Nowy czuły krótki pentapleks (ShoP) PCR do typowania

Nowy czuły krótki pentapleks (ShoP) PCR do typowania

PRZEK£ADY
C. Meissner, P. Bruse, E. Mueller, M. Oehmichen
Nowy czuły krótki pentapleks (ShoP) PCR
do typowania zdegradowanego DNA
Forensic Science International 2007, t. 166, nr 2–3, s. 121
Wstêp
W ostatniej dekadzie typowanie DNA wysoce polimorficznych loci STR (krótkich powtórzeñ tandemowych) sta³o siê najpotê¿niejszym narzêdziem
rozró¿niania osób, poniewa¿ loci te s¹ stabilne nawet w tkankach, w których zaszed³ rozk³ad. Du¿o zastosowañ, nawet w przypadkach, w których dysponowano bardzo niewielk¹ iloœci¹ DNA, znalaz³a
przede wszystkim jednoczesna amplifikacja wielu
markerów STR w tej samej PCR. W tych multipleksowych analizach PCR barwniki fluorescencyjne zazwyczaj s¹ przy³¹czone do primera forward ró¿nych
loci, aby umo¿liwiæ rozró¿nienie fragmentów o podobnych rozmiarach. Rozwój elektroforezy kapilarnej umo¿liwia wykrywanie on-line tych oznaczonych
amplikonów PCR i ma jednoczeœnie zaletê w postaci wysokiego przerobu, automatycznej obs³ugi i automatycznego zbierania danych. W wielu badaniach
kryminalistycznych, w których wykorzystywany jest
materia³ genetyczny (pobrany ze szcz¹tków szkieletowych pogrzebanych w ziemi, cia³, które uleg³y rozk³adowi, tkanek zatopionych w parafinie albo w³osów
telogenowych), DNA jest wysoce zdegradowane
z powodu jakoœci próbki albo warunków œrodowiskowych.
Stopieñ rozk³adu DNA w znacznym stopniu zale¿y
od w³asnoœci geochemicznych gleby, wp³ywu otoczenia, populacji mikroorganizmów i temperatury. Szczególnie niekorzystny wp³yw na powodzenie typowania
DNA z koœci albo zêbów ma przede wszystkim wilgotne œrodowisko. Z drugiej strony, degradacja DNA jest
wolniejsza w warunkach zmarzliny w regionach arktycznych, co umo¿liwia analizê szcz¹tków nawet
sprzed 50 000 lat. Historyczne DNA ekstrahowane
z koœci o wieku do 10 000 lat ma jednak œredni¹ wielkoœæ od 100 do 150 bp, a procesy oksydacyjne i hydrolityczne sprawiaj¹, ¿e amplifikacja PCR i typowanie
DNA s¹ niezwykle trudne. W najgorszym razie DNA
mo¿e byæ tak zdegradowane, ¿e nie da siê z niego
otrzymaæ profili STR.
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 259 (styczeñ–marzec) 2008
Przedstawiono wiele ró¿nych metod poprawienia jakoœci profilowania zdegradowanego DNA. Badania te
obejmuj¹ ewaluacjê ró¿nych metod ekstrakcji, usuwania specyficznych inhibitorów PCR, a tak¿e oczyszczania ekstraktów, metodê nested PCR i typowania standaryzowanego zdegradowanego DNA. Ostatnio w literaturze przedmiotu pojawi³ siê obszerny przegl¹d zastosowania amplikonów o zmniejszonych rozmiarach
do wiarygodnego typowania zdegradowanego DNA. Te
minipleksy PCR s¹ rekomendowane w przypadkach,
w których dochodzi do wypadania alleli i zmniejszenia
czu³oœci. Tego typu zjawiska s¹ obserwowane
szczególnie w zakresie d³u¿szych alleli. Jak dot¹d kilka
tych interesuj¹cych minipleksów PCR opisano (³¹cznie
z badaniem w³osów w fazie telogenu) na potrzeby wielu ekspertyz kryminalistycznych.
