Zmiany w sekwencji długich powtórzeĘ koĘcowych (LTR

:MIANYWSEKWENCJIDŒUGICHPOWTÌRZEÊKOÊCOWYCH,42
ENDOGENNYCH RETROWIRUSÌW uWINI 0%26
U ZWIERZ’T W STADZIE
PRZEZNACZONYMDOKSENOTRANSPLANTACJI
#HANGESINTHELENGTHOFLONGTERMINALREPEATSEQUENCES,42
OFPORCINEENDO†
GENOUSRETROVIRUSES0%26
FROMPIGSOFTHEHERDINBREDFORXENOTRANSPLANTATION
MGRIN˜'RZEGORZ-ACHNIKMGR3ABINA'AŒKA
DR4OMASZ,OCHMGR$ANIEL3YPNIEWSKI
DR)LONA"EDNAREK
:AKŒAD"IOTECHNOLOGIII)N˜YNIERII'ENETYCZNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
+IEROWNIK:AKŒADUDRNBIOL)LONA"EDNAREK
STRESZCZENIE
Stosowane obecnie allotransplantacje są limitowane
przez istniejący niedobór dawców do przeszczepów.
Ksenotransplantacje, czyli przeszczepy międzygatunkowe mogą stanowić alternatywne rozwiązanie. Endogenne retrowirusy świni (ang. Porcine Endogenous
Retroviruses PERV), wykryte w organizmach świń (potencjalnego gatunku donorowego narządów) stanowią
istotną przeszkodę we wdrożeniu ksenotransplantacji
do praktyki. PERV posiadają zdolność do zakażania
komórek ludzkich in vitro, i mogą modulować stopień
infekcyjności poprzez zmiany w sekwencji DNA i/lub
tworzenie cząstek rekombinacyjnych. W doświadczeniach in vitro obserwowano następowanie zmian w sekwencjach DNA w obrębie długich powtórzeń końcowych (ang. Long Terminal Repeats, LTR), co wpływało
na stopień infekcyjności wirusa względem komórek
człowieka. Celem pracy było wykazanie, czy zmiany
w sekwencjach LTR PERV, obserwowane in vitro, występują również w organizmie świni domowej w stadzie
przeznaczonym do ksenotransplantacji.
Do badań wykorzystano DNA ekstrahowane z krwi pełnej świń ze stada przeznaczonego do ksenotransplantacji. Przeprowadzono reakcję Long-PCR z użyciem
starterów zlokalizowanych w obrębie sekwencji LTR
PERV. Produkty reakcji rozdzielano w żelu agarozowym. Uzyskano szereg produktów amplifikacji; produkty o długości 1000 i 560 par zasad (pz) izolowano
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
ABSTRACT
Allotransplantation procedures are limited by graft donor deficiency. Xenotransplantations, being interspecies
transplantations, may serve as an alternative solution.
Porcine endogenous retroviruses (PERV) found in porcine genome (potential graft donor) are the major obstacle in xenotransplantation implementation. PERV are
capable of infecting human cells in vitro an may modulate their infectivity through changes in DNA sequence and/or formation of recombinant particles. In vitro
studies revealed that changes in DNA sequences within
long terminal repeats (LTR) influenced infection in human cell lines. The aim of the study was to investigate,
whether in vitro changes in LTR sequences occur also
in pigs in vivo.
The studied material was DNA extracted from whole
blood from pigs from the herd inbred for xenotransplantation. Long PCR assay with primers localized within
PERV LTR sequences was carried out. Amplification
products were separated on agarose gels. Several products were observed. Amplimers of 1000 and 560 base
pairs (bp) were eluted from gels, purified, and sequenced. Obtained sequences were compared with reference
data from GenBank and were analyzed using EMBOSS
software. A 39 bp fragment (WS_39), analogous to that
described in literature, was repeated in the studied 560
bp amplimers five times, while it was repeated only 2-3
times in the reference sequences. The obtained results
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
–ŸŸžŸ¤°°U
z żelu, oczyszczano i poddano sekwencjonowaniu. Wyniki porównano z sekwencjami referencyjnymi, zgromadzonymi w bazie danych GenBank i analizowano
z użyciem oprogramowania EMBOSS.
