STRESZCZENIE

STRESZCZENIE
Badanie mechanizmów utrzymania stabilności genomu ma zasadnicze znaczenie
w poznawaniu etiologii nowotworów. Destabilizacja genomu, obserwowana w nowotworach,
jest wynikiem defektów mechanizmów naprawy DNA oraz mechanizmów kontroli cyklu
komórkowego. Przedmiotem pracy jest funkcjonalna analiza substytucji nukleotydowych
w genach wybranych białek bezpośrednio uczestniczących w naprawie DNA lub biorących
udział w utrzymaniu stabilności genomu pośrednio poprzez regulację cyklu komórkowego.
Metylotransferaza MGMT, będąca białkiem naprawy bezpośredniej, jest podstawowym
elementem obrony przed kancerogennymi efektami czynników alkilujących, a zarazem
głównym elementem oporności na metylujące chemoterapeutyki. Glikozylaza TDG,
uczestnicząca w systemie naprawy poprzez wycinanie zasady, jest białkiem, które łączy
naprawę DNA, kontrolę epigenetycznych modyfikacji DNA i regulację ekspresji genów.
Opiekuńcze białko HSPA8 jest istotne dla podstawowego metabolizmu wszystkich typów
komórek i tkanek. Zaangażowane jest m.in. w apoptozę, modulację konformacji białek
i transdukcję sygnałów. Plejotropowe białko p53 pełni centralną rolę w koordynowaniu
komórkowej odpowiedzi na szeroki zakres czynników stresu. Jego aktywność prowadzi do
stymulacji procesów naprawy i innych mechanizmów obronnych, bądź do zaprzestania
podziałów komórkowych i indukcji apoptozy. Utrata funkcji p53 spowodowana mutacjami
genu TP53, bądź inną inaktywacją tego białka, obserwowana jest w większości nowotworów.
Mutacje germinalne TP53 są odpowiedzialne za zespół Li-Fraumeni, czyli dziedzicznie
zwiększoną predyspozycję do zachorowania na różne nowotwory. Helikazy WRN i RECQL
należące do rodziny RecQ, biorą udział w utrzymaniu stabilności genomu poprzez rozplatanie
struktur przejściowych, powstających podczas replikacji i rekombinacji DNA.
Głównym celem pracy była analiza funkcjonalna zmian w sekwencjach regulujących
ekspresję genów MGMT, TDG i HSPA8, a także scharakteryzowanie substytucji
w sekwencjach kodujących genów TP53, RECQL i WRN. Testy funkcjonalne pomagają
w rozstrzygnięciu, czy wykryta w populacji zmiana sekwencji jest rzadko występującym,
neutralnym wariantem, czy mutacją inaktywującą białko. Pomagają również w określeniu
charakteru polimorfizmu (neutralny versus funkcjonalny). Funkcjonalne polimorfizmy typu
SNP mogą modulować ryzyko zachorowania na różne choroby, w tym choroby
nowotworowe.
1
Badania przeprowadzono głównie metodą reporterowych testów z udziałem lucyferazy.
Do określania wewnątrzkomórkowej lokalizacji zmutowanych helikaz stosowana była metoda
barwienia fluorescencyjnego z udziałem białka mRFP1.
Zaobserwowano, że często występujący polimorfizm 1099C>T (rs16906252) regionu
„promotorowo-enhancerowego” genu MGMT nie jest funkcjonalnie neutralny. Analiza
alternatywnego transkryptu TDG pozbawionego eksonu 2 zasugerowała, że prawdopodobnie
jest on skutkiem nieprawidłowego procesu wycinania intronów. Zidentyfikowany promotor
TDG okazał się bardzo silnym aktywatorem transkrypcji, natomiast wykryty w nim
polimorfizm nie wykazał funkcjonalnego znaczenia. Został opracowany oryginalny test
reporterowy umożliwiający badanie znaczenia polimorfizmów i mutacji występujących
w intronach. Bazując na nim wykazano, że polimorfizm 1541-1542delGT w intronie 2 genu
HSPA8 wpływa na aktywność genu reporterowego. Heterozygotyczny genotyp związany
z tym polimorfizmem obniża ryzyko raka płuca. W genie TP53 została wykryta mutacja
germinalna, która całkowicie pozbawia białko p53 zdolności aktywacji transkrypcji. Nie
uzyskano potwierdzenia, że transkrypcja genów jest promowana przez helikazową aktywność
białka WRN, natomiast wykazano, że zdolność aktywacji transkrypcji posiada białko
RECQL. Okazało się ponadto, że jąderkowa lokalizacja helikazy WRN oraz tworzenie przez
nią toroidalnych ciałek jądrowych ulegają zakłóceniu przez zniekształcenie poprawnej
struktury trzeciorzędowej domeny HRDC tego białka.
Testy reporterowe z udziałem lucyferazy wykazały funkcjonalne znaczenie niektórych
badanych zmian sekwencji nukleotydowych, występujących w odcinkach regulujących
ekspresję genów lub w odcinkach kodujących sekwencję białka. Porównanie otrzymanych
wyników z wynikami opublikowanymi przez innych badaczy wskazuje na konieczność
testowania znaczenia substytucji w odcinkach regulatorowych w oparciu o możliwie jak
najdłuższe fragmenty DNA, uwzględniające wpływ na badane odcinki sekwencji
sąsiadujących.
2