Wykorzystuj¹c doœwiadczenia zwi¹zane z degradacj¹ DNA zachodz¹c¹ nawet w ci¹gu d³ugiego czasu,
autorzy opracowali multipleks PCR, w którym ¿aden
z wykrywalnych alleli nie ma wiêcej ni¿ 150 bp d³ugoœci. W artykule zaprezentowano metodê krótkiego pentapleksu PCR (ShoP-PCR), która umo¿liwia uzyskanie
doskona³ych wyników nawet w przypadkach, w których
typowanie DNA nie powiod³o siê z u¿yciem zestawów
dostêpnych na rynku.
Materia³y i metody
Opracowanie primerów
Sekwencje primerów opracowano za pomoc¹ oprogramowania Primer3 i GeneFisher (http://bibiser.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-in/gf_submit?mode=STARTUP&sample=dna). Primery forward zosta³y oznaczone barwnikami fluorescencyjnymi (tab. 1).
Amplifikacja PCR
Pentaplex zastosowano w mieszaninie reakcyjnej
10 μl zawieraj¹cej 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl,
po 200 μM ka¿dego dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dUTP),
83
PRZEK£ADY
2,2 mM MgCl2, 500 μg/ml albuminy surowicy wo³owej,
1% Tween 20, po 200 nM z ka¿dego primera amelogeniny, po 600 nM ka¿dego z primerów D8S1179, po 1000
nM ka¿dego z primerów vWA, po 75 nM ka¿dego z primerów TH01, 150 nM ka¿dego z primerów D3S1358,
1 U Platinum Taq DNA Polimerazy (Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy), 0,1 U UNG (MBI Fermentas, Leon-Rot,
Niemcy) i zmienne iloœci matrycy DNA. Aby unikn¹æ kontaminacji, próbki produktów PCR wytrawiano enzymem
UNG (Uracil-DNA Glikosylase) przed amplifikacj¹ poprzez inkubacjê w temperaturze 7oC przez 5 min. Profil
cykli ShoP-PCR w systemie PCR GeneAmp 2400 (Applied Biosystems, Darmstadt, Niemcy) by³ nastêpuj¹cy:
95oC przez 11 min (wstêpna inkubacja), 96oC przez
2 min, a po niej 10 cykli denaturacji przez 30 s w 94oC,
przy³¹czanie primerów przez 30 s w temp. 60oC i ich wyd³u¿anie przez 45 s w temp. 70oC, a nastêpnie przez
18–22 cykle denaturacji przez 30 s w temp. 90oC, przy³¹czanie primerów przez 30 s w temp. 60oC i wyd³u¿anie
primerów przez 45 s w temp. 70oC. Po tym nastêpowa³
etap ostatecznego wyd³u¿ania przez 90 min w temp.
60oC. Pod koniec reakcji PCR utrzymywano temperaturê 4oC. Prêdkoœæ zmiany temperatury (ramping) miêdzy
przy³¹czaniem i wyd³u¿aniem starannie ustawiono
w przedziale miêdzy 0,3o a 0,5oC/s.
œwinia, koñ, krowa, mysz, szczur, ¿aba, ryba, owca, zaj¹c, œwinka morska, koza, jeleñ, czarny jeleñ, lis, go³¹b
i œledŸ) i wyizolowano trzy najbardziej spokrewnione
naczelne (goryl, orangutan, szympans). Izolacjê DNA
przeprowadzono za pomoc¹ QIAmp, pakietu Mini DNA
(Qiagen, Niemcy). Ekstrakty przechowywano w temperaturze -20oC. Aby udowodniæ specyficznoœæ wyd³u¿ania primerów dla cz³owieka, dodatkowo wykorzystano
zestaw ró¿nych ekstraktów DNA z bakterii i grzybów.
Po jednym nanogramie DNA z ka¿dego ekstraktu poddano PCR zgodnie z powy¿szym opisem.
