybiotykoterapia; podstawowa opieka zdrowotna
Key words:
Prescription habits; alder people; family doctors; antibiotics therapy; primary care
dziedzinie są interwencje polegające na udostępnieniu lekarzom POZ szybkich testów bakteryjnych oraz testów bakteryjnych z równoczesnym oznaczaniem poziomu CRP, a także systematyczne szkolenia dotyczące zasad stosowania antybiotyków. Stałe monitorowanie nawyków preskrypcyjnych lekarzy
POZ może stanowić istotne źródło informacji o skuteczności
podejmowanych działań mających na celu poprawę w tym zakresie sytuacji w Polsce. Procesom tym powinno towarzyszyć
podnoszenie świadomości społeczeństwa na temat zagrożeń
związanych z niewłaściwym stosowaniem antybiotyków.
CELE PRACY
1. Analiza nawyków preskrypcyjnych antybiotyków
w dwóch grupach wiekowych: 7-65. i powyżej 65r.ż.
z uwzględnieniem klasyfikacji chemiczno-terapeutycznej.
2. Ocena wyników w poszczególnych jednostkach administracyjnych województwa opolskiego i ocena dynamiki
zmian ilościowych i jakościowych przepisywanych antybiotyków w latach 2005 i 2006.
3. Porównanie nawyków preskrypcyjnych lekarzy POZ
pracujących w środowisku miejskim i pozamiejskim
(podmiejskim i wiejskim).
MATERIAŁ I METODA
Przeprowadzono analizę danych udostępnionych
przez Opolski Oddział NFZ pochodzących z zestawień
refundacyjnych aptek otwartych z lat 2005 i 2006. Dane
zawierały zagregowane roczne ilości zrefundowanych
opakowań antybiotyków podzielonych na 14 grup chemiczno-terapeutycznych, z określonymi obszarami administracyjnymi miejsca realizacji recept z dokładnością do powiatu oraz określoną ilością zarejestrowanych
w POZ podopiecznych w dwóch grupach: 7-65. r.ż. i powyżej 65. roku życia. Podział na grupy wiekowe 0-6., 7-65.
i powyżej 65. wynikał z przyjętego przez NFZ systemu rozliczeniowego. Grupa pacjentów w wieku od 0 do 6. r.ż. była
poddana odrębnej analizie, której wyniki są przedstawione
w osobnej publikacji.
Powiaty województwa opolskiego różnią się między
sobą liczbą zarejestrowanych podopiecznych. Stwierdzono nieznaczny spadek liczby podopiecznych w analizowanych latach w obrębie tego samego powiatu. Celem
uniknięcia wpływu różnic w liczbie zarejestrowanych
podopiecznych w latach oraz różnic liczebności między
powiatami część analiz porównawczych przeprowadzono
zestawiając ilorazy rocznych ilości zrefundowanych opakowań antybiotyków i zarejestrowanych podopiecznych
w przeliczeniu na jeden statystyczny powiat. Dla porównania nawyków proskrypcyjnych lekarzy POZ pracujących
w środowisku miejskim i pozamiejskim wybrano miasto Opole i powiat opolski. Szczegółowej analizie poddano ponad 90% najczęściej refundowanych antybiotyków.
Ocenę uzyskanych danych przeprowadzono w oparciu
o statystykę opisową i wyznaczono wartości średnie. Ponadto dane poddano analizie wariancji (ANOVA/MANOVA),
a w przypadku ujawnienia znamiennych statystycznie efektów głównych, znamienność statystyczną różnic średnich
w grupach określono w trybie post hoc (test NIR). Celem
uzyskania odpowiedzi na pytanie czy istnieją różnice w nawykach preskrypcyjnych pomiędzy lekarzami pracującymi
w środowisku miejskim i pozamiejskim otrzymane dane
znormalizowano metodą unitaryzacji klasycznej zgodnie ze
wzorem:
00
xi – min(xi;xj)
xij=
0 max(xi;xj) – min(xi;xj)
(gdzie xij są elementami porównywanych zbiorów).
Wszystkie analizy statystyczne były przeprowadzane przy
użyciu komputerowego programu STATISTICA Wer.7.1,
StatSoft.
WYNIKI BADAŃ
Łącznie poddano analizie 702 417,35 opakowań antybiotyków (332 263,57 w roku 2005
i 370 154,78 opakowań w roku 2006). W grupie wiekowej 7-65 556 552,66 opakowań (262339,41 w roku
2005, 294 213,25 w roku 2006) oraz 145 865,69 opakowań (69924,16 rok 2005, 75941,53 rok 2006) w grupie
wiekowej powyżej 65. roku życia. Liczba osób w wieku
7-65 zaoptowanych na listach aktywnych POZ województwa opolskiego w roku 2005 wynosiła 734 405, a w 2006
727 768. W grupie powyżej 65. roku życia liczby te wynosiły odpowiednio 131 616 oraz 125 252.
Stwierdzono duże różnice w ilości opakowań poszczególnych analizowanych antybiotyków w grupach wiekowych (Ryc.1).
Celem określenia częstości przepisywania poszczególnych grup antybiotyków przeliczono ilość zrefundowanych opakowań na jednego podopiecznego. W grupie
wiekowej 7-65. r.ż. najczęściej przepisywano penicyliny
o szerokim spektrum działania nastepnie cefalosporyny
i ich pochodne (o 28 % mniej) oraz makrolity (mniej o 31%),
a najrzadziej fluorochinolony, linkozamidy oraz połączenia sulfonamidów z trimetoprimem (ponad 80% mniej).
W grupie wiekowej powyżej 65. r.ż. dominują pochodne nitrofuranu oraz cefalosporyny i ich pochodne. Zwraca uwagę
wysoka pozycja tetracyklin i fluorochinolonów. Najrzadziej
9
kowych stwierdzono różnice
w ich profilu. I tak w grupie
wiekowej powyżej 65. r.ż.
o 414% częściej przepisuje się pochodne nitrofuranu,
a o 326% fluorochinolony.
Wysoką pozycję zajmują też
cefalosporyny i tetracykliny,
natomiast penicyliny o szerokim spektrum działania są
o 31% rzadziej przepisywane
niż w młodszej grupie (Ryc. 2).
Stwierdzono istotnie statystyczny wzrost średnich ilości
zrefundowanych opakowań
antybiotyków,
przypadających na jednego podopiecznego w grupie wiekowej 7-65.
r.ż. we wszystkich powiatach
woj. opolskiego w 2006 w porównaniu do roku poprzedniego (p=0,017). Średnio w 2005
przypadało 0,36 opakowania
na jednego podopiecznego
a 2006 0,40 (Ryc.3).
Stwierdzono
również
istotnie statystyczny wzrost
średnich ilości zrefundowanych opakowań antybiotyków,
przypadających na jednego
podopiecznego u osób powyżej 65. roku życia we wszystkich powiatach woj. opolskie-
Tabela I. Ilość podopiecznych, średnia ilość opakowań na podopiecznego oraz różnica w latach 2005
i 2006 w powiatach woj. opolskiego w grupie wiekowej 7-65 r.ż.
Ilość podopiecznych
Ilość opakowań na podopiecznego
powiaty
2005
2006
2005
2006
Δ
Miasto Opole
89643
89052
0,32
0,36
0,04
Powiat opolski
84385
83835
0,38
0,41
0,03
Powiat strzelecki
52669
52366
0,38
0,43
0,04
Powiat prudnicki
41228
41142
0,43
0,43
0,00
Powiat kluczborski
51143
50412
0,34
0,36
0,02
Powiat kędzierzyńsko70744
70153
0,37
0,39
0,02
kozielski
Powiat głubczycki
36580
36175
0,40
0,51
0,11
Powiat brzeski
71164
70443
0,39
0,44
0,05
Powiat krapkowicki
47296
46957
0,34
0,41
0,07
Powiat namysłowski
32528
32297
0,29
0,35
0,05
Powiat nyski
111251
109540
0,35
0,42
0,07
Powiat oleski
45774
45396
0,28
0,34
0,06
Tabela II. Ilość podopiecznych, średnia ilość opakowań na podopiecznego oraz różnica w latach
2005 i 2006 w powiatach woj. opolskiego u osób wieku powyżej 65 r.ż.
Ilość podopiecznych
Ilość opakowań na podopiecznego
powiaty
2005
2006
2005
2006
Δ
Miasto Opole
15706
15001
0,41
0,58
0,17
Powiat opolski
15960
15207
0,59
0,70
0,12
Powiat strzelecki
9775
9304
0,54
0,58
0,04
Powiat prudnicki
8717
8337
0,55
0,58
0,03
Powiat kluczborski
8784
8316
0,57
0,59
0,03
Powiat kędzierzyńsko13105
12534
0,46
0,46
0,00
kozielski
Powiat głubczycki
6781
6393
0,58
0,76
0,18
Powiat brzeski
11901
11313
0,61
0,67
0,06
Powiat krapkowicki
7990
7605
0,46
0,53
0,07
Powiat namysłowski
5349
5060
0,41
0,54
0,13
Powiat nyski
19074
18076
0,49
0,64
0,15
Powiat oleski
8474
8106
0,58
0,59
0,01
gr.
7-65
Opole
miasto
Opole
powiat
Opole
miasto
gr.
pow.65 Opole
powiat
połączenia
sulfonamidów z
trimetoprimem i jego
poch.
linkozami-dy
fluorochinolony
pochodne nitrofuranu
‘05
‘06
‘05
‘06
‘05
‘06
‘05
‘06
‘05
‘06
‘05
‘06
‘05
‘06
‘05
‘06
‘05
‘06
56
51
58
68
70
77
38
40
37
44
19
31
14
17
8
11
8
8
85
82
77
82
59
60
43
48
38
46
22
31
13
16
12
15
12
10
36
34
58
68
70
77
38
40
37
44
88
142
14
17
7
10
8
8
69
61
77
82
59
60
43
48
38
46
103 166
13
16
8
11
12
10
z pośród szczegółowo analizowanych grup przepisywane
były linkozamidy i połączenia sulfonamidów z trimetoprimem (ponad 90% mniej). Porównując częstość przepisywania poszczególnych klas antybiotyków w grupach wie-
10
tetracykliny
połączenie penicyliny
z inhibitorami
b-laktazmy
makrolidy
cefalosporyny i ich
pochodne
penicyliny o szerokim
spektrum działania
Tabela III. Średnie ilości zrefundowanych opakowań antybiotyków w latach 2005 i 2006 w mieście Opole i powiecie opolskim na
jednego podopiecznego 7-65 r.ż. stanowiących ponad 90% wszystkich zrefundowanych antybiotyków (ilość opakowań/
ilość podopiecznych/rok [‰]).
go w 2006 w porównaniu do roku poprzedniego (p=0,014).
Średnio w 2005 przypadało 0,52 opakowania na jednego
podopiecznego a 2006 0,60 (Ryc.4).
Ponadto stwierdzono istotnie statystyczny wzrost przepisywalności antybiotyków w grupie osób powyżej 65. roku życia
w porównaniu do grupy z przedziału wiekowego 7-65. zarówno
w 2005 jak i 2006. Średnia ilość opakowań z dwóch lat
w grupie 7-65. wyniosła 0,38 opakowania, a w grupie osób
powyżej 65. wyniosła 0,56 opakowania średnio na rok
(p<0,00005).
Rozpatrując przyrosty preskrypcji antybiotyków w poszczególnych powiatach (Tab. I i Tab. II) stwierdzono, że
były one największe w głubczyckim, nyskim i krapkowickim, w obu grupach wiekowych.
W tabeli III przedstawiono porównanie średnich ilości opakowań w przeliczeniu na jednego podopiecznego
w roku, wyrażonej w promilach, zestawiając ilości zlecanych antybiotyków przez lekarzy pracujących w mieście
w porównaniu do ilości antybiotyków zlecanych przez lekarzy pracujących w środowisku pozamiejskim (podmiejskim
i wiejskim).
Analiza danych wykazała istotnie statystycznie większą
przepisywalność antybiotyków w powiecie w porównaniu
do miasta w obu grupach wiekowych (p=0,017).
DYSKUSJA
Nadkonsumpcja antybiotyków ma charakter powszechny nie tylko w krajach rozwijających się, ale tak że w krajach wysoko rozwiniętych. Przyczyny tego zjawiska są
złożone. Zastosowanie bądź zaniechanie preskrypcji antybiotyku zależy od relacji lekarz – pacjent, wieku oraz doświadczenia zawodowego lekarza, trudności diagnostycznych (infekcja wirusowa czy bakteryjna?), czynników
ekonomicznych, najczęściej nieuświadomionych nawyków
preskrypcyjnych lekarzy, konsekwencji prawnych wynikających z niezastosowania antybiotykoterapii [1,6,9].
Niewiele wiadomo dlaczego lekarze stosują antybiotyki
w określonych sytuacjach klinicznych i dlaczego preferują daną grupę antybiotyków [1,10]. Nadkonsumpcja
antybiotyków, w głównej mierze uzależniona jest od stosowania tych leków w stanach zapalnych dróg oddechowych których w 70-80% etiologia jest pochodzenia wirusowego. A zatem, antybiotykoterapia tych zakażeń nie
ma uzasadnienia merytorycznego [11]. Powyższe fakty
mają istotne znaczenie z tego powodu, ponieważ konsultacje pacjentów ze stanami zapalnymi górnych dróg oddechowych są jedną z najczęstszych przyczyn zgłaszalności
pacjentów do placówek POZ. Kelley i wsp. [6] wykazali że antybiotyki są przepisywane w 51% u pacjentów
z przeziębieniem, w 52% u chorych z zapaleniem gardła
i w 62% u pacjentów z zapaleniem oskrzeli. Należy również
podkreślić, iż w przypadku przedłużających infekcji wirusowych pojawiają się problemy nie będące przedmiotem aktualnych rekomendacji. Dotyczą one głównie pogarszania się
objawów klinicznych po siedmiu dniach trwania infekcji,
zwrócenia uwagi na fakt, iż te same objawy kliniczne mogą
powodować różne czynniki, a te same czynniki etiologiczne
mogą dawać odmienne obrazy kliniczne, obraz kliniczny spowodowany przez określony czynnik może się zmieniać wraz
z wiekiem, porą roku oraz położeniem geograficznym [12].
W niniejszej pracy przeprowadzona analiza nawyków
preskrypcyjnych lekarzy POZ dotyczyła tylko jednego wo-
jewództwa. Istnieją w piśmiennictwie opracowania dotyczące stosowania antybiotyków z terenu innych województw
w Polsce – województwa lubelskiego oraz podlaskiego,
jednakże analizowany tam materiał nie obejmował całości
populacji tych województw [13,14]. Województwo opolskie charakteryzuje się stosunkowo małą populacją (ok.
950 000 mieszkańców), sprawnie działającym systemem
rejestracji stosowanych leków, realizowanym przez Opolski Oddział Wojewódzki Narodowego Funduszu Zdrowia.
A zatem było możliwe dokonanie zbiorczej analizy przepisywanych antybiotyków przez wszystkich lekarzy POZ
w latach 2005 i 2006. System finansowania świadczeń warunkował podział na grupy wiekowe 0-6, 7-65 i powyżej
65. r.ż.. W związku z tym, że grupa 0-6 była przedmiotem
odrębnego opracowania, podjęto analizę pozostałych grup.
Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na istotnie statystyczny wzrost preskrypcji antybiotyków w 2006 roku
w porównaniu do 2005 w badanej populacji województwa
opolskiego. W 2005 roku przepisano 332 263,57 natomiast
w 2006 roku 370 154,78 opakowań. Podobne wyniki obserwuje się w innych krajach [1,6,9,11,15]. Nawyki preskrypcyjne lekarzy należy rozpatrywać również po uwzględnieniu wieku pacjenta. Specyficzne problemy dotyczą nadużywania antybiotyków u dzieci od 0-6 z uwagi na odległe
następstwa w późniejszym okresie życia [16,17,18]. Drugą
taką ważną grupą poza pacjentami w średnim wieku są pacjenci w wieku podeszłym. Istnieją doniesienia w piśmiennictwie mówiące o potrzebie racjonalizacji stosowania antybiotyków w tym szczególnym okresie życia [7,8,9,19].
W naszych badaniach stwierdzono istotnie statystycznie
większe zlecanie antybiotyków u osób powyżej 65. r.ż.
w porównaniu do grupy 7-65. r.ż. Zjawisko to ma charakter
narastający, ponieważ w roku 2006 w porównaniu do 2005
roku, obserwowano znamienny wzrost wskaźnika opakowań
przepisanych na jednego pacjenta w grupie powyżej 65. r.ż..
W badanym materiale zwraca uwagę odmienność profilu
stosowanych antybiotyków w grupie powyżej 65. r.ż., w porównaniu do grupy 7-65. r.ż. W grupie powyżej 65. r.ż. dominują pochodne nitrofuranu i cefalosporyny. Znaczący udział
pochodnych nitrofuranu może być uwarunkowany częstym
występowaniem różnorakich zaburzeń układu moczowego
u pacjentów w wieku podeszłym. Należy jednak podkreślić,
że jedynie 10% tych zaburzeń ma tło zapalne [20]. Można więc
przypuszczać, że w znacznym stopniu przepisywanie leków
z tej grupy jest nieuzasadnione. Z uwagi na wielochorobowość dotyczącą pacjentów tej grupy występowanie chorób
metabolicznych np. cukrzyca. Stosowanie cefalosporyn przez
lekarzy POZ może mieć swoje uzasadnienie w ich dotychczasowym doświadczeniu i nawykach proskrypcyjnych, a także charakteryzuje się większą skutecznością. Zwraca uwagę
stosunkowo duży udział tetracyklin u pacjentów w wieku
podeszłym. Przyczyną tego może być niski koszt, łatwość
dawkowania, wywiad w kierunku uczuleń na inne grupy antybiotyków, oraz postać recepturowa (np. maści). Z punktu
widzenia obowiązujących rekomendacji należało się spodziewać mniejszego udziału procentowego tej grupy leków
w profilu leków stosowanych przez lekarzy POZ. Mimo
wysokich kosztów zaobserwowano stosunkowo częste przepisywanie antybiotyków z grupy fluorochinolonów u osób
w wieku podeszłym. Podobne obserwacje poczynili inni au-
11
torzy [9]. Zjawisko to może być uzasadnione dobra skutecznością, tolerancją i bezpieczeństwem tych leków i ,przede
wszystkim, stanem klinicznym pacjenta.
W grupie 7-65 dominują penicyliny o szerokim spektrum działania, a makrolidy stosowane są na równi z cefalosporynami. Na dominację tej grupy penicylin mogły
mieć wpływ również dzieci i młodzież w wieku 7 -18 lat.
Niezależnie jednak od czynników wpływających na przedstawione nawyki preskrypcyjne w tej grupie chorych uderza fakt niezgodności z obowiązującymi rekomendacjami,
zwraca uwagę minimalny udział penicylin o wąskim spektrum działania i znacząca obecność makrolidów. Związek
pomiędzy narastaniem oporności bakterii a nadmiernym
stosowaniem antybiotyków jest dobrze udokumentowany
[3,4,5,6,8,9]. Wiąże się to zjawisko z selekcją opornych
szczepów bakteryjnych, co prowadzi do rozprzestrzenienia genów opornych poprzez przenoszenie na inne bakterie i redukuje skuteczność antybiotykoterapii [5]. Narastanie oporności bakterii stało się wyzwaniem dla zdrowia publicznego na całym świecie [8]. Należy podkreślić,
że oporność na antybiotyki narasta w alarmującym stopniu
zarówno w lecznictwie szpitalnym jak i otwartym. Badania
amerykańskie wskazują, że wrażliwość na penicyliny w latach 1994 -2000 zmalała z 76% do 66%, na erytromycynę
z 90% na 74%, a 1/3 izolatów pneumokoków jest niewrażliwa na penicyliny [6].
Analiza nawyków preskrypcyjnych powinna również uwzględnić miejsce funkcjonowania lekarza POZ.
Znaczenie dla podjęcia decyzji terapeutycznej i zastosowania antybiotyku może mieć różny dostęp w środowisku miejskim i pozamiejskim do ośrodków referencyjnych, nocnej i świątecznej ambulatoryjnej i wyjazdowej
opieki lekarskiej, dostęp do placówek POZ jak również
dostępność do różnego rodzaju zdarzeń edukacyjnych.
W badanym materiale stwierdzono znamiennie częstsze
przepisywanie antybiotyków przez lekarzy pracujących
w ośrodkach pozamiejskich w porównaniu do lekarzy zatrudnionych na terenie miasta.
Podsumowując, zaletą przedstawianej analizy była możliwość korzystania z kompletnej, elektronicznej bazy obejmującej wszystkie zrealizowane zlecenia na antybiotyki
w aptekach województwa opolskiego. Ponadto możliwe było
zidentyfikowanie miejsca działalności świadczeniodawcy
– powiat, środowisko miejskie i pozamiejskie. Ograniczeniem był brak dostępu do danych klinicznych pacjenta, stosunkowo szeroki podział grup wiekowych determinowany
systemem finansowania.
Niezależnie od kampanii prowadzonych przez media
medyczne, jak i instytucje publiczne, na rzecz ograniczania
stosowania antybiotyków lekarze POZ nadal nie dysponują
odpowiednimi narzędziami sprzyjającymi racjonalizacji leczenia stanów zapalnych. Przede wszystkim, konieczny jest
szybki i szeroki dostęp do systematycznie aktualizowanych
rekomendacji, umożliwienie stosowania szybkich testów
bakteryjnych oraz łatwiejszego korzystania z szerokiej diagnostyki mikrobiologicznej. Ważne jest szkolenie w zakresie
zasad antybiotykoterapii lekarzy i pielęgniarek, jak również
wdrażanie strategii polegającej na podnoszeniu świadomości
zdrowotnej pacjentów, zachęcanie ich do współuczestniczenia
w procesie podejmowania decyzji terapeutycznej. Szczegól-
12
nie ważnym dla lekarza POZ jest poświęcenie odpowiedniej
ilości czasu podczas konsultacji lekarskiej na przekonanie
pacjenta o nieskuteczności stosowania terapii antybiotykowej w przypadku infekcji wirusowej. Kluczową rolę
w odwróceniu trendu nadkonsumpcji antybiotyków powinni spełnić lekarze POZ a przede wszystkim lekarze
rodzinni.
WNIOSKI
1. W obserwowanym okresie 2005-2006 stwierdzono w województwie opolskim istotny wzrost ilości przepisywanych opakowań antybiotyków przypadających na jednego mieszkańca.
2. Stwierdzono znamiennie większą przepisywalność antybiotyków w populacji osób powyżej 65. r.ż. w porównaniu do pacjentów z grupy 7-65. r.ż..
3. Obserwowano odmienność profilu stosowanych antybiotyków z dominacją pochodnych nitrofuranu, w grupie
powyżej 65. r.ż. w porównaniu do grupy 7-65. r.ż..
Piśmiennictwo
1. Wood F., Simpson S., Butler C.C.:Socially responsible
antibiotic choices in primary care: a qualitative study
of GPs’ decisions to prescribe broad-spectrum and
fluroquinolone antibiotics. Family Practice 2007;24,
427-434.
2. Wise R, Hart T, Cars O et al. Antimicrobial resistance: is
a major threat to public health. BMJ 1998 17:609-610
3. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumonia in the United States.N Engl J Med.
2000,343,1917-1924.
4. Hyde TB, Gay K, Stephens DS, et al. Macrolide resistance among invasive Streptococcus isolates. JAMA.
2001,286,1857-1862.
5. Jackson C. i wsp.: Promoting adherence to antibiotics: A
test of implementation intentions. Patient Education and
Counseling 2006;61, 212-218.
6. Kelley M. Feasibility of a Primary Care Intervention to
Decrease Oral Antibiotics for Acute Upper Respiratory
Tract Infections: A Pilot Study.NC Med J 2006;67,4,
249-254.
7. Veyssier P. Antibiotic therapy in the elderly [Antibiotherapie chez le sujet age].Rev Prat 2003;53(14)
1566-71.
8. Crigger N.J. I wsp.: Development of the choices and
acquisition of antibiotics model from a descriptive study
of a lay Honduran population. Int J Nurs Stud 2004;41,
745-53.
9. Mazzaglia G., Caputi A.P., Rossi A., Bettoncelli G.,
Stefanini G., Ventriglia G., Nardi R., Brignoli O., Cridelli C.: Exploring patient- and doctor-related variables associated with antibiotic prescribing for respiratory infections in primare care.Eur J Clin Pharmacol
2003;59,651-657.
10.Bradley CP, Decision making and prescribing pattern-a
literature review. Fam Pract 1991;8:276-287.
11.Hrissos S., Eccles M., Johnston M., Francis J., Kaner
E.F.S., Steen N., Grimshaw J. An intervention modeling
experiment to change GPs’ intentions to implement evidence-based practice: using theory-based interventions
to promote GP management of upper respiratory tract
infection without prescribing antibiotics.BMC Health
Services Research 2008;8:10 doi:10.1186/1472-69638-10.
12.Dosh S. Antibiotics for upper respiratory infections. Letters to the Editor.J Fam Med 2000;49,(10).
13.Panasiuk L.,Lukas W. Paprzycki P.:Empirical firstline antibioticotherapy In adult rural patients with
acute respiratory tract infections.AAEM 2007; 14,
159-167.
14.Chlabicz S., Ołtarzewska A.M. Pytel-Krolczuk B.:Respiratory tract infections:diagnosis and use of antibiotics
by family physicians in north-eastern Poland.Int J Antimicrob Agents 2004;23, 446-450.
15.Sahlan S. I wsp.: Reducing unnecessary prescriptions of
antibiotics for acute cough: adaptation of a leaflet aimed
at Turkish immigrants in Germany.BMC Family Practice
2008; 9:57, 1-7.
16.Guarner F., Malagelada J.R. Gut flora in health and disease. Lancet 2003,361,512- 519.
17.San Joaquin VH, Stull TL: Antibacterial agents in pediatrics. Infect Dis Clin North Am 2000,14,341-355.
18. Kozyrskyj A.L., Ernst P., Becker A.B.: Increased risk of
childhood asthma from antibiotic use in early life. Chest
2007,131,1753-9
19.Lacey D.:Tube feeding, antibiotics, and hospitalization
of nursing home residents with end-stage dementia:Prescription of key medical decision-makers. Am J Alzheimers Dis Other Demen 2005; 20(4) 211-9.
20.Walker S. I wsp.: Why are antibiotics prescribed for
asymptomatic bacteriuria in institutionalized elderly people? CMAJ 2000;163(3), 273-277.
Adres do korespondencji:
Krystian Adamik
ul. 3-go Maja13-15; 41-800 Zabrze
Tel. 32/271 91 22
E – mail: [email protected]
13
Dominik Kołodziej, Dorota Jabłecka, Dominika Grigier, Dominika Drużba
Katedra i Zakład Toksykologii
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Sosnowcu
Kierownik placówki: Prof. dr hab. Jerzy Kwapuliński
Streszczenie
Cukrzyca jako zaburzenie metaboliczne o wieloczynnikowej etiologii, charakteryzuje się przewlekłą hiperglikemią oraz towarzyszącymi zaburzeniami gospodarki
węglowodanowej, lipidowej i białkowej wynikającymi
z zaburzeń wydzielania insuliny i/lub defektu jej działania w poszczególnych tkankach. Cukrzyca typu 2
jest następstwem interakcji czynników genetycznych
i środowiskowych, prowadzących do defektów sekrecji
i działania insuliny. Patogeneza cukrzycy typu 2 jest kompleksowa i nie do końca wyjaśniona, jednakże głównym
czynnikiem etiologicznym jest oporność komórek na endogenna insulinę. Poważnym problemem osób chorych
na cukrzycę jest zwiększone ryzyko powikłań w postaci
mikroangiopatii (retinopatie i nefropatie) oraz makroangiopatii wpływające na skrócenie średniego czasu życia
w porównaniu do populacji ogólnej. Nie bez znaczenia
pozostaje również spadek jakości życia osób chorych na
cukrzycę. Liczba chorych cierpiących z powodu cukrzycy systematycznie rośnie. Przewiduje się iż w 2030 roku
na cukrzycę będzie chorowało 4,4% ludności świata.
W pracy przedstawiono aktualne standardy i leki stosowane w leczeniu cukrzycy typu 2.
Słowa kluczowe: cukrzyca, powikłania naczyniowe, doustne leki przeciwcukrzycowe
Summary
Diabetes, as a functional disorder of multiple-factor
aetiology, is characterised by a chronic hyperglycaemia
and the accompanying carbohydrate, protein and lipid
metabolism disorders resulting from aberration in the
secretion of insulin and/or its dysfunction in individual
tissues. Type 2 diabetes is a consequence of interaction
of genetic and environmental factors, leading to defects
in the secretion and action of insulin. The pathogenesis of
type 2 diabetes is complex and still not fully explained.
Nevertheless, cell resistance to the endogenous insulin
(insuline resistance, IR) seems to be the major factor. The
increased risk of complications such as microangiopathy
(retinopathies and nephropathies) or macroangiopathy,
lowering the life expectance in relation to the general population, is a serious problem of people suffering from
type 2 diabetes. The reduction in the quality of life of
people with diabetes is significant as well. The number
of people affected by diabetes increases systematically.
It is expected that in 2030, 4,4 % of world’s population
will be suffering from diabetes. The work presents the
current standards and drugs used in the treatment of type
2 diabetes.
Key words: diabetes, vascular complications, oral antidiabetic drugs
Cukrzyca (diabetes mellitus), czyli zespół zaburzeń polegających na nieprawidłowej regulacji metabolizmu węglowodanów, lipidów i białek z powodu upośledzenia wydzielania insuliny i/lub spadku wrażliwości tkanek obwodowych
na insulinę, staje się coraz częściej diagnozowaną jednostką
chorobową, zarówno w Polsce jak i na świecie.
Z roku na rok liczba chorych na cukrzycę systematycznie rośnie. W 1994 roku w Polsce zdiagnozowano 775 tysięcy przypadków cukrzycy typu 2, a w roku 2000 już 1 147
tysięcy. Szacuje się, iż w 2010 roku na cukrzycę typu 2
w Polsce będzie chorowało 1 519 tysięcy osób. Biorąc
pod uwagę powyższe dane, można stwierdzić, iż cukrzyca,
w tym szczególnie cukrzyca typu 2, jest jednym z głównych
problemów zdrowotnych początku XXl wieku.
Cukrzyca typu 2 (dawniej nazywana insulinoniezależną) to najczęstsza postać cukrzycy występująca u 85-90 %
wszystkich chorych. Do rozwoju cukrzycy przyczyniają się
zarówno predyspozycje genetyczne, jak i czynniki środowiskowe (mała aktywność fizyczna, zbyt duża podaż kalorii,
przewlekły stres, depresja, nadużywanie alkoholu i nikotynizm).
Do najważniejszych czynników patogenetycznych cukrzycy typu 2 zalicza się dysfunkcję komórek β trzustki oraz
insulinooporność, jednakże zakres ich występowania może
znacznie różnić się u poszczególnych chorych.
Rozwój naturalny cukrzycy przedstawia schemat na sąsiedniej stronie.
Do tej pory nie udało się jednoznacznie stwierdzić co
jest głównym czynnikiem indukującym rozwój cukrzycy.
Powyższy wykres pokazuje jednak, iż insulinooporność
rozwija się podczas całego życia, natomiast wzrost ten
nie jest jednoznaczny z wystąpieniem objawów cukrzycy
z uwagi na mechanizmy kompensacyjne w postaci zwiększonej produkcji insuliny w komórkach β trzustki. Dopiero
spadek insulinosekrecji, spowodowany dysfunkcją komórek
β, prowadzi do wystąpienia nieprawidłowego stężenia glu-
Patogezeza
Cukrzyca, ze względu na wieloczynnikową etiologię
oraz zróżnicowany przebieg nie jest chorobą jednolitą.
Współczesny podział obejmuje cukrzycę typu 1, typu 2 oraz
określone, specyficzne typy cukrzycy (np. cukrzyca ciężarnych).
14
Oznaczanie wartości HbA1c nie powinno być wykorzystywane jako metoda diagnostyczna, a jedynie jako wskaźnik wyrównania
metabolicznego w cukrzycy.
Nie powinno się prowadzić diagnostyki stanów hiperglikemicznych u pacjentów w ostrej
fazie choroby zapalnej, po urazie, po zabiegu
operacyjnym lub w okresie krótkotrwałego stosowania leków zwiększających stężenie glukozy we krwi.
Według Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego prawidłowo leczony chory na cukrzycę powinien mieć dobrze wyrównaną zarówno glikemię, jak i ciśnienie tętnicze oraz
profil lipidowy. O ile to możliwe, w trakcie
leczenia należy dążyć do następujących wartości:
kozy na czczo (glikemia na czczo w granicach 100 – 125 mg/
dl) oraz zaburzonej tolerancji glukozy (glikemia 2 godziny
po doustnym obciążeniu 75g glukozy w przedziale 140 – 199
mg/dl), a z upływem czasu do pełnoobjawowej cukrzycy.
Uważa się, że insulinooporność może mieć charakter
przedreceptorowy (przyspieszony metabolizm insuliny,
synteza insuliny o nieprawidłowej budowie), receptorowy (nieprawidłowy receptor insulinowy oraz zmniejszenie
liczby receptorów w organizmie) i poreceptorowy (mutacja
genów białek odpowiedzialnych za wewnątrzkomórkową
transmisję sygnału pobudzenia receptora oraz dysfunkcja
transporterów glukozy – głównie GLUT4). Na skutek rozwoju insulinooporności w wątrobie dochodzi do wzrostu
glukoneogenezy, w mięśniach szkieletowych do spadku
wychwytu i zużycia glukozy, a w adipocytach do nasilenia
lipolizy. Wywołaną insulinoopornością, długotrwale utrzymującą się wtórną hiperinsulinomię uważa się za jeden
z najważniejszych czynników zwiększających ryzyko wystąpienia powikłań cukrzycowych dotyczących zarówno
dużych naczyń (makroangiopatie) jak i retino i nefropatii
(mikroangiopatie).
Dysfunkcja komórek β rozwija się w wyniku toksycznego działania glukozy (glukotoksyczność) oraz wolnych
kwasów tłuszczowych (lipotoksyczność), które powodują
nasiloną apoptozę i przyczyniają się do wyeksploatowania
komórek β oraz spadku ich masy. Słabo rozwinięty system
antyoksydacyjny komórek β czyni je bardzo podatnymi na
stres oksydacyjny występujący zarówno podczas ostrej, jak
i przewlekłej hiperglikemii.
Rozpoznanie i kryteria wyrównania
Diagnozę cukrzycy można postawić posługując się trzema równorzędnymi kryteriami:
• Obecność typowych objawów cukrzycy (wielomocz,
polidypsja, osłabienie) połączone z glikemią przygodną oznaczoną o dowolnej porze, niezależnie od posiłku,
wynoszącą co najmniej 200 mg/dl
• Glikemia na czczo – dwukrotne stwierdzenie wartości
wynoszącej co najmniej 126 mg/dl
• Glikemia przekraczająca 200 mg/dl po upływie 2 godzin,
w doustnym teście tolerancji glukozy (OGTT)
1.
Glikemia
*glikemia na czczo w osoczu żylnym < 110 mg/dl
*glikemia na czczo podczas samokontroli < 70-90 mg/dl
*HbA1c poniżej 6,1 – 6,5 %
2. Ciśnienie tętnicze
U chorych na cukrzycę (z uwagi na to, że cukrzyca
jest jednym z niezależnych czynników ryzyka choroby
niedokrwiennej serca) obowiązują bardziej rygorystyczne
kryteria wyrównania wynoszące 130/80 mm Hg.
3. Gospodarka lipidowa
*cholesterol całkowity < 175 mg/dl
*LDL < 100 mg/dl
*HDL > 40 mg/dl dla mężczyzn i >50 mg/dl dla kobiet
*TG < 150 mg/dl
Ażeby móc osiągnąć powyższe kryteria wyrównania
pacjent chory na cukrzycę typu 2 poza leczeniem niefarmakologicznym najczęściej musi przyjmować leki z grupy
hipotensyjnych, przeciwcukrzycowych, hipolipemicznych,
a czasami również innych (np. przy współistniejącej chorobie wieńcowej). Poniżej zostaną omówione leki obecnie
stosowane do wyrównania glikemii oraz zapobiegania powikłaniom narządowym u pacjentów z cukrzycą typu 2.
Leczenie – doustne leki przeciwcukrzycowe
1.
Biguanidy
Biguanidy są pochodnymi guanidyny, związku występującego naturalnie w nasionach rutwicy lekarskiej (Galega officinalis). Pierwsze próby zastosowania tej grupy związków
do leczenia hipoglikemizującego sięgają lat 30 XX wieku,
jednakże ze względu na działania niepożądane dopiero
wprowadzenie fenforminy, a później metforminy umożliwiło ich bezpieczne stosowanie u chorych na cukrzycę.
Mechanizm działania metforminy jest złożony, a niektóre właściwości farmakodynamiczne nie zostały w pełni
15
wyjaśnione. Biguanidy zmieniają potencjał elektrostatyczny
błony mitochondrialnej, co prowadzi do zmniejszenia stężenia ATP, a tym samym wpływa na hamowanie glukoneogenezy wątrobowej, nasilenie glikolizy beztlenowej w tkankach obwodowych oraz hamowanie wchłaniania jelitowego
glukozy, witaminy B12, kwasu foliowego i aminokwasów.
Metformina zwiększa wrażliwość na insulinę zarówno hepatocytów, jak i mięśni szkieletowych, nie wpływając przy
tym na wydzielanie insuliny. Dodatkowo wykazano korzystne działanie metforminy na przemianę lipidową (obniżanie
stężenia tri glicerydów, VLDL i LDL przy jednoczesnym
niewielkim wzroście HDL) oraz na właściwości reologiczne
krwi (hamowanie agregacji płytek krwi oraz nasilenie fibrynolizy).
Biodostępność dla organizmu preparatów metforminy
wynosi 50 – 60%. Po podaniu doustnym biguanidy wchłaniają się w dwunastnicy oraz początkowym odcinku jelita
cienkiego. Maksymalne stężenie w osoczu występuje po
2-3 godzinach po zażyciu, przy czym pokarm może opóźnić
wchłanianie.
Biguanidy mogą być stosowane w monoterapii lub
w terapii skojarzonej z pochodnymi sulfonylomocznika, glinidami lub z insuliną.
Po zastosowaniu biguanidów działania niepożądane obserwuje się u około 20 – 30% chorych. Do najczęstszych
działań niepożądanych należą dolegliwości żołądkowo-jelitowe (suchość w jamie ustnej, uczucie metalicznego smaku,
brak apetytu, nudności, wzdęcia, biegunka lub zaparcia).
W większości przypadków objawy te są przemijające,
a dodatkowo można je ograniczyć poprzez stopniowe zwiększanie dawki leku. Z innych działań niepożądanych należy
wymienić zaburzenia wchłaniania witaminy B12 i kwasu foliowego, co może prowadzić do niedokrwistości oraz kwasicę mleczanową występującą jednak bardzo rzadko, a wynikającą głównie ze współistnienia innych schorzeń u chorego
na cukrzycę (niewydolność nerek, wątroby czy też wstrząs
kardiogenny lub septyczny).
Przeciwwskazaniem do stosowania metforminy jest
uczulenie na biguanidy, wiek powyżej 75. lat, obecność
ostrych powikłań cukrzycy, niewydolność wątroby, ostre
infekcje ciężkiego stopnia, okres okołooperacyjny, niewydolność nerek oraz ciąża i laktacja.