W sekwencji LTR PERV o długości 560 pz zaobserwowano pięciokrotne powielenie odcinka 39 nukleotydów
(WS_39), analogicznego z opisanym w literaturze, natomiast w sekwencjach referencyjnych fragment ten
występował dwu- lub trzykrotnie. Uzyskane wyniki
sugerują, że PERV mogły ulegać w przeszłości zmianom i infekować komórki zarodkowe świni w postaci
rekombinowanej lub, że są one obecnie zdolne do rekombinacji na drodze retrotranspozycji in vivo w organizmie świń.
suggest, that PERVs may have fluctuated in the past
and the recombined particles had infected porcine stem
cells. Alternatively, PERVs may be capable of recombinating by retrotransposition in pigs in vivo at present.
Key-words: Transplantation, Heterologous; Endogenous retroviruses; Recombination, Genetic
Słowa kluczowe: transplantacje heterologiczne; endogenne retrowirusy; rekombinacja genetyczna
' "Õ
Od ostatniej dekady XX-go wieku obserwuje się ponowne zainteresowanie grup badawczych zagadnieniem ksenotransplantacji. Ponowne podjęcie tematyki przeszczepów
odzwierzęcych było możliwe dzięki wynalezieniu skutecznych leków immunosupresyjnych oraz rozwojowi technik
inżynierii genetycznej. W chwili obecnej uznaje się, że ze
względu na wiele aspektów, optymalnym gatunkiem donorowym narządów do przeszczepów jest świnia domowa
(Sus scrofa). Niestety, w organizmach świń zaobserwowano obecność cząstek wirusowych, zdolnych do infekowania
komórek człowieka w warunkach in vitro [1]. Cząstki teendogenne retrowirusy świni (ang. porcine endogenous retroviruses, PERV), są obecne w genomie każdego osobnika
i pozostając w stanie zintegrowanym z genomowym DNA,
nazywane są prowirusami. Endogenne retrowirusy świni
występują w wielu kopiach w genomie komórek zwierząt
i nie jest możliwe ich całkowite usunięcie poprzez prostą
selekcję stad [2]. Jak dotąd, nie stwierdzono zakażenia organizmu człowieka po kontakcie z tkankami pochodzącymi od
świni (np. podczas przeszczepu wysp trzustkowych świni,
perfundacji wątroby krwią świni) [3], co jednak nie wyklucza ryzyka podczas zabiegów ksenotransplantacji. Endogenne retrowirusy świni dziedziczą się zgodnie z prawami
Mendla, kumulując w toku ewolucji liczne mutacje, co
z czasem czyni je niezdolnymi do replikacji [4]. Ze względu na różnice w budowie wyróżnia się trzy subtypy PERV:
PERV-A, PERV-B, PERV-C [5, 6], przy czym różnice występują zwłaszcza w obrębie genu env, kodującego białka
otoczki wirusa, pozostałe geny (gag oraz pol) wykazują
wysoki stopień homologii, wynoszący ponad 95% [5, 6].
Badania wykazały, że PERV-A i PERV-B są obecne u każdego osobnika we wszystkich stadach, natomiast PERV subtypu C nie występuje u niektórych zwierząt. Subtypy A, B i
C różnią się względem siebie stopniem infekcyjności [7, 8].