Czułość a mieszaniny DNA
Przygotowano dziesiêæ ró¿nych rozcieñczeñ ekstraktów DNA z krwi odpowiednio z iloœci¹ matrycy 100,
50, 25, 12,5 i 6,25 pg. Iloœæ DNA matrycowego w mieszaninie ustalono, stosuj¹c zestaw do kwantyfikacji PicoGreen dsDNA (MoBiTec, Goettingen, Niemcy) w systemie VersaFluor™ Fluorometer (Bio-Rad, Monachium,
Niemcy) do iloœci 0,025 ng, a nastêpnie rozcieñczono
do 0,0125 i 0,00625 ng. Przygotowano próbki mieszanin (1:0, 19:1, 9:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:9, 1:19 i 0:1)
z dwóch ró¿nych ekstraktów DNA z ca³kowitym wk³adem DNA – 1 ng i przeprowadzono pomiar iloœci zgodnie z powy¿szym opisem.
Wykrywanie sygnału
Test DNase I
Od jednego do dwóch mikrosatelitów ka¿dego produktu PCR mieszano z 0,5 μl standardu wewnêtrznego
GeneScan-400HD (ROX) i 14,5 μl dejonizowanego formamidu (Sigma, Tufkirchen, Niemcy). Mieszanina zosta³a poddana denaturacji w termocyklerze PCR przez
3 min w temp. 96oC. Po ch³odzeniu na lodzie próbki nastrzykiwano elektrokinetycznie przez 5 s. Ujawnianie
wykonywano na analizatorze 310 ABI Prism Genetic
zgodnie z zaleceniami producenta (Applied Biosystems, Darmstadt, Niemcy). Wielkoœæ fragmentów i iloœæ
produktów PCR ustalono automatycznie, pos³uguj¹c
siê oprogramowaniem Gene Scan Analysis 3.1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Niemcy).
Procedury walidacji
Aby przeœledziæ, czy powiod³o siê typowanie zdegradowanego DNA, wykonano test DNase I. DNA o wysokiej masie cz¹steczkowej ekstrahowano z wykorzystaniem zestawu MasterPure™ do puryfikacji DNA
(Epicentre, Madison, WI, USA). Osiemdziesi¹t mikrogramów ekstraktów trawiono za pomoc¹ 8 U DNAse I w 200
μl mieszaniny reakcyjnej z wykorzystaniem pakietu
DNA-free (Ambion, Huntingdon, W. Brytania). Nastêpnie pobierano po 20 μl ekstraktu, odpowiednio po 0,5,
1, 2, 3, 4, 8, 15 i 30 min, i zatrzymywano reakcjê przez
dodanie 4 μl odczynnika dezaktywuj¹cego (DNase
Inactivation Reagent). Pobierano po 0,2 μl zdegradowanego DNA i poddawano PCR w objêtoœci 10 μl –
zgodnie z opisem zamieszczonym powy¿ej.
Specyficznoœæ primerów
Badania kryminalistyczne
Wymazy z jamy ustnej pobrano od 200 niespokrewnionych, zdrowych ochotników. DNA natychmiast ekstrahowano z u¿yciem Cheleksu 100. Porównano 200
ludzkich profili DNA otrzymanych za pomoc¹ ShoP-PCR z profilami tych samych osób otrzymanymi z zastosowaniem systemu SGM i PowerPlex 16.
Aby sprawdziæ specyficznoœæ metody dla materia³u
ludzkiego, pobrano DNA od ró¿nych zwierz¹t (kot, pies,
Zbadano osiem przyk³adowych próbek DNA niskiej
jakoœci, wœród których by³ znaczek z listu w sprawie
o szanta¿, pieluszka, pow³oczka zawiniêta w plastikow¹ torebkê i dywan ze sprawy zwi¹zanej z napastowaniem na tle seksualnym, szcz¹tki szkieletu pogrzebane
w ziemi, zatopione w parafinie tkanki mózgowe dwóch
ofiar morderstwa, jeden w³os w fazie telogenu – dowód
w sprawie napaœci w supermarkecie oraz niedopa³ek
84
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 259 (styczeñ–marzec) 2008
PRZEK£ADY
papierosa znaleziony na przystanku autobusowym
i wykorzystany w sprawie dotycz¹cej identyfikacji.