2.
Pochodne sulfonylomocznika
Pochodne sulfonylomocznika są sulfonamidami o ogólnym wzorze chemicznym R1-SO2NHOCNH-R2. Pierwsza generacja pochodnych sulfonylomocznika (tolbutamid,
chlorpropamid) posiada na końcu R1 pierścień fenolowy,
a na końcu R2 pierścień alifatyczny. W przypadku pochodnych sulfonylomocznika drugiej generacji (glibenklamid,
gliklazyd, glipizyd i glimepiryd) zarówno podstawnik R1
jak i R2 posiadają pierścienie aromatyczne. Poprzez zastą-
16
pienie alifatycznego podstawnika R2 ugrupowaniem aromatycznym zwiększono swoistość wiązania pochodnych
sulfonylomocznika z receptorem SUR kanału potasowego
w komórkach β oraz siłę działania.
Pochodne sulfonylomocznika działają hipoglikemizująco poprzez zwiększanie wydzielania insuliny przez komórki
β trzustki. Zwiększone wydzielanie insuliny jest wynikiem
pobudzenia receptorów SUR1 (podjednostek kanałów potasowych komórek β trzustki), co skutkuje zamknięciem kanałów potasowych, depolaryzacją błony komórkowej, która
z kolei wywołuje otwarcie bramkowanych napięciem kanałów wapniowych. Napływ jonów wapnia do komórki wyzwala wydzielanie insuliny z ziarnistości wydzielniczych.
Poza wspólnym dla pochodnych sulfonylomocznika wpływem na komórki β, wykazują one szereg specyficznych
działań pozatrzustkowych, różnie wyrażonych w przypadku
poszczególnych pochodnych. Do najważniejszych należy
tutaj: zwiększanie glikolizy, lipogenezy oraz wątrobowej
syntezy glikogenu, zmniejszanie glukoneogenezy oraz utleniania kwasów tłuszczowych. W mięśniach szkieletowych
powodują zwiększanie transportu glukozy oraz stymulują
syntezę glikogenu. W przypadku niektórych pochodnych
sulfonylomocznika (gliklazyd) opisuje się również działanie
antyoksydacyjne.
Aktualnie dostępne na rynku pochodne sulfonylomocznika drugiej generacji mimo wspólnego mechanizmu działania na receptor SUR, różnią się pod względem niektórych
właściwości farmakokinetycznych.
Glipizyd jest szybko działającą pochodną sulfonylomocznika. Godzinę po podaniu osiąga maksymalne stężenie
w osoczu. Jednocześnie przy czasie półtrwania wynoszącym
7 godzin, glipizyd klasyfikuje się jako lek krótkodziałający. W celu umożliwienia podawania glipizydu raz na dobę,
a więc zagwarantowania wygodnego dla pacjentów dawkowania, stworzono postać z przedłużonym uwalnianiem
– glipizyd GITS. System GITS oparty jest na 2 warstwach:
pierwszej nieprzepuszczalnej dla wody, posiadającej jedynie jeden mikroskopijny otwór wykonany promieniem laserowym oraz drugiej, złożonej głównie z tlenku polietylenu. Wewnętrzna warstwa tabletki chłonąc wodę pęcznieje,
powodując wypychanie rozpuszczonej substancji czynnej
przez mikroskopijny otwór, zapewniając stałe stężenie leku
w surowicy. Z działań pozatrzustkowych glipizydu wymienić należy: poprawę parametrów krzepnięcia krwi oraz
korzystny wpływ na profil lipidowy chorych na cukrzycę.
Dawkowanie glipizydu GITS wynosi 5 – 10 mg na dobę.
Gliklazyd charakteryzuje się podwójnym działaniem:
metabolicznym i naczyniowym. Oprócz wpływu na komórki β zmniejsza adhezję i agregację płytek, poprawia funkcję
wydzielniczą śródbłonka oraz wykazuje właściwości antyoksydacyjne. Maksymalne stężenie w osoczu osiąga po
2 – 6 godzinach, a okres połowicznego wydalania wynosi 12
godzin. W celu zmniejszenia skutecznej dawki gliklazydu
oraz zapewnienia optymalnego, dobowego profilu farmakokinetycznego powstała forma gliklazydu MR. Oparta jest
ona na hydrofilnej macierzy, która chłonąc wodę przechodzi w stan żelu, z którego w sposób kontrolowany uwalnia
się substancja czynna. Gliklazyd MR podawany jest raz na
dobę w dawce 30 -120 mg.
Glimepiryd to pochodna sulfonylomocznika drugiej ge-
neracji, posiadająca aktywny hipoglikemicznie metabolit.
Dzięki temu może być stosowany raz na dobę bez konieczności modyfikacji budowy tabletki. Maksymalne stężenie
w surowicy osiąga 2,5 godziny po podaniu, a okres półtrwania wynosi 5 – 8 godzin. Glimepiryd działa również obwodowo zmniejszając insulinooporność. Stosowany jest raz na
dobę w dawce 1 – 6 mg.
Po zastosowaniu pochodnych sulfonylomocznika mogą
wystąpić działania niepożądane
w postaci: hipoglikemii, zmian w obrazie szpiku kostnego, zmian skórnych, zaburzeń czynności wątroby.
Nie należy stosować pochodnych sulfonylomocznika
w przypadku nadwrażliwości na dany preparat, kwasicy ketonowej, stanów przedśpiączkowych oraz ciąży.
3.
Inhibitory α-glukozydazy
Inhibitory α-glukozydazy to związki chemiczne posiadające w swojej strukturze aminocukier, który z powodu wiązania C-N nie może ulec enzymatycznej hydrolizie przez
α-glukozydazy. Najlepiej poznanym lekiem z tej grupy jest
pseudotetrasacharyd – akarboza.
Mechanizm działania akarbozy polega na kompetycyjnym blokowaniu α-glukozydazy, jednego z enzymów
znajdujących się w rąbku szczoteczkowatym kosmków jelita cienkiego. α-glukozydazy rozkładają oligosacharydy
do monosacharydów, które ulegają wchłanianiu. Na skutek
zablokowania α-glukozydazy dochodzi do spowolnienia
rozkładu węglowodanów, które przesuwają się do dalszej
części jelita, gdzie są powoli wchłaniane. W ten sposób
praktycznie nie wchłaniana do organizmu akarboza (1 – 2%)
przyczynia się do „spłaszczenia” krzywej glikemii po przyjęciu posiłku węglowodanowego.
Akarboza jest lekiem słabszym od pochodnych sulfonylomocznika, metforminy czy tiazolidinedionów. Wskazana
jest do leczenia cukrzycy typu 2 w początkowych stadiach,
w terapii złożonej z innymi doustnymi lekami przeciwcukrzycowymi, a także insuliną.
Głównym działaniem niepożądanym akarbozy, wynikającym z jej mechanizmu działania, są zaburzenia ze strony
przewodu pokarmowego, spowodowane nadmierną fermentacją w jelitach. U 35 – 50% chorych leczonych akarbozą
może się to manifestować wzdęciami, biegunką, uczuciem
przelewania w jamie brzusznej a czasem również bólem.
Przeciwwskazaniem do stosowania akarbozy jest zespół
upośledzonego wchłaniania, stany zapalne jelit, niewydolność wątroby oraz stany zaawansowanych zaparć.
Akarbozę powinno się podawać w dawkach podzielonych (3 razy dziennie) 25 - 100 mg.
4.
Tiazolidinediony (glitazony)
Tiazolidinediony zbudowane są z pierścienia tiazolidyno-2,4-dionowego oraz łańcuchów bocznych, charakterystycznych dla poszczególnych leków. Pierwszym lekiem
z grupy glitazonów był troglitazon, a następnie zostały
wprowadzone rozyglitazon i pioglitazon.
Mechanizm działania glitazonów jest związany z oddziaływaniem na jądrowe receptory aktywujące proliferację
peroksysomów (określane jako PPAR), pełniących w orga-
nizmie funkcję czynników transkrypcyjnych. Konsekwencją interakcji tiazolidinedionów z PPARγ (izoforma występująca głównie w tkance tłuszczowej) jest zmiana ekspresji
ponad 100 różnych genów, w tym regulujących wychwyt,
magazynowanie i metabolizm lipidów, wychwyt i zużywanie glukozy, a także ekspresję adiponektyny, IL-6 i TNF-α.
W odróżnieniu od doustnych leków przeciwcukrzycowych
z grupy pochodnych sulfonylomocznika glitazony nie
zwiększają wydzielania insuliny i nie powodują występowania hipoglikemii. Glitazony zmniejszają wytwarzanie glukozy w wątrobie oraz uczulają tkanki na działanie insuliny.
Ponadto zwiększają zużycie glukozy w mięśniach i innych
tkankach. TZD wpływają również na profil lipidowy, przy
czym wpływ ten różnie zaznacza się w przypadku poszczególnych leków. Coraz liczniejsze obserwacje sugerują, że
TZD mogą wywierać ochronny wpływ na strukturę i funkcję komórek β trzustki.
Obecnie w Polsce stosuje się tylko rozyglitazon, który
działa ok. 100 razy silniej od troglitazonu. Maksymalne stężenie we krwi, po podaniu doustnym występuje po 1,75 h.
Czas połowicznej eliminacji jest długi i wynosi 103 – 158 h.
Rozyglitazon może być stosowany zarówno w monoterapii
jak i terapii dwu, trzylejkowej z metforminą oraz pochodnymi sulfonylomocznika.
Najczęstszymi działaniami niepożądanymi tej grupy leków są obrzęki, anemia oraz przyrost masy ciała. W ostatnim czasie pojawiły się kontrowersyjne doniesienia dotyczące negatywnych skutków działania TZD na układ krążenia oraz możliwość wywoływania obrzęku plamki żółtej,
jednak ażeby wyciągnąć jednoznaczne wnioski potrzebne są
dalsze obserwacje.
Przeciwwskazaniem do stosowania glitazonów jest
niewydolność krążenia w każdej klasie oraz niewydolność
wątroby. Leku nie wolno podawać kobietom w ciąży oraz
w okresie karmienia.
5.
Glinidy
Glinidy to pochodne kwasu karbamoilometylobenzoesowego, będące analogami meglitynidu. Stanowią nową grupę
krótkodziałających stymulatorów wydzielania endogennej insuliny przez komórki β trzustki. Do obecnie dostępnych na rynku pochodnych meglitynidu należą: repaglinid oraz nateglinid.
Mechanizm działania glinidów jest częściowo podobny
do mechanizmu działania pochodnych sulfonylomocznika.
Wiążąc się z zależnymi od ATP receptoremi kanałów potasowych (innym niż w przypadku pochodnych sulfonylomocznika) powodują zamknięcie tych kanałów. Prowadzi
to do depolaryzacji błony komórkowej, następstwem czego
jest otwarcie potencjałozależnych kanałów wapniowych.
Napływ jonów wapnia do komórki stymuluje wydzielanie
insuliny na drodze egzocytozy. Glinidy zaliczane są do leków regulujących glikemię spowodowaną spożyciem posiłku, a stymulacja wydzielania insuliny odbywa się w sposób
zależny od stężenia glukozy. Glinidy są lekami bezpiecznymi, nie powodują hiperinsulinomii i hiperglikemii.
Glinidy po podaniu doustnym przed posiłkiem wchłaniają się szybko, osiągając maksymalne stężenie w osoczu
po ok. 1 godzinie. Okres połowicznej eliminacji z osocza
wynosi również ok. 1 h.
17
Pochodne glinidów można stosować zarówno w monoterapii, jak i leczeniu skojarzonym.
Działania niepożądane glinidów są rzadkie a obejmują:
hipoglikemię, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, zaburzenia ze
strony skóry i tkanki podskórnej, przejściowe zaburzenia widzenia oraz wzrost stężenia kwasu moczowego w surowicy.
Przeciwwskazaniem do stosowania glinidów jest nadwrażliwość na preparat z tej grupy, zaburzenia czynności
wątroby ciężkiego stopnia oraz ciąża i laktacja.
6.
Syntetyczne analogi hormonów jelitowych
Najnowszą grupą leków stosowanych do leczenia cukrzycy typu 2 stanowią inkretynomimetyki, których przedstawicielem jest eksenatyd. Związek ten jest syntetycznym
agonistą receptora glukagonopodobnego peptydu 1 (GLP-1),
odpornym na działanie dipeptydylopeptydazy lV (DPP lV
- enzymu rozkładającego peptydy jelitowe).
GIP oraz GLP-1 (glukagonopodobny peptyd 1) są naturalnymi hormonami inkretynowymi występującymi
w organizmie człowieka. GLP-1 syntetyzowany jest głównie przez komórki L jelita krętego i okrężnicy w odpowiedzi
na bodziec glikemiczny. Odpowiedzialny jest za stymulację wydzielania insuliny i supresję wydzielania glukagonu,
ponadto opóźnia opróżnianie żołądka oraz zmniejsza apetyt
i przyjmowanie pokarmów. Receptory dla GLP-1 znajdują się w komórkach β trzustki oraz tkankach obwodowych
(OUN, nerki, serce, płuca i przewód pokarmowy).
Eksenatyd, jako agonista receptora GLP-1, zwiększa
wydzielanie insuliny w sposób zależny od stężenia glukozy,
zmniejsza poposiłkowe stężenie glukagonu oraz spowalnia
opróżnianie żołądka, co warunkuje wolniejsze narastanie
stężenia glukozy. Wydzielanie insuliny stymulowane jest
jedynie w warunkach hiperglikemii, a po osiągnięciu stanu
okołonormoglikemii, stężenie insuliny obniża się do poziomu podstawowego. W wielu badaniach wykazano wpływ
eksenatydu na zmniejszenie masy ciała.
Eksenatyd jest odporny na DDP lV. Czas połowicznego
rozpadu wynosi ok. 2,4 godziny, przy czym efekt kliniczny
trwa 4 – 6 godzin po pojedynczej dawce.
Mgr farm. Dominik Kołodziej
Katedra i Zakład Toksykologii
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Sosnowcu
Ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec
e-mail: [email protected]
18
Najczęściej występującymi objawami niepożądanymi
przy stosowaniu eksanatydu są nudności o łagodnym bądź
umiarkowanym nasileniu oraz rzadziej wymioty. Obserwowano również hipoglikemię, chociaż najczęściej była ona
lekka lub umiarkowana.
Terapię eksenatydem rozpoczyna się od dawki 5 µg podawanej 2 razy na dobę w formie podskórnych iniekcji. Po
4 tygodniach dawka zwiększana jest do 2 x 10 µg.
W leczeniu cukrzycy typu 2 zastosowanie znajdują również inhibitory dipeptydylopeptydazy lV (DPP lV). Inhibitory DPP IV podawane są doustnie. Podanie pojedynczej
dawki leku powoduje 24-godzinne zahamowanie aktywności DPP IV i zwiększenie stężenia endogennej insuliny
wskutek zahamowania rozpadu GLP-1 i GIP. W randomizowanym badaniu wykazano, że częstość hipoglikemii powodowanych przez inhibitory DPP IV była niska i nieistotna
statystycznie w porównaniu z placebo.
Piśmiennictwo:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Sieradzki J. : Cukrzyca 2006 t 1 i 2.
Maśliński S, Ryżewski J. :Patofizjologia 2002.
Grzeszczak W. :Farmakoterapia w cukrzycy 2007.
Janiec W, Krupińska J.: Farmakodynamika 2002.
Kostowski W.: Farmakologia 2001.
Kluz j, Adamiec R,: Nowe perspektywy terapii chorych
na cukrzycę typu 2 oparte na glukagonopodobnym peptydzie 1 (GLP-1) i żołądkowym peptydzie hamującym
(GIP) Post Hig Med. Dośw 2006, 60, 15-23.
7. Wróbel M, Szymborska-Kajanek A, Grzeszczak W, Strojek K, Miejsce eksenatydu w leczeniu chorych na cukrzycę typu 2: Przegląd kardiodiabetologiczny 2007;2,4:
234-240.
8. Małecki M.: Otyłość-insulinooporność-cukrzyca typu 2,
Kardiol Pol 2006; 64: 10 (supl. 6): 561–566.
9. Jasik M, Dęmbe K, Karnafel W: Doustne leki przeciwcukrzycowe w terapii cukrzycy typu 2, Przew Lek 2005;
3: 74-80.
Interakcje Dziurawca zwyczajnego (Hypericum perforatum)
Interactions of St. John’s wort (Hypericum perforatum)
Daniel Wolny, Agnieszka Nowakowska-Wolna, Ewa Chodurek, Zofia Dzierżewicz
Katedra i Zakład Biofarmacji, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny,
41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1
Kierownik Katedry i Zakładu Biofarmacji: prof. dr hab. Zofia Dzierżewicz
Streszczenie
Jednymi z bardzo popularnych leków ziołowych, szeroko dostępnymi w sprzedaży bez recepty, są preparaty sporządzone z Dziurawca zwyczajnego (Hypericum
perforatum). Leczenie dziurawcem jest uważne za
bezpieczne, choć niestety nie wolne od ryzyka różnorakich objawów ubocznych i licznych interakcji z innymi lekami. W związku z tym, że producent specyfików
ziołowych nie jest zobowiązany do prowadzenia badań
dotyczących interakcji oraz zamieszczania stosownych
informacji na opakowaniu lub ulotce swojego produktu,
ciężar informowania o potencjalnych skutkach ubocznych czy możliwości wystąpienia interakcji z innymi
lekami zażywanymi przez pacjenta spoczywa na farmaceutach.
Słowa kluczowe: Dziurawiec zwyczajny, Hypericum
perforatum, interakcje
Wstęp
Wielu pacjentów stosuje różne preparaty ziołowe wychodząc z założenia, że będąc lekami naturalnymi są one
bardzo bezpieczne. Takie podejście powoduje gwałtowny
wzrost użycia naturalnych preparatów ziołowych. Jak podaje Eisenberg i wsp. [1] w Stanach Zjednoczonych Ameryki
Północnej pomiędzy rokiem 1990 a 1998 spożycie leków
ziołowych wzrosło aż o 380%. Jednocześnie uwidoczniło się wiele problemów dotyczących interakcji i efektów
ubocznych skojarzonych z przyjmowaniem tych wydawałoby się bezpiecznych medykamentów.
Jednymi z bardzo popularnych leków ziołowych, szeroko dostępnymi w sprzedaży bez recepty, są preparaty sporządzone z Dziurawca zwyczajnego (Hypericum perforatum). Roślina ta nazywana również ziołem św. Jana znana
była już w starożytności, a pisali o niej m.in.: Dioskurides
i Hipokrates. W średniowieczu dziurawiec był uważany za
roślinę magiczną, która miała chronić przed złymi duchami,
a w XVI w. sławny lekarz i alchemik Paracelsus nazywał
go „arniką dla nerwów”, co oznaczało, iż dziurawiec jest
również znakomitym lekiem na nerwy.
Ziele dziurawca (Herba hyperici) do Farmakopei Polskiej zostało wprowadzone dopiero w 1970 r. do wydania
IV, mimo iż znane jest w medycynie ludowej od wieków.
Surowiec, który wykorzystuje się do celów leczniczych
Abstract
Preparations made of St. John’s wort (Hypericum perforatum) are very popular and very accessible by other
the counter sale. The treatment by St. John’s wort is
considered to be safe, but unfortunately is not devoid of
adverse effects and interactions with drugs. Pharmacists
have duty to inform patients about potential adverse effects or possibilities of drug interactions especially in
the case of herbal remedy, because producers of this
kind of products are not obligated to conduct clinical
trials and to place proper information on the leaflet.
Key words: St. John’s wort, Hypericum perforatum,
interactions
stanowią szczyty pędów, zbierane w początkowym okresie
kwitnienia (maj, czerwiec) i wysuszone w warunkach naturalnych w miejscach przewiewnych i zacienionych [2].
Farmakopea Polska VI określa dla ziela dziurawca wymagania zawartości flawonoidów w przeliczeniu na hiperozyd
(nie mniej niż 1,8%), natomiast Farmakopea Europejska 5.0
przewiduje zawartości sumy hiperycyn, w przeliczeniu na
hiperycynę (nie mniej niż 0.08%). Farmakopea Polska VI
określa również zwykle stosowane dawki. Doustnie w odwarach i nalewkach oraz w preparatach psychotonizujących
jednorazowa, a także dobowa dawka wynosi od 2g do 4g.
W zastosowaniu zewnętrznym do okładów i przemywań
stosuje się 5% do 10% odwar. Z surowca tego wytwarzane
są różnego rodzaju postacie: napary, odwary, oleje, roztwory, wyciągi alkoholowe, tabletki, jak również stosuje się go
do wyrobu mieszanek ziołowych. Jest on rośliną leczniczą,
której aktywność farmakologiczna zależy od postaci leku.
Wyciągi wodne z ziela dziurawca w postaci naparów (infusa) i odwarów (decocta) nie zawierają hiperforyny i hiperycyny, które są nierozpuszczalne w wodzie, lecz składniki
hydrofilne, takie jak glikozydy flawonoidowe, fenolokwasy,
garbniki. Dlatego też wykazują one głównie działanie ściągające, żółciopędne i spazmolityczne. Z kolei wyciągi olejowe (olea) działają przeciwzapalnie i są wykorzystywane do
sporządzania okładów na trudno gojące się rany, owrzodzenia, oparzenia, stłuczenia i wybroczyny. Natomiast wyciągi
19
alkoholowe ze świeżego ziela (intracta), soki (succi) oraz
nalewki (tincturae) zawierające hiperforynę i hiperycynę,
wykazują głównie działanie antydepresyjne [2, 3]. Obecnie
na polskim rynku występują też liczne preparaty wyciągu
z dziurawca zwyczajnego w postaci tabletek i kapsułek, jak
np: Deprim, Deprim forte, Depresplant, Dziurawiec ziele,
Don’t Worry, Hypercaps, Hyperherba, Hyperosedat, Perhip,
Remotiv, Silenil. Jednakże prowadzone badania wykazały, że preparaty te wchodzą w interakcje z wieloma lekami
z różnych grup powodując poważne skutki uboczne.
Skład i działanie
Dziurawiec zawiera szereg substancji chemicznych
odpowiedzialnych za terapeutyczne efekty jego działania.
W składzie tej rośliny można wyróżnić grupę pochodnych
diantronowych i antranolowych (0.05 – 0.3%), którą tworzą między innymi hiperycyna, pseudohiperycyna oraz
protohiperycyna, protopseudohiperycyna i cyklopseudohiperycyna, ulegające przekształceniu pod wpływem
światła do hiperycyny i pseudohiperycyny. Kolejną dużą
grupę składników tworzą flawonoidy (2 – 4%), do których zalicza się flawonole (kemferol, kwercetyna), flawony (luteolina, eter 5,3-dimetylowy luteoliny), glikozydy
(hiperozyd (0.3 – 0.7%), rutyna, kwercytryna, izokwercytryna, glikozydy leteoliny), biflawonoidy (amentoflawon (0.01 – 0.05%), biapigenina (0.1 – 0.5%)). Zidentyfikowano także pochodne floroglucynowe, do których
zalicza się hiperforynę (2 – 4.5%), adhiperforynę (0.2
– 1.8%), furohiperoforynę, 1,3,6,7-tetrahydroksyksanton.
W dziurawcu występują ponadto proantocyjanidyny,
głównie katechiny i epikatechiny. Dalsze składniki tej
rośliny to olejki eteryczne, takie jak: 2-metylooktan, nnonan, 2-metylodekan, α– i β-pinen, terpineol, geraniol,
β-kariofylen, hamulen i śladowe ilości monoterpenów.
Ponadto stwierdzono obecność kwasów fenolowych (kawowy, chlorogenowy, p-kumarowy, ferulowy, izoferulo-
Ryc. 1 Składniki dziurawca:
hiperycyna (A),
hiperforyna (B)
20
wy, p-hydroksybenzoesowy, wanilinowy), kwasy: izowalerianowy, nikotynowy, laurynowy, mirystynowy, palmitynowy, stearynowy, garbniki katechinowe, karotenoidy,
cholinę, witaminę C, nikotynamid, pektyny, fitosterole
i inne. W roślinie tej znajdują się także ksantony, związki
rzadko występujące w roślinach, ale charakterystyczne
dla rodziny Hypericaceae [4, 5].
Dziurawiec zwyczajny jest surowcem farmaceutycznym
o szerokim spektrum działania na skórę (dermaticum), a także posiadający właściwości przeciwskurczowe (spasmolyticum), przeciwdepresyjne (psychosedativum), antyseptyczne
(antisepticum). To wielokierunkowe działanie spowodowane jest bogactwem składu chemicznego tej rośliny leczniczej.
Dziurawiec zwyczajny znalazł zastosowanie również
w homeopatii. Jest używany w terapii uszkodzeń nerwów
obwodowych spowodowanych np. zmiażdżeniem, cięciem
lub rozerwaniem z towarzyszącymi silnymi bólami przebiegającymi wzdłuż nerwów. Bywa też wykorzystywany we
wstrząsie mózgu lub rdzenia przedłużonego, jak również
w mdłościach, niestrawności, bolesnych hemoroidach oraz
stanach depresyjnych.
Dziurawiec jest natomiast mało znany jako roślina
wykorzystywana w kosmetyce, choć mają tu zastosowanie wszystkie jego formy. Wyciągi olejowe mają działanie
gojące i regenerujące, a sam olejek dziurawcowy jest częstym składnikiem odżywek do włosów. Kremy zawierające
wyciągi z dziurawca przeznaczone są do pielęgnacji skóry
normalnej i tłustej. Natomiast ze względu na zawartość hiperycyny, czerwonego barwnika uczulającego na promienie
słoneczne, dziurawiec jest wykorzystywany do produkcji
kremów i maści do zewnętrznego leczenia odbarwień skóry
(bielactwa) oraz kremów i emulsji przyciemniających barwę
skóry, tzw. samoopalaczy.
Składnik dziurawca – hiperforyna indukuje apoptozę
różnych komórek nowotworowych, nie tylko guzów litych,
ale także komórek białaczkowych. Ponadto, ten składnik
dziurawca zmniejsza inwazyjność i zdolność do przerzutów
komórek nowotworowych, a także wykazuje działanie hamujące angiogenezę. Właściwości te powodują, że hiperforyna jest w kręgu zainteresowania badaczy jako potencjalny
lek antynowotworowy [6].
Leczenie dziurawcem jest uważne za leczenie bezpieczne, choć niestety nie wolne od ryzyka różnorakich objawów
ubocznych i licznych interakcji z innymi grupami leków.
Jednym z działań niepożądanych stosowania dziurawca
może być uczulenie skóry na światło słoneczne, ujawniające
sie w postaci zaczerwienienia, poparzeń, pęcherzy i ogólnego osłabienia. Związane jest to z hiperycyną, która jest substancją fotodynamiczną. Dlatego też osoby z jasną karnacją
powinny unikać ostrego słońca i innych źródeł światła ultrafioletowego [7]. Do najczęstszych powikłań należą również: zaburzenia gastryczne (8%), zawroty głowy (4.5%),
uczucie zmęczenia i nadmiernego uspokojenia polekowego
(4.3%), suchość w ustach (4.0%), niepokój (2.6%), bóle
głowy (1.7%) i bezsenność (0.9%). Oczywiście preparaty
z Dziurawca zwyczajnego nie powinny być używane
w czasie ciąży oraz karmienia piersią, jak również są przeciwwskazane w poważnych uszkodzeniach wątroby i nerek
oraz w wysokiej gorączce [8].
Interakcje składników dziurawca
z innymi lekami
Składniki dziurawca wchodzą w interakcje z innymi
lekami zarówno na poziomie farmakodynamiki, jak i farmakokinetyki. Moore i wsp. [9] w swoich doświadczeniach
wykazali, że hiperforyna posiada zdolność do aktywacji
jądrowego receptora pregnanu X (PXR), należącego do
rodziny receptorów dla hormonów sterydowych. Zaktywowany receptor PRX łączy się z promotorem genu CYP3A4
powodując ekspresję tego genu. Ponadto receptor ten indukuje gen oporności wielolekowej MDR1, co prowadzi do
wzrostu wytwarzania glikoproteiny P. Zwiększona synteza CYP3A4 powoduję intensyfikację metabolizmu leków
przekształcanych przez ten układ enzymatyczny, powodując
interakcję farmakokinetyczne na poziomie metabolizmu.
Natomiast zwiększona aktywność glikoproteiny P powoduje
interakcje farmakokinetyczne na poziomie biodostępności.
Białko to występujące w komórka jelita, wątroby i nerek
odgrywa istotną rolę w absorbcji, dystrybucji i wydalaniu
leków, zmniejszając transport komórkowy z przestrzeni
jelita do komórek epitelium, oraz zwiększając wydalanie
ksenobiotyków z hepatocytów i nefronów odpowiednio do
przewodów żółciowych i kanalików nerkowych. Interakcje
przetworów dziurawca z innymi lekami mogą powodować
także inne składniki tej rośliny. Nebel i wsp. [10] postulują iż za interakcję dziurawca z teofiliną odpowiedzialna jest
hiperycyna, która indukuje aktywność izoformy CYP1A2
i CYP2C19 cytochromu P450. Stwierdzono także przypadki
interakcji preparatów dziurawca z warfaryną, co wskazuję
że składniki tej rośliny indukują także izoformę CYP2C9,
która odpowiedzialna jest za metabolizm wspomnianego
leku [11].
Ziele dziurawca stosowane jest z powodzeniem w łagodnej i średniej depresji. Wiele pacjentów stosuje preparaty
z tej rośliny równolegle do syntetycznych leków antydepresyjnych. Hiperforyna oraz w mniejszym stopniu hiperycyna
są inhibitorami zwrotnego wychwytu serotoniny. Stosowanie
dziurawca łącznie z syntetycznymi inhibitorami wychwytu
serotoniny takimi jak: sertralina, paroksetyna, nefazodon
i wenlafaksyna prowadzi do wzajemnej interakcji tych środków na poziomie farmakodynamicznym, poprzez synergizm
ich działania. Może to skutkować wystąpieniem syndromu
serotoninowego objawiającego się zmianami nastroju, bólami głowy, nadpobudliwością ruchową, dolegliwościami
żołądkowo-jelitowymi [12]. Barbenel i wsp. [13] opisali
nawet przypadek wystąpienia manii u 28-letniej pacjentki
przyjmującej jednocześnie sertralinę i preparat dziurawca.
Ponadto Johne i wsp. [14] przeprowadzając próbę kliniczną
wykazali obniżenie stężenia amitryptyliny we krwi i moczu
u 12 pacjentów przyjmujących ten lek łącznie z dziurawcem. Obserwację tą można wyjaśnić faktem, iż amitryptylina jest substratem glikoproteiny P oraz jej metabolizm na
drodze demetylacji, a następnie hydroksylacji zachodzi przy
udziale CYP2C19 i CYP3A4, które są indukowane przez
składniki dziurawca.
Występują także interakcje dziurawca z benzodiazepinami: alprazolanem i midazolanem. Leki te są często wykorzystywane jako markery aktywności izoenzymu CYP3A4,
ponieważ są poprzez ten enzym całkowicie metabolizowa-
ne. Badania kliniczne z wykorzystaniem zdrowych ochotników wykazały obniżenie stężenia tych leków we krwi w
wyniku koadministracji z dziurawcem [15, 16]. Ponadto
obniżenie stężenia midazolamu we krwi było większe po
podaniu doustnym niż dożylnym, co wskazuje że składniki dziurawca indukują aktywność CYP3A4 występującego
zarówno w jelicie, jak i w wątrobie [15]. Kolejnym lekiem
anksjolitycznym wchodzącym w interakcję z dziurawcem
jest agonista receptora 5-HT1A, buspiron. Dannawi i wsp.
[17] opisują przypadek syndromu serotoninowego wywołanego wzmożoną aktywacją receptorów serotoninowych
w wyniku działania buspironu i inhibicji wychwytu serotoniny z przestrzeni synaptycznej przez hiperforynę i hiperycynę. Ponadto Spinella i Eaton [18] opisują przypadek
uszkodzenia mózgu poprzedzonego hipomanią u pacjentki
przyjmującej buspiron w połączeniu z zielem dziurawca
i preparatem Ginko biloba.
Istnieją kliniczne przesłanki, że niektóre leki roślinne
mogą obniżać stężenie digoksyny we krwi. Do preparatów
takich należy zaliczyć także dziurawiec, który po 10 dniach
równoległego przyjmowania z digoksyną obniża poziom
jej stężenia w surowicy pacjenta [19]. Prawdopodobnie za
zjawisko to odpowiada indukcja glikoproteiny P przez hiperforynę, co zdaje się potwierdzać korelacja tej interakcji
z dawką tego składnika dziurawca. Glikoproteina P w wyniku indukcji zwiększa wyrzut digoksyny z enterocytów do
światła jelita, zmniejszając jej stężenie we krwi, co wobec
wąskiego współczynnika terapeutycznego tego leku, objawia się nieskutecznością terapii. Sugimoto i wsp. [20] przeprowadzili badania mające na celu wykazanie istnienia interakcji pomiędzy preparatami dziurawca a lekami antyhiperlipidemicznymi: symwastatyną i prawastatyną. W wyniku
prób klinicznych stwierdzili oni, że zachodzi interakcja tylko
w przypadku pierwszego z tych leków, bowiem symwastatyna w przeciwieństwie do prawastatyny metabolizowana
jest w ustroju ludzkim poprzez enzymy szlaku zależnego od
cytochromu P-450 oraz stanowi substrat dla glikoproteiny P.
Tannergreen i wsp. [21] donoszą, że regularne przyjmowanie dziurawca zmniejsza biodostępność werapamilu.
Badacze ci sugerują, iż jest to spowodowane zwiększoną
aktywnością enzymu CYP3A4 w jelicie, co zwiększa efekt
pierwszego przejścia tego leku. Dodatkowo lek ten jest także substratem dla glikoproteiny P. Spośród leków działających na układ krążenia interakcję ze składnikami dziurawca wykazują także antykoagulanty, wspomniana wcześniej
warfaryna oraz fenprokumon. Leki te w wyniku aktywacji
układów enzymatycznych związanych z cytochromem P450
ulegają szybszemu metabolizmowi, co objawia się zmniejszeniem ich działania przeciwzakrzepowego [22].
Istnieją doniesienia o występowaniu krwawień u kobiet przyjmujących doustne środki antykoncepcyjne w połączeniu z preparatami dziurawca. Informacje te znalazły
potwierdzenie w dwóch próbach klinicznych z wykorzystaniem zdrowych ochotniczek przyjmujących etynyloestradiol
i noretyndron [23, 24]. Ponadto były zgłaszane przypadki
zajścia w ciąże przez kobiety przyjmujące środki antykoncepcyjne w połączeniu z dziurawcem: w Wielkiej Brytanii – siedem przypadków, w Niemczech – cztery oraz dwa
w Szwecji [25]. Przyczyną tych zjawisk jest obniżanie przez
preparaty dziurawca stężenia noretyndronu i etynyloestria-
21
diolu we krwi, spowodowane indukcją izoformy CYP3A4
odowiedzialnej za oksydatywny metabolizm tych środków
hormonalnych.
Interakcja składników dziurawca z cyklosporyną jest
jedną z najlepiej udokumentowanych. Istnieją liczne opisy
przypadków tej bardzo poważnej i potencjalnie śmiertelnej
interferencji pomiędzy lekiem roślinnym a syntetycznym
[26, 27, 28, 29]. Przypadki te dotyczą pacjentów po transplantacji serca, nerki i wątroby przyjmujących cyklosporynę, u których poziom tego leku we krwi uległ obniżeniu po
przyjęciu terapeutycznej dawki preparatu z dziurawca, w następstwie czego pojawiały się niekiedy epizody ostrego odrzucenia przeszczepu. W przypadku odstawienia dziurawca
obraz kliniczny ulegał poprawie. Mechanizm tej interakcji
polega na obniżeniu absorbcji cyklosporyny, która jest substratem glikoproteiny P, w jelicie oraz przyspieszeniu metabolizmu tego leku przez izoformę CYP3A4. Ponadto dwie
próby kliniczne przeprowadzone przez Mai i wsp. [30] oraz
Herberta i wsp. [31] wykazały drastyczne obniżenie stężenia takrolimusa w koadministracji z dziurawcem. Lek ten
jest intensywnie metabolizowany w wątrobie głównie przez
CYP3A4 oraz jest substratem glikoproteny P.
Stwierdzono przypadek obniżenia stężenia teofiliny we
krwi związany z zażywaniem dziurawca i wykazano in vitro, że składnik dziurawca – hiperycyna, indukuje enzymy
wątrobowe [10]. Jednakże późniejsze próby kliniczne dowiodły, iż w trakcie piętnastodniowego przyjmowania dziurawca farmakokinetyka teofiliny nie uległa zmianie [32].
Wang i wsp. [33] badając wpływ dziurawca na farmakokinetykę feksofenadyny zauważyli, że jednorazowe podanie
zioła zwiększa, podczas gdy 14-dniowe obniża stężenie tego
leku antyhistaminowego we krwi. Ponieważ feksofenadyna
jest markerem aktywności glikoproteiny P, autorzy ci wysunęli hipotezę, że jednorazowa dawka hamuje, podczas gdy
dłuższe przyjmowanie dziurawca, pobudza jelitową izoformę tego białka.
Próby kliniczne wykazały interakcje przetworów dziurawca z lekami antyretrowirusowymi: indinavirem [34] oraz
niverapiną [35]. Obniżenie stężenia tych leków u pacjentów
zarażonych wirusem HIV pociąga za sobą konsekwencje
w postaci zwiększonej odporności wirusów na leki a przez
to nieskuteczności terapii. Należy zauważyć, że inne leki
antyretrowirusowe również metabolizowane są przez izoformę CYP3A4, więc interakcja ta może dotyczyć także
nich. Próba przeprowadzona na 12 pacjentach wykazała, że preparaty dziurawca wzmagają katalizowaną przez
CYP3A4 sulfoksydację oraz zależną od CYP2C19 hydroksylację omeprazolu [36].
Spośród wszystkich raportów dotyczących interakcji
pomiędzy lekami roślinnymi, a tradycyjnymi 79% dotyczy
interakcji dziurawca, publikacji dotyczących tego zjawiska
jest ponad 270 [37]. Wskazuje to na skalę w jakiej środek ten
może wpływać na farmakokinetykę innych środków leczniczych. Główny mechanizm interakcji spowodowanych
przez preparaty dziurawca jest indukcja izoformy CYP3A4
cytochromu P-450, enzymu odpowiedzialnego za oksydatywny metabolizm ponad 50% leków. Dodając do tego
wpływ składników tej rośliny na aktywność innych izoform
tego układu enzymatycznego oraz glikoproteiny P można
przypuszczać, że ten lek roślinny może wpływać na farma-
22
kokinetykę blisko 80% wszystkich leków [37]. Leki ziołowe w tym dziurawiec dostępne są w sprzedaży OTC i często
stosowane są przez pacjentów bez konsultacji z lekarzem.
W związku z tym, że producent specyfików ziołowych nie
jest zobowiązany do prowadzenia badań dotyczących interakcji oraz zamieszczania stosownych informacji na opakowaniu lub ulotce swojego produktu, ciężar informowania
o potencjalnych skutkach ubocznych czy możliwości wystąpienia interakcji z innymi lekami zażywanymi przez pacjenta spoczywa na farmaceutach.
Piśmiennictwo
1. Eisenberg D i wsp. Trends in alternative medicine use
in United States. 1990-1998. JAMA 1998; 280: 15691575.
