Techniki stosowane w diagnostyce wścieklizny – wczoraj i dziś

Techniki stosowane w diagnostyce wścieklizny – wczoraj i dziś?
Anna Orłowska, Marcin Smreczak, Jan F. Żmudziński
Zakład Wirusologii, Państwowy Instytut Weterynaryjny
– Państwowy Instytut Badawczy
Wścieklizna jest ostrą wirusową infekcją ośrodkowego układu nerwowego, występującą
u zwierząt lądowych (w tym również u ludzi) oraz nietoperzy. Typowe objawy kliniczne
choroby obejmują zmiany w zachowaniu (agresja) i postępujący paraliż prowadzący do
śmierci. Transmisja choroby następuje zazwyczaj poprzez pogryzienie ponieważ wirus
wścieklizny znajduję się w ślinie chorego zwierzęcia. Czynnikiem wywołującym chorobę jest
neurotropowy wirus wścieklizny należący do rodziny Rhabdoviridae i rodzaju Lyssavirus.
Genom jego stanowi jednoniciowy, niesegmentowany kwas rybonukleinowy o ujemnej
polarności, zawierający 5 genów kodujących białka strukturalne wirusa wścieklizny:
nukleoproteinę, fosfoproteinę, białko matriks, glikoproteinę oraz RNA zależną polimerazę
RNA. Analiza filogenetyczna oparta na porównaniu sekwencji genów kodujących
nukleoproteinę i glikoproteinę wirusa wścieklizny wykazała występowanie 7 genotypów w
obrębie rodzaju Lyssavirus (Johnson N., 2002). Są to klasyczny wirus wścieklizny (genotyp
1), wirus Lagos (genotyp 2), Mokola (genotyp 3), Duvenhage (genotyp 4), European Bat
Lyssavirus typ 1 - EBLV 1 (genotyp 5) i typ 2 - EBLV 2 (genotyp 6) oraz Australian Bat
Lyssavirus –ABLV (genotyp 7). W Polsce występują klasyczny wirus wścieklizny u zwierząt
lądowych oraz EBLV 1 u nietoperzy.
Diagnostyka wścieklizny opiera się na wykrywaniu antygenu wirusowego, izolacji
całego wirusa lub jego kwasu rybonukleinowego. Pierwszym badaniem mikroskopowym
stosowanym w diagnostyce wścieklizny było badanie histopatologiczne, polegające na
wykrywaniu zasadochłonnych wtrętów zwanych ciałkami Negriego w cytoplazmie neuronów
(Surreau P, 1996). Rutynowa diagnostyka wścieklizny obejmuje odczyn immunofluorescencji
bezpośredniej (FAT – fluorescent antibody test) oraz izolację wirusa wścieklizny na myszach
(MIT – mouse inoculation test) lub w hodowli komórek neuroblastomy (RTCIT – rabies
tissue culture inoculation test) (Smreczak M, 2004). Materiał do badań stanowi tkanka
mózgowa, a w szczególności rogi Amona, móżdżek oraz wzgórze, ponieważ głównie tam
dochodzi do namnażania się wirusa wścieklizny. W teście immunofluorescencji bezpośredniej, opartym na reakcji antygen – przeciwciało, wykrywa się antygen wirusa wścieklizny,
który stanowią jego białka. Z nadesłanego materiału wykonuje się preparaty odciskowe.
Następnie znakuje się je koniugatem zawierającym przeciwciała, skierowane przeciwko
białkom wirusa wścieklizny, skoniugowane z izotiocjanianem fluoresceiny, który w świetle
UV emituje charakterystyczne zielone światło. Dzięki temu, w przypadku obecności w
badanym materiale wirusa, dochodzi do reakcji antygen – przeciwciało czego wynikiem jest
charakterystyczna zielona fluorescencja widziana pod mikroskopem w świetle UV.
W testach MIT oraz RTCIT izolowany jest żywy wirus wścieklizny. Myszy białe
zakaża się domózgowo zawiesiną badanego mózgowia, a następnie obserwuje przez 30 dni.
Zwierzęta, u których wystąpiły objawy choroby usypia się a ich mózgowia sprawdza w teście
FAT na obecność antygenu wirusowego. Izolacja wirusa w hodowli komórek neuroblastomy,
zastępująca MIT, polega na 72 godzinnej inkubacji komórek i zawiesiny badanego mózgowia,
a następnie wyznakowaniu utrwalonej hodowli komórek koniugatem FITC. W przypadku
obecności wirusa wścieklizny w cytoplazmie komórek neuroblastomy widoczne są ciałka
wtrętowe o charakterystycznej zielonej fluorescencji.
