Nowe oblicze RNA - Uniwersytet Jagielloński

Nowe oblicze RNA
Józef Dulak
DMB
Zakład Biotechnologii Medycznej
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Uniwersytet Jagielloński
biotka.mol.uj.edu.pl/~hemeoxygenase
9 grudnia 2006
Regulacja ekspresji genów
RNA komórek eukariotycznych
Indukcja ekspresji genów eukariotycznych
Wiele poziomów
regulacji ekspresji
Regulacja ekspresji genów związanych z pobieraniem
i magazynowaniem żelaza
Sposoby hamowania ekspresji genów
- Pułapki oligonukleotydowe
- Nukleotydy antysensowe
- Rybozymy
Pułapki oligonukleotydowe (decoys)
Hybrydyzacja kwasów naukleinowych jako sposób
hamowania ekspresji genów
DNA hybrydyzuje
z DNA
DNA hybrydyzuje
z RNA
RNA hybrydyzuje
z RNA
U
U
U
U
U
U
U
U
Rybozymy – katalityczne cząsteczki RNA
H- A, C lub U
Oligonukleotydy antysensowe
Wszystkie wyżej wymienione sposoby są jednak
mało wydajne i w znacznym stopniu „sztuczne”,
czyli wymyślone przez człowieka
Zastosowanie jednoniciowego, antysensowego RNA
do hamowania ekspresji genów
1991 – Fire et al. – C. elegans
Dwuniciowe RNA bardziej efektywne aniżeli jednoniciowe...
- Interferencja RNA była przekazywana potomstwu
-Do hamowania ekspresji genów potrzebne było niewiele cząsteczek RNA,
co sugerowało mechanizm katalityczny (amplifikację)
Dwuniciowe RNA hamuje ekspresję genów bardziej
efektywnie niż jednoniciowe
Zarodek
kontrolny
Zarodek
nastrzyknięty
jednoniciowym
antysensowym RNA
Nicień
po podaniu
niespecyficznego
dsRNA
Zarodek
z uwidocznionym
mRNA genu mex-3
Zarodek
nastrzyknięty
dwuniciowym
RNA
Nicień
po podaniu
specyficznego
dsRNA
Dwuniciowe RNA o długości kilkuset nukleotydów
Fire at al., 1998
Nobel 2007 w dziedzinie fizjologii lub medycyny
Andrew Fire
Craig Mello
Patent na interferencję RNA
Genetic inhibition by double-stranded RNA
Abstract
A process is provided of introducing an RNA into a living cell to inhibit gene expression of a target
gene in that cell. The process may be practiced ex vivo or in vivo. The RNA has a region with doublestranded structure. Inhibition is sequence-specific in that the nucleotide sequences of the duplex
region of the RNA and of a portion of the target gene are identical. The present invention is
distinguished from prior art interference in gene expression by antisense or triple-strand methods
Inventors: Fire; Andrew (Baltimore, MD), Kostas; Stephen (Chicago, IL), Montgomery;
Mary (St. Paul, MN), Timmons; Lisa (Lawrence, KS), Xu; SiQun (Ballwin,
MO), Tabara; Hiroaki (Shizuoka, JP), Driver; Samuel E. (Providence, RI),
Mello; Craig C. (Shrewsbury, MA)
Assignee: Carnegie Institute of Washington (Washington, DC)
Appl. No. 09/215,257
Filed: December 18, 1998
This application claims the benefit of U.S. Provisional Appln. No. 60/068,562, filed Dec. 23, 1997.
Interferencja RNA
Specyficzne hamowanie ekspresji genów przez dwuniciowe RNA na
drodze:
1. indukcji specyficznej degradacji komplementarnego
mRNA
2. hamowania translacji
3. modyfikacji chromatyny
Wyjaśnienie mechanizmu działania interferencyjnego RNA
Enzym Dicer tnie dsRNA na krótkie, 21-23 nukleotydowe
fragmenty
Mechanizm działania siRNA
Zastosowanie siRNA u ssaków
Zastosowanie siRNA u ssaków
Wprowadzenie siRNA kodowanego w wektorze
Sposoby dostarczania siRNA do komórek
Chemicznie syntetyzowane siRNA – krótkotrwałe wyłączenie
siRNA kodowane w wektorze – długotrwałe wyłączenie
Ekspresja siRNA wprowadzonego w wektorze
Rózne rodzaje regulatorowych cząsteczek RNA
Figure 12.48 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Celem miRNA jest często niekodujący fragment 3’ mRNA
Figure 12.49 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Biogeneza i mechanizm działania miRNA
Esquela-Kerscher & Slack, Nature Rev Cancer 2006
Interferencja RNA u różnych organizmów
drożdże
rzodkiewnik
Meister & Tuschl, Nature 2004
muszka owocowa
C. elegans/ssaki
Mechanizm działania różnych cząsteczek
interferującego RNA jest podobny
Fizjologiczne znaczenie miRNA
C. elegans – geny lin-4 & let-7 – kodują miRNA
Mutacja w tych genach – zaburzenia w rozwoju C. elegans
Udział w:
programowanej śmierci komórki (apoptoza)
specyfikacji charakteru neuronów
kontroli gromadzenia tłuszczu
zapobieganiu proliferacji genetycznych pasożytów
Transpozony (skaczące geny)
¾ Fragmenty DNA kodujące enzymy umożliwiające transpozycję
(przeniesienie z jednego miejsca genomu do innego miejsca – „skaczące
geny”).