2. Ożarowski A, Jaroniewski W. Rośliny lecznicze
i ich praktyczne zastosowanie. Instytut Wydawniczy
Związków Zawodowych. Warszawa 1987.
3. Gałuszko M, Cubała WJ. Rola dziurawca w leczeniu depresji. Psychiatria 2005; 2:93-96.
4. Nahrstedt A, Butterweck V. Biologically active and other
chemical constituents of the herb of Hypericum perforatum L. Pharmacopsychiatry. 1997;30:129-134.
5. Greeson JM, Sanford B, Monti DA. St. John’s wort
(Hypericum perforatum): a review of the current pharmacological, toxicological, and clinical literature.
Psychopharmacology (Berl) 2001; 153: 402-414.
6. Quiney C i wsp. Hyperforin, a new lead compound against the progression of cancer and leukemia? Leukemia
2006; 20: 1519-1525.
7. Brockmöller J i wsp. Hypericin and pseudohypericin:
pharmacokinetics and effects on photosensitivity in humans. Pharmacopsychiatry. 1997; 30: 94-101.
8. Ernst E i wsp. Adverse effects profile of the herbal antidepressant St. John’s wort (Hypericum perforatum L.).
Eur J Clin Pharmacol 1998; 54: 589-594.
9. Moore LB i wsp. St. John’s wort induces hepatic drug
metabolism through activation of the pregnane X receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 7500-7502.
10.Nebel A i wsp. Potential metabolic interaction between St. John’s wort and theophylline. Ann Pharmacother
1999; 33: 502-504.
11.Kaminsky LS, Zhang ZY. Human P450 metabolism of
warfarin. Pharmacol Ther 1997; 73: 67-74.
12.Gordon JB. SSRIs and St.John’s Wort: possible toxicity?
Am Fam Physician 1998; 57: 950-953.
13.Barbenel DM i wsp. Mania in a patient receiving testosterone replacement postorchidectomy taking St John’s wort
and sertraline. J Psychopharmacol 2000; 14: 84-86.
14.Johne A i wsp. Decreased plasma levels of amitriptyline and its metabolites on comedication with an extract
from St. John’s wort ( Hypericum perforatum ). J Clin
Psychopharmacol 2002; 22: 46-54.
15.Dresser GK i wsp. Coordinate induction of both cytochrome P4503A and MDR1 by St John’s wort in healthy
subjects. Clin Pharmacol Ther 2003; 73: 41-50.
16.Wang Z i wsp. The effects of St John’s wort (Hypericum
perforatum) on human cytochrome P450 activity. Clin
Pharmacol Ther 2001; 70: 317-326.
17.Dannawi M. Possible serotonin syndrome after combination of buspirone and St John’s Wort. J Psychopharmacol
2002; 16: 401-406.
18.Spinella M, Eaton LA. Hypomania induced by herbal and
pharmaceutical psychotropic medicines following mild
traumatic brain injury. Brain Inj 2002; 16: 359-367.
19.Johne A i wsp. Pharmacokinetic interaction of digoxin
with an herbal extract from St John’s wort (Hypericum
perforatum). Clin Pharmacol Ther 1999; 66: 338-345.
20.Sugimoto K i wsp. Different effects of St John’s wort
on the pharmacokinetics of simvastatin and pravastatin.
Clin Pharmacol Ther 2001; 70: 518-524.
21.Tannergreen C i wsp. St John’s wort decreases the bioavailability of R- and S-verapamil through induction of
the first-pass metabolism. Clin Pharmacol Ther 2004;
75: 298-309.
22.Jiang X i wsp. Effect of St John’s wort and ginseng on
the pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfarin in healthy subjects. Br J Clin Pharmacol 2004; 57:
592-599.
23.Hall SD i wsp. The interaction between St John’s wort
and an oral contraceptive. Clin Pharmacol Ther 2003;
74: 525-535.
24.Pfrunder A i wsp. Interaction of St John’s wort with lowdose oral contraceptive therapy: a randomized controlled
trial. Br J Clin Pharmacol 2003; 56: 683-690.
25.Murphy PA. St. John’s wort and oral contraceptives: reasons for concern? J Midwifery Womens Health 2002;
47: 447-450.
26.Ahmed SM, Banner NR, Dubrey SW. Low cyclosporin
-A level due to Saint-John’s-wort in heart transplant patients. J Heart Lung Transplant 2001; 20: 795-799.
27.Barone GW i wsp. Drug interaction between St. John’s
wort and cyclosporine. Ann Pharmacother. 2000; 34:
1013-1016.
28.Breidenbach T i wsp. Drug interaction of St John’s wort
with cyclosporin. Lancet 2000; 355: 1912-1915.
29.Karliova M i wsp. Interaction of Hypericum perforatum
(St. John’s wort) with cyclosporin A metabolism in a patient
after liver transplantation. J Hepatol 2000; 33: 853-855.
30.Mai I i wsp. Impact of St John’s wort treatment on the
pharmacokinetics of tacrolimus and mycophenolic acid
in renal transplant patients. Nephrol Dial Transplant
2003; 18: 819-822.
31.Hebert MF i wsp. Effects of St. John’s wort (Hypericum
perforatum) on tacrolimus pharmacokinetics in healthy
volunteers. J Clin Pharmacol 2004; 44: 89-94.
32.Morimoto T i wsp. Effect of St. John’s wort on the pharmacokinetics of theophylline in healthy volunteers. J
Clin Pharmacol 2004; 44: 95-101.
33.Wang Z i wsp. Effect of St John’s wort on the pharmacokinetics of fexofenadine. Clin Pharmacol Ther 2002;
71: 414-420.
34.Piscitelli SC i wsp. Indinavir concentrations and St
John’s wort. Lancet 2000; 355: 547-548.
35.de Maat MM i wsp. Drug interaction between St John’s
wort and nevirapine. AIDS 2001; 15: 420-421.
36.Wang LS i wsp. St John’s wort induces both cytochrome
P450 3A4-catalyzed sulfoxidation and 2C19-dependent
hydroxylation of omeprazole. Clin Pharmacol Ther
2004; 75: 191-197.
37.Tirona RG, Bailey DG. Herbal product-drug interactions
mediated by induction. Br J Clin Pharmacol 2006; 61:
677-681.
mgr Daniel Wolny
Katedra i Zakład Biofarmacji
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny
tel.: 032 364 1064
23
Modyfikacja dostępności farmaceutycznej piroksykamu
z tabletek z udziałem wybranych solubilizatorów
Modification of the pharmaceutical availability of piroxicam
from tablets with the use of selected solubilizators
Beata Szulc-Musioł, Lucyna Bułaś
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach,
Katedra i Zakład Farmacji Stosowanej Wydziału Farmaceutycznego
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu
Kierownik Katedry: dr hab. n. farm. Andrzej Jankowski
Streszczenie:
Piroksykam to niesteroidowy lek przeciwzapalny
z grupy oksykamy. Według klasyfikacji BCS należy do
II klasy, charakteryzującej się małą rozpuszczalnością
i dobrym wchłanianiem. Celem pracy było zbadanie
wpływu wybranych surfaktantów na uwalnianie piroksykamu z tabletek. Tabletki sporządzono metodą granulacji na mokro. W sporządzonych granulatach zawierających tenzydy, zbadano parametry granulometryczne
takie jak Indeks Carra i Współczynnik Hausnera. Parametry fizyczne tabletek oceniono zgodnie z FPVI. Rezultaty badań pozwoliły wykazać użyteczność badanych
surfaktantów w poprawie dostępności farmaceutycznej
piroksykamu z tabletek.
Słowa kluczowe: piroksykam, surfaktanty, Tween 80,
Laurylosiarczan sodu, Brij58, tabletki, dostępność farmaceutyczna
1. Wstęp
Piroksykam to przedstawiciel niesteroidowych leków przeciwzapalnych z grupy oksykamy. Wykazuje działanie przeciwzapalne, przeciwbólowe, przeciwgorączkowe. Jest stosowany w
leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, osteoartrozie [1].
Współczesna technologia stałych doustnych postaci leku
farmaceutycznych wymaga, aby substancja lecznicza po
rozpadzie leku znajdowała się w stanie rozproszenia molekularnego. Piroksykam należy do II klasy BCS [2]. Praktycznie nie rozpuszcza się w wodzie, za to dobrze wchłania się z przewodu pokarmowego. Mała rozpuszczalność
w płynach ustrojowych skutkuje drażniącym działaniem na
śluzówkę żołądka oraz jelit [3]. Dlatego prowadzone są badania zmierzające do zwiększenia jego rozpuszczalności, bowiem biodostępność leku w fazie ciekłej jest większa a działanie szybsze [4-8].
Uzyskanie leku w stanie rozproszenia molekularnego można uzyskać różnymi metodami [9]. Jedną z metod
zmierzającą do poprawy szybkości rozpuszczania substancji
24
Abstract:
Piroxicam is a non-steroidal anti-inflammatory drug
from oxicams group. It is classified in the Biopharmaceutic Drug Classification (BCS) system as
a Class II drug with low solubility and high permeability. The aim of this study was to evaluate the effect of selected surfactants on the release
of piroxicam from tablets. Tablets were made by wet
granulation technique. In manufactured granulates containing tenzides, granulometric parametes such as Carr
Index and Hausner Factor were investigated. Physical
parameters of tablets were graded according to FPVI.
Results of the study allowed determining the usefulness
of investigated surfactants in the improvement of the
pharmaceutical availability of piroxicam from tablets.
Keywords: piroxicam, surfactants, Tween 80, sodium
lauryl sulphate, Brij58, tablets, pharmaceutical availability
leczniczych trudno rozpuszczalnych lub praktycznie nierozpuszczalnych w wodzie jest wykorzystanie solubilizacji
micelarnej [10-12]
Celem pracy było otrzymanie stałej doustnej postaci
leku - tabletek z piroksykamem z formulacyjnym udziałem
solubilizotora micelarnego. W pracy oceniono wpływ wybranych solubilizatorów na właściwości fizykochemiczne
oraz szybkość uwalniania substancji biologicznie czynnej
z wytworzonych tabletek. Z grupy niejonowych związków
powierzchniowo czynnych zastosowano: Tween 80(T80)
i Brij58 a z anionowo czynnych -laurylosiarczan sodu (LSS).
2. Materiał i metody
2.1Substancje
Piroksykam (Jelfa S.A.), Tween80, Brij58, laurylosiarczan sodu, Avicel PH-101 i skrobia ziemniaczana (SigmaAldrich, Germany): stearynian magnezu (Merck, Germany),
laktoza (Galfarm, Poland), kwas solny (POCH, Poland).
2.2 Sporządzanie tabletek z piroksykamem
Opracowano siedem wariantów tabletek zawierających
10mg piroksykamu. Tabletki sporządzono metodą granulacji na mokro. Zawartość procentowa substancji leczniczej
i pomocniczych w przeliczeniu na tabletkę:
piroksykam
skrobia ziemniaczana0
laktoza0
Avicel PH-101
stearynian magnezu0
0 5%
0 45%
0 30%
0 19%
01%
Ryc. 1. Wartość Indeksu Carra dla badanych granulatów
Składniki masy tabletkowej zarabiano w moździerzu
wodnym roztworem zawierającym odpowiedni solubilizator
i żelatynę (1% w/v). Wilgotną masę przecierano przez sito
0.8 mm. Granulaty suszono w suszarce w temp. 300C przez
12 godz. Wysuszone granulaty ujednolicano stosując sito
o wielkości oczek 0.8 mm. Substancję poślizgową (stearynian magnezu) dodawano bezpośrednio przed tabletkowaniem. Tabletki o masie ok. 200 mg tłoczono przy użyciu
stempli o średnicy Ø=9mm na tabletkarce Erweka AR400.
Solubilizatory zastosowano w ilości 0.4% (wariant I: F-T80-I; F-Brij58-I; F-LSS-I) i 4% (wariant II:
F-T80-II; F-Brij58-II; F-LSS-II) całkowitej masy granulatu.
Dodatkowo jako odnośnik sporządzono granulat bez dodatku surfaktantu (F-0).
W otrzymanych granulatach oznaczono gęstość nasypową i gęstość po ubiciu (wolumetr typu Polfa W2). Dla
każdej serii granulatu pomiary wykonano trzykrotnie. Uzyskane rezultaty pozwoliły obliczyć indeks Carra wg wzoru:
IC=(TD-BD)*100/TD, gdzie: TD - gęstość po ubiciu (g/cm3),
BD – gęstość nasypowa (g/cm3).
Wartości gęstości nasypowej i gęstości po ubiciu posłużyły także do obliczenia współczynnika Hausnera. Wykonane
tabletki przebadano zgodnie z FPVI [13], określając jednolitość masy pojedynczych tabletek, ścieralność i czas rozpadu.
2.3 Oznaczenie dostępności farmaceutycznej
Badanie dostępności farmaceutycznej przeprowadzono
zgodnie z FPVI metodą łopatkową do 0.1 mol kwasu solnego przy prędkości obrotów 60obr/min. Ilość uwolnionej
substancji leczniczej oznaczono spektrofotometrycznie,
mierząc absorbancję przy 353nm. Stężenie piroksykamu
obliczono z równania opisującego krzywą kalibracji. Wyniki pomiarów stężenia piroksykamu przedstawiono jako
procent uwolnionej dawki (Q). Uzyskane wyniki poddano
analizie statystycznej. Za poziom istotności przyjęto p<0.05.
Do oceny średnich zastosowano test Dunneta.
3. Wyniki i ich omówienie
Obliczone wartości indeksu Carra i współczynnika Hausnera w badanych granulatach przedstawiono na rycinie 1
i 2. Porównując dane na ryc. 1 można stwierdzić, że obecność surfaktanta w masie formulacyjnej istotnie wpływa na
wartość indeksu Carra. Najniższe wartości tego parametru
wykazywały formulacje z 4% dodatkiem surfaktanta. Wła-
Ryc. 2. Wartość Współczynnika Hausnera
dla badanych granulatów
Ryc. 3. Profil uwalniania piroksykamu z badanych tabletek
do 0.1 mol kwasu solnego
ściwości nasypowe granulatów są korzystne gdy współczynnik
Hausnera przyjmuje wartości bliskie jedności. W badanych układach mieszczą się one w przedziałach od 1.25 do 1.29 (0.4% zawartość surfaktanta) oraz 1.21-1.23 (4% zawartość surfaktanta)
i są niższe niż w granulacie bez obecności surfaktanta, dla którego współczynnik Hausnera wynosił 1.38 (ryc.2)
Właściwości fizykochemiczne tabletek zestawiono w tabeli 1. Z zestawienia wynika, że sporządzone tabletki wykazują prawidłowe parametry, zgodnie z wymaganiami FPVI.
Wygląd tabletek wszystkich otrzymanych serii nie budził zastrzeżeń. Wytworzone tabletki charakteryzowały
się gładką powierzchnią i jednakowym kształtem. Średnia masa przebadanych tabletek wynosiła około 0.2g
i masa żadnej tabletki nie przekracza granicy dopuszczalnego odchylenia. W badaniach ścieralności stwierdzono,
że tabletki wszystkich serii odpowiadają wymaganiom
(w żadnym przypadku ubytek masy nie przekraczał 1%).
Zastosowanie surfaktantów w masie tabletkowej wpłynęło
25
Formulacje
F-0
F-T80-I
F-Brij58-I
F-LSS-I
F-T80-II
F-Brij58-II
F-LSS-II
Odchylenie od
średniej masy
tabletki (%)
2.93
2.56
2.21
2.72
2.19
2.14
2.51
Ścieralność
(%)
Czas rozpadu
(min)
0.71 ± 0.03
0.78 ± 0.02
0.59 ± 0.02
0.91 ± 0.01
0.61 ± 0.01
0.52 ± 0.02
0.52 ± 0.03
3.20 ± 0.15
3.01 ± 0.11
2.45 ± 0.13
2.52 ± 0.10
2.26 ± 0.09
2.23 ± 0.15
2.17 ± 0.15
Tabela 1. Właściwości fizykochemiczne tabletek
Formulacje →
Czas [min]↓
Q5
Q10
Q15
Q20
Q25
Q30
Q45
K (min-1)*10-2
F-0
F-T80-I
44.73 ± 5.20
57.38 ± 3.11
62.50 ± 2.05
66.27 ± 1.90
72.84 ± 2.29
76.54 ± 1.41
78.68 ± 0.99
3.09 ± 0.30
49.30 ± 3.15
61.87 ± 4.87
67.85 ± 2.56
72.80 ± 3.68
77.87 ± 4.64
81.35 ± 3.49
83.79 ± 4.25
1.37 ± 0.12 a
Formulacje →
Czas [min]↓
Q5
Q10
Q15
Q20
Q25
Q30
Q45
K (min-1)*10-2
F-T80-II
Wnioski
1. Obecność surfaktanta w masie formulacyjnej powo-
duje zmniejszenie wartość indeksu Carra, co sugeruje poprawę sypkości granulatów.
2. Zastosowanie surfaktantów w masie tabletkowej
wpłynęło na skrócenie czasu rozpadu otrzymanych
tabletek. Najkrótszy czas rozpadu wykazywały tabletki serii F-LSS-II zawierające w swoim składzie
laurylosiarczan sodu w ilości 4%.
3. Wyniki badań szybkości uwalniania piroksykamu z tabletek wykazywały
zasadność wprowadzenia surfakF-Brij58-I
F-LSS-I
tanta do receptury tabletek. Doda55.32 ± 4.97 c
50.17 ± 3.31 a
tek substancji solubilizujących do
63.63 ± 5.66 a
68.22 ± 4.73 c
masy tabletkowej istotnie wpływa
74.91 ± 4.92 c
78.12 ± 3.60 c
na szybkość i ilość uwolnionej
79.99 ± 4.88 c
82.35 ± 4.30 c
substancji leczniczej. Współczync
c
84.39 ± 5.30
84.58 ± 4.68
nik Q uzyskał najwyższe wartości
b
c
85.17 ± 4.49
89.64 ± 3.54
dla tabletek zawierających jako
b
c
88.57 ± 3.75
93.72 ± 4.44
a
a
solubilizator laurylosiarczan sodu
1.45 ± 0.27
1.57 ± 0.19
i Brij 58 w ilości 4%.
F-Brij58-II
59.85 ± 4.37
66.64 ± 3.20 b
75.46 ± 2.68 b
79.98 ± 2.65 a
84.34 ± 3.46 a
86.69 ± 3.95 a
89.45 ± 3.36 a
1.86 ± 0.21 a
c
F-LSS-II
69.78 ± 2.57
75.34 ± 3.35 c
82.56 ± 3.35 c
85.86 ± 3.81 c
87.27 ± 4.07 c
89.07 ± 3.76 c
92.12 ± 3.81 c
2.07 ± 0.37 a
c
70.11 ± 5.12 c
78.81 ± 5.12 c
84.34 ± 3.55 c
86.89 ± 2.79 c
89.87 ± 2.91 c
92.57 ± 4.11 c
94.55 ± 2.73 c
2.18 ± 0.49 a
statystycznie istotnie w porównaniu do tabletek bez solubilizatora: a p≤0.05; b p≤0.01; c p≤0.001
Tabela 2. Wartości współczynnika Q (%)
na skrócenie czasu rozpadu otrzymanych tabletek. Najkrótszy czas rozpadu wykazywały tabletki serii F-LSSII zawierające w swoim składzie laurylosiarczan sodu
w ilości 4%.
Rezultaty badań dostępności farmaceutycznej (współczynnik Q) piroksykamu w modelowym płynie zbiorczym
(0.1 mol kwas solny) z badanych formulacji przedstawiono
w tabeli 2. Stanowiły one podstawę do prześledzenia zależności Q w funkcji czasu (t, min): Q=f (t, min), przedstawionego na rycinie 3. Najniższą dostępnością farmaceutyczną
(ok. 80% po 45 minutach uwalniania) charakteryzowały się
tabletki serii F0 (bez dodatku tenzydu) i serii F-T80-I zawierającej jako niejonowy surfaktant Tween80 w ilości 0.4%.
Za wyjątkiem serii F-T80-I, we wszystkich pozostałych
seriach tabletek ilość uwolnionego środka leczniczego
w badanych punktach pomiarowych była istotnie wyższa
dla tabletek zawierających w swoim składzie solubilizator micelarny w porównaniu do tabletek bez ich udziału
(seria F-0). Najlepsze wyniki uzyskano dla tabletek zawierających jako solubilizator laurylosiarczan sodu i Brij 58
w ilości 4% (po 15 minutach uwolniło się ponad 80% substancji).
26
Piśmiennictwo:
1. Zielska-Olczak M, Olczak S. Izoenzymy cyklooksygenazy i inhibitory cyklooksygenazy-2. Farm Pol 2000;
18: 869-874.
2. Nachajski M, Zgoda M M. Zastosowanie solubilizacji
hydrotropowej i micelarnej w celu poprawy dostępności
farmaceutycznej NLPZ- środków leczniczych z II klasy
BCS. Farm Pol 2008; 64: 231-237.
3. Gomułka S. Bezpieczniejsze niesteroidowe leki przeciwzapalne-niespełnione oczekiwania (na razie?). Terapia i
Leki 2002; 5: 5-10.
4. Jug M i wsp.: Hydroxypropyl methylcellulose microspheres with piroxicam and piroxicam-hydroxypropylbeta-cyclodextrin inclusion complex. Pharmazie 2004;
59: 686-691.
5. Ingkatawornwong S i wsp.: Studies on aging piroxicampolyvinylpyrrolidone solid dispersions. Pharmazie 2001;
56: 227-230.
6. Albertini B i wsp.: Evaluation of beta-lactose, PVP K12
and PVP K90 as excipients to prepare piroxicam granules using two wet granulation techniques. Eur J Pharm
Biopharm 2003; 56: 479-487.
7. Verma M M i wsp.: Dissolution, bioavailability and ulcerogenic studies on piroxicam-nicotinamide solid dispersion formulations. Boll Chim Farm 2003; 142: 119-124.
8. Van Hees T i wsp.: Determination of the free/included
piroxicam ratio in cyclodextrin complexes: comparison between UV spectrophotometry and differential
scanning calorimetry.; Eur J Pharm Sci 2002; 15(4):
347-53.
9. Nachajski M, Zgoda M M. Zastosowanie solubilizacji
hydrotropowej i micelarnej w celu poprawy dostępności
farmaceutycznej NLPZ- środków leczniczych z II klasy
BCS. Farmacja Polska 2008, 64 (5), 231-237.
10.Jankowski A, Gadomska-Nowak M. Wpływ metody
sporządzania oraz dodatku substancji pomocniczych na
dostępność farmaceutyczną piroksykamu z czopków.
Farm Pol 2004; 20: 970-975.
11.Zgoda M M. Solubilizacja hydrotropowa i micelarna
trudno rozpuszczalnych w wodzie środków leczniczych.
Farm Pol 2007; 4(53): 135-143.
12.Szulc-Musioł B, Jankowski A. Influence of surfactants of
Rofam type on properties of piroxicam tablets. Acta Pol
Pharm Drug Research (w druku).
13.Farmakopea Polska VI. Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne. Warszawa 2002.
Beata Szulc-Musioł
Katedra i Zakład Farmacji Stosowanej
ul. Kasztanowa 3
41-200 Sosnowiec
Tel. 032 291-84-23
27
Depression of β1-integrin signalling and IGF-I receptor
expression is responsible for oxidative stress
– induced inhibition of collagen biosynthesis
and cell growth in cultured fibroblasts.
Osłabienie sygnału generowanego przez receptor β1
integrynowy oraz ekspresji receptora IGF-I jest odpowiedzialne
za indukowane przez stres oksydacyjny upośledzenie
Paweł Sienkiewicz, Wojciech Miltyk, Jerzy Pałka*
Department of Medicinal Chemistry
Medical University in Bialystok
Head of the Department: prof. Jerzy Pałka
ABSTRACT
STRESZCZENIE
The molecular mechanism of oxidative stress dependent
inhibition of collagen biosynthesis and cell growth was
studied in cultured human skin fibroblasts. Insulin-like
growth factor-I (IGF-I) and prolidase play an important
role in collagen biosynthesis and cell growth. IGF-I
stimulates collagen and prolidase gene expression.
Prolidase [EC 3.4.13.9] is involved in the recycling of
proline for the protein biosynthesis and cell growth.
Prolidase expression is under control of signaling by β1integrin receptor. The endpoint of signal transduced by
β1-integrin receptor, as well as IGF-IR, is activation of
MAP-kinases (ERK1, ERK2). The effects of oxidative
stress on collagen and DNA biosynthesis, expression
of prolidase, β1-integrin receptor, focal adhesion kinase
pp125FAK(FAK), IGF-IR and MAP- kinases (ERK1,
ERK2) were evaluated. Subconfluent cells were submitted to oxidative stresses with 30 µM t-butylhydroperoxide (t-BHP) for 1h per day for 3 days. It was found, that
oxidative stres induced inhibition of collagen biosynthesis, prolidase expression and cell growth in human
dermal fibroblasts. The mechanism of this phenomenon
was found at the level of IGFR and β1-integrin signaling. It explains the inhibition of collagen and DNA biosynthesis in fibroblasts submitted to oxidative stress.
Przedmiotem badań jest ocena molekularnego mechanizmu upośledzenia biosyntezy kolagenu i podziałów
komórkowych w przebiegu doświadczalnego stresu
oksydacyjnego w hodowli fibroblastów. Insulino-podobny czynnik wzrostowy I (IGF-I) i prolidaza pełnią
ważną rolę w biosyntezie kolagenu i wzroście komórek.
IGF-I pobudza ekspresję genów kolagenu i prolidazy.
Prolidaza [EC 3.4.13.9] uczestniczy w recyklingu proliny do biosyntezy białek i wzrostu komórek. Ekspresja
prolidazy jest pod kontrolą szlaku sygnałowego indukowanego przez receptor β1 integrynowy. Końcowym etapem szlaku sygnałowego indukowanego przez receptor
β1 integrynowy i receptor IGF-I jest aktywacja MAP
kinaz, ERK1 i ERK2. Zbadano wpływ doświadczalnego stresu oksydacyjnego na biosyntezę kolagenu i DNA,
ekspresję prolidazy, receptorów β1 integrynowego i IGF-I, białek FAK, ERK1 i ERK2. Fibroblasty przed osiągnięciem stanu inhibicji kontaktowej poddano stresowi
oksydacyjnemu przez dodatek do podłoża hodowlanego 30 μM t-butylo-nadtlenku wodoru (tBHP) na okres
1 godziny/dzień powtarzając tą procedurę przez 3 dni.
Wykazano, że stres oksydacyjny indukował obniżenie
biosyntezy kolagenu, ekspresji prolidazy i wzrostu komórek w hodowli fibroblastów. Wykazano, że mechanizm tego zjawiska obejmuje upośledzenie aktywacji
szlaków sygnałowych generowanych przez receptor β1
integrynowy i receptor IGF-I. Wyjaśnia to mechanizm
upośledzenia biosyntezy kolagenu i DNA w fibroblastach poddanych stresowi oksydacyjnemu.
Key words: collagen, cell growth, IGF-I receptor, β1integrins, intracellular signaling, oxidative stress, prolidase
Słowa kluczowe: fibroblasty, kolagen, prolidaza, receptor IGF-I, receptor β1 integrynowy, szlaki sygnałowe,
stres oksydacyjny
28
INTRODUCTION
Oxidative stress plays important role in pathogenesis of
many diseases. Oxygen radicals cause oxidation of nucleic
acids [1], lipids [2] and proteins [3] contributing to disturbances in cellular metabolism. One of the proteins affected
by oxidative stress is collagen [4-7].
Collagen is the most abundant extracellular protein in
mammals, responsible for maintenance of architecture and
integrity of connective tissue. It also plays an important role
in interaction with integrin receptors, through which it participates in regulation of numerous physiological and pathological processes [8, 9].
Collagen biosynthesis in human dermal fibroblasts may
depend on the activity of prolidase [10-12]. Prolidase [EC
3.4.13.9] is a cytosolic enzyme which catalyses hydrolysis
of imidodipeptides (mainly derived from collagen degradation) [13], releasing proline, which is used for collagen resynthesis [14] and cell growth [15].
Prolidase activity is known to be induced by β1-integrin
receptor activation [16]. Stimulated β1-integrin receptor induces phosphorylation of non-receptor focal adhesion kinase
pp125FAK(FAK) [17], which is then capable of interacting
with several proteins [18] and subsequently, two mitogen
activated protein kinases (MAPK), extracellular-signal-regulated kinase 1 (ERK1) and kinase 2 (ERK2) [19]. The end
point of the signaling is activation of transcription factors
and gene expression of many proteins involved in regulation
of cell growth and differentiation [20].
Another factor that stimulates collagen biosynthesis and
cell growth is the insulin-like growth factor- I (IGF-I) [21],
that exerts its effects through interaction with IGF-I receptor (IGF-IR) [22]. Stimulation of this receptor results in the
activation of the Ras-Raf-mitogen activated protein kinase
(MAPK) pathway, which involves the same signaling proteins and kinases as β1-integrin transduced pathway, except
FAK [23]. The effects of IGF-I action is induction of collagen gene expression [24], up-regulation of prolidase activity
[25], as well as stimulation of mitotic division and apoptosis
prevention [26].
The current study was undertaken to investigate the effects of oxidative stress on collagen and DNA biosynthesis,
expression of prolidase, β1-integrin receptor, FAK, MAPkinases (ERK1, ERK2) and IGF-I receptor (IGF-IR) in cultured fibroblasts.
MATERIALS AND METHODS
Materials. Anti–Goat IgG antibody, Anti–Mouse IgG
antibody, bacterial collagenase, Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/
nitro blue tetrazolium liquid substrate reagent (BCIP/NBT),
L-glycyl-proline, L-proline, monoclonal (rabbit) anti-focal
adhesion kinase pp125FAK antibody, monoclonal (goat) antiIGF-IR antibody, monoclonal (mouse) anti-MAPK antibody,
p-nitrophenol and p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside
were provided by Sigma Corp., USA., as were most other chemicals and buffers used. t-Butylhydroperoxide (tBHP) was the product of Fluka Chemie AG (Germany).
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) and fetal
Fig. 1. β-galactosidase activity in control human dermal fibroblasts
and the cells submitted to oxidative stress by treatment with 30 µM
t-butylhydroperoxide (t-BHP) as described in the methods section.
Mean values from three independent experiments done in duplicates are presented. P<0.001.
Fig. 2. 5-[3H] proline incorporation into proteins susceptible to the
action of bacterial collagenase in control human dermal fibroblasts
and the cells submitted to oxidative stress with t-BHP as described in
methods section. Mean values from three independent experiments
done in duplicates are presented. P<0.001.
bovine serum (FBS) used in cell culture were products of
Gibco, USA. Glutamine, penicillin and streptomycin were
obtained from Quality Biologicals Inc., USA. Monoclonal
(goat) anti-β1-integrin antibody and polyclonal (goat) antiβ-actin antibody were the products of Santa Cruz Biotechnology Inc., USA. Nitrocellulose membrane (0,2 µm), sodium dodecylsulphate (SDS), polyacrylamide, molecular
weight standards and Coomassie Briliant Blue R-250 were
received from Bio-Rad Laboratories, USA. L-5[3H] proline
(28 Ci/mmol) was purchased from Amersham, UK. Polyclonal (rabbit) anti-human prolidase antibody was the gift
from Dr. James Phang (NCI-Frederick Cancer Research and
Development Center, Frederick, MD, USA). Anti-Rabbit
IgG were obtained from Promega Corp., USA. [3H]thymidine (6,7 Ci/mmol) was purchased from ICN Biomedicals
Inc., USA and Scintillation Coctail „Ultima Gold XR” from
Packard, USA.
Tissue culture. All studies were performed on normal
human skin fibroblasts (CRL-1474), purchased in American
Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Fibrob-
29
Fig. 3. Western immunoblot analysis for prolidase in control human
dermal fibroblasts (C) and the cells submitted to oxidative stress
by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide (t-BHP) as described
in method section. Samples used for electrophoresis consisted of
20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6). Detection of β-actin
was carried out in order to provide the loading control. The arrows
indicate the molecular mass of standards. The intensity of the bands
was quantified by densitometric analysis.
Fig. 4. Western immunoblot analysis for β1-integrin receptor (A) and
FAK (B) in control human dermal fibroblasts (C) and the cells submitted to oxidative stress by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide
(t-BHP) as described in methods section. Samples used for electrophoresis consisted of 20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6).
Detection of β-actin was carried out in order to provide the loading
control. The arrows indicate the molecular mass of standards. The
intensity of the bands was quantified by densitometric analysis.
lasts were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal
bovine serum (FBS), 2 mM glutamine, 50 U/ml penicillin, 50
µg/ml streptomycin at 370C in a 5 % CO2 incubator. Cells were
counted in a hemocytometer and cultured at 1 x 105 cells per
well in 2 ml of growth medium in 6 well plates (Costar). Cells
reached about 80% of confluence at day 3 and such cells were
used for assays. Cells were used in the 8th to 14th passages.
Induction of oxidative stress in human dermal fibroblasts. Subconfluent cells were submitted to 2 repetitive oxidative stress by treatment for 2 days with 30 µM t-butylhydroperoxide (t-BHP) for 1 h per day according to the method
described by Dumont et al. [27]. Induction of oxidative stress
was performed in the following manner: 10 µl of 3 mM tBHP in DPBS was added to each well, containing 1 ml of
DMEM with 10% FBS and plates were incubated in 370C
for 1 hour. After this time, medium containing t-BHP was removed, cells were rinsed twice with DMEM and maintained
in DMEM containing 10% FBS. The next 1hour treatment
of the fibroblasts with t-BHP was performed after 24 hours,
30
Fig. 5. Western immunoblot analysis for IGF-I receptor in control
human dermal fibroblasts (C) and the cells submitted to oxidative
stress by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide (t-BHP) as described in methods section. Samples used for electrophoresis consisted of 20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6). Detection of
β-actin was carried out in order to provide the loading control. The
arrows indicate the molecular mass of standards. The intensity of the
bands was quantified by densitometric analysis.
Fig. 6. Time course experiment for DNA biosynthesis (measured
by [3H]thymidine incorporation assay) in control human dermal fibroblasts and the cells submitted to oxidative stress with 30 µM tbutylhydroperoxide (t-BHP) as described in methods section. Mean
values from three independent experiments done in duplicates are
presented.
in order to let the cells recover from the previous one. Control
cultures were incubated similarly but in the absence of t-BHP.
In order to prepare the cell extracts for assays the fibroblasts
were harvested 24h after the last scheduled stress.
Determination of β- galactosidase activity. The activity
of β- galactosidase was determined according to the method
described by Chateriee et al. [28], modified by Zwierz et al.
[29]. 150 µl of 20 mM solution of substrate (p-nitrophenylβ-D-galactopyranoside dissolved in Mc Ilvane’s phosphatecitrate buffer pH 4.7) was mixed with 200 µl of Mc Ilvane’s
phosphatecitrate buffer pH 4.7 and 50 µl of cell extract.
After 30 minutes of incubation in 370C, the reaction was terminated by adding 1ml borate buffer pH 9.8. The amount of
released p-nitrophenol was determined colorimetrically by
absorbance at 410 nm and calculated from calibration curve
for p-nitrophenol standards. Protein concentration was
measured by the method of Lowry et al.[30]. Enzyme activity was reported as nanomoles of released p-nitrophenol
during one minute per milligram of supernatant protein.
DNA synthesis. Cells were counted in a hemocytometer and cultured at 1 x 105 cells per well in 1 ml of growth
Fig. 7. Western immunoblot analysis for MAP- kinases- ERK1, ERK2
in control human dermal fibroblasts (C) and the cells submitted to
oxidative stress by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide (tBHP) as described in methods section. Samples used for electrophoresis consisted of 20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6).
Detection of β- actin was carried out in order to provide the loading
control. The arrows indicate the molecular mass of standards. The
intensity of the bands was quantified by densitometric analysis.
medium until they reached about 80% of confluence. After
the last 1h treatment of studied cells with t-BHP, 0.5 µCi
[3H]-thymidine (6.7 Ci/mmol) was added to each well and
plates were incubated in 370C with 5% CO2 for 4 hours. After that time cell surface was rinsed 3 times with 1 ml of 0.05
M Tris-HCl and 2 times with 1 ml of 5% TCA. Then, cells
were lysed in 1ml of 0.1 M NaOH containing 1% SDS. After
5 minutes the cell lysate was moved into scintillation vials
containing 4 ml scintillation liquid and radioactivity of the
samples was measured.
Collagen synthesis. After the last scheduled 1h treatment of studied fibroblasts with t-BHP, the cells were labeled for 24 h with 5[3H]proline (5 µCi/ml, 28 Ci/mmol)
and incorporation of radioactive precursor into proteins was
measured as described previously [30]. Incorporation of
tracer into collagen was determined by digesting proteins
with purified Clostridium histolyticum collagenase, according to the method of Peterkofsky [31]. Total protein synthesis
was calculated from the sum of radioactivity of collagenaseresistant proteins and collagen digest. Results are shown as
combined values for cell plus medium fractions.
SDS-PAGE. Slab SDS/PAGE was used, according to
the method of Laemmli [32].
Western Immunoblot Analysis. After SDS-PAGE, the
gels were allowed to equilibrate for 5 min. in 25 mM Tris,
0.2 M glycine in 20% (v/v) methanol. The proteins were
transfered to 0.2 µm pore-sized nitrocellulose at 100 mA
for 1 hour by using a LKB 2117 Multiphor II electrophoresis unit. The nitrocellulose was incubated with: polyclonal
antibody against human prolidase at concentration 1:3,000;
monoclonal anti-β1-integrin and polyclonal anti-FAK antibodies at concentration 1:1,000; monoclonal anti-IGF-IR
antibody, monoclonal anti-MAPK antibody and polyclonal
anti-β-actin antibody at concentration 1:5000 in 5% dried
milk in Tris buffered saline with Tween 20 (TBS-T) (20
mmol/l Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 150 mmol/l
NaCl and 0.05% Tween 20) for 1 hour. In order to analyze
prolidase and FAK, anti-Rabbit IgG (whole molecule) alkaline phosphatase conjugate was added at concentration
1:5,000 in TBS-T, in order to analyze MAP-kinases second antibody-alkaline phosphatase conjugated, anti-Mouse
IgG (whole molecule) was added at concentration 1:7,500
in TBS-T and in order to analyze β1-integrin subunit, IGFIR and β-actin second antibody- alkaline phosphatase
conjugated, anti-Goat IgG (whole molecule) was added at
concentration 1:5,000 in TBS-T and incubated for 30 min
while slowly shaking. Then nitrocellulose was washed with
TBS-T (5 x 5 min) and submitted to 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium liquid substrate
reagent (BCIP/NBT). The intensity of the bands was quantified by densitometric analysis.
RESULTS
Tert-butylhydroperoxide (t-BHP) that generates free
oxygen radicals [33] is commonly used as an experimental model for induction of oxidative stress in cultured cells
[34, 27]. The effectiveness of t-BHP in inducing oxidative
stress in fibroblasts was measured by determination of β- galactosidase activity that represent a biomarker of oxidative
stress [36, 27]. As can be seen in Fig. 1, β- galactosidase
activity was increased by about 2 fold in fibroblasts treated with
t-BHP compared to control cells. The results suggest high efficiency of t-BHP in inducing oxidative stress in studied cells.