W badaniach naukowych klasyczne techniki stosowane w diagnostyce wścieklizny ze
względu na czułość reakcji, jakość badanego materiału oraz czas potrzebny na uzyskanie
wyniku, zastępowane są przez molekularne metody, polegające na wykrywaniu materiału
genetycznego wirusa. Wśród nich wyróżnia się reakcje RT-PCR, heminested RT-PCR oraz
PCR w czasie rzeczywistym (real - time RT - PCR). Wymienione metody są znacznie
czulsze od klasycznych technik stosowanych w diagnostyce wścieklizny, a ponadto
umożliwiają wykrycie wirusa w próbkach w stanie rozkładu gnilnego, gdzie zastosowanie
metod immunofluorescencji i izolacji wirusa, bądź to na myszach, bądź w hodowli komórek
neuroblastomy, są ograniczone jakością materiału przesłanego do badania (David D., 2002).
Dodatkową zaletą molekularnych metod jest ich wyższa czułość reakcji względem FAT czy
MIT . Picard – Meyer i wsp. dowiedli w swojej pracy, że heminested RT – PCR jest 5x105
razy czulszy niż RTCIT i 3x105 razy czulszy niż MIT (Picard – Meyer 2004). Ma to ogromne
znaczenie w diagnostyce, ponieważ zmniejsza ryzyko uzyskania fałszywie ujemnego wyniku
w szczególności gdy materiałem badanym są ślinianki, wymazy z gardła, ślina czy płyn
mózgowo – rdzeniowy, gdzie wirus występuje w niewielkich ilościach i nie jest możliwy do
wykrycia tradycyjnymi metodami diagnostycznymi. Ponadto metody molekularne pozwalają
na uzyskanie wyniku badania w znacznie krótszym czasie niż technikami MIT czy RTCIT.
Wspomnieć należy, że w przypadku reakcji real – time RT – PCR wyniki badania monitorowane są w czasie trwania eksperymentu przez co dodatkowo skraca się czas potrzebny na
uzyskanie wyniku. Ważną zaletą metod molekularnych, oprócz wykrywania kwasu
nukleinowego wirusa, jest możliwość wykorzystania ich do genotypowania izolatów. Stosując
odpowiednie pary starterów czy też sondy komplementarne do matrycy możliwe jest
różnicowanie izolatów na poszczególne genotypy. Black i wsp. (Black E.M. 2002)
technologię TaqMan zastosowali do wykrywania oraz różnicowania sześciu genotypów
wirusa wścieklizny. Dodatkowo określili czułość metody. Wykrywalność wirusa wścieklizny
uzyskali na poziomie 0,02 TCID50/ml przez co dowiedli, że real - time RT - PCR jest
doskonałym testem do detekcji i różnicowania genotypów wirusa wścieklizny.
Pomimo wymienionych zalet, techniki biologii molekularnej mogą być stosowane
jedynie w laboratoriach gdzie istnieją odpowiednie procedury kontroli jakości, metody
poddawane są walidacji, a badania wykonywane są przez doświadczony i wykwalifikowany
personel. Obecnie techniki te mogą być stosowane jedynie jako pomocnicze w rutynowej
diagnostyce wścieklizny, które potwierdzają wynik testu immunofluorescencji czy izolacji
wirusa wścieklizny ponieważ nie są to metody diagnostyczne rekomendowane przez OIE oraz
WHO. Można mieć nadzieje, że w niedalekiej przyszłości, metody te znajdą szerokie
zastosowanie w diagnostyce wścieklizny i staną się cennym narzędziem w badaniach
epidemiologicznych nad wirusem wścieklizny i wścieklizną.
Piśmiennictwo:
1. Black E.M., Lowings J.P., Smith J., Heaton P.R., McElhinney L.M.: A rapid RT-PCR
method to differentiate six established genotypes of rabies and rabies – related viruses
using Taqman technology. J Virol Meth (2002) 105 25 – 35.
2. David D., Yakobson B., Rotenberg D., Dveres N., Davidson I., Stram Y.: Rabies virus
detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Vet Microbiol (2002)
87 111 – 118.
3. Johnson N., McElhinney L.M., Smith J., Lowings P., Fooks A.R.: Phylogenetic
comparison of the genus Lyssavirus using distal coding sequences of the glycoprotein
and nucleoprotein genes. Arch Virol (2002) 147 2111 – 2123.
4. Picard – Meyer E., Bruyere V., Barrat J., Tissot E., Barrat M.J., Cliquet F.:
Development of a hemi-nested RT – PCR method for the specific determination of
European Bat Lyssavirus 1 Comparison with other rabies diagnostic methods. Vaccine
(2004) 22 1921 – 1929.
5. Smreczak M.: Laboratoryjna diagnostyka wścieklizny. Puławy 2004.
6. Surreau P., Ravvisse P., Rollin P.E.,: Rabies diagnosis by animal inoculation,
identification of Negri Dobies, ELISA In: The natura histry of rabies, G.M. Bayer
(wyd). CRC Press, Boca Raton, FL., 1996, 203 -217.