Wyniki
W tworzeniu nowego systemu multipleksowego bardzo istotne znaczenie ma ustalenie solidnego i wiarygodnego systemu typowania DNA dla wszystkich rodzajów próbek. ShoP-PCR zosta³ opracowany tak, aby
umo¿liwiæ amplifikacjê nawet znacznie zdegradowanego DNA. Ta multipleksowa metoda obejmuje loci amelogeniny, TH01, VWA, D3S1358 i D8S1179. D³ugoœæ
alleli opisanych w literaturze nie przekracza 150 bp (allele wraz z przedzia³ami rozmiarów dla ka¿dego locus
wyszczególniono w tabeli 1).
Primery amelogeniny s¹ ukierunkowane na region
inny ni¿ para primerów powszechnie u¿ywanych przez
kryminalistyków. Otrzymane primery amelogeniny ró¿ni¹ siê o 1077 bp od regionu u¿ywanego w pakietach
komercyjnych (pierwszy raz opisane przez H. Haasa-Rochholza i G. Weilera). Jak przedstawiono w tabeli 1,
ten nowy docelowy region wykazuje ró¿nicê 3 bp miêdzy allelem X i Y. Warunki PCR i koncentracje primerów
uzyskanej mieszaniny reakcyjnej ShoP-PCR zosta³y
starannie dopasowane, tak aby otrzymaæ optymalne
wyniki. Wa¿nym krokiem by³o dostosowanie prêdkoœci
zmiany temperatury (ramping), nie tylko dla termocyklera GeneAmp 2400, lecz tak¿e dla innych termocyklerów (GeneAmp 9600, Applied Biosystems, Darmstadt, Niemcy; PCR Express, Thermo Electron/Hybaid,
Tabela 1
Opis, liczba powtórzeń składników drabiny alleli, przedział wielkości alleli i sekwencje primerów loci ShoP-PCR
Sekwencje D8S1179 primera forward ju¿ by³y publikowane (M.D. Barber, B.H. Parkin: Sequence analysis and allelic designation of the two short tandem
repeat loci D18S51 and D8S1179, „Int. J. Legal Med.” 1996, nr 109, s. 62–65).
Tabela 2
Wysokość pików podprążków (%) z uwzględnieniem standardowego błędu (S.E.)
n to liczba zaobserwowanych i wykrywalnych pików stutter (pików podpr¹¿ków) w allelach; wartoœci w nawiasach odpowiadaj¹ liczbie obserwacji dla ka¿dego produktu
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 259 (styczeñ–marzec) 2008
85
PRZEK£ADY
Dreieich, Niemcy) albo PowerPlex 16 System™ (Promega, Mannheim, Niemcy). Aby wykluczyæ mutacje w
obrêbie sekwencji przy³¹czania siê primera, zbadano
200 zdrowych osób z wykorzystaniem ShoP-PCR oraz
zestawu SGMplus™ albo Powerplex 16 System.
Oprócz przypadku, w którym allel 16 nie by³ wykrywalny w genotypie 16/17 locus VWA za pomoc¹ systemu
SGMplus™, nie zaobserwowano ró¿nic miêdzy wynikami typowania z u¿yciem komercyjnie dostêpnych
zestawów albo ShoP-PCR. Czêstotliwoœci dla 200 niespokrewionych osób by³y zgodne z oczekiwaniami wynikaj¹cymi z zastosowania prawa Hardy’ego-Weinberga. Przy zastosowaniu 200 pg matrycy DNA cztery autosomalne loci wykazywa³y ró¿nice w zakresie heterozygotycznego niezbalansowania. Wartoœæ najni¿sz¹
zaobserwowano dla uk³adu TH01:4,07 ±11,30%, zaœ
najwy¿sz¹ dla D8S1179:13,38 ±13,29%. D3S1358 wykazuje heterozygotyczne niezbalansowanie 9,35
±9,40%, VWA 7,23 ±10,64%. Wystêpowanie specyficznych dla alleli podpr¹¿ków opisano w tabeli 2.