Genom PERV zbudowany jest z dwóch identycznych cząsteczek RNA o dodatniej polarności. Struktura genetyczna
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
zawiera, oprócz genów kodujących białka, szereg charakterystycznych, niekodujących segmentów genomu, które
pełnią rolę regulacyjną [4]. W stosunku do genomowego
RNA PERV, forma prowirusowa zawiera dodatkowo na obu
końcach tzw. końcowe fragmenty powtórzone (ang. Long
Terminal Repeats, LTR). Sekwencje LTR zawierają liczne
elementy regulatorowe, takie jak sekwencje promotorowe
i wzmacniające (enhancery), elementy wiążące hormony
a także sygnał poliadenylacji [4]. Wykazano, że sekwencje
promotorowe zawarte w elementach LTR mogą także regulować in cis ekspresję genów gospodarza [9]. Cząsteczki
retrowirusów, w tym również PERV, mogą ulegać licznym
rearanżacjom, które w większości przypadków prowadzą do
defektów genetycznych i spadku potencjału infekcyjnego,
lecz zwiększają ryzyko powstawania nowych form rekombinacyjnych PERV [10]. Wykazano także ukierunkowane
rearanżacje genomu PERV w kierunku wzrostu potencjału
infekcyjnego względem komórek człowieka in vitro [11,
12]. Rekombinacyjne cząsteczki PERV-A/C wykazywały około 500 razy silniejszy potencjał zakaźny in vitro niż
subtyp PERV-A. [11]. Obserwowano również multiplikację
regulacyjnych regionów LTR. Dane literaturowe wskazują,
że kilkukrotne powielenie 39-nukleotydowego fragmentu
LTR o charakterze wzmacniacza (enhancera) powodowało
wzrost stopnia replikacji wirusa [13]. Zmiany te obserwowano w warunkach in vitro, po wielokrotnych pasażach komórek człowieka linii HEK293 zakażonych wirusem PERV
[14]. Celem niniejszej pracy było scharakteryzowanie genomowego DNA świń ze stada przeznaczonego do ksenotransplantacji pod względem liczby powtórzeń kluczowego
odcinka 39 nukleotydów w końcowych sekwencjach powtórzonych PERV.
"ŸŸ")
Materiałem do badań była krew obwodowa świń (dwóch
osobników, oznaczonych jako 2118 oraz 2050) pochodzących ze stad hodowlanych Instytutu Zootechniki w Balicach
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
–ŸŸžŸ¤°°U
')ŸŸ'Ÿ')'
W wyniku rozdziału elektroforetycznego produktów
reakcji Long-PCR uzyskano szereg amplimerów, których
długość oszacowano na około 7200, 1000 i 560 par zasad
(pz). Produkty, które zostały poddane dalszej analizie przedstawiono na rycinie 1. Produkty Long-PCR o długości 560
pz dla osobników 2118 i 2050 oznaczono odpowiednio jako
2118_560 i 2050_560. Amplimery poddano sekwencjonowaniu i potwierdzono zgodność ich sekwencji z sekwencjami PERV umieszczonymi w bazie danych GenBank.
Wykazano, że analizowane produkty Long-PCR należały
wyłącznie do końcowych fragmentów powtórzonych PERV
(LTR) i nie obejmowały genów kodujących białka. Są to
prawdopodobnie tzw. „solo-LTR”, elementy występujące
¬A‡Ÿ‡
|®J®l-tŸ RqRp –|\|–R ¬A®y¬Ÿ ‚–|J¥p }ªŸ –R-pAolŸ |yak‡Ÿ powszechnie w genomach ssaków [4], będące pozostało®y-A®|y|Ÿ‚–Ô¸RpŸ|J‚|ªl-J-oÔA¬Ÿ&Ÿ|Ÿ‚RtyRoŸJt¥a|²AlŸ ściami po rekombinacji homologicznej prowirusów i usuaRy|u¥Ÿ„œ¤°°Ÿ‚®…Ÿ|–-®Ÿ‚–|J¥p ¬Ÿ‚|JJ-yRŸJ-q˜®RoŸ-y-ql®lRŸ nięciu większości ich sekwencji. W amplimerach 2118_560