Collagen biosynthesis was evaluated by measurement of
5[3H]proline incorporation into proteins, susceptible to action of bacterial collagenase, as described in Materials and methods. Exposure of cells to oxidative stress contributed to a decrease
in collagen biosynthesis to about 50 % of control (Fig. 2).
The decrease in collagen biosynthesis in human dermal
fibroblasts submitted to oxidative stress was accompanied
by a decrease in the prolidase expression (Fig. 3).
Although prolidase is stimulated through signal induced
by β1-integrin [16, 36], we observed no differences in expression of this receptor between control and t-BHP treated
fibroblasts (Fig. 4A). However, expression of FAK in the
cells treated with t-BHP was distinctly decreased, compared
to controls (Fig. 4B). It suggests, that β1-integrin signaling
may play important role in oxidative stress-induced collagen biosynthesis disturbances.
Considering the role of IGF-I in regulation of collagen
biosynthesis, we evaluated the expression of IGF-IR receptor
in studied cells. As can be seen in Fig. 5 in fibroblasts treated
with t-BHP, IGF-I receptor expression was decreased. Both
α and β subunits were affected.
Inhibitory effect of oxidative stress on expression of
IGF-I receptor suggests, that this phenomenon may attenuate DNA biosynthesis and subsequently mitotic divisions,
since IGF-I exerts a strong stimulatory effect on these processes [26]. Therefore, [3H]thymidine incorporation assay
was performed, as described in Materials and methods. During the time course of the experiment, DNA biosynthesis
significantly decreased in the cells treated with t-BHP compared to control (Fig. 6).
Signal transmitted by stimulated IGF-I receptor leads
to activation of two MAP-kinases (ERK1 and ERK2) [37].
As can be seen in Fig. 7 the expression of MAP- kinases
was decreased in fibroblasts treated with t-BHP, compared
to control cells.
31
DISCUSSION
Oxidative stress is known to affect tissue metabolism
[38,39]. It participates in pathogenesis of inflammation
[40,41] and diabetes [41,42], promotes carcinogenesis [1]
and induces cellular senescence resulting from accumulation of oxidative damage in DNA, lipids and proteins [43].
Collagen, which accounts for about one third of total body
proteins is essential not only for the maintenance of the connective tissue, but also for interaction with integrins. Activation of these receptors by extracellular matrix proteins, e.g.
collagen, regulates cellular gene expression, differentiation,
cell growth [44] and plays an important role in wound repair
[45], tumorigenicity and invasiveness [46].
This study suggests, that oxidative stress exerts inhibitory effect on collagen biosynthesis in human dermal fibroblasts. Similar effect on collagen production was previously
demonstrated in human cardiac fibroblasts exposed to varying concentrations of hydrogen peroxide or xanthine plus
xanthine oxide [7]. In order to explain the mechanism of this
process, we considered prolidase as a target enzyme.
Prolidase activity has been demonstrated to play an important role in regulation of collagen biosynthesis in fibroblasts [10-12]. In fact, the enzyme expression was decreased
in fibroblasts exposed to t-BHP. Decreased prolidase expression in these cells was accompanied by a decrease in the expression of phosphorylated FAK protein. The correlation is
well known phenomenon. Activation of β1-integrin receptor
that is known to increase in prolidase expression and activity [16, 36] leads to phosphorylation of FAK [17]. Therefore
decrease in expression of FAK in t-BHP treated fibroblasts
may explain decrease in prolidase expression. Similarly decreased expression of MAP- kinases (ERK1 and ERK2) was
observed in t-BHP treated cells.
Extracellular signal-regulated kinases pathway constitutes a major one, through which growth factor receptors
transmit signals to the nucleus. It is known, that some growth
factor receptors (EGFR, PDGFR or T-cell receptor) undergo phosphorylation in response to treatment with oxidants.
Their phosphorylation leads to activation of p44/42 MAPK
signaling pathway [47-52]. However, it has been recently
shown, that oxidative stress can variously modulate ERKs
activity in a time- and dose-dependent manner [53,54]. In
addition, reactive carbonyl compounds, glyoxal and methylglyoxal formed extensively in conditions of oxidative stress
have been demonstrated to be capable of dephosphorylation
of intracellular phospho-ERKs, what results in their inactivation [55].
IGF-I receptor is a receptor-tyrosine kinase that plays a
critical role in signaling that leads to cell survival and proliferation. It is also a strong stimulator of collagen and DNA
biosynthesis [21, 26]. It has been proposed, that activation
of this receptor may protect different cells from oxidative
stress [56-58] and regulate their resistance to the action of
oxidants [59].
We found that down-regulation of IGF-I receptor expression in fibroblasts submitted to oxidative stress was accompanied by parallel changes in expression of both MAP-kinases (ERK1 and ERK2). Simultaneously, DNA biosynthesis
in fibroblasts treated with t-BHP decreased during the time
32
course of the experiment. In view of these data it seems that
decrease in collagen biosynthesis and cell division caused
by oxidative stress may be mostly a consequence of disturbances in β1-integrin and IGF-I receptor signaling.
References
1. Kawanishi S., Hiraku Y., Oikawa S. Mechanism of guanine-specific DNA damage by oxidative stress and its
role in carcinogenesis and aging. Mutat. Res. 2001; 488:
65-76.
2. Mazhul V., Shcherbin D., Zavodnik I., Rękawiecka K.,
Bryszewska M. The effect of oxidative stress induced
by t-butyl hydroperoxide on the structural dynamics of
membrane proteins of chinese hamster fibroblasts. Cell
Biol Intern. 1999; 23: 345-350.
3. Stadtman E.R. Protein oxidation and aging. Science 1992;
257: 1220-1224.
4. Dean R.T., Thomas S.M., Vince G., Wolff S.P. Oxidation
induced proteolysis and its possible restriction by some
secondary protein modifications. Biomed Biochim Acta.
1986; 11-12: 1563-1573.
5. Monboisse J.C., Gardes-Albert M., Randaoux A., Borel
J.P., Ferradini C. Collagen degradation by superoxide
anion in pulse and gamma radiolysis. Biochim Biophys
Acta. 1988; 965: 29-35.
6. Kawaguchi Y., Tanaka H., Okada T., Konishi H., Takahashi M., Ito M., Asai J. The effects of ultraviolet A and
reactive oxygen species on the mRNA expression of
72-kDa type IV collagenase and its tissue inhibitor in
cultured human dermal fibroblasts. Arch Dermatol Res.
1996; 288: 39-44.
7. Siwik D.A., Pagano P.J., Colucci W.S. Oxidative stress
regulates collagen synthesis and matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts. Am J Physiol Cell
Physiol. 2001; 280: 53-60.
8. Gumbiner B.M., Yamada K.M. Cell-to-cell contact and
extracellular matrix. Curr Opin Cell Biol. 1995; 7: 615618.
9. Plow E.F., Haas T.A., Zhang L., Loftus J., Smith J.W. Ligand binding to integrins. J Biol Chem. 2000; 275: 2178521788.
10. Pałka J., Miltyk W., Karna E., Wołczyński S. Modulation of prolidase activity during in vitro aging of human
skin fibroblasts the role of extracellular matrix collagen.
Tokai J Exp Clin Med. 1996; 21: 207-213.
11. Miltyk W., Pałka J.A. Potential role of pyrroline 5-carboxylate in regulation of collagen biosynthesis in cultured human skin fibroblasts. Comp Biochem Physiol A.
2000; 125: 265-271.
12. Muszynska A., Pałka J., Gorodkiewicz E. The mechanism of daunorubicin-induced inhibition of prolidase
activity in human skin fibroblasts and its implication
to impaired collagen biosynthesis. Exp Toxicol Pathol.
2000; 52: 149-55.
13. Myara I., Charpentier C., Lemonnier A. Prolidase and
prolidase deficiency, Life Sci. 1984; 34: 1985-1998.
14. Yaron A., Naider F. Proline-dependent structural and
biological properties of peptides and proteins. Crit Rev
Biochem Mol Biol. 1993; 28: 31-81.
15. Emmerson K.S., Phang J.M. Hydrolysis of proline
dipeptides completely fulfills the proline requirement in
a proline-auxotropic Chinese hamster ovary cell line. J
Nutr. 1993; 123: 909-914.
16. Pałka J, Phang J. Prolidase activity in fibroblasts is regulated by interaction of extracellular matrix with cell
surface integrin receptor. J. Cell. Biochem. 1997; 67
166-175.
17. Hanks S.K., Calalb M.B., Harper M.C., Patel S.K. Focal
adhesion protein-tyrosine kinase phosphorylated in response to cell attachment to fibronectin. Proc Natl Acad
Sci USA. 1992; 89: 8487-8491.
18. Juliano R. Cooperation between soluble factors and
integrin- mediated cell anchorage in the control of
cell growth and differentiation. Bioessays 1996;18:
911-917.
19. Seger R., Krebs E.G. The MAPK signaling cascade.
FASEB J. 1995; 9: 726-735.
20. Labat-Robert J., Robert L. Interaction between cells
and extracellular matrix: signaling by integrins and the
elastin-laminin receptor. Prog. Mol. Subcell. Biol. 2000;
25: 57-70.
21. Goldstein R.H., Poliks C.F., Plich P.F., Smith B.D., Fine,
A. Stimulation of collagen formation by insulin-like
growth factor-I in cultures of human lung fibroblasts.
Endocrinology 1989; 124: 964-970.
22. Le Roith D., Werner H., Beitner-Johnson D., Roberts
Jr. C.T. Molecular and cellular aspects of the insulinlike growth factor-I receptor. Endocr. Rev. 1995;16:
143-64.
23. Butler A.A., Yakar S., Gewolb I.H., Karas M., Okubo
Y., LeRoith, D. Insulin-like growth factor-I receptor
signal transduction: at the interface between physiology and cell biology. Comp Biochem Physiol B. 1998;
121: 19-26.
24. Tanaka H., Wakisaka A., Ogasa H., Kawai S., Liang C.T.
Effect of IGF-I and PDGF administered in vivo on the
expression of osteoblast- related genes in old rats. J Endocrinol. 2002; 174: 63-70.
25. Miltyk W., Karna E., Wołczyński S., Pałka J. Insulin-like
growth factor I- dependent regulation of prolidase activity in cultured human skin fibroblasts. Mol Cell Biochem.
1998; 189: 177-184.
26. Baserga R., Hongo A., Rubini M., Prisco M., Valentinis
B. The IGF-I receptor in cell growth, transformation
and apoptosis. Biochem Biophys Acta. 1997; 1332:
105-106.
27. Dumont P., Burton M., Chen Q. M., Gonos E. S., Frippiat C., Mazarati J. B., Eliaers F., Remacle J., Touissant
O. Induction of replicative senescence biomarkers by
sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.
Free Radic Biol Med. 2000; 28: 361-373.
28. Chatteriee S., Velicer L.F., Sweeley C.C. Glycosphingolipid glycosyl hydrolases and glycosidases of synchronized human KB cells. J Biol Chem. 1975; 250:
4972- 4979.
29. Zwierz K., Gindzieński A., Głowacka D., Porowski T.
The degradation of glycoconjugates in the human gastric
mucous membrane. Acta Med Acad Sci Hung. 1981; 38:
145-152.
30. Oyamada I., Pałka J., Schalk E.M., Takeda K., Peterkofsky B. Scorbutic and fasted guinea pig sera contain an
insulin-like growth factor I reversible inhibitor of proteoglycan and collagen synthesis in chick embryo chondrocytes and adult human skin fibroblasts. Arch Biochem
Biophys. 1990; 276: 85-93.
31. Peterkofsky B., Pałka J., Wilson S., Takeda K., Shah V.
Elevated activity of low molecular weight insulin-like
growth factor- binding proteins in sera of vitamin C- deficient and fasted guinea pigs. Endocrinology 1991; 128:
1769-1779.
32. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;
227: 680-685.
33. Ochi T., Miyaura S. Cytotoxicity of an organic hydroperoxide and cellular antioxidant defense system against
hydroperoxides in cultured mammalian cells. Toxicology 1989; 55: 69-82.
34. Makino N., Bannai S., Sugita Y. Kinetic studies on the
removal of extrecellular tert-butyl hydroperoxide by
cultured fibroblasts. Biochim Biophys Acta 1995; 1243:
503-508.
35. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G.,
Roskeley C., Medrano E.E., Linskens M., Rubelj I.,
Pereira-Smith O., Peacocke M., Campisi, J. A biomarker that identifies senescent cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92:
9363-9367.
36. Pałka J.A., Phang J.M. Prolidase activity is regulated by
cell surface extracellular matrix interaction in normal fibroblast and MCF-7 cells. Proc Am Assoc Cancer Res.
1994; 35: 531.
37. Werner H., Le Roith D. New concepts in regulation and
function of the insulin-like growth factors: implications
for understanding normal growth and neoplasia. Cell
Mol Life Sci. 2000; 57: 932-942.
38. Mocali A., Caldini R., Chevanne M., Paoletti F. Induction, effects and quantification of sublethal oxidative
stress by hydrogen peroxide on cultured human fibroblasts. Exp Cell Res. 1995; 216: 388-395.
39. Allen R.G., Tresini M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radic Biol Med. 2000; 28; 463-499.
40. Salvemini D., Ischiropoulos, H., Cuzzocrea, S. Roles of
nitric oxide and superoxide in inflammation. Methods
Mol. Biol. 225 (2003) 291-303.
41. Jialal I., Devaraj S., Venugopal S.K. Oxidative stress,
inflammation, and diabetic vasculopathies: the role of alpha tocopherol therapy. Free Radic Res. 2002; 36: 13311336.
42. Haskins K., Bradley B., Powers K., Fadok V., Flores S.,
Ling X., Pugazhenthi S., Reusch J., Kench J. Oxidative
stress in type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci. 2003; 1005:
43-54.
43. Toussaint O., Medrano E.E., Von Zglinicki T. Cellular
and molecular mechanisms of stress- induced premature senescence (SIPS) of human diploid fibroblasts and
melanocytes. Exp Gerontol. 2000; 35: 927-945.
44. Carey D.J. Control of growth and differentiation of vascular cells by extracellular matrix. Ann Rev Physiol.
1991; 53: 161-177.
33
45. Hart J., Silcock D., Gunnigle S., Cullen B., Light N.D.,
Watt P.W. The role of oxidised regenerated cellulose/collagen in wound repair: effects in vitro on fibroblast biology and in vivo in a model of compromised healing. Int
J Biochem Cell Biol. 2002; 34; 1557-1570.
46. Varner J.A., Cheresh D.A. Integrins and cancer. Curr
Opin Cell Biol. 1996; 8: 724-730.
47. Sachsenmaier C., Radler-Pohl A., Zinck R., Nordheim
A., Herrlich P., Rahmsdorf H.J. Involvement of growth
factor receptors in the mammalian UVC response. Cell.
1994; 78: 963-972.
48. Schieven G.L., Mittler R.S., Nadler S.G., Kirihara J.M.,
Bolen J.B., Kanner S.B., Ledbetter J.A., 1994. ZAP-70
tyrosine kinase, CD45, and T cell receptor involvement
in UV- and H2O2-induced T cell signal transduction. J
Biol Chem. 1994; 269: 20718-20726.
49. Huang R.P., Wu J.X., Fan Y., Adamson E.D. UV activates growth factor receptors via reactive oxygen intermediates. J Cell Biol. 1996; 133: 211-220.
50. Knebel A., Rahmsdorf H.J., Ullrich A., Herrlich P. Dephosphorylation of receptor tyrosine kinases as target of
regulation by radiation, oxidants or alkylating agents.
EMBO J. 1996; 15: 5314-5325.
51. Zanella C.L., Posada J., Tritton T.R., Mossman B.T. Asbestos causes stimulation of the extracellular-regulated
kinase 1 mitogen-activated protein kinase cascade after
phophorylation of the epidermal growth factor receptor.
Cancer Res. 1996; 56: 5334-5338.
52. Chen W., Martindale J.L., Holbrook N.J., Liu Y. Tumor
promoter arsenite activates extracellular signal-regulated kinase through a signaling pathway mediated by epidermal growth factor receptor and Shc. Mol Cell Biol.
1998; 18: 5178-5188.
Adres do korespondencji;
Prof. Jerzy Pałka
Department of Medicinal Chemistry
Medical University of Białystok
ul. Jana Kilinskiego 1
15-089 Białystok
Tel: (85)7485706
34
53. Li J., Holbrook N.J. Common mechanisms for declines
in oxidative stress tolerance and proliferation with aging.
Free Radic Biol Med. 2003; 35: 292-299.
54. Bai X., Lu D., Bai J., Zheng H., Ke Z., Li X., Luo S.
Oxidative stress inhibits osteoblastic differentiation of
bone cells by ERK and NF-κB. Biochem Biophys Res
Commun. 2004; 314: 197-207.
55. Akhand A.A., Hossain K., Kato M., Miyata T., Du J., Suzuki H., Kurokawa K., Nakashima I. Glyoxal and methylglyoxal induce aggregation and inactivation of ERK
in human endothelial cells. Free Radic Biol Med. 2001;
31: 1228-1235.
56. Kang B.P., Urbonas A., Baddoo A., Baskin S., Malhotra A., Meggs L.G. IGF-I inhibits the mitochondrial apoptosis program in mesangial cells exposed to
high glucose. Am J Physiol Renal Physiol. 2003; 285:
1013-1024.
57.Hong F., Kwon S.J, Jhun B.S., Kim S.S., Ha J., Kim
S.J., Sohn N.W., Kang C., Kang I., 2001. Insulinlike growth factor-1 protects H9c2 cardiac myoblasts from oxidative stress-induced apoptosis via
phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular
signal-regulated kinase pathways. Life Sci. 2001;
68: 1095-1105.
58.Galvan V., Logvinova A., Sperandio S., Ichijo H.,
Bredesen D.E. Type 1 insulin-like growth factor receptor (IGF-IR) signaling inhibits apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1). J Biol Chem. 2003; 278: 1332513332.
59.Holzenberger M., Dupont J., Ducos B., Leneuve P.,
Geloen A., Even P.C., Cervera P., Le Bouc Y. IGF-I
receptor regulates lifespan and resistance to oxidative
stress in mice. Nature 2003; 421: 182-187.
Wpływ stopnia ufosforylowania bakteryjnych endotoksyn
na ich aktywność biologiczną
The influence of phosphorylation degree of bacterial endotoxins
on their biological activity
Jolanta Lodowska1, Dorota Jasek1, Daniel Wolny 2, Ludmiła Węglarz1, Zofia Dzierżewicz2
Katedra i Zakład Biochemii, 2Katedra i Zakład Biofarmacji,
Wydział Farmaceutyczny, Śląska Akademia Medyczna,
Kierownik Katedry i Zakładu Biochemii: prof. dr hab. Ludmiła Węglarz
Kierownik Katedry i Zakładu Biofarmacji: prof. dr hab. Zofia Dzierżewicz
1
Streszczenie
Lipopolisacharyd (LPS), zwany endotoksyną bakteryjną, jest głównym czynnikiem wywołującym zakażenia
bakteriami Gram-ujemnymi. Ten składnik zewnętrznej
błony bakteryjnej posiada trzy regiony o odmiennych
funkcjach biologicznych: część O-swoistą, rdzeń oligosacharydowy oraz lipid A. Za aktywność biologiczną
odpowiedzialny jest komponent lipidowy, którego skład
i budowa przestrzenna decyduje o aktywności biologicznej endotoksyny. Jednym z istotnych dla właściwości
biologicznych LPS aspektów strukturalnych jest stopień
ufosforylowana lipidu A, wpływa bowiem na rozpuszczalność endotoksyny w układach wodnych oraz przyłączenie jej do białka wiążącego LPS (LBP, ang. LPS
binding potein) i transportującego ją do fosfolipidowej
błony komórkowej zainfekowanego makroorganizmu.
Mniejszy stopień podstawienia lipidu A grupami fosforanowymi warunkuje mniejszą aktywność endotoksyczną, przejawiającą się np. zahamowaniem indukcji cytokin oraz obniżeniem powinowactwa do receptorów LPS
na komórkach ludzkich. Brak podstawników fosforanowych w lipidzie A zmniejsza również uporządkowanie
reszt acylowych, co w efekcie modyfikuje właściwości
biologiczne endotoksyny.
Grupy fosforanowe mogą także występować w regionie
heptozowym i Kdo oligosacharydu rdzeniowego. Działają one jak sygnały indukujące lub inhibujące Kdo-transferazy i heptozylotransferazy. Ponadto z fosforanami
mogą łączyć się kationy Mg2+ i Ca2+ warunkując strukturalną i funkcjonalną integralność błony zewnętrznej.
Abstract
Lipopolysaccharide, also called endotoxin, is a major pathogenic factor of Gram-negative bacteria. This bacterial
outer membrane component consists of three regions:
antigen-O, oligosaccharide core and lipid A, which differ
in chemical structure and biological activity. Lipid A is
essential for the endotoxic effects of Gram-negative bacteria and its composition and structural features determine biological activities of LPS complexes. The degree
of lipid A phosphorylation is one of the crucial features
responsible for the bioactivity of this region, affecting
on solubility of endotoxin in water and its attachment
to LPS binding protein (LPB), which transport endotoxin to cell membrane of infected macroorganisms. The
decrease of endotoxic activity, manifested by decreased
secretion cytokines and reduced affinity to human cell
LPS receptors, is correlated with the lower degree of
phosphorylation. The lack of phosphate groups in lipid
A also influences three-dimensional arrangement of acylic substituents which modifies biological properties of
endotoxins.
Phosphate groups may also be attached to heptoses and
Kdo in the core region of LPS. They function as inhibiting or inducing signals for heptosyltransferases and
Kdo-transferases. Moreover, Mg2+ and Ca2+ kations may
join phosphate groups, thus affecting structural and functional integrity of the outer membrane.
Key words: lipopolysaccharide, lipid A, phosphates,
biological activity
Słowa kluczowe: lipopolisacharyd, lipid A, fosforany,
aktywność biologiczna
35
Wprowadzenie
Lipopolisacharyd (LPS) jest jednym z najważniejszych
składników strukturalnych zewnętrznej błony bakterii Gram
-ujemnych. Uczestniczy bowiem w procesie komunikowania
tych mikroorganizmów ze środowiskiem zewnętrznym [1].
Wpływa także na prawidłowe funkcjonowanie oraz przeżywalność komórek bakteryjnych chroniąc je przed działaniem kwasów żółciowych zainfekowanego makroorganizmu i hydrofobowych antybiotyków [2]. Ten heteropolimer,
składający się z trzech połączonych kowalencyjnie komponentów strukturalnych: części O-swoistej, oligosacharydu
rdzeniowego i lipidu A, odpowiedzialny jest za chorobotwórczość bakterii Gram-ujemnych. Stymuluje leukocyty
i komórki śródbłonka, co powoduje uwolnienie licznych cytokin i mediatorów stanu zapalnego, m.in. interleukin (IL-1,
IL-6, IL-8, IL-10), czynnika martwicy nowotworu (TNFα),
produktów metabolizmu kwasu arachidonowego (prostaglandyny, leukotrieny), czynnika aktywującego płytki krwi,
wolnych rodników tlenowych, nadtlenku wodoru i tlenku
azotu [3-5]. Dla podkreślenia jego działań negatywnych nazwano go endotoksyną bakteryjną. Na aktywność biologiczną LPS wpływ ma przede wszystkim struktura chemiczna
lipidu A, m. in. jego stopień ufosforylowania. Jednak grupy
fosforanowe mogą też często występować w wewnętrznej
części oligosacharydu rdzeniowego [6,7]. Nie można jednak
wykluczyć podstawienia nimi reszt cukrowych w antygenie O
[8]. Najczęstsze miejsca podstawienia fosforanami struktury
LPS przedstawiono na ryc. 1.
Zależność aktywności biologicznej
lipopolisacharydu od jego struktury
chemicznej
Za wzorzec całkowitej aktywności biologicznej uznano lipid A wyizolowany z bakterii Escherichia coli. Jego
szkielet cukrowy stanowi disacharyd d-glukozoaminylowy
(GlcpN-β(1→6)-GlcpN) podstawiony dwiema grupami
fosforanowymi. Jedna związana jest estrowo w pozycji 4’
Ryc. 1. Budowa chemiczna lipopolisacharydu [5]
Fig. 1 Chemical structure of lipopolysaccharide [5]
36
(GlcNII) na końcu nieredukującym, a druga α-glikozydowo
w pozycji 1 (GlcNI) końca redukującego. Do tego disacharydu przyłączone są cztery reszty acylowe w pozycjach 2,
3, 2’, 3’ oraz dwie kolejne będące podstawnikami kwasów
tłuszczowych znajdujących się w pozycjach 2’ i 3’ GlcNII
[5,9]. Jest to więc difosforylowany heksaacyl lipid A o asymetrycznym rozmieszczeniu kwasów tłuszczowych (ryc. 2).
Bardzo podobną strukturą charakteryzuje się lipid A rodzaju
Pectinatus, który także wykazuje pełną aktywność endotoksyczną [10]. Badania mające na celu ustalenie struktury chemicznej LPS syntetyzowanego przez różne bakterie
Gram-ujemne, dowiodły, że odstępstwa od tej „wzorcowej”
budowy wpływają na obniżenie aktywności biologicznej
[11-14]. Pełną aktywność toksyczną wykazuje lipid A zawierający disacharyd heksozoaminylowy podstawiony asymetrycznie sześcioma resztami acylowymi [15,16]. Jest on
100-krotnie bardziej aktywny niż cząsteczka o pięciu lub
siedmiu resztach acylowych (ryc. 2). LPS zawierający heksaacylowany lipid A jest łatwiej wiązany przez makrofagi
niż endotoksyna o dwóch lub czterech resztach acylowych.
Lipidowy komponent LPS podstawiony czterema kwasami
tłuszczowymi jest prawie nieaktywny biologicznie, a deacylowany nie wykazuje żadnej aktywności w obronie przed
leukocytami [3,5,17].
Na aktywność biologiczną lipidu A wpływ ma również
asymetria podstawienia kwasami tłuszczowymi szkieletu
cukrowego. Bakterie, których grupy acylowe w lipidzie A
ułożone są symetrycznie, np. Chromobacterium violaceum,
Neisseria meningitidis wykazują dużo mniejszą toksyczność niż struktury z niesymetrycznym rozmieszczeniem
tych podstawników [2,17].
Wpływ stopnia ufosforylowania lipidu A
na jego aktywność biologiczną
O właściwościach biologicznych lipidu A stanowi nie
tylko liczba, rodzaj oraz rozmieszczenie kwasów tłuszczowych, ale także ilość reszt fosforanowych. Holst i wsp. [11]
twierdzą, że podstawniki fosforanowe szkieletu cukrowego
Ryc. 2. Wpływ modyfikacji strukturalnych hydrofobowej składowej lipidu A na aktywność biologiczną bakteryjnych endotoksyn na przykładzie
zmian strukturalnych w lipidzie A E. coli wraz ze współczynnikami określającymi stopień zmniejszenia aktywności zmodyfikowanego lipidu
A w odniesieniu do jego kompletnej struktury [5,20]
Fig. 2 The influence of structural modifications of hydrophobic part of lipid A on biological activity of bacterial endotoxins, as exemplified
by E. coli lipid A structural changes with coefficients reflecting degree of a decrease of modified lipid A activity with reference to its whole
structure
lipidu A mogą pośrednio wpływać na rozpuszczalność LPS
w układach wodnych, zwiększając tym samym jego toksyczność. Również Cox i wsp. [18] stwierdzili korelację między
stopniem ufosforylowania lipidu A a jego aktywnością biologiczną. Nie tylko LPS bakterii E. coli [15], który uznaje
się za „wzorcowy”, lecz także jego mutant K12, który jest
odporny na peptydowy antybiotyk polimyksynę B, wykazuje dużą aktywność. Prawdopodobnie wiąże się to z występowaniem w lipidzie A tych drobnoustrojów znacznych ilości
fosfoetanoloaminy. W lipidzie A Campylobacter jejuni zidentyfikowano aż trzy różne disacharydy heksozoaminylowe
o dość niepospolitych strukturach. Jednak w każdym z nich
zostały zachowane dwa podstawniki fosforanowe. Mimo
różnic strukturalnych aktywność lipidu A tego patogenu jest
porównywalna z aktywnością „wzorcowego” LPS. Wykazuje on w organizmie gospodarza letalność, pirogenność
i lokalną nekrozę skórną [19]. Potwierdza to wpływ stopnia ufosforylowania lipidu A na jego aktywność biologiczną. Za słusznością powyższej tezy przemawiają również
wyniki badań Rietschel’a i wsp. [20], według których, im
mniej reszt fosforanowych zawiera lipid A, tym mniejszą wykazuje aktywność. Lipid A z monofosforylowanym przy C1 lub C4’ disacharydem heksozoaminylowym
jest 100 razy mniej aktywny niż zawierający dwa takie
podstawniki (ryc. 3) [3]. Także Kumada i wsp. [21] zauważyli, że wysoka aktywność LPS jest uwarunkowana
lipidem A o strukturze difosforylowanej w pozycji 1 i 4’
cukru. Prowadząc badania na niepodstawionym w pozycji
4’ i monofosforylowanym przy C1 rdzenia heksozoaminylowego lipidzie A bakterii Porphyromonas gingivalis,
stwierdzili jego niską endotoksyczność oraz pewną unikalną
cechę biologiczną - indukcję mitozy w komórkach śledziony
myszy niewrażliwych na endotoksynę. Niska chorobotwórczość cechuje też lipid A bakterii Marinomonas vaga lub
Bacteroides fragilis, zawierający tylko glikozydowo związany fosforan w pozycji 1 [22,23]. Z tego względu LPS
B. fragilis uznawany jest za antagonistę endotoksyny, co
może mieć znaczenie przy opracowywaniu szczepionek.
Według Krauss’a i wsp. [24] także brak grupy fosforanowej w pozycji 1, a jej obecność przy C4’ szkieletu disacharydowego lipidu A skutkuje obniżeniem toksyczności
(Neisseria gonorrhoeae, Mesorhizobium huakuii). Nieufosforylowany i niewykazujący aktywności biologicznej
lipid A syntetyzują m.in. bakterie Bacteroides intermedius, Rhizobium leguminosarum i Francisella tularensis
[25-27].
Zależność aktywności biologicznej od stopnia ufosforylowania lipidu A została przedstawiona w tabeli I.
Reszty fosforanowe, jako ujemnie naładowane podstawniki szkieletu cukrowego lipidu A, mogą mieć również
wpływ na przyłączanie endotoksyny do białka wiążącego
LPS (LBP, ang. LPS binding potein), które transportuje je
do fosfolipidowej błony komórkowej zainfekowanego makroorganizmu [17]. Zastąpienie grup fosforanowych resztami α-d-mannopiranozowymi nie wpływa na właściwości
fizykochemiczne, ale powoduje zmniejszenie aktywności
endotoksycznej, przejawiającej się zahamowaniem indukcji
cytokin oraz obniżeniem powinowactwa do receptorów LPS
na komórkach ludzkich [17]. Schwudke i wsp. [28] twierdzą, że brak podstawników fosforanowych zmniejsza także
37
Ryc. 3. Modyfikacje hydrofilowej komponenty lipidu A a aktywność biologiczna bakteryjnych endotoksyn, na przykładzie zmian strukturalnych
w lipidzie A E. coli wraz ze współczynnikami określającymi stopień zmniejszenia aktywności zmodyfikowanego lipidu A w odniesieniu do jego
kompletnej struktury [5,20]
Fig. 3 The effect of modifications of hydrophylic part of lipid A on biological activity of bacterial endotoxins, as exemplified by E. coli lipid A
structural changes with coefficients reflecting degree of a decrease of modified lipid A activity with reference to its whole structure
uporządkowanie reszt acylowych w lipidzie A, co w efekcie
modyfikuje właściwości biologiczne LPS.
Bakterie Porphyromonas gingivalis, Rhodobacter sp.
syntetyzują charakteryzujący się niewielką endotoksycznością lipid A o strukturze różniącej się od formy o „wzorcowej” aktywności jedynie podstawnikami fosforanowymi
i acylowymi [29]. Jednak niektóre mikroorganizmy (Plesiomonas shigelloides, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodobacter capsulatus) posiadają niewykazujący aktywności
toksycznej lipid A o strukturze odpowiadającej temu komponentowi LPS u E. coli. Łukasiewicz i wsp. [30] sugerowali, że bakteria Plesiomonas shigelloides ma dużą zdolność indukcji cytokin, co może wynikać z difosforylowanej
struktury lipidu A. Jednak przeczą temu wyniki ich późniejszych badań in vitro prowadzonych na zdefosforylowanej
cząsteczce tego składnika LPS, bowiem nie potwierdziły
wpływu ufosforylowania na powyższą formę aktywności
biologicznej. Do nieaktywnych zaliczono również stosunkowo konserwatywną, difosforylowaną strukturę lipidu A
bakterii Rhodopseudomonas sphaeroides [31] i Rhodobacter capsulatus [24]. Silipo i wsp. [32] wysunęli tezę o syntetyzowaniu przez bakterie nieufosforylowanego lipidu A
o zmniejszonym stopniu zacylowania jako celowej strategii
polegającej na łagodzeniu obrony makrooorganizmu. Bhat
i wsp. [26] sugerują, że obecność podstawników fosforanowych w disacharydzie glukozoaminylowym jest dużo ważniejsza dla bakterii jelitowych niż innych, gdyż warunkuje
ich żywotność, oraz wraz z resztami acylowymi determinuje właściwości toksyczne lipidu A oraz zdolność LPS do
immunostymulacji w zainfekowanym makroorganizmie.
Do grup fosforanowych lipidu A mogą być przyłączone
dodatkowe podstawniki, np. etanoloamina (Etn), drugi fosforan (P), 4–aminoarabinoza (4-AraN), 4-amino-4-deoksy-l-
38
arabinopiranoza (l-Arap4N), d-arabinofuranoza (Araf),
glukozoamina (GlcN) [33-35]. Prawdopodobnie mogą one
wzmagać aktywność toksyczną LPS lub ją modyfikować.
Vaara i wsp. [36] twierdzą, że kationowa 4-AraN wzmaga
oporność przeciwko niektórym antybiotykom dzięki odpychaniu przez grupy fosforanowe czynników antymikrobiologicznych posiadających ładunek dodatni, np. polimyksynę
B. Przy czym, oporność na ten antybiotyk jest proporcjonalna do liczby podstawionych 4-AraN grup fosforanowych
w lipidzie A. Prowadząc badania nad LPS bakterii z rodzaju Pectinatus Helander i wsp. [37] początkowo sugerowali, że obecność niezestryfikowanego fosforanu w dystalnej
GlcN jest istotna dla wiązania polimyksyny. Jednak ich teza,
o oporności na ten antybiotyk mikroorganizmów (Bacteroides fragilis, Chromobacterium violaceum, Proteus mirabilis, Pseudomonas cepacia, mutanty pmr S. typhimurium)
syntetyzujących lipid A pozbawiony tej grupy fosforanowej
lub zawierający kationowe podstawniki, nie została potwierdzona w badaniach nad Pectinatus. Ich dalsze badania dowiodły jednak, że dodatnio naładowane podstawniki
reszt fosforanowych w lipidzie A determinują reaktywność
względem polimyksyny. Maskowanie grup fosforanowych
skutkuje przesunięciem w kierunku kationowym ładunku
pola elektrostatycznego w LPS, co nie sprzyja wiązaniu
polimyksyny i w konsekwencji wpływa na wirulencję bakterii [37].
Lipid A Chromobacterium violaceum zawiera podstawione obie grupy fosforanowe - pierwszą glikozydowo
GlcN, a drugą estrowo l-Arap4N [38]. Prawdopodobnie nadaje to specyficzność serologiczną lipidowi A. Pomimo, iż
właściwości biologiczne tej cząsteczki nie zostały jeszcze
w pełni zbadane, to sugeruje się jej znaczną aktywność, niższą jednak niż „aktywnych” form LPS. Krauss i wsp. [24]
Rodzaj podstawnika
Organizm
disacharydu w pozycji
C4’
Agrobacterium tumefaciens
Bordetella pertussis
Bartonella henselae
Chlamydia trachomatis
Comamonas testosteroni
Escherichia coli
Erwinia carotovora
Haemophilus ducreyi
Haemophilus influenzae
Pseudomonas reactans
Yersinia pestis
Pectinatus frisingensis
Pectinatus cerevisiiphilus
Pseudomonas aeruginosa PA01
Plesiomonas shigelloides
Salmonella typhimurium
Moraxella catarrhalis
Vibrio cholerae
Campylobacter jejuni
Chromobacterium violaceum
Klebsiella pneumoniae O3
Rhodospirillum tenue 2761
Rhodopseudomonas gelatinosa
Rhodobacter capsulatus
Porphyromonas gingivalis
Rhodopseudomonas sphaeroides
Neisseria gonorrhoeae
Shigella sonnei
Mesorhizobium huakuii
Bacteroides fragilis
Flavobacterium meningosepticum
Leptospira interrogans
Marinomonas vaga
Aquifex pyrophilus
Bacteroides intermedius
Bdellovibrio bacteriovorus
Francisella tularensis
Rhizobium etli
Rhizobium leguminosarum
Rhodomicrobium vannielii
Aktywność biologiczna
Literatura
wysoka
średniowysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
brak danych
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
wysoka
brak danych
wysoka
średniowysoka
wysoka
wysoka
wysoka
niska
niska
niska
[32]
[33]
[47]
[48]
[29]
[9]
[41]
[45]
[46]
[49]
[35]
[10]
[10]
[51]
[30]
[36]
[52]
[34]
[40]
[38]
[37]
[53]
[39]
[24]
[21]
[31]
zredukowana
brak danych
zredukowana
zredukowana
niska
zredukowana
niska
[54]
[55]
[14]
[22]
[13]
[56]
[23]
niska
niska
niska
niska
niska
brak danych
niska
[12]
[25]
[28]
[27]
[57]
[26]
[11]
C1
Difosforylowane
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P
-P-l-Arap4N
-P
-P-l-Arap4N
-P-PEtn
-P
-P
-P-l-Arap4N
-P
-P-PEtn
-P
-P-PEtn
-P-PEtn
-P-Etn
-P-Arap4N
-P-GlcpN
-P-l-Arap4N
-P-l-Arap4N
-P-Araf
-P-l-Arap4N
-P
-P
-P-Etn
-P-Etn
-P
-P-Etn
-P
-P
Monofosforylowane
-P
-P
-P
-GalA
-P
-P
-PMe
-P
Nieufosforylowane
-GalA
-d-Manp
-d-Manp
-GalA
-GalA
-d-GlcN
-d-Manp
P – reszta fosforanowa, Etn – etanoloamina, PEtn – fosfoetanoloamina, d-GalpA – kwas d-galakturonowy, Arap4N–4-amino-4-deoksy-l-arabinopiranoza, Araf
- arabinofuranoza, GlcpN – 2-amino-2-deoksy-d-glukopiranoza, d-Manp – d-mannopiranoza, Me – grupa metylowa, d-GlcN - d-glukozoamina, GalA - kwas
galakturonowy
Tabela I. Stopień ufosforylowania lipidu A i aktywność biologiczna bakterii Gram-ujemnych
Table I. Phosphorylation degree of lipid A and biological activity of Gram-negative bacteria
stwierdzili, że podstawienie reszty fosforanowej etanoloaminą lub fosfoetanoloaminą zmniejsza toksyczność lipidu A. Przeczą temu jednak wyniki badań zawierającego te
podstawniki LPS bakterii Rhodopseudomonas gelatinosa,
które wykazały wysoką aktywność biologiczną tej endotoksyny [39].