Podczas gdy wysokoœæ pików podpr¹¿ków dla locus
TH01 jest podobna dla ka¿dego allela bez wzglêdu na jego wielkoœæ i wysokoœæ piku dla VWA, a szczególnie dla
D3S1358, to D8S1179 nie wykazuje ¿adnej tendencji.
Przy badaniu zestawu próbek DNA ró¿nych zwierz¹t, bakterii i grzybów wykryto jedynie sygna³y u orangutana i goryla. DNA szympansa da³o profil z primerami amelogeniny, TH01, D3S1358 i VWA, choæ specyficzne sygna³y dla VWA by³y poza zakresem drabiny alleli dla cz³owieka (danych nie przedstawiono).
Zbadano ró¿ne koncentracje matrycy i ujawniono granicê wykrywalnoœci 12,5 pg DNA matrycowego ekstraho-
wanego z tkanki post mortem niewykazuj¹cej ¿adnych
oznak rozk³adu. Jest to równe iloœci mniej wiêcej dwóch
komórek diploidalnych. Przy iloœci 6,25 pg, jak siê spodziewano, zaobserwowano wypadanie alleli (ryc. 1).
Domieszki 50 pg w ca³kowitej iloœci 1000 pg DNA
(1:19) by³y wyraŸnie wykrywalne (danych nie przedstawiono). Kiedy wykonano test DNase I, otrzymano ca³y
profil DNA po trawieniu trwaj¹cym 3 minuty (SGMplus™ wykazuje tylko sygna³y dla loci amelogeniny,
D3S1358 i D8S1179). Przy trawieniu trwaj¹cym 4 minuty wyraŸnie widoczne by³y cztery z piêciu loci ShoP –
w przeciwieñstwie do SGMplus™, gdzie wykrywalne
by³o tylko locus D19S433 (ryc. 2A i B).
Ryc. 2. DNA sztucznie zdegradowane drog¹ trawienia DNase I przez
2 min (a i d), 3 min (b i e) i 4 min (c i f). Profile DNA otrzymane z u¿yciem
zestawu SGMplus™ (A) i ShoP-PCR (B). Pe³ny profil piêciu loci ShoP
otrzymano po 3 min, a cztery z piêciu loci by³y wyraŸnie widoczne po
4 min.
Ryc. 1. Wyniki oznaczania DNA ShoP-PCR z wykorzystaniem 100 pg (a),
25 pg (c) i 12,5 pg (c) i 6,25 (d) DNA matrycowego. Zauwa¿my wypadanie alleli na dole (d) odpowiednio w loci amelogeniny, TH01 i VWA.
86
Jak przedstawia tabela 3, analiza ShoP-PCR w badaniach kryminalistycznych dla wszystkich oœmiu badanych próbek da³a wynik lepszy ni¿ zestawy komercyjne. Przyk³ady profili ShoP-PCR zaprezentowano dla
pow³oczki (ryc. 3A) i pieluszki (ryc. 3B) w sprawie napastowania na tle seksualnym. W piêciu z przypadków
otrzymano wykrywalny pe³ny profil DNA dla loci ShoP,
w przypadkach 6 i 8 cztery z piêciu loci by³y wyraŸnie
widoczne. Nawet dla próbki koœci pogrzebanej w ziemi
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 259 (styczeñ–marzec) 2008
PRZEK£ADY
Ryc. 3. Wynik oznaczania DNA z u¿yciem ShoP-PCR ze œladów z pow³oczki (A) i pieluszki (B) w wypadku podejrzenia napastowania na tle seksualnym
dziecka. Po zastosowaniu komercyjnych zestawów nie otrzymano ¿adnych sygna³ów.
przez 7 lat otrzymano trzy pe³ne loci. Dla porównania –
SGMplus™ i/albo PowerPlex 16™ da³o mniej albo
wrêcz nie da³o wyników.