i 2050_560 wykazano obecność fragmentu DNA o dłu„°°°Ÿ‚®Ÿ|–-®Ÿ^°Ÿ‚®…
gości 39 nukleotydów (oznaczonego jako WS_39), który
k/Krakowa, przeznaczonych do celów ksenotransplantacji. Do ekstrakcji DNA zastosowano metodę z użyciem proteinazy K oraz ekstrakcji mieszaniną fenol-chloroform. Jakość DNA oceniano
poprzez rozdział elektroforetyczny w 1% żelu
agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wydajność ekstrakcji oraz stopień zanieczyszczeń
materiału szacowano spektrofotometrycznie. Do
amplifikacji genomu PERV zastosowano reakcję Long-PCR z lokalizacją starterów w końcowych fragmentach powtórzonych (LTR). Startery ¬A‡Ÿ¤‡
umiejscowiono w ten sposób, aby amplifikacji |–}ªy-ylRŸ \–-auRy ¥Ÿ ' ¨¡zŸ „|²Ÿ )…Ÿ ®Ÿ -u‚qluR–-ulŸ ^°Ÿ ‚®Ÿ –R-pAolŸ
ulegał możliwie cały genom prowirusa: (starter |yakŸ „|²Ÿ (…‡Ÿ 'lJ|A®yRŸ ‚lÖAl|p–| yRŸ ‚|ªlRqRylRŸ RqRuRy ¥Ÿ ' ¨
PERVL-F: AAT CCT CTT GCT GTT TGC ATC ¡zŸªŸ|7¥Ÿ7-J-y¬AiŸ‚–}7p-Ai
AAG ACC GC) i 3’ LTR (starter PERVL-R: ACA
GTC GTA CAC CAC GCA GGG GTA G) na podstawie sekwencji dostępnej w bazie danych GenBank (numer dostępu: AF038599). Sekwencje
starterów zaprojektowano z użyciem programu
komputerowego Prime (GCG Wisconsin Package). Spodziewana długość produktu PCR dla prowirusów pełnej długości wynosiła około 7200 par
zasad. Amplifikację prowadzono z użyciem amplifikatora Perkin Elmer 9600. Zastosowano po- ¬A‡Ÿ¡‡
limerazę DNA LA Taq Polymerase (Takara INC, |–}ªy-ylRŸ\–-auRy ¥Ÿ' ¨¡zŸ„¥Ÿa}–¬…Ÿ®Ÿ\–-auRy RuŸŸ|ŸAi-–-p Rk
Japonia), przeznaczoną do syntezy długich łańcu- –®RŸª®u-Ayl-A®-Ÿ|‚l˜-y¬uŸ‚–®R®Ÿ AiRR\ŸlŸª˜‚‡Ÿ<`=
chów DNA. Produkty reakcji Long- PCR rozdzielano na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydy- w obu badanych sekwencjach został pięciokrotnie powieny. Długości uzyskanych produktów szacowano względem lony (ryc.2). Odcinek WS_39 porównano in silico z opimarkera wielkości DNA Size Marker λ/BstpI (Takara INC, sywanym w literaturze fragmentem DNA o charakterze
Japonia). Po rozdziale elektroforetycznym pojedyncze wzmacniacza (ang. enhancer) i wykazano różnicę dwóch
prążki wycinano z żelu i oczyszczano za pomocą techniki nukleotydów, co sugeruje, że jest to analogiczny odcinek
z użyciem krzemionki i jodku sodu. Otrzymane fragmenty sekwencji prowirusa PERV [14]. (ryc.3). U retrowirusów
DNA poddano sekwencjonowaniu z zastosowaniem tych (w tym endogennych) występuje mechanizm zwiększania
samych starterów jak w reakcji Long-PCR. Sekwencjono- liczby powtórzeń określonych fragmentów DNA o chawanie przeprowadzono z użyciem sekwenatora płytowego rakterze regulacyjnym, co skutkuje zwiększeniem stopnia
ABI PRISM 377. Wyniki sekwencjonowania analizowano replikacji wirusa [15]. Zjawisko to może występować in
za pomocą pakietu oprogramowania EMBOSS (www.bioin- vivo, jak np. u wirusa białaczki kota (ang Feline Leukeformatics.nl/emboss).