Odzwierciedleniem przestrzennym struktury chemicznej lipidu A jest jej konformacja, która wpływa na właściwości biologiczne lipopolisacharydu. Struktura chemiczna
o największej aktywności, czyli difosforylowany heksaacyl
lipid A z asymetrycznie rozmieszczonymi podstawnikami
acylowymi przybiera kształt stożkowaty, charakteryzujący
się dużym kątem odchylenia szkieletu glukozoaminylowego
od powierzchni tworzonej przez kwasy tłuszczowe (>45°).
Taka konformacja lipidu A skutkuje silną indukcją IL-6
[17]. W monofosforylowanym lipidzie A kąt odchylenia jest
mniejszy i cząsteczka występuje w bardziej cylindrycznej
konformacji. Jest to związane z obniżeniem jej aktywności
toksycznej, przejawiającej się w hamowaniu sekrecji IL-6
[5,17]. Łukasiewicz i Ługowski [2] twierdzą, że cylindrycz-
39
ne lipidy A tetra- lub pentaacylowane o kącie nachylenia
mniejszym niż 25° całkowicie tracą swoje właściwości toksyczne.
Zależność funkcji biologicznych oligosacharydu rdzeniowego od stopnia jego
ufosforylowania
W strukturze LPS ufosforylowany może być nie tylko lipid A, lecz także oligosacharyd rdzeniowy. Niektóre bakterie
Gram-ujemne posiadają region heptozowy oraz Kdo (kwas
3-deoksy-d-mannooktulozonowy) podstawione w pozycji
7 fosforanem lub jego pochodnymi, najczęściej fosfoetanoloaminą lub pirofosforanem. U meningokoków stwierdzono zróżnicowanie immunotypowe, bowiem niektóre z nich
posiadają przy C3 lub C6 dystalnej heptozy (HepII) fosfoetanoloaminę (PEtn), a u innych brak tego podstawnika
[18]. W pozycji C6, rzadziej C7, komponentu oligosacharydowego LPS bakterii Campylobacter jejuni Aspinall i wsp.
[40] zidentyfikowali PEtn związaną z proksymalną resztą
heptozową (HepI). Również u Erwinia carotovora występuje jednostka HepI monofosforylowana w pozycji C4 [41].
LPS Klebsiella pneumoniae serotypu C3 posiada ubogo
ufosforylowany rdzeń oligosacharydowy, a w serotypie C1
zamiast reszty fosforanowej występuje kwas galakturonowy [37]. Gatunki Pectinatus cerevisiiphilus i P. frisingensis
syntetyzują wyjątkową strukturę sacharydową – ufosforylowaną glukozoaminę przyłączoną do C4 Kdo [10]. LPS
z ufosforylowanym Kdo w pozycji C5 zidentyfikowano
również u Vibrio cholerae, Bacteroides gingivalis i Bordetella pertussis [42-44]. W endotoksynach Haemophilus ducreyi obecny jest monofosforylowany Kdo [45].
Nie wyjaśniono jeszcze w pełni wpływu ufosforylowania komponenty oligosacharydowej LPS na aktywność biologiczną tych biomolekuł. Według Helander’a i wsp. [46]
obecne w Kdo podstawniki fosforanowe mogą działać jak
sygnały indukujące lub inhibujące Kdo-transferazy i heptozylotransferazy. Ponadto z fosforanami mogą łączyć się
kationy Mg2+ i Ca2+ warunkując strukturalną i funkcjonalną integralność błony zewnętrznej. Ufosforylowana część
rdzeniowa endotoksyny bakterii Helicobacter pylori ma
natomiast znaczenie w wiązaniu lamininy, glikoproteiny
występującej w błonach komórkowych makroorganizmów.
Proces ten jest istotny w inicjowaniu kolonizacji śluzówki żołądka przez te bakterie i prawdopodobnie wiąże się
z wpływem LPS na prawidłowe oddziaływanie białek błony
podstawnej komórek, a tym samym słabszym wiązaniem lamininy z jej receptorem w nabłonku żołądka [3].
Łukasiewicz i wsp. [30] zasugerowali, że w warunkach
in vivo rdzeń oligosacharydowy Plesiomonas shigelloides
typu S zawierający, zamiast reszty fosforanowej, kwas galakturonowy, może wykazywać zdolność do dezagregacji
i mniej efektywnej neutralizacji komórki bakteryjnej przez
organizm gospodarza, co teoretycznie przekłada się na
wyższą toksyczność tych mikroorganizmów.
40
Piśmiennictwo
1. Rietschel ETh, Wollenweber HW, Brade H, Zahringer U,
Lindner B, Seydel U, Bradaczek H, Barnickel G, Labischinski H, Giesgrecht P, Structure and Conformation of
the Lipid A Component of Lipopolisaccharides, Handbook
of Endotoxin, Elsevier, Science Publishers 1984, 187-219.
2. Łukasiewicz J, Ługowski C. Biologiczna aktywność lipopolisachrydu. Post Hig Med Dośw 2003; 57: 33-53.
3. Różalski A. Lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych –
struktura chemiczna, aktywność biologiczna i znaczenie w
chorobotwórczości. (II) Budowa chemiczna a funkcja biologiczna LPS. Post Mikrobiol 1995; 3 (XXXIIV): 317-33.
4. Saluk–Juszczak J, Wachowicz B. Aktywność prozapalna
lipopolisacharydu. Post Biochem 2005; 51: 280-5.
5. Lodowska J i wsp.: Heterogenność strukturalna lipidu A
bakterii Gram-ujemnych. Post Hig Med Dośw 2007; 61:
106-21.
6. Olsthroon MMA i wsp.: Identification of a novel core
type in Salmonella lipopolysaccharide. Complete structure analysis of the core region of the lipopolysaccharide
from Salmonella enterica sv. arizonae O62. J Biol Chem
1998; 273: 3817-29.
7. Vinogradov EV i wsp.: The structures of the carbohydrate backbones of the lipopolysaccharides from Escherichia coli rough mutants F470 (R1 core type) and F576
(R2 core type). Eur J Biochem 1999; 261: 629-39.
8. Shashkov AS i wsp.: Structure of a 2-aminoethyl phosphate-containing O-specific polysaccharide of Proteus
penneri 63 from a new serogroup O68. Eur J Biochem
2000; 267: 601-5.
9. Rosner MR i wsp.: Structure of the lipopolysaccharide
from an Escherichia coli heptose-less mutant. I. Chemical degradations and identification of products. J Biol
Chem 1979; 254: 5906-17.
10.Helander IM i wsp.: Chemical structure of the lipid A
component of lipopolysaccharides of the genus Pectinatus. Eur J Biochem 1994; 224: 63-70.
11.Holst O i wsp.: structural studies on the phosphate-free
lipid A of Rhodomicrobium vannielii ATCC 17100. Eur J
Biochem 1983; 137: 325-32.
12.Plötzt B i wsp.: Characterization of a novel lipid A containing d-galacturonic acid that replaces phosphate residues. The structure of the lipid A of the lipopolysacchride
from the hyperthermophilic bacterium Aquifex pyrophilus. J Biol Chem 2000; 275: 11222-8.
13.Tanamoto K i wsp.: Biological properties of lipid A isolated from Flavobacterium meningosepticum. Clin Diagn
Lab Immun 2001; 8: 522-7.
14.Choma A, Sowiński P. Characterization of Mesorhizobium
huakuii lipid A containing both d-galacturonic acid and
phosphate residues. Eur J Biochem 2004; 271: 1310-22.
15.Rosner MR i wsp.: Structure of the lipopolysaccharide
from an Escherichia coli heptose-less mutant. I. Chemical degradations and identification of products. J Biol
Chem 1979; 254: 5906-17.
16.Alexander C, Zähringer U. Chemical structure of lipid
A – the primary immunomodulatory center of bacterial
lipopolysaccharides. Trends Glycosci Glyc 2002; 14:
69-86.
17.Schromm AB i wsp.: Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A
portion. Eur J Biochem 2000; 267: 2008-13.
18.Cox AD i wsp.: Phosphorylation of the lipid A region
of meningococcal lipopolysaccharide: Identification of a
family of transferases that add phosphoetanoloamine to
lipopolysaccharide. J Bacteriol 2003; 185: 3270-7.
19.Moran AP i wsp.: Structural analysis of the lipid A component of Campylobacter jejuni CCUG 10936 (serotype
O:2) lipopolysaccharide. Description of a lipid A containing a hybrid backbone of 2-amino-2-deoxy-d-glucose
and 2,3-diamino-2,3-dideoxy-d-glucose. Eur J Biochem
1991; 198: 459-69.
20.Rietschel E i wsp.: Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J
1994; 8: 217-25.
21.Kumada H i wsp.: Structural study on the free lipid A
isolated from lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol 1995; 177: 2098-106.
22.Weintraub A i wsp.: Structural characterization of the lipid
A component of Bacteroides fragilis strain NCTC 9343
lipopolysaccharide. Eur J Biochem. 1989; 183: 425-31.
23.Krasikova IN i wsp.: Detailed structure of lipid A from lipopolysaccharide from the marine proteobacterium Marinomonas vaga ATCC 27119. Eur. J. Biochem. 2004;
271: 2895-904.
24.Krauss JH i wsp.: Structural analysis of the nontoxic lipid A of Rhodobacter capsulatus 37b4. Eur J Biochem
1989; 180: 519-26.
25.Johne B, Olson I, Bryn K. Fatty acids and sugars in lipopolysaccharides from Bacteroides intermedius, Bacteroides gingivalis and Bacteroides loescheii. Oral Microbiol
Immunol 1988; 3: 22-7.
26.Bhat UR, Forsberg LS, Carlson RW. Structure of lipid
A component of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli lipopolysaccharide. Unique nonphosphorylated lipid
A containing 2-amino-2-deoxygluconate, galacturonate,
and glucosamine. J Biol Chem 1994; 269: 14402-10.
27.Vinogradov E, Perry MB, Conlan JW. Structural analysis
of Francisella tularensis lipopolysaccharide. Eur J Biochem 2002; 269: 6112-8.
28.Schwudke D i wsp.: The obligate predatory Bdellovibrio
bacteriovorus possesses a neutral lipid A containing α-dmannoses that replace phosphate residues. Similarities
and differences between the lipid A and the lipopolysaccharides of the wild type strain B. bacteriovorus HD100
and its host-independent derivative HI100. J Biol Chem
2003; 278: 27502-12.
29.Iida T i wsp.: Chemical structure of lipid A isolated from
Comamonas testosteroni lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1996; 237: 468-75.
30.Łukasiewicz T i wsp.: Structure of the lipid A – inner
core region and biological activity of Plesiomonas shigelloides O54 (strain CNCTC 113/92) lipopolysaccharide. Glycobiology 2006; 16: 538-50.
31.Quereshi N i wsp.: Chemical reduction of 3-oxo and
unsaturated groups in fatty acids of diphosphoryl lipid
A from the lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas
sphaeroides. Comparison of biological properties before and after reduction. J Biol Chem 1991; 266: 6532-8.
32.Silipo A i wsp.: Full structural characterization of the lipid A components from the Agrobacterium tumefaciens
strain C58 lipopolysaccharide fraction. Glycobiology
2004; 14: 805-15.
33.Caroff M i wsp.: Structural characterization of the lipid
A of Bordetella pertussis 1414 endotoxin. J Bacteriol
1994; 176: 5156-9.
34.Broady KW, Rietschel ET, Lüderitz O. The chemical
structure of the lipid A component of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae. Eur J Biochem 1981; 115:
463-8.
35.Venezia ND i wsp.: Lipopolysaccharides from Yersinia
pestis. Studies on lipid A of lipopolysacccharides I and
II. Eur J Biochem 1985; 151: 399-404.
36.Vaara M, Viljanen P. Binding of polymyxin B nonapeptide to gram-negative bacteria. Antimicrob. Agents Chemother 1985; 27: 548-54.
37.Helander IM i wsp.: Characterization of lipopolysaccharides of polymyxin-resistant and polymyxin-sensitive
Klebsiella pneumoniae O3. Eur J Biochem 1996; 237:
272-8.
38.Hase S, Rietschel ET. The chemical structure of the lipid
A component of lipopolysaccharides from Chromobacterium violaceum NCTC 9694. Eur J Biochem 1977; 75:
23-34.
39.Tharanathan RN i wsp.: The structure of lipid A from the
lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas gelatinosa
29/1. Arch Microbiol 1985; 141: 279-83.
40. Aspinall GO i wsp.: Chemical structure of the
core region of Campylobacter jejuni serotype O:2
lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1993; 213:
1029-37
41.Fukuoka S i wsp.: Elucidation of the structure of the core
region and the complete structure of the R-type lipopolysaccharide of Erwinia carotovora FERM P-7576. Eur J
Biochem 1997; 250: 55-62.
42.Brade H. Occurrence of 2-keto-deoxyoctonic acid 5-phosphate in lipopolysaccharides of Vibrio cholerae ogawa
and inaba. J Bacteriol 1985; 161: 795-8.
43.Kumada H i wsp.: Occurrence of O-phosphorylated
2-keto-3-deoxyoctonate in the lipopolysaccharide of
Bacteroides gingivalis. FEMS Microbiol Lett 1988; 51:
77-80.
44.Chaby R, Szabó L. 3-deoxy-2-octulosonic acid 5-phosphate: a component of the endotoxin of Bordetella
pertussis. Eur J Biochem 1975; 59: 277-80.
45.Melaugh W i wsp.: Partial characterization of the major
lipooligosaccharide from a strain of Haemophilus ducreyi, the causative agent of chancroid, a genital ulcer
disease. J Biol Chem 1992; 267: 13434-9.
46.Helander IM i wsp.: Chemical structure of the lipopolysaccharide of Haemophilus influenzae strain I-69 Rd-/b+.
Eur J Biochem 1988; 177: 483-92.
47.Zähringer U i wsp.: Structure and biological activity of the short-chain lipopolysaccharide from Bartonella henselae ATCC 49882. J Biol Chem 2004; 279:
21046-54.
48.Rund S i wsp.: Structural analysis of the lipopolysaccharide from Chlamydia trachomatis serotype L2. J Biol
Chem 1999; 274: 16819-20.
41
49.Silipo A i wsp.: Structural determination of lipid A of the
lipopolysaccharide from Pseudomonas reactans. Eur J
Biochem 2002; 269: 2498-505.
50.Venezia ND i wsp.: Lipopolysaccharides from Yersinia
pestis. Studies on lipid A of lipopolysacccharides I and
II. Eur J Biochem 1985; 151: 399-404.
51.Bhat UR i wsp.: Structural studies of lipid A from Pseudomonas aeruginosa PA01: occurrence of 4-amino-4deoxyarabinose. J Bacteriol 1990; 172: 6631-6.
52.Masoud H, Perry MB, Richards JC. Characterization of
the lipopolysaccharide of Moraxella catarrhalis. Structural analysis of the lipid A from M. catrarrhalis serotype A
lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1994; 220: 209-16.
53. Tharanathan RN, Weckesser J, Mayer H. Structural studies on the d-arabinose-containing lipid A from Rhodospirillum tenue 2761. Eur J Biochem 1978; 84: 385-94.
54.Post DMB i wsp.: Intracellular survival of Neisseria gonorrhoeae in male urethral epithelial cells: importance
of a hexaacyl lipid A. Infect Immun 2002; 70: 909-20.
55.Ł ugowski C, Romanowska E. Chemical studies on
Shigella sonnei lipid A. Eur J Biochem 1974; 48:
319-23.
56.Que-Gewirth NLS i wsp.: A methylated phosphate group
and four amide-linked acyl chains in Leptospira interrogans lipid A. The membrane anchor of an unusual lipopolysaccharide that activates TLR2. J Biol Chem 2004;
279: 25420-9.
57.Que NLS i wsp.: Purification and mass spectrometry
of six lipid A species from the bacterial endosymbiont
Rhizobium etli. Demonstration of a conserved distal unit
and variable proximal portion. J Biol Chem 2000; 275:
28006-16.
dr Jolanta Lodowska
Katedra i Zakład Biochemii,
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
tel.: 032 364 1064
42
w raku endometrium
Expression profile of genes connected with biological activity of leptin
in endometrial cancer
Małgorzata Stachowicz1, Joanna Orchel1, Jacek Olender1,
Izabela Woźniczko1 Andrzej Witek2
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej w Sosnowcu
Katedra i Klinika Położnictwa i Ginekologii w Katowicach
3
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej w Sosnowcu
1
2
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej w Sosnowcu
Kierownik: dr hab. Urszula Mazurek
Streszczenie
Leptyna indukuje wzrost komórek nowotworowych
poprzez aktywację różnych ścieżek sygnałowych w komórce. Celem pracy było porównanie transkryptomów
tkanek endometrium wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix)
oraz wyselekcjonowanie z puli transkryptów genów
kodujących białka związane z aktywnością biologiczną leptyny, które na poziomie mRNA różnicują tkanki endometrium. W badaniu analizowano wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz
gruczolakoraka endometrium G1-G4, Na podstawie
bazy Affymetrix, bazy NCBi i danych literaturowych
wyselekcjonowano 91 transkryptów genów kodujących
białka związane z aktywnością biologiczną leptyny.
Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Expres
wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.6,0,
Excel oraz SAM (significance analysis of microarrays)
Wśród tych genów w gruczolakoraku endometrium
obserwowano nadekspresję MMP2, MMP9 i VEGFA.
w porównaniu do endometrium prawidłowego w fazie
proliferacyjnej.
Słowa kluczowe; leptyna, mikromacierz oligonukleotydowa, rak enometrium
Wstęp
Leptyna (LEP) początkowo zidentyfikowana jako hormon związany z regulacją przyjmowania pokarmu, jest adipokiną o wielokierunkowym działaniu. Plejotropowa natura leptyny związana jest z występowaniem w organizmie
receptora leptyny Ob-R. Znanych jest kilka izoform receptora leptyny będących wynikiem alternatywnego składania eksonów i proteolitycznego rozszczepienia białek
już istniejących izoform receptora (ryc. 1). Wewnątrzko-
Summary
Intracellular signalling pathways are activated by leptin
and are involved in cancerogenesis.
The aim of the study was to analyze of endometrial
tissues transcriptome by using oligonucleotide microarray technique (HGU133A Affymetrix). Next, among
from 91 transcripts connecting with biological activity
of leptin there were choose genes which differentiated
investigated tissues of endometrium. There were analyzed: endometrium histopatological estimated as healthy in proliferative phase and endometrial adenocarcinoma (G1-G4). The obtained values of fluorescence for
each probe on microarray chips were normalized with
the RMAExpress.. Differences in mRNA levels were
evaluated with SAM program (Significance Analysis of
Microarrays), Statistica v.6,0 and Excel. Among from
91 transcripts connecting with biological activity of leptin including transcripts involved in leptin– induced intracellular signaling pathway; MMP2, MMP9 i VEGFA
occurred overexpression in cancer tisssues.
Key words; leptin, oligonucleotide microarray, endometrial cancer
mórkowa domena receptora leptyny Ob-Rb zawiera region
box1 złożony z 29 aminokwasów, który przyłącza domenę
kinazy tyrozynowej Janusa JAK2, region box2 również odpowiedzialny za przyłączenie kinazy JAK oraz region box3,
miejsce wiązania białek STAT (ang. signal transducer and
activator of transcription), które po ufosforylowaniu i utworzeniu dimerów pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych
w regulacji ekspresji genów [1,] (ryc. 1). Badania Myers’a
dowodzą, że w przypadku długiej izoformy receptora leptyny Ob-Rb do aktywacji kinaz JAK oprócz regionu box1
43
kinase1) oraz kinazy MEK1/MAP2K1
i MEK2/MAP2K2 (ang. mitogen-activated protein kinase kinase 1; mitogenactivated protein kinase kinase 2) i kinaza
Raf [2]. Kinazy MAP przemieszczają się
do jądra komórkowego, gdzie dochodzi
do fosforylacji i aktywacji czynników
transkrypcyjnych, takich jak c-jun, c-fos,
c-myc, erg-1 i w konsekwencji prowadzi
do indukcji ekspresji genów związanych
z procesami proliferacji i różnicowania].
Ufosforylowana Tyr 985 jest miejscem
przyłączania się zarówno fosfatazy tyrozynowej SHP-2 jak i białka hamującego
przekaz sygnału, białka SOCS3 (ang.
suppressor of cytokine signaling 3). Przyłączenie białka SOCS3 do reszty Tyr 985
Ryc. 1. Izoformy receptora leptyny; Ob-Ra – krótka izoforma receptora leptyny, Obznosi sygnał przekazywany za pośrednicRb – długa izoforma receptora leptyny, Ob-Re – rozpuszczalna forma receptora
twem Ob-Rb z powodu uniemożliwienia
leptyny, Lep – leptyna, regiony – box-1, box-2, box-3; JAK2 – kinaza tyrozynowa
Janusa 2 (ang. Janus Kinase 2), Tyr985, Tyr1077, Tyr1138 – reszty tyrozynowe w obrębie
przyłączenia się JAK2 do receptora. Białwewnątrzkomórkowej domeny długiej izoformy receptora leptyny, p – fosforylacja,
ko SOCS3 oddziałuje poprzez domeny SH2
białka STAT (ang. the Signal Transducers and Activators of Transcription), MAP – kiz ufosofrylowaną resztą Tyr 985 receptora
nazy aktywowane mitogenami (ang. mitogen-activated protein kinases)
leptyny blokując jego aktywność [2].
Badania ostatnich lat wykazały obecwymagana jest także obecność odcinka złożonego z 31-36
ność
jej
receptorów
(LEPR)
w wielu komórkach i narząreszt aminokwasowych [2].
dach,
a
co
za
tym
idzie
zaangażowanie
leptyny w: angioDługa izoforma receptora leptyny OB-Rb, ze względu
genezę,
dojrzewanie
układu
rozrodczego,
tworzenie kości,
na podobieństwo strukturalne do podjednostki gp 130, aktygojenie
ran,
a
także
funkcjonowanie
układu
immunologiczwuje po połączeniu się z ligandem ścieżki przekazu sygnału
nego
[3,4,5,].
Badania
ostatnich
lat
dowodzą,
że leptyna inw komórce. Białko gp 130 oddziałuje z kinazami tyrozynodukuje
wzrost
komórek
nowotworowych
poprzez
aktywawymi z rodziny JAK (Janus Kinase) i jest łącznikiem przecję
różnych
ścieżek
sygnałowych
w
komórce
[6,7,8,9,10,].
noszącym pobudzenie z aktywowanego receptora na kinazę
Poznanie plejotropowej aktywności leptyny w komórkach
tyrozynową
Jak pokazano na rycinie 1, Ob-Rb posiada w obrębie zmienionych nowotworowo może w przyszłości być wywewnątrzkomórkowej domeny trzy konserwatywne reszty korzystane do projektowania strategii terapeutycznych
tyrozynowe; Tyr 985, Tyr 1077 i Tyr 1138, które wykazują w walce z rakiem. Chociaż ilość prac dotyczących funkcji
różną zdolność aktywowania przekazu sygnału w komórce leptyny i jej receptora w różnych typach nowotworów stale
i określają plejotropową naturę receptora leptyny. Leptyna wzrasta, to jednak nadal jest to temat nie do końca poznany.
łącząc się na powierzchni komórki z receptorem OB-Rb po- Do dzisiaj nie została w pełni poznana funkcja leptyny i jej
woduje jego dimeryzację i aktywuje poprzez transfosforyla- receptora w progresji różnych typów nowotworów, w tym
cję kinazę tyrozynową Janusa JAK2, co w dalszej kolejności w raku endometrium, który jest piątym pod względem częprowadzi do fosforylacji reszt tyrozynowych w obrębie we- stości występowania nowotworem złośliwym kobiet [11].
Nowotwory zaliczane na podstawie badania klinicznego
wnątrzkomórkowej domeny OB-Rb.
Tyr 985 uczestniczy w aktywacji w komórce szlaku i patomorfologicznego do tego samego stadium zaawansoERK1/2 – szlaku kinaz regulowanych przez sygnały ze- wania, leczone w ten sam sposób, w różnym stopniu poddają
wnątrzkomórkowe (ang. extra cellular signal-regulated się terapii. Różnice te przypisywane są cechom molekularkinases). Kinaza tyrozynowa JAK 2 asocjuje z Ob-Rb za nym, które odpowiedzialne są za różny przebieg kliniczny
pośrednictwem domeny box1 oraz fragmentu złożonego nowotworów o podobnym obrazie histologicznym. Analiza
z 31-36 aminokwasów. Ufosforylowane reszty tyrozynowe molekularna nowotworów umożliwia poszukiwanie genów,
na powierzchni Ob-Rb stanowią miejsca przyłączania białek które są zaangażowane w proces nowotworzenia. Duże nasygnałowych z domenami SH2 (ang. Src homology). Ufos- dzieje w leczeniu nowotworów wiąże się z terapią celowaforylowana reszta Tyr 985 przyłącza fosfatazę tyrozynową ną, której głównym przesłaniem jest poszukiwanie leków
SHP‑2, która następnie ulega fosforylacji i przyłącza białko z grupy związków oddziałujących na receptory substancji
adaptorowe Grb2. W konsekwencji w komórce zostaje uru- będących czynnikami wzrostu. Szlaki przekazywania sychomiony przekaz sygnału za pośrednictwem kaskady kinaz gnału w komórce odgrywające rolę w regulacji proliferacji,
MAP-2 białkowych kinaz aktywowanych przez czynniki apoptozie i transformacji nowotworowej stanowią podstamitogenne (ang. mitogen activated protein kinases), w który wę badań mających na celu poszukiwanie potencjalnych
ostatecznie zaangażowane są kinazy ERK (ERK1; MAPK3 markerów mających znaczenie w procesie nowotworzenia.
ang. extracelluarly regulated protein kinases1; mitogen- Ponieważ zasadniczym założeniem terapii celowanej jest
activated protein kinase 3 i ERK2; MAPK1 – extracellu- poszukiwanie leków, które byłyby w stanie hamować receparly regulated protein kinases2; mitogen-activated protein tory komórkowe, za pośrednictwem których dochodzi w ko-
44
mórce do pobudzenia szlaków związanych
z procesami nowotworzenia, coraz większe
znaczenie mają badania prowadzone na poziomie całego, genomu, transkryptomu lub
proteromu
Celem przedstawionej pracy było porównanie transkryptomów związanych
z aktywnością biologiczną leptyny w endometrium prawidłowym w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraku endometrium, wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix).
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiły wycinki
endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraka endometrium
G1-G4, pobieranych od chorych leczonych
w Katedrze i Klinice Położnictwa i GinekoRyc 2. Geny związane z aktywnością biologiczną leptyny charakteryzujące się nadelogii w Katowicach.
kspresją aktywności transkrypcyjnej w raku endometrium w porównaniu do aktywności
Ekstrakcja całkowitego RNA: Po homo- transkrypcyjnej genów w endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej
genizacji 50-100 mg wycinków endometrium przy użyciu homogenizatora Pozytron
w programie RMA Expres wykorzystując programy kompu(Kinematyka AG, Szwajcaria), ekstrahowano RNA z uży- terowe: Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance anaciem odczynnika TRIZOL (Gibco BRL) (Invitrogen Life lysis of microarrays).
Technologies, Kalifornia, USA), zgodnie z protokołem producenta Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wy- Wyniki
korzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit, Qiagen w celu
usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń DNA. Ekstrakty
Analizę profilu ekspresji genów kodujących białka kaRNA oceniano ilościowo przy użyciu spektrofotometru Ge- skad sygnałowych aktywowanych przez leptynę w wycinneQuant II (Pharmacia) Wartość absorbancji przy długości kach endometrium, rozpoczęto od porównania raportów
fali 260 nm była podstawą do obliczenia stężenia RNA, wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymeprzy założeniu, że wynik pomiaru w kuwecie o drodze trix bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescencji na
optycznej 1 cm równy 1 OD260 odpowiada stężeniu 40 µg mikromacierzy. Rozkład sygnałów fluorescencji na płytce,
RNA w 1 cm3 ekstraktu, oraz jakościowo techniką elektro- zgodny z zaleceniami producenta mikromacierzy (Affymeforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem ety- trix „Technical Manual GeneChip Expression Analysis”)
dyny.
był podstawą do akceptacji kolejnych transkryptomów do
Wyznaczanie transkryptomu metodą mikroma- analizy porównawczej, którą rozpoczęto od normalizacji
cierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HG- wyników w programie RMA Express, w celu wyrównania
U133A (Affymetrix). Około 8 µg całkowitego RNA zostało zróżnicowanych wartości tła oraz szumu, zmniejszającego
wykorzystane do syntezy dwuniciowego cDNA (Gibco BRL prawdopodobieństwo błędnej interpretacji wyników.
SuperScript Choice system). W następnym etapie otrzymaAnalizę porównawczą transkryptomów, rozpoczęto od
ny cRNA wyznakowano biotyną (reakcja transkrypcji in grupowania transkryptomów wykonując aglomeracyjną
vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA analizę skupień. Jako miarę odległości między mikromaprzeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3 cierzami wykorzystano odległość Czebyszewa, a zastosooraz HG-U133A (Affymetrix) Znakowanie produktów hy- waną metodą aglomeracji była metoda średnich połączeń
brydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem ważonych. Oceniono w ten sposób zgodność grupowania
streptawidyna–fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami wycinków na podstawie charakterystyki klinicznej, histopaprzeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi tologicznej i molekularnej. Do analizy porównawczej typostreptawidyna–fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGE- wano te transkryptomy, które były kwalifikowane do tej saWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej mej grupy, niezależnie od zastosowanego kryterium podziaHG–U133A w przewodniku Gene Expression Analysis łu (klinicznego, histopatologicznego czy molekularnego).
Technical Manual (Affymetrix, Kalifornia, USA). W naW dalszym etapie analizy porównawczej z grupy 22283
stępnym etapie płytki mikromacierzy poddano skanowaniu mRNA, które można analizować na mikromacierzy HGskanerem Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent U133A, na podstawie danych literaturowych oraz bazy
Technologies, Kalifornia, USA). Otrzymane wyniki inten- NCBI i Affymetrix wyselekcjonowano 91 transkryptów,
sywności fluoroscencji zostały zapisane i zarchiwizowa- których geny kodują białka uczestniczące w ścieżkach przene w programie Microarray Suite. Analizę porównawczą kazu sygnału w komórce, aktywowanych przez leptynę.
transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wynikow
Następnie wykorzystując technikę Blanda i Altmana wy-
45
ID
201069_at
201693_s_at
203936_s_at
211527_x_at
mRNA
SLR
1,41
2 SLR
4,09
MMP2
Metaloproteinaza 2 (gelatinase A),
↑
EGR1
białko odpowiedzi wczesnego wzrostu (early growth
response 1)
2,24
9,4
↑
MMP9
metallopeptidase 9 (gelatinase B),
1,81
6,11
↑
VEGFA
czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular
endothelial growth factor A
1,58
4,85
↑
Tabela 1
Transkrypty różnicujące raka endometrium wybrane z 91 mRNA związanych z aktywnością biologiczną leptyny. SLR – ang. signal log ratio
– stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych grupach, 2SLR – wartość opisująca wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji pomiędzy porównywanymi transkryptomami, strzałka ↑ - oznacza, nadekspresję genu w wycinkach
gruczolakoraka endometrium
selekcjonowano geny, które różnicują wycinki endometrium
prawidłowego w fazie proliferacyjnej i gruczolakoraka endometrium G1-G4 (tab. 1, ryc 2).
Dyskusja
Technika mikromacierzy oligonukleotydowych została
wykorzystana w celu analizy transkryptów wchodzących
w skład ścieżek sygnałowych aktywowanych w komórce po połączeniu się leptyny z jej receptorem. Spośród 91
transkryptów genów związanych z aktywnością biologiczną leptyny, Wyznaczenie dla wszystkich transkryptów parametru SLR wskazującego wielokrotność różnicy sygnału
fluorescencji charakterystycznych dla transkryptomów endometrium kontrolnego i gruczolakoraka, stanowilo jedno
z kryteriów typowania genów różnicujących endometrium.
Otrzymane wyniki wskazują, że obserwowane różnice aktywności transkrypcyjnej genów tj. MMP2, MMP9 i VEGFA mogą mieć związek z procesem angiogenezy, W danych
literaturowych wciąż poszerzana jest lista czynników i cząsteczek stymulujących ten proces. Istnieją doniesienia literaturowe, w których podkreśla się udział leptyny jako czynnika proangiogennego stymulującego proces angiogenezy
in vivo i in vitro. Badania Somasundar i wsp. [13] na przykład dowodzą, że in vitro leptyna ma zdolność wzmagania
proliferacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych
z siłą działania podobną do tej, jaką posiada VEGF (vascular endothelial growth factor). Badania prowadzone na
modelach zwierzęcych potwierdziły, że leptyna ma zdolność stymulowania procesu angiogenezy synergistycznie
z dwoma innymi kluczowymi czynnikami proangiogennymi, tj. z FGF-2 (fibroblast growth factor) i VEGF. Ponadto leptyna zwiększa ekspresję genów zaangażowanych
w proces angiogenezy, tj.: MMP-2 (matrix metalloproteinases 2) i MMP-9 (matrix metalloproteinases 9) [14].
W świetle otrzymanych wyników wydaje się jednak, że
proces angiogenezy w raku endometrium stymulowany
jest raczej poprzez aktywację VEGF a nie leptynę, o czym
świadczy brak tej ostatniej wśród genów różnicujących
badane tkanki nowotworowe i histopatologicznie ocenione jako zdrowe.
46
Piśmiennictwo
1. Frühbeck G. Intracellular signalling pathways activated
by leptin. Biochem J 2006; 1(393): 7-20.
2. Myers MG, Jr. Leptin receptor signaling and the regulation of mammalian physiology. The Endocrine Society
2004; 59: 287-304.
3. Trentz O.A , Handschin A.E., Hemmi S., Zund G, Wanner G.A., Trentz O. Leptin regulates human osteoblast
proliferation and phenotype marker expression in vitro.
European Cells and Materials. 2004; 7(1), 89
4. Frank S., Stallmeyer B., Kampfer H., Kolb N., Pfeilschifter J. Leptin enhances wound re-epithelialization and
constitutes a direct function of leptin in skin repair. JClin-Invest. 2000; 106(4), 501-9
5. Matarese G. Leptin and the immune system: how nutritional status influences the immune response. Eur Cytokine Netw. 2000; 11(1), 7-14
6. Pai R, Lin C, Tran T, Tarnawski A. Leptin activates
STAT and ERK2 pathways and induces gastric cancer
cell proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 2005
Jun 17;331(4):984-92
7. Frankenberry KA, Skinner H, Somasundar P, McFadden DW, Vona-Davis LC. Leptin receptor expression
and cell signaling in breast cancer. Int J Oncol. 2006
Apr;28(4):985-93
8. Somasundar P, Frankenberry KA, Skinner H, Vedula G,
McFadden DW, Riggs D, Jackson B, Vangilder R, Hileman SM, Vona-Davis LC. Prostate cancer cell proliferation is influenced by leptin. J Surg Res. 2004 May
1;118(1):71-82]
9. Attoub S., Noe V., Pirola L., Bruyneel E., Chastre E.,
Mareel M., Wymann M.P., Gespach Ch. Leptin promotes
invasiveness of kidney and colonic epithelial cells via phosphoinositide 3-kinase-, Rho-, and Rac-dependent signaling
pathways. The FASEB Journal. 2000;14, 2329-2338
10.Koda M., Sulkowska M., Wincewicz A., Kanczuga-Koda L., Musiatowicz B., Szymanska M, Sulkowska S.
Expression of leptin, leptin receptor, and hypoxia inducible factor 1α in human endometrial cancer. Annals of the
New York Academy of Sciences. 2007; 1095(1), 90-98
11. Kaźmierczak W. Rak endometrium – aspekty hormonalne. Ginek Prakt. 2004; 12( 2), 13-16
12.Somasundar P, Yu AK, Vona-Davis L, McFadden DW.
Differential effects of leptin on cancer in vitro. J Surg
Res 2003; 113: 50-55.
13.Park HY, Kwon HM, Lim HJ, Hong BK, Lee JY, Park
BE, Jang Y, Cho SY, Kim HS. Potential role of leptin
in angiogenesis: leptin induces endothelial cell proliferation and expression of matrix metalloproteinases in vivo
and in vitro. Exp Mol Med. 2001; 33(2): 95-102.
mgr Małgorzata Stachowicz
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Wydziału Farmaceutycznego i Oddziału Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny,
41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1,
tel.: 00 48 032 364 10 20, fax: 00 48 032 364 10 20,
47
w terapii genowej nowotworów
Recombinant adeno-associated virus vector (rAAV) preparations
for cancer gene therapy
Maciej Małecki1,2, Karolina Hajdukiewicz2, Jan Pachecka2
Zakład Biologii Komórki, Centrum Onkologii-Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Warszawa
Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny,
Warszawa
1
2
p.o. Kierownika Zakładu Biologii Komórki: doc. dr hab. Maciej Małecki
Kierownik Katedry i Zakładu Biochemii i Chemii Klinicznej: prof. dr hab. Jan Pachecka
Streszczenie
W terapii genowej wykorzystuje się, zawierające kodujące sekwencje kwasów nukleinowych, preparaty genowe wprowadzane do komórek za pomocą nośników
genów, czyli wektorów. Prawidłowy układ nośnik/gen
decyduje o wydajnym procesie transfekcji oraz ekspresji genów, która warunkuje efekt terapeutyczny, odpowiedź biologiczną komórek, narządów. Prowadzone są
intensywne badania nad uzyskiwaniem bezpiecznych
dla pacjentów preparatów genowych. Wektory konstruowane w oparciu o genom wirusów związanych
z adenowirusami (rAAV) efektywnie wnoszą geny do
komórek, są nietoksyczne i niepatogenne. rAAV wykorzystywane są w badaniach podstawowych oraz w leczeniu chorych na nowotwory. Próby kliniczne terapii
genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na
nowotwory skóry oraz prostaty. Obecność rAAV w klinice odzwierciedla postęp w terapii genowej, a tym samym ujawnia kierunki rozwoju współczesnej farmacji.
Słowa kluczowe: terapia genowa, wirusy związane
z adenowirusami, nowotwory
Wprowadzenie
Terapia genowa, terapia fotodynamiczna czy wykorzystanie komórek macierzystych do celów terapeutycznych
odzwierciedlają postęp w naukach farmaceutycznych, a ich
obecność w klinice czyni możliwym leczenie pacjentów, dla
których klasyczne środki i metody leczenia nie są do końca skuteczne. Terapia genowa, znana w klinice od lat 90.
ubiegłego stulecia [1] wykorzystuje geny kodujące białka
o funkcji terapeutycznej. W chwili obecnej w badaniach klinicznych terapii genowej wykorzystuje się nośniki genów
konstruowane głównie w oparciu o genom adenowirusów,
lentiwirusów oraz wirusów związanych z adenowirusami
48
Abstract
Gene therapy methods are based on coding nucleic acid
sequences that are administered directly to cells via
carriers commonly recognized as DNA vectors. The
correctly prepared cDNA/vector formula determines
efficient transfection of cells, transgen expression, and
therefore biological responses. The studies concerning
the development of safe and efficient vectors are still
conducted. Recombinant adeno-associated virus vectors
(rAAV) are a most promising candidates for cancer gene
therapy protocols. They are nonpathogenic and seem to
be safer than other viral vectors. rAAV effectively infect cancer cells of broad range and permit stable and
efficient transgene expression. In vivo studies show a
promising observations and therapeutic implications.