Dyskusja
Krótki pentapleks PCR obejmuje loci amelogeniny,
TH01, VWA, D3S1358 i D8S1179. Zosta³ opracowany
w celu umo¿liwienia typowania DNA nawet w przypadkach, w których DNA jest wysoce zdegradowane albo
wystêpuje w niewielkiej iloœci. Poniewa¿ nawet z DNA
o bardzo z³ej jakoœci otrzymuje siê fragmenty o rozmiarach 100–150 bp, ¿aden z powszechnie spotykanych
alleli w tych piêciu loci nie przekracza d³ugoœci fragmentu 150 bp. W celu unikniêcia nak³adania siê alleli
dwóch ró¿nych loci oznaczonych tym samym barwnikiem fluorescencyjnym dobrano primery tak, aby miêdzy najmniejszym powszechnie spotykanym allelem
jednego locus i najwiêkszym drugiego wystêpowa³a odleg³oœæ co najmniej 10 bp. W niektórych próbkach
stwierdzono obecnoœæ nietypowych pików, które wygl¹daj¹ na szersze, wiêc ³atwo je odró¿niæ od specyficznych, znakowanych barwnikiem fluoroscencyjnym produktów PCR. W innych przypadkach wykryto kilka pików albo kleksów barwnika. Pojawienie siê artefaktów
nie utrudnia³o jednak interpretacji wyników, poniewa¿
wiêkszoœæ z tych pików wyst¹pi³a poza d³ugoœciami
fragmentów w³aœciwych alleli danego locus albo poni¿ej limitu wykrywalnoœci 50 RFU. Przy projektowaniu
primerów do amplifikacji PCR procedury dopasowania
sekwencji alleli musz¹ wykluczaæ miejsca przy³¹czenia
primerów, niele¿¹ce poza obszarem zainteresowania.
Polimorfizmy w regionach przy³¹czania primerów mog¹
prowadziæ do pojawienia siê alleli zerowych, co z kolei
mo¿e sprawiæ, ¿e pojawi¹ siê fa³szywe homozygoty, tak
jak opisano ostatnio dla locus D5S818, gdzie w allelu 10
wystêpuje mutacja w miejscu przy³¹czania primera.
W PCR o krótkich docelowych amplikonach najbli¿sza pozycja primerów w stosunku do interesuj¹cych
nas STR-ów nie zawsze jest t¹ wybran¹, poniewa¿ regiony flankowania primerów czêsto zawieraj¹ struktury
albo sekwencje powtórzeñ mog¹ce utrudniæ PCR po-
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 259 (styczeñ–marzec) 2008
przez niedopuszczenie do przy³¹czania siê primera albo powstania artefaktów PCR. Z tego powodu ka¿d¹
z projektowanych reakcji PCR powinno siê starannie
przetestowaæ w zakresie wystêpowania artefaktów
i wiarygodnoœci w du¿ej grupie próbek DNA ludzkiego
i zwierzêcego oraz œladów kryminalistycznych.
Zjawisko wypadania alleli w piêciu loci sprawdzono,
porównuj¹c profile DNA 200 osób z wynikami dla
dwóch dostêpnych na rynku zestawów PowerPlex 16
System™ (Promega, Madison, USA) i SGMplus™ (Applied Biosystems, Darmstadt, Niemcy). We wszystkich
przypadkach otrzymano identyczne profile i nie stwierdzono preferencyjnej amplifikacji, wypadania alleli ani
loci. Utrata allela 16 zaobserwowana w locus VWA przy
zastosowaniu zestawu SGMplus™ ma byæ wynikiem
mutacji w obszarze przy³¹czania primera, tak jak zaobserwowano te¿ dla allela 19, poniewa¿ profile PowerPlex 16 System™ i ShoP-PCR by³y identyczne. Specyficznoœæ primerów testowano na próbie DNA zwierz¹t,
bakterii i grzybów. Tylko dla DNA naczelnych otrzymano wykrywalne sygna³y – czêœciowo allele poza drabin¹ – które ju¿ zaobserwowano w ramach innych badañ
ludzkich loci STR przy sprawdzaniu DNA naczelnych.