mia Virus, FeLV) [16]. Porównanie WS_39 z sekwencjami
PERV-A, PERV-B oraz PERV-C z bazy danych GenBank
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
–ŸŸžŸ¤°°U
¬A‡Ÿ`‡
|–}ªy-ylRŸ \–-auRy ¥Ÿ ' ¨¡zŸ „|²Ÿ )…Ÿ ®Ÿ ˜RpªRyAo-ulŸ –R\R–RyA¬oy¬ulŸ
&kGŸ&kŸlŸ&kŸ®Ÿ®y-oJ¥oÔA¬ulŸ˜l֟ªŸ7-®lRŸJ-y¬AiŸRy-ypŸ
„|²Ÿ(…‡Ÿ'lJ|A®yRŸJª¥kŸ|–-®Ÿ –®¬p–| yRŸ‚|ªlRqRylRŸRqRuRy ¥Ÿ' ¨¡z
wykazało, że w tych sekwencjach WS_39 występuje dwulub trzykrotnie (ryc. 4).
' Pięciokrotne powielenie odcinka WS_39 w DNA badanych osobników może sugerować, że: i). komórki zarodkowe świni uległy zakażeniu przez endogenne retrowirusy
świni o formie odmiennej, niż występujące obecnie lub ii).
w genomie świń czynne są mechanizmy retrotranspozycji,
które mogą prowadzić do powstawania nowych form prowirusów PERV. W dalszych badaniach należałoby ocenić, czy
obserwowane powielenie odcinka o charakterze wzmacniacza może wpływać na ekspresję genów sąsiadujących lub
leżących w pewnej odległości od PERV LTR.
Badania wykonano w ramach projektu badawczego
MNiI nr 2 P04B 022 29 (grant promotorski).
""#
1. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA. Infection of human
cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat Med 1997;
3(3): 282-286.
2. Machnik G i wsp. Endogenne Retrowirusy Świni
(PERV) jako zagrożenie w ksenotransplantacjach. Med
Weter 2004; 60: 345-348.
3. Paradis K i wsp. Search for cross-species transmission
of porcine endogenous retrovirus in patients treated with
living pig tissue. Science 1999; 285: 1236-1241.
4. Linial M, Weiss RA. Other human and primate retroviruses. [W:] Fields Virology., 4th ed. Philadelphia PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001.
5. Akiyoshi DE i wsp. Identification of a full-length cDNA
for an endogenous retrovirus of miniature swine. J Virol
1998; 72(5): 4503-4507.
6. Bösch S, Arnauld C, Jestin A. Study of full-length porcine endogenous retrovirus genomes with envelope gene
polymorphism in a specific-pathogen-free large white
swine herd. J Virol 2000; 74(18): 8575-8581.
7. Czauderna F i wsp. Establishment and characterization of molecular clones of porcine endogenous retroviruses replicating on human cells. J Virol 2000;
74(9): 4028-4038.
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
8. Takeuchi Y i wsp. Host range and interference studies of
three classes of pig endogenous retrovirus. J Virol 1998;
72(12): 9986-9991.
9. Nakamura A i wsp. Human endogenous retroviruses
with transcriptional potential in the brain. J. Hum. Genet., 2003; 48: 575-581
10. Piekarowicz A. Podstawy wirusologii molekularnej.
Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2004.
11. Harrison I i wsp. Determinants of high titer in recombinant porcine endogenous retroviruses. J Virol 2004;
78(24): 13871-13879.
12. Bartosch B i wsp. Evidence and consequence of porcine endogenous retrovirus recombination. J Virol 2004;
78(24): 13880-13890.
13. Denner J i wsp Genetic alterations of the long terminal repeat of an ecotropic porcine endogenous retrovirus during passage in human cells. Virology 2003;
314:125-133.
14. Scheef G i wsp The number of a U3 repeat box acting
as an enhancer in long terminal repeats of polytropic
replication-competent porcine endogenous retroviruses
dynamically fluctuates during serial virus passages in
human cells. J Virol 2001; 75(15): 6933-6940.
15. Wolgamot G., Miller A.D. Replication of Mus dunni
endogenous retrovirus depends on promoter activation
followed by enhancer multimerization. J Virol 1999;
73(12): 9803-9809.
16. Nishigaki K i wsp., Analysis of the disease potential of
a recombinant retrovirus containing friend murine leukemia virus sequences and a unique long terminal repeat
from feline leukemia virus. J Virol 2002; 76(3): 1527-1532.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†