¾ Mogą prowadzić do poziomego przekazywania genów, czyli przenoszenia
się genu z genomu jednego gatunku na inny.
Czerwony kolor
nasion
spowodowany
jest
transpozonami
Funkcje miRNA
Większość zwierząt ma od 100-200 różnych miRNA
(ocenia się, że u ludzi ok.1000 i mogą stanowić 1-4%
wszystkich genów ulegających ekspresji)
Lokalizacja w genomie: większość w obrębie
intronów genów kodujących białka
Ocenia się, że miRNA kontrolują około 30%
ludzkich genów!
Ok. 30% genów miRNA wykazuje homologię między
C. elegans, Drosophila i człowiekiem
miRNA a choroby człowieka
-Zaburzenia w ekspresji miRNA w nowotworach
(rak nerki, piersi, chłoniaki, inne)
-miRNA mogą zarówno odgrywać rolę hamująca jak
i stymulująca powstawnie nowotworów (czyli mogą być
supresorami jak i onkogenami) – „oncomirs”
Rola miRNA w rozwoju nowotworów
Esquela-Kerscher & Slack, Nature Rev Cancer 2006
Zastosowanie interferencji RNA
- odwrotna genetyka (reverse genetics)
Praktycznie wszystkie 19 000 genów C. elegans zostało
wyłączonych za pomoca siRNA !
Terapia genowa
wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków
Gen
terapeutyczny
Białko
lecznicze
Wektor
Pacjent
Ekspresja genu terapeutycznego
Efekt leczniczy
Terapia genowa
Wzmacniająca Substytucyjna
wzmocnienie
ekspresji genów
wprowadzenie
brakującego genu
Nowotwory
Choroby układu krążenia
Hamująca
hamowanie ekspresji
genów
np. Nowotwory
choroby układu krążenia
Choroby dziedziczne
(wrodzone błędy metaboliczne,
mukowiscydoza,
dystrofia mięśniowa )
Terapeutyczne kwasy nukleinowe
DNA
Geny
(Wektory DNA)
RNA
Sekwencje niekodujące
Oligonukleotydy
Antysensowe
Geny
(wektory RNA)
Pułapki
oligonukleotydwe
Sekwencje
niekodujące
rybozymy
siRNA
Rózne sposoby hamowania ekspresji genów
Próby kliniczne terapii z zastosowaniem
siRNA –
w zapobieganiu degeneracji plamki żółtej
DMB
Degeneracja plamki
siRNA przeciw mRNA VEGF
Acuity Pharmaceuticals
Normal Macula
Dry AMD:Drusen
formation under
the Macula
Wet AMD:Macula with
abnormal blood vessels
+ siRNA
siRNA-027 hamuje patologiczną angiogenezę
Kontrola
siRNA-027
Możliwe zastosowania siRNA
- leczenie zakażeń wirusowych (HCV, HIV)
- hamowanie angiogenezy – AMD, łuszczyca,
reumatoidalne zapalenie stawów, nowotwory
- choroby neurodegeneracyjne – pląsawica Huntingtona
- Astma – hamowanie produkcji cytokin prozapalnych
siRNA w terapii
Różnorodny świat RNA
Wnioski
-Zrozumienie mechanizmów ekspresji genów jest
równie ważne jak próby wykorzystania tych zjawisk
-Skuteczne zastosowanie biotechnologii wymaga
dogłębnej wiedzy nt. mechanizmów regulacji ekspresji
genów
-Badania o charakterze bardzo podstawowym stworzyły
mozliwości pracy dla wielu osób
Nobel Prize Award Ceremony
The Nobel Prize Award Ceremony at the
Stockholm Concert Hall, Sweden.
December 10, 4:30 p.m. - 6:00 p.m. (CET).