W eksperymentach z rozcieñczeniami wiarygodne
wyniki otrzymywano dla co najmniej 12,5 pg ludzkiego
DNA, aczkolwiek w niektórych przypadkach zaobserwowano niezbalansowan¹ heterozygotê. Wiadomo, ¿e
w warunkach, w których dostêpna jest tylko niewielka
iloœæ DNA, wystêpuje tendencja do amplifikacji preferencyjnej. Nale¿y mieæ równie¿ na uwadze niezbalansowanie i wypadanie alleli. Krótkie fragmenty ShoP-PCR przyczyni³y siê do zwiêkszenia czu³oœci ze
wzglêdu na wy¿sz¹ wydajnoœæ amplifikacji. Nawet przy
iloœci DNA 12,5 pg otrzymano pe³ny profil. Kiedy przeprowadzano PCR 6,25 pg DNA matrycowego, zaobserwowano wypadanie alleli, poniewa¿ spodziewano siê
efektów stochastycznych podczas przy³¹czania primerów i amplifikacji PCR. W innych multipleksowych
reakcjach PCR zjawiska te s¹ obserwowane przy badaniu iloœci DNA 200 pg.
Inne istotne zagadnienie, któremu nale¿a³o siê
przyjrzeæ w procedurze walidacji, to kwestia wiarygod-
87
PRZEK£ADY
noœci i czu³oœci przy analizie mieszanin, poniewa¿ granica wykrywalnoœci mniejszoœciowego sk³adnika w ich
ekstraktach zale¿y od iloœci owego sk³adnika. Dla ca³kowitej iloœci DNA 1000 pg mo¿liwe by³o otrzymanie
pe³nego profilu w iloœci 50 pg. Wykrywalny limit 1:19
mniejszoœciowego sk³adnika jest podobny do limitu,
który obserwuje siê w przypadkach, gdy stosowane s¹
inne metody wykorzystuj¹ce multipleks.
Dziêki analizie zdegradowanego materia³u ujawni³a siê najwa¿niejsza zaleta opisanego systemu. Zdegradowane DNA przygotowano drog¹ trawienia
DNase I w kontrolowanych warunkach. Nawet po trawieniu trwaj¹cym 4 minuty wyraŸnie widoczne by³y
cztery z piêciu loci. Nie jest zaskoczeniem, ¿e najpierw
zachodzi³o wypadanie alleli najwiêkszego locus,
D3S1358. Stwierdzono tak¿e brak wykrywalnego sygna³u dla locus FGA, kiedy to wykorzystano zestaw do
amplifikacji AmpFISTR™ Blue PCR i wykrywalne by³y
dwa z trzech loci.
Omawiana metoda umo¿liwia typowanie zdegradowanego DNA ze wzglêdu na ma³e rozmiary docelowych
fragmentów, poniewa¿ ¿aden z wykrywalnych alleli nie
przekracza d³ugoœci 150 bp. Wad¹ ShoP-PCR jest stosunkowo niewielka si³a dyskryminacji – 1:3,16 x 104,
poniewa¿ widoczne s¹ tylko 4 autosomalne loci. Dla
porównania, si³y dyskryminacji dla systemu SGMplus™
(1:3,3 x 1012) i systemu PowerPlex 16 (1:1.83 x 1017)
s¹ o rz¹d wielkoœci wy¿sze. Tak wiêc zestawy komercyjne okazuj¹ siê lepsze, kiedy dysponuje siê wystarczaj¹c¹ iloœci¹ niezdegradowanego DNA.
przechowywane w formalinie, dla których z wykorzystaniem zestawu SGMplus™ albo PowerPlex 16 System™ otrzymywano tylko do dwóch loci. W³osy w fazie
telogenu to materia³ czêsto zabezpieczany na miejscach przestêpstw. DNA znajduj¹ce siê w keratynie
w³osa jest znacznie zdegradowane, a analiza DNA ze
zgubionych w³osów bez cebulek czêsto nie daje ¿adnych wyników. Z pojedynczego w³osa telegonowego
zabezpieczonego na odzie¿y ofiary autorzy otrzymali
pe³ny profil (tab. 3).