So far, recombinant adeno-associated based vectors are
successfully used in the clinic for gene therapy of melanoma and prostate patients.
Key words: gene therapy, adeno-associated viruses,
cancers
(AAV). Wiele opracowań wskazuje, iż preparaty genowe wirusowe, mimo iż efektywnie wnoszą geny do komórek, nie
są bezpieczne dla pacjentów . Najczęściej opisywane niepożądane działania rekombinowanych wirusów to wysoka immunogenność oraz mutageneza insercyjna. W chwili obecnej wektory konstruowane w oparciu o genom AAV należą
do najbezpieczniejszych. rAAV bardzo wydajnie infekują
komórki gospodarza, a czas ekspresji transgenu jest długi.
W próbach terapii genowej wykorzystuje się rAAV z uwagi
na brak ich patogenności, toksyczności, wydajną infekcję
komórek oraz długą i wysoką ekspresję wprowadzanych
genów. Atrakcyjność kliniczną rAAV zwiększa również występowanie w przyrodzie serotypów AAV (AAV1-AAV12).
Możliwość konstruowania in vitro serotypów rAAV pozwala na przygotowywanie preparatów genowych wnoszących
geny do określonych narządów człowieka. Dalsze badania
przedkiniczne i kliniczne wskażą czy i kiedy rAAV staną się
uniwersalnymi nośnikami genów w terapii genowej i rozszerzą tym samym spektrum środków leczniczych współczesnej farmakoterapii.
Wirusy związane z adenowirusami (AAV)
Wirusy AAV należą do rodziny Parvoviridae, rodzaju
Dependovirus. AAV mają średnicę około 25 nm, symetrię
ikozahedralną i zawierają pojedynczą nić DNA, składającą się z 4680 par zasad (AAV2). Genom wirusa AAV zbudowany jest z dwóch otwartych ramek odczytu lewej rep
i prawej cap, oskrzydlonych sekwencjami ITR (ang. inverted terminal repeats) złożonymi ze 145 par zasad. Sekwencje ITR są niezbędne do replikacji, pakowania i integracji
DNA AAV do genomu gospodarza. W wirusowym genomie
można wyróżnić trzy promotory: p5, p19 i p40. Dwa pierwsze odpowiedzialne są za ekspresję genów białek Rep, natomiast promotor p40 reguluje ekspresją białek kapsydowych
Cap. Zmienność składu aminokwasowego białek kapsydowych determinuje występowanie w przyrodzie serotypów
AAV wykazujących tropizm narządowy. AAV nie posiadają zdolności do samodzielnego namnażania się w komórce
gospodarza, a do replikacji genomu wymagają obecności
wirusa wspomagającego. Wśród najczęściej opisywanych
wirusów ko-infekujących opisuje się adenowirusy oraz herpeswirusy. Unikalną cechą AAV jest również zdolność do
miejscowo-specyficznej integracji własnego DNA do chromosomu 19 człowieka (19q13.4, AAVS1) [2]. Wnikanie
AAV (transdukcja, infekcja) do komórek jest procesem wieloetapowym, w którym można wyróżnić przyłączenie wirusa do powierzchni komórki, transport wewnątrzkomórkowy,
zdarzenia jądrowe. Rozpoznanie i związanie AAV z błona
komórkową wiąże się z oddziaływaniem białek kapsydu wirusów z receptorami komórkowymi. W przypadku wirusa
AAV serotyp 2 (AAV2) najczęściej opisywanymi receptorami są proteoglikany bogate w siarczan heparanu (HSPG).
W wiązaniu błonowym AAV biorą także udział receptory
pomocnicze - ko-receptory, np. dla AAV2 ko-receptorami są
np. integryny oraz receptor dla czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGFR1) [3].
Rekombinowane wektory AAV
jako potencjalne środki lecznicze
Środki lecznicze współczesnej farmakoterapii mają
zdefiniowaną strukturę, postać, cechuje je ściśle określony
skład ilościowy i jakość, uzyskiwane są dzięki powtarzalnym procedurom syntezy. Znana jest ich aktywność biologiczna, działania niepożądane, a znaczenie kliniczne jest
już najczęściej dobrze udokumentowane. Preparaty genowe, których podstawą są kwasy nukleinowe, są w chwili
obecnej wykorzystywane głównie w pracach eksperymentalnych na liniach komórkowych i zwierzętach oraz stanowią przedmiot wstępnych prób klinicznych terapii genowej
na pacjentach. Biochemiczna formuła preparatu genowego sprowadza się do sekwencji DNA kodujących wybrane
białka o funkcji terapeutycznej, zaś postać farmaceutyczna – determinowana bezpośrednio przez rozwój technologii farmacji stosowanej – sprowadza się do formy wektora
– wirusowego lub niewirusowego nośnika genów. Zainteresowanie wirusowymi wektorami AAV wynika bezpośrednio z
ich charakterystyki molekularno-biochemicznej. Uzyskiwane in vitro - rekombinowane AAV- efektywnie wnoszą geny
do komórek oraz pozwalają na długą ekspresję transgenów,
są nieimmunogenne i niepatogenne dla gospodarza. Obecność serotypów AAV zwiększa ich atrakcyjność kliniczną.
W chwili obecnej, dzięki metodom inżynierii genetycznej,
możliwym jest w warunkach laboratorium konstruowanie
i namnażanie wirusów AAV niosących wybrane geny terapeutyczne. Formuła uzyskiwania rAAV przewiduje także
przygotowanie preparatów genowych rAAV do stosowania
w klinice, czyli spełniających farmakopealne wymagania jakości [4]. Uzyskiwanie rekombinowanych wektorów AAV
wiąże się z potrzebą klonowania molekularnego genów
AAV w formie plazmidów. Istniejąca w chwili obecnej procedura przewiduje wykorzystanie plazmidów AAV (pAAV)
niosących geny rep, cap, transgen oskrzydlony sekwencjami ITR oraz genów wirusów wspomagających np. adenowirusowe geny E1, E2A, E4, VA. Plazmidy wprowadza się
do komórek pakujących hodowanych w warunkach in vitro
w formie hodowli adhezyjnych lub zawiesinowych. Najczęściej wykorzystuje się komórki pakujące ustalonych linii
komórkowych HEK293, HEK293T, HeLa, A549. Z komórek pakujących, transfekowanych pAAV izoluje się cząstki
rekombinowanych wektorów AAV niosących wybrane geny
terapeutyczne. Ilość cząstek wirusowych (miano) w uzyskanym preparacie ocenia się głównie poprzez określenie np.
metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (ang. real
time PCR) liczby kopii genomu rAAV w preparacie (gc/ml).
Wyniki badań oceniających natomiast jakość uzyskanego
preparatu – czystość biochemiczną, mikrobiologiczną, toksykologiczną warunkują wykorzystanie preparatu w warunkach klinicznych.
Preparaty rAAV w terapii genowej
nowotworów
W terapii genowej chorych na nowotwory wykorzystywane są geny kodujące białka o zdefiniowanej aktywności
antynowotworowej. Badania prowadzone są z rekombinowanymi wektorami AAV jako nośnikami genów kodujących
białka proapoptotyczne, antyangiogenne, immunotropowe.
Większość badań prowadzonych jest w warunkach eksperymentalnych – na komórkach linii komórkowych oraz na
zwierzętach laboratoryjnych. Pierwsze próby kliniczne terapii genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na
raka prostaty i czerniaka [1].
Geny samobójcze W terapii genowej nowotworów nierzadko wykorzystuje się rAAV niosące geny samobójcze.
Do komórek nowotworowych wprowadza się rAAV kodujące białko enzymatyczne przekształcające nieaktywną formę
leku (prolek) w postać toksyczną dla komórek. W pracach
wskazuje się również, iż zasięg oddziaływania toksycznego
metabolitu jest szerszy niż wynikający z wydajności infekcji
komórek, z uwagi na efekt oddziaływania międzykomórko-
49
wego (ang. bystander effect) [5]. Najczęściej stosowanym
genem samobójczym jest gen kodujący enzym kinazę tymidynową wirusa opryszczki pospolitej (HSVtk). Jej działanie
w intensywnie dzielących się komórkach nowotworu polega
na fosforylacji nukleozydowych analogów tymidyny, (np.
gancyklowir; acyklowir). Ufosforylowane postaci leków są
inhibitorami polimerazy DNA. Giną komórki, do których
wprowadzony został transgen i zaszła jego ekspresja, jak
oraz komórki, do których toksyczny metabolit dostał się połączeniami międzykomórkowymi. Badania z użyciem AAVHSVtk, w połączeniu z gancyklowirem przeprowadzono np.
na komórkach nowotworów głowy i szyi [6], piersi [7], skóry [8]. W doświadczeniach Su i wsp. [9] mysie komórki raka
wątroby transdukowano wektorem rAAV/HSVtk, pod kontrolą wątrobowo-specyficznego promotora (dla albuminy)
oraz specyficznego dla nowotworu elementu wzmacniającego (dla α-fetoproteiny) [9]. Po podaniu gancykloviru wykazano, że tylko komórki raka wątroby, które wykazywały odczyn dodatni względem obecności albumin i α-fetoproteiny,
uległy zniszczeniu. Podobne badania, jednak na komórkach
raka jajnika, przeprowadzili również Bao i wsp. [10].
Geny proapoptotyczne W terapii genowej nowotworów
wykorzystuje się również geny kodujące białka apoptozy.
W pracy Rohr i wsp. [11] konstrukt rAAV/p53 wprowadzano do komórek niedrobnokomórkowego raka płuca Wraz
ze zwiększającą się dawką preparatu rAAV, obserwowano
zahamowanie wzrostu nowotworu w porównaniu z komórkami transdukowanymi wektorem kontrolnym rAAV/
GFP. Redukcję masy nowotworu wiązano ze zwiększonym
poziomem apoptozy, a jednoczesne podawanie cisplatyny,
wykazało synergistyczny efekt. W innych badaniach wykazano natomiast wydłużenie czasu przeżycia myszy z rakiem
jelita grubego po podaniu „koktajlu terapeutycznego” niosącego jednocześnie gen p53 (Ad- p53) oraz gen kodujący
domenę kringle 1 ludzkiego wątrobowego czynnika wzrostu
(HGFK1) [12]. Zhang i wsp. [13] skonstruowali natomiast
wektor niosący gen TRAIL, będący pod kontrolą promotora dla ludzkiej telomerazy, który wydajnie transdukował
komórki raka wątroby, indukując w nich proces apoptozy. Przeciwnowotworowy efekt wzmocniony był równoległą ekspozycją komórek nowotworowych na działanie
5-fluorouracylu. Podobne doświadczenia z użyciem rAAVTRAIL wykonał Wang i wsp. [14].
Geny antyangiogenne Jedną ze strategii terapii genowej
nowotworów jest antyangiogeneza, czyli próby ograniczania
wzrostu i funkcji naczyń krwionośnych nowotworów. Ma
i wsp. [15] prowadzili badania na komórkach glejaka zaszczepionych szczurom. Doguzowo podawano preparat rAAV
kodujący angiostatynę. Wykazano zahamowanie wzrostu
nowotworu i wydłużenie czasu przeżycia 40% szczurów,
w porównaniu z grupą kontrolną, która otrzymywała preparat rAAV bez genu terapeutycznego. Shi i wsp. [16] zaproponowali użycie rAAV niosące gen endostatyny w badaniach
nad rakiem jelita grubego. Doswidczenia wykonano in vitro,
jak i in vivo. rAAV-endostatyna podawano zwierzętom domięśniowo. Obserwowano wysoki poziom rekombinowanej
endostatyny w surowicy i zahamowanie indukowanej przez
nowotwór angiogenezy, a w konsekwencji ograniczenie
50
wzrostu guza jelita grubego. Interesujące wyniki opublikowali również Ponnazhagan i wsp. [17]. Autorzy obserwowali ograniczenie wzrostu nowotworu jajnika u myszy, którym
domięśniowo podano preparat bicistronowy rAAV niosący
geny angiostatyny oraz endostatyny jednocześnie.
Geny immunotropowe Wiadomym jest, iż nowotwory posiadają niezwykłą właściwość ucieczki spod nadzoru
układu immunologicznego organizmu. Podejmowanych jest
wiele badań mających na celu stymulację układu odpornościowego do walki z nowotworem np. poprzez dostarczanie
do komórek guza za pomocą wektorów rAAV genów cytokin, które ulegając ekspresji pobudzają komórki prezentujące antygeny oraz limfocyty T cytotoksyczne [18]. Do grupy wykorzystywanych cytokin należą również interferony.
W pracy Zhang i wsp. [19] komórki różnych linii nowotworowych transdukowano konstruktem rAAV niosącym gen
syntetycznego interferonu oraz bakteryjny gen oporności na
neomycynę (rAAV-IFN-conI-Neo). Obserwowano brak różnic we wzroście w porównaniu z komórkami niestransdukowanymi. Pomimo odporności tych komórek na działanie
IFN in vitro, po przeniesieniu stransdukowanych komórek
do zwierząt, guzy wzrastały wolniej niż u zwierząt z komórkami nietransdukowanymi W pracy Hammer i wsp. [20]
natomiast do transdukcji komórek raka mózgu zastosowano
rAAV z genem dla interferonu β (rAAV-IFN β) oraz trichostatynę (inhibitor deacetylazy histonów o działaniu przeciwnowotworowym). Autorzy opisali, iż w wyniku zastosowania rAAV/INF i trichostatyny wzrost guzów mózbu był
ograniczony. W pracy zaś Devchand i wsp. [21] do transdukcji komórek guzów nowotworowych wykorzystano wektor
rAAV kodujący interleukinę 12 (IL12). Wykazano, zależny
od ekspresji IL12 wzrost syntezy interferonu γ i wzmożoną
proliferację limfocytów, [21]. W badaniach poświęconych
terapii genowej nowotworów i genom immunotropowym
wykorzystywane sa również komórki dendrytyczne transdukowanie za pomocą wektorów rAAV. W pracy Liu i wsp.
[22] do komórek dendrytycznych, w przebiegu raka piersi,
wprowadzane były wektory rAAV kodujące błonową glikoproteinę - laktadherynę (BA46). Wprowadzenie do komórek
dendrytycznych AAV/BA46/Neo zaowocowało ekspresją
laktadheryny, szybką odpowiedzią limfocytów cytotoksycznych
na MHC kl.I prezentujące BA46, pobudzeniem limfocytów T do
produkcji IFN-γ oraz ekspresją dodatkowych antygenów na powierzchni komórek dendrytycznych (CD80, CD86).
Podsumowanie
Preparaty genowe konstruowane w oparciu o genom
niepatogennych wirusów związanych z adenowirusami
(AAV) wykorzystywane są obecnie w badaniach eksperymentalnych, zaś pierwsze próby kliniczne przeprowadzono
u chorych na nowotwory skóry i prostaty. Obecność rAAV
w laboratoriach i klinikach wynika bezpośrednio z faktów, iż
naukowcy potrafią konstruować i namnażać rAAV in vitro,
a uzyskane preparaty zawierają aktywne biologicznie cząstki wirusowe, które są dla pacjentów bezpieczne i wprowadzają wybrane geny terapeutyczne do komórek nowotworowych. Obecność rekombinowanych wektorów wirusowych
AAV w badaniach odzwierciedla postęp w terapii chorych
na nowotwory.
Piśmiennictwo
1. www.wiley.co.uk/genmed
2. Małecki M, Woźniak A, Janik P. Wirusy związane z adenowirusami (AAV). Postępy Biochem 2008; 54: 57-63.
3. Małecki M. Wirusowe strategie w terapii genowej ze
szczególnym uwzględnieniem wektorów konstruowanych z wirusów związanych z adenowirusami (AAV).
Postępy Biol. Kom 2004; 31: 47-57.
4. Farmakopea Europejska 2006.
5. Stribbling SM i wsp.: Regressions of established breast
cancer xenografts by carboxypeptidase G2 suicide gene
therapy and the prodrug CMDA are due to a bystander
effect. Hum. Gene Ther 2000; 11: 285-92.
6. Kanazawa T i wsp.: Suicide gene therapy using AAVHSVtk/ganciclovir in combination with irradiation results in regression of human head and neck cancer xenorafts in nude mice. Gene Ther 2003; 10: 51-58.
7. Li ZB i wsp.: Recombinant AAV-mediated HSVtk gene
transfer with direct intratumoral injections and Tet-On
regulation for implanted human breast cancer. BMC
Cancer 2006; 6: 66.
8. Schoensiegel F i wsp.: MIA (melanoma inhibitory activity) promoter mediated tissue-specific suicide gene therapy of malignant melanoma. Cancer Gene Ther 2004;
11: 408-18.
9. Su H i wsp.: Selective-killing of AFP-positive hepatocellular carcinoma cells by adeno-associated virus transfer
of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Hum.
Gene Ther 1996; 7: 463-70.
10.Bao R, Selvakumaran M, Hamilton TC. Targeted Gene
Therapy of Ovarian Cancer Using an Ovarian-specific
Promoter. Gyn. Oncol 2002; 84: 228-34.
11.Rohr UP i wsp.: Non-small lung cancer are prime targets for p53 gene transfer mediated by a recombinant
adeno-associated virus type-2 vector Cancer Gene Ther
2003;10: 898-906.
12.Nie B i wsp.: AAV-HGFK1 and Ad-p53 cocktail therapy
prolongs survival of mice with colon cancer. Mol. Cancer Ther 2008;7: 2855-65.
13.Zhang Y i wsp.: AAV-mediated TRAIL gene expression driven by hTERT promoter suppressed human
hepatocellular carcinoma growth in mice. Life Science
2008;82: 1154-61.
14.Samulski RJ i wsp.: Targeted integration of adeno-associated virus (AAV) into human chromosome 19. EMBO
1991; 10: 3941-50.
15.Ma HI i wsp.: Intratumoral gene therapy of malignant
brain tumor in a rat model with angiostatin delivered by
adeno-associated viral (AAV) vector. Gene Ther 2002;
9: 2-11.
16. Shi W i wsp.: Adeno-associated virus-mediated gene
transfer of endostatin inhibits angiogenesis and tumor
growth in vivo. Cancer Gene Ther 2002; 9: 513-21.
17.Ponnazhagan S i wsp.:
Adeno-Associated Virus
2-Mediated Antiangiogenic Cancer Gene Therapy:
Long-Term Efficacy of a Vector Encoding Angiostatin
and Endostatin over Vectors Encoding a Single Factor.
Cancer Res 2004; 64: 1781-7.
18.Anderson R i wsp.: Construction and biological characterization of an interleukin-12 fusion protein (Flexi-12): delivery to acute myeloid leukemic blasts
using adeno-associated virus. Hum. Gene Ther 1997;
8: 1125-35.
19.Zhang JF i wsp.: Gene therapy with an adeno-associated
virus carrying an interferon gene results in tumor growth
suppression and regression. Cancer Gene Ther 1996; 3:
31-8.
20.Hmner JB i wsp.: The efficacy of combination therapy
using adeno-associated virus-interferon beta and trichostatin A in vitro and in a murine model of neuroblastoma.
J Ped. Sur 2008; 43: 177-83.
21.Paul D i wsp.: Construction of a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector expressing murine interleukin-12 (IL-12) Ther. 2000. 7, s. 308-315.
22.Liu Y i wsp.: Use and specificity of breast cancer antigen/milk protein BA46 for generating anti-self-cytotoxic
T lymphocytes by recombinant adeno-associated virusbased gene loading of dendritic cells. Cancer Gene Ther
2005; 12: 304-12.
doc. dr hab. n. med. Maciej Małecki
Zakład Biologii Komórki
Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa
tel. 022 546 26 20
[email protected]
51
Structure-activity relationship of benzodiazepine derivatives.
Part I. Non-nucleoside reverse transcriptase HIV-1 inhibitors
Piotr Włodno, Elżbieta Brzezińska
Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Medycznej, Wydział Farmaceutyczny
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Elżbieta Brzezińska
Streszczenie
Przeprowadzono analizę ilościowej zależności pomiędzy
strukturą i działaniem (QSAR) 52 pochodnych 4,5,6,7-tetrahydro-imidazolo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)onu o działaniu hamującym na RT HIV-1. W analizie zastosowano parametry fizykochemiczne badanych związków obliczone z zastosowaniem metody pół-empirycznej
PM3. Zastosowano analizę regresji wielokrotnej (MR),
analizę skupień (CA) i analizę funkcji dyskryminacyjnej
(DFA) w celu wyłonienia grupy zmiennych klasyfikujących pochodne benzodiazepiny zgodnie z poziomem ich
aktywności anty-HIV-1 RT. Dzięki zastosowaniu analizy
MR ustalono istotną rolę parametrów hydrofobowych
i elektronowych badanych związków dla ich aktywności
biologicznej. Istotne równanie regresji wieloczynnikowej uzyskane w MR może być użyte do przewidywania
poziomu aktywności różnych pochodnych benzodiazepiny. Zależność ta zawiera parametry użyte w metodach
CA i DFA. Analiz DFA i CA wykazały, że parametry:
log P (współczynnik podziału), N-N (odległość pomiędzy
atomami azotu BDZ), Q1 (ładunek elektryczny zgromadzony na atomie azotu N1 BDZ), %PSA (powierzchnia
polarna cząsteczki), HD (liczba wiązań wodorowych)
i V (objętość cząsteczki) są odpowiedzialne za klasyfikację związków jako silnie i słabo działające. Zdolność
przekraczania bariery krew-mózg odgrywa ważną rolę
w tej klasyfikacji. Zastosowane analizy pozwoliły zaproponować zasadę klasyfikacji BDZ wykazujących działanie anty-HIV-1 RT.
Słowa kluczowe: ilościowa zależność pomiędzy struktura i aktywnością; analiza regresji; analiza funkcji dyskryminacyjnej; analiza skupień; pochodne benzodiazepiny
52
Abstract
A quantitative structure-activity relationship (QSAR)
analysis of 52 4,5,6,7-tetrahydro-imidazo[4,5,1-jk][1,4]
benzodiazepin-2(1H)-one derivatives as RT HIV-1 inhibitors was carried out. The semi-empirical method
PM3 was employed to calculate a set of physicochemical
parameters for investigated compounds. The Multiple
Regression analysis (MR), Cluster Analysis (CA), and
Discriminant Function Analysis (DFA) were employed
to reduce dimensionality and investigate which subset of
variables is effective for classifying the benzodiazepine
derivatives according to their degree of anti- HIV-1 RT
activity. By using the MR we have found the important
role of the hydrophobic and electronic parameters of
investigated benzodiazepines H1-H52 for their activity.
The good multivariate relationship obtained by the use
of MR method can be used for predicting the quantitative
effect of anty-HIV-1 RT activity of different benzodiazepine derivatives. These relationships involved the parameters used in CA and DFA methods. The DFA and CA
methods showed that the parameters log P (partition coefficient), N-N (distance between BDZ nitrogen atoms),
Q1 (electric charge focused on BDZ N1 atom), %PSA
(polar surface area), HD (number of hydrogen bounds)
and V (molecular volume) are responsible for separation
between compounds with higher and lower activity. The
blood-brain barrier permeability plays very important
role in this classification. From used analysis we present a
prediction rule of classifying benzodiazepine derivatives
with anty-HIV-1 RT activity.
Keywords: quantitative structure-activity relationship;
regression, discriminant and cluster analysis, benzodiazepine derivatives
Wstęp
W badaniach nad poszukiwaniem nowych substancji
biologicznie czynnych wykorzystywane są tzw. układy wyjściowe – centroidy. Niektóre centroidy, częściej występują
w chemii medycznej i określane są mianem uprzywilejowanych, a ich pochodne wykazują różne kierunki działania. Do
tego typu układów wyjściowych zaliczyć można centroid
benzodiazepinowy. Jest to struktura, na bazie której otrzymano wiele substancji czynnych o bardzo różnorodnym kierunku i zakresie działania. Pochodne benzodiazepiny (BDZ)
zostały odkryte w 1954 roku przez Leo Sternbacha. Pierwsza
pochodna tego układu została opatentowana w 1959 roku,
a wprowadzona do lecznictwa już w roku 1960 pod nazwą
Librium (chlordiazepoksyd) [1]. Zainteresowanie tym lekiem zaowocowało wieloma badaniami. Obecnie zsyntetyzowano już tysiące BDZ, z czego na rynku dostępne są leki
zawierające kilkanaście substancji czynnych o tej budowie.
Są one szeroko stosowane w lecznictwie, jako ligandy receptora benzodiazepinowego w układzie GABA-ergicznym.
Ich działanie przeciwlękowe, miorelaksujące i uspokajające
uważane jest za klasyczne i nazywane diazepamo-podobnym. Badano również inne zastosowania farmakologiczne
pochodnych benzodiazepiny. Wymienić można wiele stwierdzonych efektów biologicznego działania BDZ. Wśród wymienianych znajdują się: związki działające przeciwarytmicznie [2-5]; antagoniści receptora cholecystokininowego
[6-8]: inhibitory odwrotnej transkkryptazy wirusa HIV-1
(NNRTI) [9-12]; antagoniści receptorów α-adrenergicznych
[13,14]; działające na receptory κ-opioidowe [15-18]; muskarynowe [19]; wpływające na ośrodek głodu [20-24];
przeciwlipemiczne [25]. Obecnie znana jest możliwość
zastosowania BDZ w wielu schorzeniach, a prace nad ich
dalszym wykorzystaniem wciąż trwają. Związki te działają
w obrębie centralnego układu nerwowego lub na obwodzie.
Ich zróżnicowane działanie może być spowodowane zarówno uwarunkowaniami farmakodynamicznymi, jak i farmakokinetycznymi. Efekt obserwowany może więc być zależny od właściwości fizykochemicznych determinujących
specyficzną biodostępność (np. umożliwiających pokonanie
bariery krew-mózg). Z powodu wielu kierunków działania i podobieństwa strukturalnego BDZ stanowią ciekawy
materiał badawczy w analizach (Q)SAR. Wnioski płynące
z analizy strukturalnej poszczególnych grup działania BDZ
w wielu przypadkach można uznać za wyczerpujące. Trudno jednak odnaleźć przykłady dociekania podstaw zróżnicowania działania pochodnych benzodiazepiny pomiędzy tymi
grupami. Podobieństwo cech fizykochemicznych związków
w grupach wykazujących określony efekt biologiczny i ich
odrębność pomiędzy grupami może definiować obserwowaną różnorodność działania pochodnych układu benzodiazepiny. Założono, że zróżnicowanie odpowiedzi biologicznej
ma podłoże farmakodynamiczne, ale również farmakokinetyczne. Rozpatrywano więc zarówno siłę działania BDZ
w grupach działania, jak również wpływ na jego ukierunkowanie. Celem pracy było odnalezienie prawidłowości
w ukierunkowaniu działania farmakologicznego pochodnych
o podobnej budowie i obserwacja centroidu benzodiazepinowego, jako niespecyficznego nośnika specyficznej odpowiedzi biologicznej. Niniejsza praca dotyczy badania grupy
52 pochodnych 4,5,6,7-tetrahydro-metylimidazolo[4,5,1-jk]
[1,4]benzo-diazepin-2(1H)-onu dla ustalenia charakterystyki strukturalnej wymagań BDZ o działaniu hamującym na
RT HIV-1. Dane strukturalne i o aktywności biologicznej
związków zgromadzono na podstawie prac źródłowych [9,
26-28].
Materiały i metody
Analizowane w pracy BDZ należą do znanej wśród nienukleozydowych inhibitorów HIV-1 RT (NNRTI) grupy
TIBO. Do badań przyjęto 52 związki (H1-H52) pochodzące
z bibliografii [9,26-28]. Strukturę pochodnych i aktywność
podano w Tabeli 1.
Dane o właściwościach fizykochemicznych związków
H1-H52 ustalono metodami obliczeniowymi z zastosowaniem metod pół-empirycznych. Podstawą badania właściwości były struktury związków w minimum energetycznym
(po optymalizacji geometrycznej metodą PM3 bez przeglądu konformacji). Związki opisano zbiorem zmiennych zgromadzonych za pomocą programów HyperChem 7.1, ACDLabs 8.0 (logD i pK): log P - lipofilowość, %PSA – odsetek
powierzchni o charakterze polarnym, N-N – odległość pomiędzy atomami azotu BDZ, HD i HA – liczba donorów
i akceptorów wiązań wodorowych, Q1 i Q2 – ładunek elektryczny na N1 i N4 BDZ, V – objętość cząsteczki, Cl, Br,
F, I – liczba atomów chlorowca, P – polaryzowalność objętościowa, S – pole powierzchni, M – masa cząsteczkowa,
Md – moment dipolowy, eH i eL – energia orbitali HOMO
i LUMO, B1 i B2 – wskażnik przenikania BBB, log D
– współczynnik dystrybucji (dane surowe przedstawiono
w Tabeli 2.).
Analizę statystyczną przeprowadzono z zastosowaniem
programu STATISTICA 7.0, metodami: regresji wielorakiej
(MR); analizy skupień (CA) metodą grupowania k-średnich;
analizy funkcji dyskryminacyjnej (DFA).
Wyniki badań
Analiza regresji wielokrotnej (MR – Multiple Regression)
Przeprowadzono pełną analizę regresji z zastosowaniem
parametrów fizykochemicznych obliczonych metodami
pół-empirycznymi dla związków H1–H52. Wyznaczono
macierz korelacji w poszukiwaniu ścisłych zależności pomiędzy zmiennymi niezależnymi, w celu odrzucenie modeli
regresji wielokrotnej, powstałych z równoczesnym udziałem skorelowanych zmiennych. Następnie prowadzono systematyczną analizę krokową dla zmiennej zależnej – aktywności biologicznej pIC50 z użyciem wszystkich zgromadzonych danych fizykochemicznych – zmiennych niezależnych.
Przeprowadzenie pełnej analizy krokowej wprowadziło do
modelu regresji 14 zmiennych niezależnych. Model ten opisuje 88% (r = 0,94; n = 52) zmienności całkowitej w badanej grupie przypadków aktywnych. Liczba przypadków (52)
nie upoważnia jednak do wprowadzenia 14 zmiennych do
modelu. Ponadto niektóre zmienne wykazywały korelacje
wewnętrzne. Ostatecznie najlepsze równanie po korekcie,
53
niezawierające skorelowanych danych tłumaczy 83% wariancji całkowitej w grupie przypadków, co nadal wskazuje
na bardzo dobre dopasowanie modelu (r = 0,91) i może mieć
wartość predykcyjną w zakresie aktywności anty-HIV-1 pochodnych benzodiazepiny. Powstały model wyrażony jest
równaniem:
pIC50 = 17,91(±5,90) + 0,23(±0,24)log P
+ 0,16(±0,03)%PSA – 5,74(±1,92)N-N – 0,58(±0,26)
HD – 0,02(±0,01)Q1 – 0,98(±0,31)HA + 2,24(±0,87)V
+ 0,43(±0,26)Cl
r = 0,91; R2 = 0,83; F = 26,611; p <0,0000; n = 52
Przedstawione równania korelacyjne zawiera elementy,
które wskazywane były uprzednio jako istotne dla aktywności anty-HIV-1 RT [29-30] i oparte na strukturze modeli
aktywności anty-HIV-1 RT [31-32] – HD, HA, N-N i Q1.
Przedstawione równanie wykazuje, że zdolność hamowania RT HIV-1 zależy wprost proporcjonalnie od lipofilowości (log P), liczby podstawników halogenowych (Cl)
i odwrotnie proporcjonalnie od liczby tworzonych wiązań
wodorowych (HD, HA), ładunku elektrycznego na atomie azotu N1 układu benzodiazepiny (Q1) i odległości
pomiędzy elektroujemnymi atomami układu zdolnymi do
tworzenia wiązań wodorowych (N-N). Dodatkowym czynnikiem wpływającym wprost proporcjonalnie na efektywność biologiczną obserwowanych przypadków jest wartość
parametru %PSA – odsetek pola powierzchni cząsteczki
zajmowany przez atomy tlenu i azotu połączone z atomami
wodoru. Jako jeden z podstawowych wskaźników zdolności
przenikania związku chemicznego przez barierę krew-mózg
(BBB) powinien posiadać wartość poniżej 16%. Wartości
wskaźnika %PSA związków H1-H52 mieści się w granicach 10,85-32,24% (średnio 15,73%). Te graniczne wartości
powodują, że efektem wpływu podwyższonego PSA może
być poprawa działania. Aktywność biologiczna badanej
grupy przypadków nie jest związana z centralnym układem
nerwowym. Dystrybucja leków w tym kierunku zmniejsza
więc potencjalnie ich stężenie w miejscu działania. Wśród
obecnych w modelu parametrów wymienić można również
inne czynniki wpływające na zdolność przekraczania tej bariery. Są nimi, wymienione już ze względu na dopasowanie
do modelu przestrzennego NNRTI, elementy struktury tworzące wiązania wodorowe HA i HD. Ich ograniczona liczba
sprzyja jednak dostępności do CUN i dla HA (akceptorów
wiązań) powinna być ≤10 oraz dla HD ≤5. W badanej grupie
związków wartość HA wynosi średnio 3,94 i HD 1,13, zaś
dla najlepiej działających przypadków przyjmuje wartości
najniższe, co zgodne jest z założeniami modelu przestrzennego [32]. Można więc stwierdzić, że wartości korzystne dla
zjawiska przenikania nie są preferowane w analizie NNRTI. Dodatkowo czynnik logP jest parametrem bezpośrednio
wykorzystywanym do obliczania teoretycznej wartości log
BB, jako podstawowej miary zdolności przenikania BBB.
Analiza skupień (CA – Cluster Analysis)
Wyniki przeprowadzonej analizy regresji wielokrotnej
związków H1-H52 stały się podstawą badania struktury danych i ich grupowania. Badania te oparto na analizie skupień
(CA) przeprowadzonej przy pomocy algorytmu klasyfikacji
54
– grupowania metodą k-średnich. Poszukiwano klasyfikacji
przedstawicieli grup BDZ przy założeniu uzyskania podziału na trzy skupienia przypadków reprezentujące poziom aktywności anty-HIV-1 – niski, średni i wysoki. Analiza oparta
została tylko na tych zmiennych (wartości standaryzowane),
których bezpośredni udział w kształtowaniu aktywności
biologicznej został udokumentowany analizą MR. Poniżej
przedstawiono wykres średnich wartości zmiennych dla
każdego skupienia (Ryc.1.) i istotne elementy wyniku analizy wariancji dla tych zmiennych (Tabela 3.):
Ryc. 1. Wykres średnich wartości standaryzowanych
zmiennych grupujących dla skupień 1-3
Badane przypadki utworzyły trzy skupienia: skupienie
1 – o średniej standaryzowanej wartości pIC50 -0,27 (działanie średnie); skupienie 2 – o średniej standaryzowanej wartości pIC50 -0,88 (działanie słabe) oraz; skupienie 3 – o średniej standaryzowanej wartości pIC50 0,93 (działanie silne). Wynik analizy wariancji wskazuje parametry
wyłonione w przebiegu analizy MR, jako kryteria przypisania obiektów do skupień 1-3. Najbardziej wyróżniającymi cechami przypadków należących do grupy silnie
działających (skupienie 3) są większe rozmiary cząsteczki
(S, V, P), większa lipofilowość (log P) i mała liczba donorów wiązań wodorowych (HD) i dodatni ładunek na atomie
azotu (Q1). Są to równocześnie parametry najsilniejszego
rozróżnienia pomiędzy związkami słabo i silnie działającymi (skupienie 2 i 3). Bardzo istotną informację przynosi
miara średniej %PSA dla skupienia 3 (patrz Tabela 3), która
odpowiada wartości surowej powyżej 16%. Potwierdza to
brak preferencji dla przenikania BBB. Dalsze obserwacje
wyników tej analizy dotyczą elementów każdego wydzielonego skupienia (Tabela 4). Dla większej czytelności uzyskanych wyników należy dodać, że kolejność przypadków
H1-H52 odpowiada wzrastającej sile działania.
Analiza funkcji dyskryminacyjnej (DFA – Discriminant
Function Analysis)
Analiza funkcji dyskryminacyjnej prowadzona w niniejszym doświadczeniu służy wyznaczeniu funkcji klasyfikacyjnych, które mogą być wykorzystane do przewidywania
poziomu potencjalnego działania pochodnych BDZ w zakresie hamowania RT HIV-1. Prowadzona tu DFA ma charakter
ilościowy. Sposób wyznaczenia zmiennej grupującej oparty
został na wynikach analizy skupień. Badane pochodne H1H52 opisano kodami grupowymi: 1 – średnio działające;
2 – słabo działające i 3 – silnie działające hamująco na RT
HIV-1. Do analizy wprowadzono tylko zmienne niezależne
(standaryzowane) uzyskane z analizy MR i użyte następnie
w analizie grupowania metodą k-średnich CA do wyznaczenia skupień 1-3 (log P, %PSA, N-N, HD, Q1, HA, V, Cl, P
i S). Analizę prowadzono przy użyciu krokowej metody postępującej wyznaczającej zmienne dyskryminujące spośród
wprowadzonych do analizy. Po pięciu kolejnych krokach
analizy i wprowadzeniu 5 zmiennych dyskryminujących do
modelu uzyskano dwie funkcje dyskryminacyjne. Obliczone
funkcje dyskryminacyjne pozwoliły na stworzenie wykresu
rozrzutu przypadków (Ryc. 2).
Ryc. 2. Wykres rozrzutu przypadków H1-H52 na podstawie
średnich zmiennych kanonicznych funkcji dyskryminacyjnej
1 (pierwiastek 1) w stosunku do funkcji dyskryminacyjnej 2
(pierwiastek 2)
Jak widać grupy 1-3 są wyraźnie rozdzielone i stanowią
skupiska przypadków o pewnym rozproszeniu. Mimo obserwowanego rozproszenia kontrola prawdopodobieństwa
a posteriori klasyfikacji związków nie wykazuje błędów
w przyporządkowaniu przypadków (tabeli prawdopodobieństwa nie zamieszczono). Poszczególne przypadki zostały zakwalifikowane do odpowiednich grup z prawdopodobieństwem w granicach r = 0,98-1,00; związki H19
(r = 0,92); H43 (r = 0,91); H32 (r = 0,71). Badanie macierzy klasyfikacji wykazało, że prawdopodobieństwo a priori
jest całkowite. Procent przypadków, które zostały poprawnie sklasyfikowane w każdej grupie przez aktualne funkcje
klasyfikacyjne równe są 100% (Tabela 5).
Na podstawie satysfakcjonujących wyników analizy zaproponowano trzy funkcje klasyfikacyjne charakteryzujące:
Grupę 1 BDZ o umiarkowanym działaniu hamującym
na RT HIV-1
G_1 = 2,8 V + 4,3 HD – 3,2 PSA% – 1,9 N-N – 0,1 Cl
– 1,2 Q1 – 5,9
Grupę 2 BDZ o słabym działaniu hamującym na RT
HIV-1
G_2 = – 5,1 V + 1,8 HD – 0,9 PSA% + 0,8 N-N – 1,2
Cl + 0,4 Q1 – 4,4
Grupę 3 BDZ o silnym działaniu hamującym na RT
HIV-1
G_3 = 3,4 V – 3,6 HD + 2,3 PSA% + 0,1 N-N + 1,2 Cl
+ 0,2 Q1 – 4,1
Przedstawione funkcje klasyfikacyjne mogą być wykorzystane jako praktyczne narzędzie klasyfikacji nowych przypadków.