DNA ekstrahowane z ludzkich koœci pogrzebanych
w glebie albo znalezionych w wilgotnym œrodowisku
jest zazwyczaj w du¿ym stopniu zdegradowane. Przy
badaniu DNA ekstrahowanego z koœci ofiar katastrof
lotniczych zaobserwowano, ¿e wypadanie alleli albo loci zachodzi wówczas, gdy allele s¹ d³u¿sze ni¿ 200 bp.
Jak wykazano dla koœci pogrzebanych w ziemi (przypadek 2), metoda ShoP-PCR daje dobre wyniki ze wzglêdu na niewielkie rozmiary docelowych fragmentów. Zabezpieczenie formalin¹ indukuje degradacjê DNA, nawet je¿eli proces utrwalania trwa³ tylko 3 godziny. Rutynowo czas dzia³ania formaliny to co najmniej 2 dni
w zbuforowanej albo niezbuforowanej formalinie, przed
zatopieniem w parafinie. Z tkanki przechowywanej
przez 15 lat, utrwalonej formalin¹ i zatopionej w parafinie (przypadek 8), otrzymano pe³ny profil DNA, dlatego
ta technika PCR jest u¿yteczna wtedy, gdy dostêpny
jest wy³¹cznie materia³ zatopiony w formalinie, czêsto
przechowywany przez dziesi¹tki lat.
Wnioski
Tabela 3
Wyniki oznaczania DNA dla ośmiu różnych śladów kryminalistycznych
Omawiany system umo¿liwia skuteczne przeprowadzenie analizy DNA
w przypadkach, w których dysponuje
Próbka
Materia³
Wiek
ShoP
Systemy komercyjne
siê iloœci¹ DNA wiêksz¹ ni¿ 12,5 pg
albo gdy materia³ jest znacznie zde1. W³osy w fazie telogenu
2 lata
5/5
0/5
gradowany. ShoP-PCR jest bardzo
2. KoϾ
7 lat
3/5
0/5
u¿yteczny w typowaniu w³osów w fa3. Pow³oczka
2 lata
3/5
1/5
zie telogenu, tkanki w znacznym
4. Pieluszka
7 dni
5/5
0/5
stopniu rozk³adu albo tkanki, która
5. Dywan
nieznany
5/5
0/5
przez d³u¿szy czas by³a pod dzia³a6. Znaczek
6 miesiêcy 4/5
0/5
niem formaliny. Opracowanie nowych
7. Niedopa³ek papierosa
nieznany
5/5
2/5
par primerów i ich po³¹czenie w mul8. Tkanka zatopiona w parafinie 15 lat
4/5
2/5
tipleksie PCR daje lepsze wyniki, kiedy zachodzi wypadanie alleli z powodu degradacji DNA albo mutacji
Poniewa¿ celem badañ by³o zaprezentowanie PCR
miejsc przy³¹czania primerów. Dla dobra badañ krymiprzydatnego dla zdegradowanego materia³u w œladach
nalistycznych warto dysponowaæ wieloma ró¿nymi loci
kryminalistycznych, przetestowano ShoP-PCR na zemultipleksowych miniSTR.
stawie próbek kryminalistycznych, takich jak w³osy
w fazie telogenu, koœci pogrzebane w ziemi albo tkanki
oprac. Ewa Nogacka
88
PROBLEMY KRYMINALISTYKI 259 (styczeñ–marzec) 2008