Wnioski
Na podstawie przeprowadzonej analizy zaproponowano
charakterystykę strukturalną pochodnych BDZ o działaniu
hamującym na RT HIV-1. Analiza MR pozwala na ustalenie, że wyższa aktywność pIC50 pochodnych H1-H52 zależna jest od następujących czynników: lipofilowości logP
powyżej 2,55; %PSA powyżej 15,73%; odległość atomów
azotu N-N poniżej 2,90 Å; liczby donorów wiązań wodorowych HD poniżej 1,13; niskiego ładunku dodatniego na
atomie azotu N1 Q1; liczby akceptorów wiązań wodorowych HA poniżej 3,94; V powyżej 275 Å3; obecności podstawników halogenowych Cl (podane wartości graniczne
stanowią średnią arytmetyczną danych surowych w badanej
grupie). Większość tych parametrów wpływa na możliwość
przenikania związków przez barierę krew-mózg. Badane
związki nie wykazywały działania diazepamo-podobnego.
Przeprowadzona analiza MR wskazuje na brak preferencji dla czynników sprzyjających pokonywaniu BBB przez
benzodiazepinowe NNRTI. Analiza skupień pokazuje, że
zmienność niektórych parametrów nie zachowuje trendu
zgodnego z wynikiem analizy regresji, szczególnie w przypadku pochodnych o słabym i średnim działaniu (skupienia
2 i 1). W opisanym przypadku najbardziej widoczne jest to
w odniesieniu do korzystnej wartości ładunku dodatniego
na atomie N1 układu benzodiazepiny. Różnice te dają możliwość obserwacji struktury zmienności kolejnych parametrów
w mniejszych zakresach przypadków. W badaniach licznych
grupa przypadków obserwowane w MR korelacje poszczególnych zmiennych są jedynie trendem wypadkowym zjawiska
w całej grupie. Węższe zakresy obserwacji w CA mogą ujawniać zmienność tego trendu dla kolejnych skupień przypadków
o bardziej sprecyzowanych właściwościach (np. biologicznych). Skupienia te, które podobne są pod względem strukturalnym, mogą charakteryzować się nawet trendem przeciwnym, co nie ujawnia się w badaniu łącznie całej grupy. Jest to
najczęściej spowodowane zbyt małym wpływem średniej wartości zmiennej dla danego skupienia. Tak ujawniona struktura
zmienności całkowitej pomaga uniknąć formułowania zbyt
uogólnionych wniosków i zastosować właściwe wskazówki do dalszych badań. Wyłonione w przebiegu CA skupienia
1-3 – grupy działania średniego, słabego i silnego są podstawą
analizy dyskryminacyjnej. Satysfakcjonujące wynik analizy
dyskryminacyjnej pozwoliły na sformułowanie równań matematycznych, jako praktycznego narzędzia kwalifikowania nowych pochodnych do badań biologicznych. Analizy CA i DFA
całkowicie potwierdzają, że zróżnicowanie odpowiedzi biologicznej w grupie BDZ NNRTI ma podłoże farmakodynamiczne, ale również farmakokinetyczne i zależy w dużej mierze od
zahamowania zdolności przenikania BBB.
Badania wykonano w ramach tematu badawczego
finansowanego przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Nr 502-13-626
55
Tabela 1.
Pochodne H1-H52 o działaniu hamującym odwrotną transkryptazę wirusa
HIV-1
4,5,6,7-tetrahydroimidazolo[4,5,1-jk]
[1,4]benzodiazepin-2(1H)-on
56
związek
R1
R2
R3
R4
pIC50
H1
H
O
CH2CO2CH3
5-CH3
3,04
H2
8-NH2
O
CPM
5-CH3
3,07
H3
9-NHCOCH3
O
CPM
5-CH3
3,80
H4
H
O
CH2CH=CHC6H5
5-CH3
3,91
H5
H
O
CH2-2-furanyl
5-CH3
3,97
H6
H
O
CH2CH2CH2CH3
5-CH3
4,00
H7
H
O
CH2CH2CH3
5-CH3
4,05
H8
H
O
CH2CHCH2
5-CH3
4,15
H9
H
O
CH2C(CH=CH2)=CH2
5-CH3
4,15
H10
H
O
CH2C(Br)CH2
5-CH3
4,21
H11
9-NH2
O
CPM
5-CH3
4,22
H12
H
O
CH2CHCHCH3
5-CH3
4,24
H13
H
O
CH2CH2CHCH2
5-CH3
4,30
H14
H
O
2-MA
5-CH3
4,33
H15
H
O
CPM
5-CH3
4,36
H16
H
O
CH2C(C2H5)=CH2
5-CH3
4,43
H17
H
O
CH2CHCHCH3
5-CH3
4,46
H18
H
O
CH2C(CH3)=CHCH3
5-CH3
4,54
H19
H
O
DMA 5-CH3
4,90
H20
8-NCH3
O
CPM
5-CH3
5,18
H21
9-N(CH3)2
O
CPM
5-CH3
5,18
H22
10-OCH3
O
DMA
5-CH3
5,18
H23
8-CONH2
O
DMA
5-CH3
5,20
H24
9-CF3
O
DMA
5-CH3
5,23
H25
10-OCH3
S
DMA
5-CH3
5,33
H26
H
O
DMA
5-CH3
5,48
H27
9-NO2
S
CPM
5-CH3
5,61
H28
10-Br
S
DMA
5-CH3
5,97
H29
8-CH3
O
DMA
5-CH3
6,00
H30
9-CF3
S
DMA
5-CH3
6,31
H31
8-CONH2
S
DMA
5-CH3
6,73
H32
9-Cl
O
DMA
5-CH3
6,74
H33
9-Cl
S
DMA
H
6,80
H34
8-OC2H5
S
DMA
5-CH3
7,02
H35
8-I
O
DMA
5-CH3
7,06
H36
H
S
CPM
5-CH3
7,22
H37
8-CN
S
DMA
5-CH3
7,25
H38
8-I
S
DMA
5-CH3
7,32
H39
8-Br
O
DMA
5-CH3
7,33
H40
8-Cl
S
DMA
H
7,34
H41
H
S
DMA
5-CH3
7,36
H42
9-Cl
S
DMA
5-CH3
7,47
H43
8-OCH3 S
DMA
5-CH3
7,47
H44
9-Cl
S
CPM
5-CH3
7,47
H45
8-CCH
S
DMA
5-CH3
7,53
H46
9-F
S
DMA
5-CH3
7,60
H47
9,10-di-Cl
S
DMA
5-CH3
7,60
H48
8-CH3
S
DMA
5-CH3
7,87
H49
8-F
S
DMA
5-CH3
8,24
H50
8-SCH3
S
DMA
5-CH3
8,30
H51
8-Cl
S
DMA
5-CH3
8,37
H52
8-Br
S
DMA
5-CH3
8,52
Tabela 2.
Wartości parametrów fizykochemicznych dla inhibitorów odwrotnej transkryptazy pochodnych 4,5,6,7-tetrahydroimidazolo[4,5,1jk][1,4]
benzodiazepin-2(1H)-onu
Zw.
pIC50
S [Å2]
V [Å3]
logP
R [Å3]
P [Å3]
M
HD
HA
Q1 [C]
Q2 [C]
Md
[D]
H1
3,04
288,39
245,87
0,45
73,18
28,43
275,31
1,00
6,00
0,08
-0,06
2,50
H2
3,07
273,19
241,07
0,49
74,23
28,28
258,32
3,00
5,00
0,08
-0,02
4,14
H3
3,80
315,25
276,53
0,12
82,61
32,04
300,36
2,00
6,00
0,09
-0,02
2,90
H4
3,91
345,85
306,20
3,18
97,25
37,17
319,41
1,00
4,00
0,08
-0,07
3,90
H5
3,97
289,02
258,18
0,16
81,93
30,85
283,33
1,00
5,00
0,08
-0,07
3,82
H6
4,00
292,37
253,94
2,08
76,20
29,54
259,35
1,00
4,00
0,06
-0,07
2,85
H7
4,05
274,05
237,30
1,69
71,59
27,70
245,32
1,00
4,00
0,08
-0,08
3,96
H8
4,15
268,03
232,71
1,02
71,48
27,51
243,31
1,00
4,00
0,08
-0,07
3,89
3,79
H9
4,15
293,24
260,11
1,95
80,41
30,99
269,35
1,00
4,00
0,08
-0,08
H10
4,21
274,39
245,10
1,67
79,02
30,14
322,20
1,00
4,00
0,08
-0,07
5,86
H11
4,22
276,61
241,59
0,49
74,23
28,28
258,32
3,00
5,00
0,09
-0,02
4,09
H12
4,24
267,59
238,85
1,38
77,51
29,35
257,34
1,00
4,00
0,07
0,03
3,43
H13
4,30
268,98
239,57
1,87
76,24
29,35
257,34
1,00
4,00
0,08
-0,08
3,89
H14
4,33
293,39
251,13
1,77
75,77
29,35
257,34
1,00
4,00
0,09
0,01
4,14
H15
4,36
263,39
230,60
1,27
69,53
26,93
243,31
1,00
4,00
0,09
0,03
3,97
H16
4,43
298,26
264,79
2,16
80,37
31,18
271,36
1,00
4,00
0,08
-0,08
3,83
H17
4,46
276,16
243,12
1,38
77,51
29,35
257,34
1,00
4,00
0,06
0,01
3,52
H18
4,54
267,70
246,64
2,35
81,23
31,28
272,37
1,00
4,00
0,06
-0,06
2,96
H19
4,90
296,72
264,60
2,11
80,54
31,18
271,36
1,00
4,00
0,09
-0,07
3,89
H20
5,18
309,36
275,43
1,54
83,96
31,95
286,38
1,00
5,00
0,09
-0,02
4,40
H21
5,18
314,05
275,88
1,54
83,96
31,95
286,38
1,00
5,00
0,09
-0,02
4,34
H22
5,18
325,98
289,07
1,85
87,00
33,65
301,39
1,00
5,00
0,08
-0,07
4,75
H23
5,20
325,92
292,41
0,94
89,12
34,45
314,93
3,00
6,00
0,09
-0,06
3,19
H24
5,23
327,92
288,92
2,99
86,51
32,74
339,36
1,00
4,00
0,09
-0,07
3,88
H25
5,33
337,12
300,41
3,45
95,59
36,82
317,45
1,00
4,00
0,24
-0,08
7,31
H26
5,48
280,33
248,13
1,69
76,12
29,35
257,34
1,00
4,00
0,08
-0,06
3,97
H27
5,61
299,03
261,08
-1,05
84,43
31,93
304,37
1,00
6,00
0,23
-0,03
4,70
H28
5,97
331,06
297,31
4,49
96,75
36,97
366,32
1,00
3,00
0,24
-0,08
6,36
H29
6,00
314,62
280,91
2,57
85,58
33,02
285,39
1,00
4,00
0,08
-0,07
4,14
H30
6,31
343,19
305,35
3,09
91,10
34,75
357,44
1,00
3,00
0,98
-0,11
11,79
H31
6,73
325,06
293,13
3,38
95,71
36,26
315,43
1,00
4,00
0,25
-0,07
4,83
H32
6,74
315,00
278,83
2,62
85,35
33,11
305,81
1,00
4,00
0,08
-0,06
3,41
H33
6,80
301,86
270,23
3,80
89,51
34,44
307,84
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,67
H34
7,02
353,63
316,68
3,79
100,33
38,65
331,48
1,00
4,00
0,23
-0,08
7,19
H35
7,06
322,51
292,59
3,36
92,25
36,21
397,26
1,00
4,00
0,09
-0,07
3,17
H36
7,22
276,06
241,70
2,86
78,11
30,09
259,37
1,00
3,00
0,24
-0,04
6,25
H37
H38
7,25
7,32
326,61
333,26
293,58
303,72
3,74
4,96
94,86
101,53
36,20
39,37
312,43
413,32
1,00
1,00
4,00
3,00
0,24
0,24
-0,08
-0,08
2,38
5,59
57
H39
7,33
321,58
293,50
4,42
91,23
34,78
348,28
1,00
4,00
0,05
-0,08
1,99
H40
7,34
307,21
273,37
3,80
89,51
34,44
307,84
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,39
H41
7,36
305,26
271,82
3,23
87,54
33,43
285,41
1,00
3,00
0,24
-0,08
6,25
H42
7,47
318,87
285,70
3,75
92,34
35,36
319,85
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,70
H43
7,47
330,65
295,69
2,98
94,00
35,90
315,43
1,00
4,00
0,23
-0,07
7,00
H44
7,47
293,20
255,88
3,38
82,92
32,02
293,81
1,00
3,00
0,24
-0,04
5,53
H45
7,53
336,46
303,57
4,35
98,81
37,82
313,46
1,00
3,00
0,24
-0,07
6,43
H46
7,60
312,71
278,42
3,84
89,34
34,25
305,41
1,00
3,00
0,24
-0,08
5,18
H47
7,60
339,19
303,78
4,74
98,73
38,20
356,31
1,00
3,00
0,24
0,07
5,82
H48
7,87
325,75
292,09
4,17
94,16
36,18
301,45
1,00
3,00
0,24
-0,08
6,65
H49
8,24
305,21
274,18
3,37
87,76
33,34
303,40
1,00
3,00
-0,01
-0,03
4,70
H50
8,30
340,09
306,56
3,32
100,45
38,27
331,49
1,00
3,00
0,24
-0,67
6,49
H51
8,37
316,25
285,51
3,75
92,34
35,36
319,85
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,44
H52
8,52
327,93
296,76
4,49
96,75
36,97
366,32
1,00
3,00
-0,05
-0,01
5,09
związki
N-N [Å]
eH
[ kcal/mol]
eL
[ kcal/mol]
B1
B2
H1
2,91
-8,74
-0,01
-0,71
H2
2,80
-8,34
0,06
-0,70
H3
2,81
-8,57
-0,24
H4
2,90
-8,75
H5
2,95
H6
H7
logD
Cl
F
Br
I
%PSA
-0,44
1,28
0,00
0,00
0,00
0,00
21,46
-0,44
-0,78
0,00
0,00
0,00
0,00
22,55
-0,80
-0,49
-0,02
0,00
0,00
0,00
0,00
20,52
-0,31
0,10
-0,02
2,81
0,00
0,00
0,00
0,00
10,29
-8,79
0,04
-0,56
-0,23
1,46
0,00
0,00
0,00
0,00
16,86
2,94
-8,90
-0,14
-0,07
-0,02
1,67
0,00
0,00
0,00
0,00
12,17
2,88
-8,75
0,03
-0,13
-0,02
1,14
0,00
0,00
0,00
0,00
12,98
H8
2,89
-8,74
0,02
-0,23
-0,02
1,47
0,00
0,00
0,00
0,00
13,27
H9
2,96
-8,76
0,00
-0,09
-0,02
2,61
0,00
0,00
0,00
0,00
12,13
H10
2,95
-8,90
-0,16
-0,13
-0,02
2,73
0,00
0,00
1,00
0,00
12,97
H11
2,81
-8,31
0,07
-0,70
-0,44
-0,66
0,00
0,00
0,00
0,00
22,27
H12
2,87
-8,24
-0,15
-0,18
-0,02
1,92
0,00
0,00
0,00
0,00
13,30
H13
2,81
-8,74
0,02
-0,10
-0,02
2,04
0,00
0,00
0,00
0,00
13,23
H14
2,85
-8,74
-0,01
-0,12
-0,02
1,79
0,00
0,00
0,00
0,00
12,13
H15
2,86
-8,75
0,03
-0,19
-0,02
0,38
0,00
0,00
0,00
0,00
13,51
H16
2,97
-8,76
0,01
-0,06
-0,02
2,33
0,00
0,00
0,00
0,00
11,93
H17
2,87
-8,23
-0,16
-0,18
-0,02
1,92
0,00
0,00
0,00
0,00
12,88
H18
2,88
-6,20
-1,19
-0,03
-0,02
2,26
0,00
0,00
0,00
0,00
13,29
H19
2,88
-8,90
-0,14
-0,07
-0,02
3,10
0,00
0,00
0,00
0,00
11,99
H20
2,74
-8,32
0,05
-0,20
-0,07
0,59
0,00
0,00
0,00
0,00
12,55
H21
2,79
-8,24
0,11
-0,20
-0,07
0,92
0,00
0,00
0,00
0,00
12,36
H22
2,88
-8,68
0,09
-0,24
-0,17
2,09
0,00
0,00
0,00
0,00
13,75
H23
2,86
-8,92
0,60
-0,88
-0,71
0,83
0,00
0,00
0,00
0,00
24,14
H24
2,88
-9,17
-0,62
0,07
-0,02
3,65
0,00
3,00
0,00
0,00
10,85
H25
2,91
-8,19
-0,69
-0,22
-0,41
2,80
0,00
0,00
0,00
0,00
17,75
H26
2,89
-8,71
0,04
-0,13
-0,02
1,64
0,00
0,00
0,00
0,00
12,69
H27
2,84
-8,79
-1,56
-1,45
-1,00
2,17
0,00
0,00
0,00
0,00
32,24
H28
2,91
-8,36
-0,94
0,07
-0,26
3,63
0,00
0,00
1,00
0,00
15,28
H29
2,86
-8,65
0,06
0,00
-0,02
2,53
0,00
0,00
0,00
0,00
11,31
H30
2,74
-5,88
-2,04
-0,14
-0,26
4,30
0,00
3,00
0,00
0,00
14,74
H31
2,90
-8,65
-0,94
-0,35
-0,54
2,50
0,00
0,00
0,00
0,00
20,82
H32
2,96
-8,68
-0,17
0,01
-0,02
3,17
1,00
0,00
0,00
0,00
11,30
H33
2,81
-8,33
-0,91
-0,03
-0,26
3,50
1,00
0,00
0,00
0,00
16,76
H34
2,89
-8,16
-0,71
-0,17
-0,41
3,50
0,00
0,00
0,00
0,00
16,92
H35
2,85
-8,74
-0,58
0,12
-0,02
3,43
0,00
0,00
0,00
1,00
11,03
H36
2,89
-8,26
-0,77
-0,18
-0,26
1,22
0,00
0,00
0,00
0,00
18,33
H37
2,90
-8,63
-1,33
-0,39
-0,64
3,76
0,00
0,00
0,00
0,00
22,78
H38
2,88
-8,31
-0,90
0,14
-0,26
4,09
0,00
0,00
0,00
1,00
15,18
H39
2,76
-8,37
-0,09
0,28
-0,02
3,18
0,00
0,00
1,00
0,00
11,06
H40
2,92
-8,32
-0,91
-0,03
-0,26
3,69
1,00
0,00
0,00
0,00
16,47
58
H41
2,89
-8,26
-0,76
-0,12
-0,26
3,82
0,00
0,00
0,00
0,00
16,58
H42
2,81
-8,32
-0,90
-0,04
-0,26
3,99
1,00
0,00
0,00
0,00
15,87
H43
2,79
-8,17
-0,85
-0,29
-0,41
2,97
0,00
0,00
0,00
0,00
18,09
H44
2,89
-8,34
-0,92
-0,10
-0,26
2,69
1,00
0,00
0,00
0,00
17,26
H45
2,88
-8,19
-0,84
0,05
-0,26
3,35
0,00
0,00
0,00
0,00
15,04
H46
2,91
-8,37
-0,96
-0,03
-0,26
3,44
0,00
1,00
0,00
0,00
16,18
H47
2,90
-8,38
-1,03
0,11
-0,26
4,40
2,00
0,00
0,00
0,00
14,92
H48
2,89
-8,19
-0,72
0,02
-0,26
3,29
0,00
0,00
0,00
0,00
15,53
H49
2,81
-8,38
-0,94
-0,10
-0,26
3,13
0,00
1,00
0,00
0,00
16,58
H50
2,78
-8,21
-0,84
-0,48
-0,67
3,50
0,00
0,00
0,00
0,00
22,32
H51
2,81
-8,31
-0,90
-0,04
-0,26
3,69
1,00
0,00
0,00
0,00
16,00
H52
2,90
-8,37
-0,94
0,07
-0,26
3,84
0,00
0,00
1,00
0,00
15,43
Tabela 3.
Wyniki analizy wariancji dla zmiennych w modelu i wartości średnich dla każdego skupienia
zmienna
F
p
pIC50
S
V
logP
P
HA
HD
Q1
N-N
Cl
PSA%
54,35542
63,76588
69,51182
38,37724
68,65278
1,64278
21,53544
9,25522
3,12496
5,79882
1,68609
0,000000
0,000000
0,000000
0,000000
0,000000
0,203915
0,000000
0,000389
0,052805
0,005491
0,195811
Średnia 1
skupienia
-0,270097
0,620892
0,586988
-0,218937
0,231819
0,340133
0,868383
-0,492178
-0,617155
-0,371015
-0,455939
Średnia 2
skupienia
-0,88282
-1,06432
-1,07565
-0,84214
-1,03855
0,13447
0,40995
-0,41918
0,31305
-0,37101
-0,02781
Średnia 3
skupienia
0,925338
0,685341
0,711052
0,865097
0,838763
-0,276852
-0,767399
0,604788
-0,004066
0,505929
0,232531
Tabela 4.
Elementy każdego skupienia i ich odległość od środka skupienia
Elementy skupienia
1 o działaniu średnim
odległość
Elementy skupienia
2 o działaniu
słabym
odległość
Elementy skupienia
3 o działaniu silnym
odległość
H3
0,996428
H1
0,826443
H25
0,622601
H4
H20
H21
H22
H23
H24
H29
H35
H39
0,800506
0,636572
0,440089
0,349281
1,401729
0,491963
0,427278
0,591008
0,813233
H2
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
H14
H15
H16
H17
H18
H19
H26
H27
H36
1,374987
0,572766
0,484278
0,349789
0,395729
0,579017
0,447480
1,323457
0,320487
0,511137
0,395197
0,462283
0,670163
0,283501
0,390788
0,481683
0,338070
1,531500
0,861703
H28
H30
H31
H32
H33
H34
H37
H38
H40
H41
H42
H43
H44
H45
H46
H47
H48
H49
H50
H51
H52
0,508992
1,767258
0,519840
0,973703
0,691904
0,679353
0,593641
0,556812
0,637294
0,508636
0,575944
0,598260
0,831838
0,448987
0,444526
1,277764
0,351001
0,799258
0,795917
0,613459
0,767912
59
Tabela 5.
Macierz obserwowanych i przewidywanych klasyfikacji przypadków w grupach z zastosowaniem modelu
Macierz klasyfikacji Wiersze: obserwowana klasyfikacja Kolumny: Przewidywana klasyfikacja
Procent poprawnie
G_1
G_2
G_3
G_1
100,0000
10
0
0
G_2
100,0000
0
20
0
G_3
100,0000
0
0
22
Razem
100,0000
10
20
22
Elżbieta Brzezińska
Zakład Chemii Analitycznej UM w Łodzi,
ul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódź, tel. 042-677-92-11;
[email protected]
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Sternbach, L.H. The Benzodiazepines Story. J Med Chem
1979; 22: 1-7.
Johnson RE. i wsp.: 4,5-Dihydro-3-(methanesulfonamidophenyl)-1-phenyl-1H-2,4-benzodiazepines: a novel class III
antiarrhythmic agents. J Med Chem 1993; 36:3361-70.
Butcher JW. i wsp.: Novel 5-cyclopropyl-1,4-benzodiazepin-2ones as potent and selective I(Ks)-blocking class III antiarrhythmic agents. Bioorg Med Chem Lett 2003; 13(6): 1165-68.
Seebohm G. i wsp.: Molecular Determinants of KCNQ1
Channel Block by a Benzodiazepine. Mol Pharmacol 2003;
64: 70–77.
Shvetsa N. i wsp.: Study of the electronic and structural
features characteristic of 4,5-dihydro-1-phenyl-1H-2,4benzodiazepines demonstrating antiarrhythmic activity. J
Mol Structure (Theochem) 1993; 463: 105–110.
Gupta S.P. Quantitative Structure-Activity Relationship Studies on Cholecystokinin Antagonists. Current Pharm Design,
2002; 8: 111-124
Ursini A. i wsp.: Synthesis and SAR of new 5-phenyl-3ureido-1,5-benzodiazepines as cholecystokinin-B receptor
antagonists. J Med Chem 2000; 43: 3596-3613
Evans B.E. i wsp.: Design of potent, orally effective non
peptidal antagonists of the peptide hormone cholecystokinin.
Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 4918-22.
Kukla MJ. i wsp.: Synthesis and anti-HIV-1 activity of 4,5,6,7tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)-one (TIBO) derivatives. J Med Chem 1991; 34: 746-751.
Ren J. i wsp.: The structure of HIV-1 reverse transcriptase
complexed with 9-chloro-TIBO: lessons for inhibitor design.
Structure 1995; 3: 915-26.
Zhou Z., Madura JD. CoMFA 3D-QSAR Analysis of HIV-1
RT Nonnucleoside Inhibitors, TIBO Derivatives Based on
Docking Conformation and Alignment Chem. Inf Comput Sci
2004; 44: 2167 -2178.
Viroj W. Analysis of binding energy activity of TIBO and HIV
-RT based on simple consideration for conformational change
African J Biotech 2007; 6: 188-189.
0Gower AJ. i wsp.: Pharmacological evaluation of in vivo tests
for alpha 2-adrenoceptor blockade in the central nervous system
and the effects of the enantiomers of mianserin and its aza-analog
ORG 3770 Arch Int Pharmacodyn Ther 1988; 291: 185-201.
Liebman JM. i wsp.: CGS 7525A, a new, centrally active alpha 2-adrenoceptor antagonist. Life Sci 1983; 32: 355-63.
Cappelli A. i wsp.: Synthesis, biological evaluation, and quantitative receptor docking simulations of 2-[(acylamino)ethyl]-1,4-benzodiazepines as novel tifluadom-like ligands with
high affinity and selectivity for k-opioid receptors. J Med
Chem 1996; 39: 860–872.
Anzini M. i wsp.: Synthesis, Biological Evaluation, and Receptor Docking Simulations of 2-[(Acylamino)ethyl]-1,4benzodiazepines as k-Opioid Receptor Agonists Endowed
with Antinociceptive and Antiamnesic Activity. J Med Chem
2003; 46: 3853-3864.
60
17. Burkard WP. [H3] Tifluadom binding in guinea-pig brain
membranes. Eur J Pharmacol, 1984; 97: 337–338.
18. Romer D. i wsp.: Unexpected opioid activity in a known class
of drug. Life Sciences 1982; 31: 1217-20
19. Dor A., Krasnowska M. Wpływ pirenzepiny – wybiórczego
antagonisty receptorów M1, podanej po inhalacji ipratropium,
na wentylację płuc u chorych na przewleklą obturacujną chorobę płuc Alergia Astma Immunologia 2000; 5: 193-196.
20. Baile CA. i wsp.: Endotoxin-elicited fever and anorexia and
elfazepam-stimulated feeding in sheep. Physiology and Behaviour 1981; 27: 271-277.
21. Van Den Broek GW. i wsp.: Feeding and depression of abomasal secretion in sheep elicited by elfazepam and 9-azacannabinol Pharmacol Biochem Behav 1979; 11: 51-6
22. Squires, RF., Saederup E. Clozapine and several other antipsychotic/antidepressant drugs preferentially block the same
core fraction of GABAA receptors. Neurochem Res 1998; 23:
1283-1290.
23. Chebib M., Graham A., Johnston A. GABA-Activated Ligand Gated Ion Channels: Medicinal Chemistry and Molecular Biology. J Med Chem 2000; 43: 8.
24. Brea J. i wsp.: QF2004B, a potential antipsychotic butyrophenone derivative with similar pharmacological properties to
clozapine Neuropharmacol 2006; 34: 1-12.
25. Kesäniemi YA., Miettinen TA. Inhibition of cholesterol absorption by neomycin, benzodiazepine derivatives and ketoconazole Eur J Clin Pharmacol 1991; 40 Suppl1: 65-7.
26. Breslin HJ. i wsp.: Synthesis and Anti-HIV-1 Activity of
4,5,6,7-Tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)-one (TIBO) Derivatives. J Med Chem 1995;
38: 771-793.
27. Ho W. i wsp.: Synthesis and Anti-HIV-1 Activity of 4,5,6,7Tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)-one (TIBO) Derivatives. J Med Chem 1995; 38:
794-802.
28. Breslin HJ. i wsp.: Synthesis and anti-HIV activity of 1,3,4,5tetrahydro-2H-1,4-benzodiazepin-2-one (TBO) derivatives.
Truncated
4,5,6,7-tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk]
[1,4]benzodiazepin-2(1H)-one (TIBO) analogues. Bioorg
Med Chem 1999; 7: 2427-2436.
29. Brzezińska E. The QSAR analysis of tricyclic non-nucleoside
inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. Acta Polon Pharm
2003; 60: 3-13.
30. Brzezińska E., Glinka R. Serach for New non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase (HIV-1 RT). Acta Polon
Pharm 2002; 59: 379-392.
31. Adams D. i wsp.: Preparation and Anti-HIV Activity of N-3
-Substituted Thymidine Nucleoside Analogs. J Med Chem
1997; 40: 1550-1558.
32. 0Schafer W. i wsp.: Non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse
transcriptase: Molecular modeling and X-ray structure investigations. J Med Chem 1993; 36: 726-733.
Wątrobowy i nerkowy układ monooksygenaz zależnych
od cytochromu P450: wpływ glikolu etylenowego
i 4-metylopirazolu
Andrzej Plewka, Danuta Plewka1, Grażyna Nowaczyk2, Joanna Kowalówka-Zawieja3,
Barbara Zielińska-Psuja3, Tomasz Szczepanik
Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny w Sosnowcu,
Katedra Morfologii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach,
2
Ośrodek Badania Efektów Edukacyjnych, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach,
3
Katedra i Zakład Toksykologii Uniwersytetu Medycznego im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
1
Streszczenie
Badania nad mechanizmem toksycznego działania glikolu etylenowego były dotąd głównie skoncentrowane
na utlenianiu tego związku przez dehydrogenazę alkoholową i aldehydową. Przemiany glikolu etylenowego
do formaldehydu przebiegają przy współudziale cytochromu P450. Początkowo zakładano, że bierze w nich
udział jedynie izoforma CYP 2E1. W chwili obecnej
istnieją przesłanki, że w przemiany te są zaangażowane inne izoenzymy. W świetle powyższych danych celem niniejszego projektu badawczego jest kompleksowa
ocena przydatności 4-metylopirazolu (4-MP) w postępowaniu leczniczym w zatruciach pojedynczych glikolem
etylenowym.
Badania zostały przeprowadzone na dojrzałych szczurach samcach szczepu Wistar. Glikol etylenowy w dawce
3830 mg/kg m.c. (1/2 DL50) był podawany per os sondą
dożołądkową, natomiast 4-MP w dawce 10 mg/kg m.c.
dootrzewnowo. Materiał do badań (nerki, wątroba) był
pobierany od zwierząt po 8; 12; 18; 24; 36 i 48 godzin od
podania ksenobiotyku. W uzyskanych mikrosomach wykonano oznaczenia aktywności układu monooksygenaz
zależnych od cytochromu P450 oraz określono poziom
izoform 2E1, 1A2 i 2B1/2.
Uzyskane wyniki wskazują, że 4-MP indukuje poziom
cytochromu P450, praktycznie nie wpływając na pozostałe składniki układu monooksygenazowego zarówno
w wątrobie jak i w nerce. Co więcej 4-MP indukował
wszystkie badane izoformy P450.
słowa kluczowe: CYPP450, szczur, wątroba, nerka, glikol etylenowy, 4-metylopirazol
Wstęp
Badania nad mechanizmem toksycznego działania glikolu etylenowego (GE) były dotąd głównie skoncentrowane
na utlenianiu tego związku przez dehydrogenazy: alkoholową (ADH) i aldehydową (ALDH) do aldehydu i kwasu
glikolowego. Ostatnie doniesienia wskazują, że mechanizm
toksycznego działania GE może polegać również na tworzeniu wolnych rodników i ich łączeniu się z makromoleku-
Abstract
Until now the researches on the mechanism of the toxic
influence of the ethylene glycol were mainly concentrated on the oxidation of this compound by the alcohol and aldehyde dehydrogenases. The changes of the
ethylene glycol into formaldehyde proceed with the
participation of the cytochrome P450. At first it was
assumed that only the CYP2E1 isoform participates in
them. At present there are premises that other isoenzymes are in these changes involved. Considering the
above-mentioned data, the aim of this research project
is comprehensive evaluation of the usefulness 4-methylpyrazole (4-MP) during treatment in the isolated ethylene glycol poisonings.
The researches were done on mature breed of Wistar
male rats. Ethylene glycol in dose 3830 mg/kg body
weight (1/2 DL50) was given per os with a stomach
probe, whereas 4-MP in dose 10 mg/kg body weight into
peritoneum. The research material (kidneys, liver) was
taken from animals 8; 12; 18; 24; 36 and 48 hours after
giving the xenobiotic. In resulted microsomes there were
done the markings of the activity of the monooxygenase
system depending on the cytochrome P450 and there
was also determined the level of the isoforms 2E1, 1A2
and 2B1/2.
The received results indicate that 4-MP induces the level
of the cytochrome P450, practically not having influence
on the other ingredients of the monooxygenase system,
both in the liver and in the kidney. Additionally, 4-MP
induced all the researched isoforms P450.
keywords: CYPP450, rat, liver, kidney, ethylene glycol,
4-methylpyrazole
łami komórkowymi, a także bezpośrednim cytotoksycznym
działaniu metabolitów. Tym samym stosowanie w terapii
zatruć glikolem etylenowym jedynie odtrutek spowalniających przemiany GE za pośrednictwem ADH może być niewystarczające. Przemiany GE do formaldehydu przebiegają
również przy współudziale cytochromu P450. Początkowo
zakładano, że bierze w nich udział jedynie izoforma CYP2E1. W chwili obecnej istnieją przesłanki, że w przemiany te są zaangażowane inne izoenzymy jak np. CYP1A2
61
czy CYP2B1/2. Obecnie w leczeniu zatruć GE stosuje się
specyficzne odtrutki, jak etanol czy 4-metylopirazol [1].
W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych porównawczych dotyczących oceny skuteczności i ryzyka stosowania
obu tych terapii. Ponadto często zatruciu glikolem etylenowym towarzyszy spożycie alkoholu etylowego. W takich
przypadkach zastosowanie 4-metylopirazolu może doprowadzić do wystąpienia interakcji pomiędzy ksenobiotykami. Wykazano bowiem, że równoczesne podanie etanolu
i 4-metylopirazolu zdrowym ochotnikom powoduje
o około 40% obniżenie szybkości eliminacji etanolu i 50%
obniżenie wydalania 4-metylopirazolu utrzymujące się do
8 godzin od podania ksenobiotyków [2, 3]. Te wzajemne
modyfikacje mogą mieć kliniczne implikacje u wielu pacjentów, którzy równocześnie spożyli etanol i glikol etylenowy. W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych czy
podobne interakcje mogą zachodzić również po łącznym
podaniu glikolu etylenowego, etanolu i 4-metylopirazolu.
Badania ostatnich lat wykazały, że glikol etylenowy może
być również utleniony do formaldehydu z uwolnieniem nadtlenku wodoru. Istotny udział w tej reakcji odgrywa cytochrom P450, a zwłaszcza jego izoforma CYP2E1 oraz izoenzymy indukowane fenobarbitalem i 3-metylocholantrenem.
Utlenianie glikolu etylenowego do formaldehydu za pośrednictwem cytochromu P450 prowadzi do wytworzenia nadtlenku
wodoru. Powstające w obecności Fe(II) rodniki ponadtlenkowe
odpowiedzialne są za wywoływanie stresu oksydacyjnego związanego z naruszeniem równowagi pomiędzy procesami generacji aktywnych form tlenu i procesami antyoksydacyjnymi.
W latach 70-tych w doświadczalnym zatruciu glikolem etylenowym u zwierząt wykazano skuteczność
4-metylopirazolu. W 1998 roku 4-metylopirazol został dopuszczony w USA do stosowania klinicznego jako specyficzna odtrutka w leczeniu zatruć glikolem etylenowym u osób
powyżej 12. roku życia [4]. 4-Metylopirazol skuteczniej niż
etanol ogranicza przemiany glikolu etylenowego zachodzące za pośrednictwem dehydrogenazy alkoholowej, zarówno
u zwierząt jak i u ludzi [5, 6]. Ponadto jego działanie inhibicyjne utrzymuje się znacznie dłużej stąd też 4-metylopirazol
zalecany jest w przypadkach ostrych i ciężkich zatruć [6, 7].
Glikol etylenowy jest inhibitorem cytochromu P450.
W biotransformacji glikolu bierze udział wiele izoenzymów
cytochromu P450. Izoformy CYP2E1 i CYP2B1/2 biorą
udział w tym metabolizmie w stopniu istotnym. Dane literaturowe wskazują, że CYP2E1 efektywnie bierze udział
w metabolizmie glikolu i sugerują, że glikol ten jest induktorem CYP2E1. Wydaje się, że delikatny wpływ stymulujący glikol ma także na CYP2B1/2, ale w stosunku do innych
izoform ma on raczej charakter inhibitorowy.
W świetle powyższych danych celem niniejszej pracy
była ocena przydatności 4-metylopirazolu w postępowaniu
leczniczym w zatruciach pojedynczych glikolem etylenowym. Dokonano oceny aktywności enzymów biorących
udział w metabolizmie glikolu etylenowego.
Materiały i metody
Zwierzęta
Badania przeprowadzono na dojrzałych szczurach samcach szczepu Wistar. Każde zwierzę przebywało osobno
62
w klatkach plastikowych a hodowla była prowadzona
w tym samym pomieszczeniu. Grupy liczyły po 5 zwierząt
dla każdego z punktów czasowych w poszczególnych grupach badawczych. W czasie trwania eksperymentu szczury
były hodowane w standardowych warunkach (21O C, wilgotność 55-60%, dzień-noc 12:12 godz.).
Szczury karmiono paszą standardową (Labofeed), którą
usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny dostęp do wody. Szczury usypiano za pomocą ketaminy
podanej domięśniowo w dawce 10 mg/kg m.c. Natychmiast
pobierano wątroby oraz nerki i umieszczano je w lodowatym roztworze soli fizjologicznej.
Materiał do badań (nerki, wątroba) pobierano od zwierząt
po 8; 12; 18; 24; 36 i 48 godzin od podania ksenobiotyku.
Traktowanie
Glikol etylenowy w dawce 3830 mg/kg m.c. (1/2
DL50) był podawany per os sondą dożołądkowo, natomiast
4-metylopirazol w dawce 10 mg/kg m.c. dootrzewnowo
(jest to standardowa dawka stosowana w terapii).
Ksenobiotyki były podawane wg następującego schematu:
- grupa kontrolna
- zwierzęta otrzymujące glikol etylenowy
- zwierzęta otrzymujące 4-metylopirazol
- zwierzęta otrzymujące oba oceniane ksenobiotyki
Izolacja frakcji mikrosomalnej
Wątrobową i nerkową frakcję mikrosomalną izolowano
według metody Dallnera [8]. Po kilkukrotnym przepłukaniu
w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie
skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema
z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę i czterech
pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnym był
0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze
Tris-HCl o pH=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm3 tego
roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano
w temperaturze 2-40 C. Uzyskany homogenat poddano procesowi wirowania różnicowego, w którym kolejno osadzano
frakcję jądrową (10 min., 900g), mitochondrialną (20 min.,
20000g) i wreszcie mikrosomalną (90 min., 105000g).
Czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym 20% o/o roztworze glicerolu tak, aby stężenie białka
było nie mniejsze niż 5 mg/cm3. Próby te natychmiast zamrażano w temperaturze -200 C.
Metody oznaczania składników układu cytochromu P450
W uzyskanych mikrosomach wykonano oznaczenia:
- stężenia białka metodą Lowry’ego i wsp. [9].
- zawartości cytochromów P450 i b5 - spektrofotometrycznie wykonując tzw. widmo różnicowe, metodą Estabrooka i Werringloera [10].
- aktywności reduktazy NADPH-cytochrom P450 i reduktazy NADH-cytochrom b5 - spektrofotometrycznie metodą Hodgesa i Leonarda [11].
- analiza ekspresji białek P450 w komórkach wątroby
i nerek przeprowadzono techniką elekroforetyczną i
Western blottingu. Analiza ilościowa izoform 2E1, 1A2
[nM/mg białka]
Ryc. 1.
Cytochrom P450
1,2
1
*
0,8
*
*
*
*
*
0,6
*
*
*
*
0,4
0,2
0
8h
Kontrola
12h
Glikol
18h
4-Metylopirazol
24h
36h
48h
[Czas]
Glikol+4-Metylopirazol
Ryc. 1.0Stężenie cytochromu P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol
(4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G)
(*) – oznacza zmianę znamiennie statystyczną dla p=0.05 w stosunku do własnej grupy kontrolnej.
[[μM/min/mg białka]
Ryc. 2.
Reduktaza NADPH-cytochrom P450
0,14
*
0,12
*
0,1
*
*
*
*
0,08
0,06
0,04
0,02
0
8h
12h
18h
24h
36h
48h
[Czas]
Kontrola
Glikol
4-Metylopirazol
Ryc. 2.0 Aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP
+ G)
i 2B1/2 została przeprowadzona na podstawie pomiarów
densytometrycznych blotów.
Analiza statystyczna
Wyniki oznaczeń biochemicznych, które przedstawiono
w tym opracowaniu są średnią z pięciu niezależnych pomiarów. Istotność różnic w poszczególnych seriach, a także
pomiędzy grupami czasowymi oceniano na podstawie testu
ANOVA na poziomie p=0.05.
Wyniki
Układ monooksygenaz zależnych od cytochromu P450
Wątroba
Traktowanie glikolem nie zmieniało zawartości cytochromu P450 do 18 godziny obserwacji. Począwszy od
24 godziny, w której stwierdzono hamowanie do 82%
kontroli, w kolejnych przedziałach czasu inhibicja pogłębiała się, osiągając 66% wartości grupy kontrolnej
w 48 godzinie (Ryc. 1). Reduktaza współpracująca z cytochromem P450 w tym doświadczeniu w pierwszej dobie obserwacji wykazywała tendencję do wzrostu swojej
aktywności, która zmieniała się w utrwaloną stymulację
sięgająca 125% kontroli w 48 godzinie od zakończenia
obserwacji (Ryc. 2).
Od 18 godziny po podaniu glikolu zaczęła spadać zawartość cytochromu b5. Od 90% wartości grupy kontrolnej do
około 65% po 48 godzinach obserwacji (Ryc. 3). Glikol nie
miał natomiast żadnego wpływu na aktywność reduktazy
współpracującej z cytochromem b5 (Ryc. 4).
Traktowanie 4-metylopirazolem doprowadziło po 8 godzinie obserwacji do 115% wzrostu zawartości cytochromu
P450, który rósł do 24 godziny, gdzie osiągał około 125%
wartości kontroli. Do końca obserwacji wartość ta nie uległa
zmianie (Ryc. 1). W tych warunkach narażenia, aktywność
63
[nM/mg białka]
Ryc. 3.
Cytochrom b5
*
0,8
*
0,7
0,6
*
*
0,5
* *
*
*
0,4
0,3
0,2
0,1
0
8h
Kontrola
12h
Glikol
4-Metylopirazol
18h
24h
36h
48h
[Czas]
Ryc. 3.0Stężenie cytochromu b5 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP)
oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G)
[[μ M/min/mg białka]
Ryc. 4.
Reduktaza NADH-cytochrom b5
0,9
*
*
*
0,8
*
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
8h
Kontrola
12h
Glikol
4-Metylopirazol
18h
24h
36h
48h
[Czas]
Ryc. 4.0 Aktywność reduktazy NADH-cytochrom b5 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G),
4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G)
[nM/mg białka]
Ryc. 5.
Cytochrom P450
0,25
0,2
0,15
*
0,1
* *
**
*
*
*
*
*
*
*
**
*
0,05
0
8h
Kontrola
12h
Glikol
4-Metylopirazol
18h
24h
36h
48h
[Czas]
Ryc. 5.0Stężenie cytochromu P450 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP)
64
[[μM/min/mg białka]
Ryc. 6.
Reduktaza NADPH-cytochrom P450
0,06
*
0,05
*
*
0,04
0,03
*
0,02
*
*
*
*
0,01
0
8h
12h
Kontrola
Glikol
4-Metylopirazol
18h
24h
36h
48h
[Czas]
Ryc. 6.0Aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G),
Ryc. 7.
Cytochrom b5
[nM/mg białka]
0,16
0,14
*
*
*
0,12
*
0,1
0,08
*
*
*
*
*
*
0,06
0,04
0,02
0
8h
Kontrola
12h
Glikol
4-Metylopirazol
18h
24h
36h
48h
[Czas]
Ryc. 7.0Stężenie cytochromu b5 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP)
Ryc. 8.
Reduktaza NADH-cytochrom b5
[[μ M/min/mg białka]
0,16
0,14
*
*
0,12
0,1
*
0,08
*
*
*
*
*
0,06
* *
*
*
0,04
0,02
0
8h
Kontrola
12h
Glikol
4-Metylopirazol
18h
24h
36h
48h
[Czas]
Ryc. 8.0 Aktywność reduktazy NADH-cytochrom b5 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G),
65
reduktazy NADPH-cytochrom P450 przez cały okres obserwacji była podobna do wartości grup kontrolnych (Ryc. 2).
W tej grupie doświadczalnej poziom wątrobowego cytochromu b5 wykazywał tendencję do słabo zaznaczonego spadku poniżej wartości kontrolnych (Ryc. 3). Podanie
4-metylopirazolu miało delikatnie stymulujący wpływ na
aktywność reduktazy NADH-cytochrom b5. Praktycznie
przez cały czas obserwacji aktywność tej reduktazy oscylowała w granicach 120% wartości kontroli (Ryc. 4).
Równoczesne podanie obu badanych ksenobiotyków
wykazywało tendencję do ujemnego wpływu na poziom
wątrobowego cytochromu P450 w całym okresie obserwacji. Ujawniono inhibicję na poziomie 90% kontroli (Ryc. 1).
Reduktaza współpracująca z tym cytochromem przez pierwszą dobę od zakończenia eksperymentu nie zmieniała swojej
aktywności. Po tym czasie aktywność tego enzymu rosła,
od 120% w 36 godzinie do 135% kontroli po 48 godzinach
obserwacji (Ryc. 2).
W warunkach łącznego narażenia obserwowano praktycznie brak wpływu badanych ksenobiotyków na oba składniki II mikrosomalnego łańcucha transportu elektronów
(Ryc. 3). Dopiero po pierwszej dobie obserwacji pojawiał
się subtelny inhibitorowy wpływ ksenobiotyków na poziom
cytochromu b5, który w 36 i 48 godzinie obserwacji wynosił
około 90% kontroli. Reduktaza NADH-cytochrom b5 zareagowała tendencją do delikatnej stymulacji swojej aktywności, sięgającej w pierwszej dobie poziom 110% kontroli.
W pozostałych fazach obserwacji stwierdzono aktywność
porównywalna do grup kontrolnych (Ryc. 4).
Nerka
Traktowanie glikolem miało negatywny wpływ na zawartość cytochromu P450 w całym przedziale obserwacji
(Ryc. 5). Począwszy od 8 godziny, gdzie stwierdzono hamowanie sięgające 88% kontroli, w kolejnych przedziałach
czasu inhibicja pogłębiała się, osiągając 62% wartości grupy
kontrolnej w 48 godzinie. Reduktaza współpracująca z cytochromem P450 w tej grupie doświadczalnej w pierwszych
kilkunastu godzinach obserwacji wykazywała tendencję do
hamowania swojej aktywności (Ryc. 6). Począwszy od 18
godziny zmieniała się ona w utrwaloną inhibicję sięgającą
nawet 60% kontroli w 24 godzinie od zakończenia obserwacji. W kolejnych przedziałach była ona nieco słabsza.
Od 24 godziny po podaniu glikolu ujawniono spadek
zawartość cytochromu b5. Wynosił on około 80% wartości
grupy kontrolnej aż do 48 godziny obserwacji (Ryc. 7). Glikol miał podobny wpływ na aktywność reduktazy współpracującej z cytochromem b5, z tą różnicą, że hamowanie
aktywności reduktazy miało już miejsce w 18 godzinie.
Szczurzy narażone na 4-metylopirazol nie zareagowały
zmianą poziomu białka mikrosomalnego w żadnym z okresów obserwacyjnych (Ryc. 8).
Traktowanie 4-metylopirazolem prowadziło do wzrostu
zawartości cytochromu P450 do 36 godziny, w której osiągnął poziom 140% kontroli (Ryc. 5), utrzymujący się do 48
godziny obserwacji. W tych warunkach aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 rosła do 24 godziny obserwacji, osiągając 140% poziomu grupy kontrolnej. W kolejnej
grupie czasowej stymulacja ta lekko obniżyła się do 130%
66
i utrzymywała się do 48 godziny obserwacji na tym poziomie (Ryc. 6).
W tej grupie doświadczalnej poziom nerkowego cytochromu b5 nie zmienił się w 8 i 12 godzinie obserwacji
(Ryc. 7). W dwóch kolejnych przedziałach czasowych ujawniono słabą stymulację zawartości tego białka, sięgającą
120% kontroli. Od tego momentu ujawniono brak wpływu
4-metylopirazolu na poziom omawianej hemoproteiny. Podanie 4-metylopirazolu stymulowało aktywność reduktazy
NADH-cytochrom b5 (Ryc. 8). Od około 110% po 8 godzinach po podaniu ksenobiotyku, do ponad 140% kontroli po
36 godzinach obserwacji.
Narażenie na równoczesne podanie glikolu etylenowego i 4-metylopirazolu miało pozytywny wpływ na poziom
cytochromu P450 praktycznie w całym okresie obserwacji
(Ryc. 5). Począwszy od 12 godziny ujawniono stymulację,
począwszy od 110%, która po 36 godzinach wynosiła 160%
kontroli. W 48 godzinie obserwacji stymulacja była słabsza
i wynosiła 140% kontroli. Reduktaza współpracująca z tym
cytochromem przez pierwszych 18 godzin od zakończenia
eksperymentu nie zmieniała swojej aktywności (Ryc. 6). Po
tym czasie aktywność tego enzymu rosła od 115% kontroli
do 145% w 48 godzinie obserwacji.
W tej grupie doświadczalnej poziom nerkowegocytochromu b5 nie zmienił się w 8 godzinie obserwacji
(Ryc. 7). Od tego momentu ujawniono hamowanie sięgające
nawet 70% kontroli, które nie zanikało do końca obserwacji.
Podanie 4-metylopirazolu hamowało aktywność reduktazy
NADH-cytochrom b5. Od 90% po 8 godzinach po podaniu
4-metylopirazolu, do 70% kontroli po 24 i 36 godzinach obserwacji (Ryc. 8).
Izoformy cytochromu P450
Wątroba
Stymulujący wpływ glikolu etylenowego na CYP2E1
obserwowano we wszystkich badanych przedziałach czasowych, jednak jego maksimum ujawniono w 24 godzinie, gdzie stanowiło ono 245% kontroli (Tab. I). Izoforma
CYP2B1/2 po 8 godzinach od zakończenia eksperymentu
miała poziom grupy kontrolnej, ale wartość ta narastała
w kolejnych przedziałach czasu (Tab. II). w 36 godzinie
osiągnęła 175% poziomu grupy kontrolnej, po czym poziom ten zaczął opadać. Poziom CYP1A2 do 24 godziny
po zakończeniu eksperymentu był taki jak w grupie kontrolnej, ale w dwóch ostatnich przedziałach obserwacji wynosił
130% kontroli (Tab. III).
W wątrobie 4-metylopirazol stymulująco wpływał na
CYP2E1. Po 8 godzinach od zakończenia eksperymentu był
on znacząco wyższy niż w kontroli, i wynosił 180% wartości
grupy kontrolnej (Tab. I). Indukcja tej izoformy narastała w
kolejnych przedziałach czasu, osiągając wartość maksymalną w 36 godzinie, gdzie stwierdzono 340% wzrost poziomu
tego białka w stosunku do kontroli. Dopiero po dwóch dobach ujawniono lekki spadek zawartości tej izoformy, jednak wynosił on nadal jeszcze 305% kontroli.
W przypadku izoformy CYP2B1/2 obserwowano podobny przebieg zmian stężenia, jednak stymulacja tego białka przez 4-metylopirazol była słabsza (Tab. II). Tym razem
Tabela. I.Poziomy CYP2E1 w wątrobie i nerce szczura narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych
łącznie 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G)
Czas od
zakończenia
narażania
8
12
18
24
36
48
Wątroba
Nerka
G
4-MP
4-MP + G
G
4-MP
4-MP + G
105
165*
220*
245*
230*
225*
180*
210*
270*
310*
340*
305*
115
130
165*
170*
185*
155*
100
95
115
135*
125
125
115
130*
130
135*
115
110
100
120
125
135*
135*
125*
Przedstawione dane oznaczają procentową zmianę stężenia izoformy cytochromu P450 odniesionej do własnej grupy kontrolnej.
* - Zmiana znamienna statystycznie dla p<0.05. Pozostałe szczegóły: patrz Materiały i Metody.
Tabela. II.Poziomy CYP2B1/2 w wątrobie i nerce szczura narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych
łącznie 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G)
Czas od
zakończenia
narażania
8
12
18
24
36
48
Wątroba
Nerka
G
4-MP
4-MP + G
G
4-MP
4-MP + G
90
115
140*
130*
180*
125
145*
170*
180*
265*
240*
205*
120
145*
195*
180*
165*
140*
100
100
120
125*
130*
130*
130
160*
200*
225*
230*
2558
105
100
135*
125
135
140*
* - Zmiana znamienna statystycznie dla p<0.05. Pozostałe szczegóły: patrz Materiały i Metody
Tabela. III. Poziomy CYP1A2 w wątrobie i nerce szczura narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych
łącznie 4-metylopirazolem
Czas od
zakończenia
narażania
8
12
18
24
36
48
Wątroba
Nerka
G
4-MP
4-MP + G
G
4-MP
4-MP + G
105
115
110
115
130
135*
100
125
115
140*
125
110
125
135*
140*
130*
120
110
90
90
90
85
90
95
110
140*
155*
150*
150*
150*
105
100
135*
125*
135*
140
* - Zmiana znamienna statystycznie dla p<0.05. Pozostałe szczegóły: patrz Materiały i Metody.
wzrost zawartości izoformy narastał do 24 godziny gdzie
pojawiała się 150% indukcja CYP2B1/2, a która utrzymywała się na nieco niższym poziomie w kolejnych godzinach
obserwacji. W 48 godzinie stymulacja wynosiła jeszcze
205% kontroli.
4-Metylopirazol nieznacznie podwyższał poziom izoformy CYP1A2 (Tab. III). Zmiana ta była obserwowana
dopiero w 12 godzinie od zakończenia doświadczenia, kiedy obserwowano wówczas indukcję wynoszącą 125% kontroli. Tylko po upływie pierwszej doby obserwowano nieco
wyższy jej poziom, kiedy stymulacja tej izoformy osiągnęła
140% kontroli.
Łączne narażenie szczurów na 4-metylopirazol i glikol
etylenowy miało stymulujący wpływ na CYP2E1 po zakończeniu eksperymentu. Już po 8 godzinach poziom tej
izoformy był już wyższy niż w kontroli, bowiem osiągał
wartość 115% (Tab. I). W kolejnych godzinach obserwacji
stymulacja narastała, osiągając poziom 185% kontroli po 36
godzinach, po czym stężenie tej izoformy lekko obniżało
swój poziom. W ostatniej fazie obserwacji stężenie CYP2E1
osiągało jeszcze 155% kontroli.
W tych warunkach takiego traktowania ujawniono również stymulację CYP2B1/2 (Tab. II). Przebieg zmian ilościowych był podobny do obserwowanych dla izoformy
CYP2E1. Tym razem maksimum indukcji pojawiło się już
po 18 godzinach, po czym w kolejnych przedziałach czasu
obserwowano nieznacznie zaznaczony spadek tej indukcji.
W 48 godzinie poziom CYP2B1/2 osiągał jeszcze 140%
kontroli.
Narażenie łączne na 4-metylopirazol i glikol etylenowy
miało słabszy wpływ na poziom CYP1A2 (Tab. III). Słabą indukcję oberwano przez cały czas od zakończenia doświadczenia, ale stwierdzona zmiana osiągała co najwyżej
140% kontroli po 18 godzinach.
Nerka
Wpływ glikolu etylenowego na CYP2E1 wykazał, że
ujawnione stymulacje tej izoformy były słabe i w swoim
maksimum w 24 godzinie stanowiły 135% kontroli (Tab. I).
W kolejnych dwóch przedziałach czasowych stymulacja ta
wynosiła 125% grupy kontrolnej. Izoforma CYP2B1/2 po
67
12 godzinach od zakończeniu eksperymentu miała poziom
grupy kontrolnej (Tab. II). Narastał on powoli w kolejnych
przedziałach czasu. w 36 godzinie przekroczył 130% poziomu grupy kontrolnej i pozostał na tym poziomie do końca
obserwacji. Poziom CYP1A2 do 48 godziny od zakończenia
eksperymentu był nieco niższy niż w grupie kontrolnej (Tab.
III).
4-Metylopirazol stymulował CYP2E1 w nerce. Jednak wyraźnie wyższy poziom tej izoformy obserwowano
dopiero po 12 godzinach od zakończenia eksperymentu był on wyższy niż w grupie kontrolnej i wynosił 130%
(Tab. I). Poziom tej izoformy utrzymywał się w kolejnych
okresach czasowych, i dopiero w 36 godzinie stwierdzono
spadek poziomu tego białka do poziomu około 115% kontroli. Utrzymywał się on na tym samym poziomie, aż do
końca obserwacji.
Nieco podobny przebieg zmian obserwowano w przypadku CYP2B1/2, jednak w tym przypadku stymulacja tej
izoformy była silniejsza (Tab. II). Ujawniono ją już w 8 godzinie, gdzie wynosiła 130% kontroli. Narastała następnie
systematycznie aż do końca obserwacji, gdzie ujawniono
poziom tego CYP-u przekraczający 250% kontroli w 48 godzinie.
4-Metylopirazol praktycznie nie zmieniał poziomu izoformy CYP1A2 w 8 godzinie obserwacji (Tab. III). Po tym
czasie nastąpiła skokowa zmiana stężenia tej izoformy,
która utrzymywała stabilny poziom aż do zakończenia doświadczenia. Obserwowano wówczas indukcję wynoszącą
około 150% kontroli.
Łączne narażenie na oba ksenobiotyki nie indukowało CYP2E1 po 8 godzinach od zakończenia eksperymentu
(Tab. I). Jednak w pozostałych okresach obserwacji stwierdzono około 130% wzrost stężenia tej izoformy.
Analogicznie zachowywała się izoforma CYP2B1/2
w pierwszej dobie obserwacji (Tab. II). W dwóch kolejnych
przedziałach czasowych obserwowano stosunkowo wyraźną stymulację. Wynosiła ona nieco ponad 150% kontroli.
CYP1A2 nie zareagował na łączne podanie badanych
ksenobiotyków przez dwie pierwsze fazy obserwacji (Tab.
III). Począwszy od 18 godziny ujawniono 135% stymulację
CYP1A2, która utrzymywała się aż do końca obserwacji.
Dyskusja
4-Metylopirazol, znany inhibitor ADH, został wdrożony do badań nad wpływem alkoholu etylowego u ludzi we
wczesnych latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku. Od
tamtej pory pokaźna ilość badań in vitro oraz eksperymentalnych badań na zwierzętach wykazała, że 4-metylopirazol
jest wartościowym narzędziem w wyjaśnianiu roli ADH
i metabolicznych konsekwencji eliminacji etanolu.
Jednak tylko kilka badań in vivo było prowadzonych
na ludziach. 4-Metylopirazol ostatnio został zaaprobowany
przez Ministerstwo Żywności i Leków USA i jest w chwili obecnej w użyciu klinicznym jako antidotum na zatrucie
glikolem [12]. Może jednak być z powodzeniem stosowany
do leczeniu zatruć metanolem.
Glikol etylenowy jest rozpuszczalnikiem organicznym
używanym w przemyśle, oraz składnikiem wielu płynów
użytkowych. Metabolizm tego alkoholu gra kluczową rolę
68
w hepatotoksycznym wpływie tej substancji. Izoenzymy
cytochromu P450 są kluczowymi enzymami w pierwszym
etapie metabolizmu glikolu etylenowego, co ma znaczenie
w hepatotoksyczności tego związku. Glikol etylenowy jest
inhibitorem ogólnego poziomu cytochromu P450. Nasze
badania nie potwierdziły wyników uzyskanych przez Imazu i wsp. [4, 7], którzy obserwowali zwiększoną zawartość
cytochromu P450 o około 15% bez wpływu na aktywność
reduktazy współpracującej z tym cytochromem. W przypadku II mikrosomalnego łańcucha transportu elektronów ich
wyniki były zbieżne z naszymi. Wykazano, że zwiększona
biotransformacja glikolu koreluje ze wzrostem poziomu wątrobowego cytochromu P450.
Dane literaturowe sugerują, że glikol etylenowy jest induktorem CYP2E1, ale nie do końca wiemy, jaki jest ostateczny wpływ tego alkoholu na inne izoenzymy cytochromu
P450. Wydaje się, że glikol etylenowy ma także słabo wyrażony wpływ stymulujący na CYP2B1/2, ale w stosunku
do innych izoform ma on raczej charakter inhibitorowy.
W naszych badaniach wykazaliśmy, że CYP2E1 istotnie
zwiększał swój poziom po traktowaniu z glikolem etylenowym. Indukcja CYP2E1 przez glikol wydaje się być istotną,
ponieważ ta izoforma odgrywa znaczącą rolę w utlenianiu
glikolu do formaldehydu. Zwiększa również produkcję nadtlenku wodoru oraz syntezę ponadtlenków, w której uczestniczy NADH i NADPH.
Co więcej, stwierdziliśmy, że CYP1A2 nie obniżał swojego poziomu. Obie te informacje należy powiązać ze wzrostem ogólnego stężenia cytochromu P450, co stawia wyniki
naszej pracy w grupie doniesień rzucających nowe spojrzenie
na opisywany problem. Wynika to między innymi z tego, że
ujawniliśmy również indukcję izoformy 2B1/2, oraz że jak
wynika z danych literaturowych inna izoforma konstytucyjna, tj. CYP2C11 też ulega indukcji w tych warunkach. Na
podstawie innych danych literaturowych wiadomo, że inne
izoformy P450 nie są zaangażowane w metabolizm glikolu etylenowego, lub ich udział jest znikomy [13]. Możemy
więc wnosić, że zastosowana dawka glikolu etylenowego
wydaje się być pozbawiona efektu hepatotoksycznego. Ta
toksyczność pojawia się tylko po podaniu dawki, która nie
może ulec detoksykacji [13, 14, 15]. Stabilny poziom cytochromu P450 i aktywność reduktazy NADPH-cytochrom
P450 przez co najmniej 48 godzin od podania ksenobiotyku
pośrednio świadczą o braku zmian degeneracyjnych w zraziku wątrobowym.
Indukowany przez glikol etylenowy wzrost aktywności
reduktazy NADPH-cytochrom P450 obserwowany przez
nas nie był dotychczas odnotowany. Np. Schenkman i wsp.
[16] obserwowali hamowanie wielu aktywności monooksygenazowych oraz wspomnianej reduktazy u królików
traktowanych glikolem. Wyższe dawki glikolu używane
w naszych badaniach mogą zwiększać metabolizm glikolu
do formaldehydu. Ten proces wymaga NADPH. Jest prawdopodobne, że hamowanie reduktazy NADPH-cytochrom
P450 wynikało stąd, że NADPH był wykorzystywany
w biotransformacji glikolu.
Badania niniejsze skupiły się na udziale układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 u szczurów traktowanych między innymi glikolem. Należy pamiętać, ze
ksenobiotyki te również wpływają na nerkowy układ mono-
oksygenaz zależnych od cytochromu P450 (MFO). Metabolity pośrednie wytwarzane przez nerkowy cytochrom P450
mogą modyfikować aktywność wątrobowego układu MFO,
komplikując w ten sposób badania procesów intoksykacji
i detoksykacji przebiegających w organizmach traktowanych ksenobiotykami.
Znamiennym według nas jest wzrost poziomu nerkowego cytochromu P450 w grupie zwierząt narażonej równocześnie na 4-metylopirazol, podczas gdy w tym samym czasie aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 również
rosła. Prawdopodobnie jest to niezbędne dla zachowania
optymalnej aktywności wątrobowego układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 w sytuacji krytycznej.
4-MP, inhibitor dehydrogenazy alkoholowej, jest nowym antidotum stosowanym w przypadkach zatrucia glikolem etylenowym. Zatrucie glikolem leczy się wykonując
płukanie żołądka zaraz po jego spożyciu, alkalizację, oraz
podając etanol. W leczeniu etanolem największą trudność
sprawia utrzymanie jego stężenia we krwi w zakresie od
1 do 2 g/dm3 przez częste modyfikowanie dawki oraz fakt,
że etanol może prowadzić do zahamowania czynności
ośrodkowego układu nerwowego, zwłaszcza u dzieci.
Terapią alternatywną jest podanie 4-metylpyrazolu, który jest konkurencyjnym inhibitorem dehydrogenazy alkoholowej. W krajach Europy zachodniej zatrucia glikolem są
rzadkością. Np. we Francji w ostatnich latach odnotowano
pięć przypadków zastosowania 4-MP u osób dorosłych zatrutych glikolem etylenowym. Pacjenci byli przyjęci wcześnie, zanim rozwinęła się niewydolność nerek, co pozwoliło
na wydalenie przez nerki niezmienionego glikolu etylenowego [17]. Odnotowano niewielkie działania uboczne 4-MP
oraz fakt, iż terapia 4-MP była łatwiejsza w dawkowaniu.
Skuteczność leczenia 4MP była potwierdzona poprzez szybkie wyrównanie kwasicy metabolicznej bez alkalizacji i wydłużenia czasu półtrwania glikolu etylenowego. Nie zaobserwowano skutków ubocznych działania 4-MP.
W wątrobie pomimo podwyższonego poziomu cytochromu P450 w grupie z 4-metylopirazolem ujawniliśmy praktycznie kontrolne poziomy aktywności reduktazy NADPHcytochrom P450. Mechanizm, poprzez który 4-metylopirazol
podwyższa stężenie cytochromu P450, może być tylko spekulowany. Być może wynika to ze zwiększenia płynności
błon cytoplazmatycznych. 4-metylopirazol wzmaga procesy
β-oksydacji nasyconych kwasów tłuszczowych w mitochondriach. Rosnąca aktywność obu badanych reduktaz może
być tego pośrednim dowodem.
W podjętych przez nas badaniach istotne było stwierdzenie, że podanie 4-MP szczurom obciążonych glikolem
etylenowym podwyższa poziom CYP2E1 - głównego izoenzymu indukowanego przez alkohole. Obserwacja ta częściowo obejmuje także izoformę CYP1A2 i CYP2B1/2. Ten
pozytywny wpływ 4-MP ujawniono także przy ocenie ogólnej poziomu cytochromu P450. Efektu takiego nie uzyskano
w przypadku drugiego badanego cytochromu.
Możemy sądzić, że 4-MP może łagodzić uszkodzenie wątroby wywołane glikolem. Nie jest to raczej wpływ poprzez
modyfikowanie istotnych CYP-ów, tj. CYP2E1, CYP2B1/2
i CYP1A1/2. Gra tu zapewne rolę skomplikowany mechanizm oparty na ochronie komórkowego GSH [18].
Pomimo utrzymującego się podwyższonego poziomu
cytochromu P450 w grupie z 4-MP ujawniliśmy stabilne
poziomy aktywności reduktazy NADPH-cytochrom P450.
Równocześnie oba składniki II mikrosomalnego łańcucha transportu elektronów były lekko stymulowane przez
4-MP. Sugerujemy, że przy tej dawce 4-MP nie pojawia
się zaawansowana peroksydacja lipidów, powiązana z mechanizmem indukowanego glikolem uszkodzenia wątroby.
Ochronny wpływ GSH w tym przypadku jest według nas
wystarczający.
Wydaje się zatem, że w przypadku potwierdzenia zatrucia glikolem etylenowym przy zachowanej funkcji nerek,
podanie 4-MP wydaje się być lekiem z wyboru.
Wnioski
1. Główny składnik układu monooksygenazowego,
tj. cytochrom P450 wykazywał stały poziom stężenia przez cały okres badania (bez narażenia). Etanol
wywoływał wzrost zawartości cytochromu P450
we wszystkich badanych przedziałach czasowych,
podczas glikol etylenowy zmniejszał stężenie tego
białka. Jednocześnie podany etanol i glikol etylenowy również powodowały zmniejszenie stężenia cytochromu P450, lecz w mniejszym stopniu niż sam
glikol etylenowy. Podanie 4-metylopirazolu niweluje
inhibicyjne działanie badanego glikolu. Łączne podanie trzech badanych ksenobiotyków prowadzi do
wyraźnej indukcji tej hemoproteiny.
2. Aktywność enzymu współpracującego z cytochromem P450 tj. reduktazy NADPH-cytochrom P450
nie korelowała z rytmem zmian zawartości powyższej hemoproteiny. Aktywność tej reduktazy zwiększała się po podaniu etanolu, ale była hamowana
przez glikol etylenowy i w większym stopniu przez
połączenie etanolu i glikolu etylenowego. Aktywność tej reduktazy zwiększyła się przy jednoczesnym
podaniu glikolu etylenowego i 4-metylopirazolu, ale
w obecności podanego jeszcze etanolu wzrost aktywności enzymu był tłumiony.
3. Składniki II mikrosomalnego łańcucha transportu
elektronów tj. cytochrom b5 i reduktaza NADH-cytochrom b5 zmieniały swoje parametry po podaniu glikolu podobnie jak w przypadku składników
I mikrosomalnego łańcucha. Stosowane ksenobiotyki obniżały zawartość cytochromu b5 oraz aktywność reduktazy współpracującej z tym białkiem
we wszystkich przedziałach czasowych. Największy wpływ inhibicyjny miał sam glikol etylenowy,
a w połączeniu z etanolem słabszy. Traktowanie samym 4-metylopirazolem nie wykazało w tym przypadku jego indukcyjnego wpływu na cytochrom b5.
Suplementacja obu ksenobiotyków wykazała ponownie, że 4-metylopirazol zmniejsza inhibicyjne
działanie glikolu etylenowego.
4. Badania poziomu wybranych izoform cytochromu
P450 wykazały, indukcję izoformy 2E1 oraz 2B1/2
zarówno po podaniu samego 4-metylopirazolu oraz
łącznie z glikolem, co może być przyczyną wystąpienia działań niepożądanych podczas stosowania
4-metylopirazolu w terapii zatruć glikolem etyleno-
69
wym. Izoforma CYP2B1/2 przy narażeniu na glikol etylenowy nieznacznie narastała do 48 godziny,
a w połączeniu z etanolem przyrost tej izoformy był
już znaczny. W przypadku CYP2E1 glikol etylenowy powodował podobny wzrost jak dla powyższej
izoformy. Poziom izoenzymu 1A2 uległ nieznacznemu wzrostowi. Narażenie na trzy badane ksenobiotyki było w swoim oddziaływaniu na badane
izoformy nieco słabsze niż w grupie z glikolem
i 4-metylopirazolem.
Piśmiennictwo
1. Sarkola T., Eriksson C.J.P.: Effect of 4-methylpyrazole
on endogenous plasma ethanol and methanol levels in
humans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 2001; 25: 513-516.
2. Bradley K.: Fomepizole - a new antidote for the treatment of ethylene glycol poisoning. J. Pharm. Soc. Winconsin 1998; 9/10: 39-45.
3. Jacobsen D., McMartin K.E.: 4-Methylpyrazole – present status. J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1996; 34: 379-381.
4. Boyer E.W. i wsp.: Severe ethylene glycol ingestion
treated without hemodialysis. Pediatrics 2001; 107:
172-173.
5. Barceloux D.G. i wsp.: American Academy of Clinical Toxicology Practice Guidelines on the Treatment
of Ethylene Glycol Poisoning. Clin. Toxicol. 1999; 37:
537-560.
6. Baud F.J. i wsp.: Treatment of ethylene glycol poisoning
with intravenous 4-methylpyrazole. N. Engl. J. Med.
1988; 319: 97-100.
7. Sarkola T. i wsp.: Ethanol, acetaldehyde, acetate, and
lactate levels after alcohol intake in white men and women: Effect of 4-methylpyrazole. Alcohol. Clin. Exp.
Res. 2002; 26: 239–245.
Adres do korespondencji
Dr hab. Andrzej Plewka
adres: Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny,
41-200 Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30
telefon: 32-364-14-30
70
8. Dallner G.: Isolation of rough and smooth microsomes general. Methods Enzymol. 1974; 32: 191-215.
9. Lowry O.H. i wsp.: Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275.
10.Estabrook R.W., Werringloer J.: The measurement of
difference spectra: application to the cytochromes of microsomes. Methods Enzymol. 1978; 52: 212-220.
11.Hodges T.K., Leonard R.T.: Purification of a plasma
membrane-bound adenosine triphosphatase from plant
roots. Methods Enzymol. 1974; 32: 392-406.
12.Brent J. i wsp.: Fomepizole for the treatment of ethylene glycol poisoning. New Engl. J. Med. 1999; 340:
832-838.
13.Cai H., Guengerich F.P.: Reaction of trichloroethylene
and trichloroethylene oxide with cytochrome P450 enzymes: Inactivation and sites of modification. Chem. Res.
Toxicol. 2001; 14: 451-458.
14.Nakahama T. i wsp.: Comparative study on the mode of
action of chlorinated ethylenes on the expression of rat
CYP forms. J. Health Sci. 2001; 47: 278-287.
15.Nakahama T., Saturani S., Inouye Y.: Effects of chlorinated ethylenes on expression of rat CYP forms: Comparative study on correlation between biological activities and chemical structures. J. Health Sci. 2000; 46:
251-258.
16.Voznesensky A.I., Schenkman J.B.: Inhibition of cytochrome-P450 reductase by polyols has an electrostatic
nature. Eur. J. Biochem. 1992; 210: 741-746.
17.Harry P. i wsp.: Ethylene glycol poisoning in a child
treated with 4-methylpyrazole. Pediatrics 1998; 102:
E31-E33.
18.Vendemiale G. i wsp.: Effect of acetaminophen administration on hepatic glutathione compartmentation and
mitochondrial energy metabolism in the rat. Biochem.
Pharmacol. 1996; 52: 1147-1154.
Regulamin redagowania prac
w „Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym”
1. FPN zamieszcza prace oryginalne doświadczalne , kliniczne i poglądowe, z zakresu nauk farmaceutycznych, medycznych i nauk pokrewnych.
2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać w formie elektronicznej na adres: fpn@
kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dyskietce 3,5” lub dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego (z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji.
Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko pierwszego autora i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny
tworzyć osobne zbiory. Nie należy umieszczać rycin i
fotografii w plikach tekstowych. Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word, Word Perfect.
Preferowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor: CMYK,
rozdzielczość 300 dpi.
3. Prace podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego.
Zachęca się autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja zastrzega sobie prawo dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu
z autorem).
4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie
była uprzednio publikowana ani nie została wysłana
do redakcji innego czasopisma oraz – zgodę Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie publikacji w czasopiśmie.
5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.
6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji redakcji.
7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw
autorskich do wydrukowanych prac (w tym prawo do
wydania drukiem, na nośnikach elektronicznych CD
i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast
drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.
8. Instrukcja dla autorów
8.1. Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie na białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego odstępu między wierszami oraz
marginesem 2,5 cm.
8.2. Strona tytułowa powinna zawierać: tytuł lub stopień naukowy, imię i nazwisko (imiona i nazwiska)
autorów w pełnym brzmieniu, tytuł pracy w języku
polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej,
oraz tytuł lub stopień naukowy, imię i nazwisko
kierownika placówki naukowej, skąd pochodzi praca. U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz
adres, telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za
korespondencję, dotyczącą manuskryptu.
8.3. Druga strona manuskryptu powinna zawierać
streszczenie (150-250 słów w języku polskim
i angielskim), w którym należy podać krótkie
wprowadzenie, cel badania, podstawowe procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz
wnioski. Pod streszczeniem należy umieścić słowa
kluczowe w języku polskim i angielskim, zgodnie
z Medical Subject Headings Index Medicus.
8.4. Oryginalne prace powinny być podzielone na rozdziały, według schematu: wstęp, materiał i metody, wyniki badań, dyskusja oraz wnioski.
8.5. Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności
cytowania w tekście pracy. Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index Medicus. Każda
pozycja – pisana od nowego wiersza, powinna być
opatrzona numerem oraz zredagowana zgodnie
z niżej podanym przykładem:
· czasopismo naukowe:
Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:
557-67.
Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.
Komosińska-Vassev K i wsp.: Graves’ disease-associated
changes in the serum lysosomal glycosidases activity and
the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;
331: 97-102.
· wydawnictwo zbiorowe:
Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia
Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie
PZWL. Warszawa 1994, 59-69.
· monografia:
Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław
2004.
Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi.
Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach oryginalnych do 20 pozycji, w poglądowych do 30
i w pozostałych do 10.
8.6. Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe
i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej
kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem
autora i tytułem pracy, z zaznaczeniem „góra”,
„dół”. Opisy rycin należy podać na oddzielnej
stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi
arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodę
Wydawcy na ponowną publikację.
8.7. Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie,
należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami umieszczonymi nad tabelą. Opisy
tabel należy podać na oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi rzymskimi.
8.8. Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej
wynosi 10, pozostałych – 5 stron.
Adres Redakcji:
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
43-300 Bielsko-Biała
ul. Wiśniowa 25/2
tel: 033/816 28 99
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Index Copernicus 2,51
Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami
o dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.
Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.
Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty otrzymająPaństwo po około 2 tygodniach
od dokonania wpłaty.
Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty
i Kolportażu:
Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego
TEL. 033 817 38 99
WYDAWCA
Nr rachunku odbiorcy:
0
PRENUMERATA
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
Nr rachunku odbiorcy:
0
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY

Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

Podobne dokumenty

Załącznik do pobrania. - Sekcja Rehabilitacji Kardiologicznej i

Porfiria skórna późna

Profil sekrecji prolaktyny w okresie dwóch godzin po

działalność dydaktyczna i naukowa