Labowe „know-how”: ELISA - Dolina Biotechnologiczna

Labowe „know-how”: ELISA
Test immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
jest jedną z najpowszechniejszych metod stosowanych w badaniach
diagnostycznych i naukowych. Jej zadaniem jest wykrycie i oszacowanie
stężenia badanego białka poprzez użycie odpowiednich przeciwciał —
monoklonalnych lub poliklonalnych. Podstawą metody jest tworzenie
kompleksów antygen-przeciwciało, których wykrycie umożliwia sprzężona
reakcja enzymatyczna. Technika została po raz pierwszy opisana przez
Petera Perlmana i Eve Engvall z Uniwersytetu w Sztokholmie w roku 1971
i doczekała się licznych modyfikacji.
Mechanizm działania – krok po kroku
1. Do badania używa się płytek, najczęściej polistyrenowych lub pleksiglasowych
(szkło akrylowe). Każda płyta składa się ze studzienek (dołków), do których
nakładane są próbki antygenu (w testach pośrednich i bezpośrednich) bądź
przeciwciała (w teście kanapkowym i bardziej złożonych wariantach ELISy).
Proces ten nazywany jest opłaszczaniem fazy stałej i jest niezbędny na
początkowym etapie reakcji.
2. Po opłaszczaniu musimy zablokować miejsca niezwiązane z opłaczającym
antygenem/przeciwciałem, a niespecyficznie wiążące białka. W tym celu
stosujemy czynniki blokujące takie jak na przykład roztwór owoalbuminy, kazeina
(odtłuszczone mleko w proszku), albumina (najczęściej BSA) lub żelatyna.
3. Kolejnym etapem jest dodanie specyficznego dla antygenu przeciwciała lub
antygenu (w teście kanapkowym). W tym momencie tworzy się kompleks
immunologiczny.
4. By uniknąć niespecyficznego tła reakcji odpłukujemy pozostałe niezwiązane
przeciwciała/antygeny.
5. W testach wymagających dodania przeciwciał drugorzędowych wykonujemy
kolejną inkubację i odpłukiwanie.
6. Po dodaniu do każdej studzienki odpowiedniego substratu chromogennego
dla enzymu, dochodzi do reakcji enzymatycznej, co charakteryzuje się powstaniem
barwnego produktu. Intensywność koloru jest sczytywana spektrofotometrycznie
przy odpowiedniej długości fali (obecnie stosuje się automatyczne czytniki) i
porównywana z krzywą wzorcową, sporządzaną dla znanych stężeń antygenu.
Znakowanie przeciwciał: do znakowania przeciwciał używa się najczęściej
peroksydazy chrzanowej, rzadziej fosfatazy alkalicznej, oksydazy glukozowej czy
beta-galaktozydazy. Każdy z tych enzymów katalizuje in vitro przekształcenie
substratu w barwny produkt. Enzymy są koniugowane z przeciwciałem i w tej
formie sprzedawane przez producentów. Sprzęganie może być kowalencyjne
(mostki disiarczkowe), poprzez łączniki dekstranowe lub wiązanie streptawidynabiotyna.
Rodzaje testów
• Bezpośredni test ELISA
– jest to bardzo szybka metoda wykrycia obecności antygenu, aczkolwiek droga i
dziś prawie już nie stosowana. Z fazą stałą wiązany jest antygen, natomiast
specyficzne przeciwciało, skoniugowane z enzymem znajduje się w roztworze.
Konieczność koniugowania z enzymem każdego przeciwciała z osobna
spowodowała, że metoda została wyparta przez techniki pośrednie.
• Pośredni test ELISA
-antygen opłaszczający płytkę wykrywany jest przez swoiste, nieznakowane
przeciwciało i tworzy z nim kompleks immunologiczny. W kolejnym etapie do
studzienek dodawane są skoniugowane z enzymem przeciwciała drugorzędowe,
nacelowane na część stałą łańcucha przeciwciała pierwszorzędowego. Jest to
genialne posunięcie, pozwala bowiem na dowolny dobór przeciwciał
drugorzędowych, które są uniwersalne dla organizmu, z którego pochodzą
przeciwciała pierwszorzędowe. Tak więc przeciwciało anty-królicze wykryje każde
przeciwciało królicze, a anty-mysie, każde przeciwciało mysie. Jest to typowy test
ELISA używany w badaniach naukowych oraz w badaniach jakościowych. Metoda
nie grzeszy jednak czułością, dlatego została udoskonalona w postaci testu typu
Sandwich.
• Test kanapkowy (sandwich ELISA)
-służy przede wszystkim do wykrywania i ilościowego oznaczania interesującego
nas antygenu w diagnostyce medycznej. Tym razem w fazie stałej znajduje się
przeciwciało monoklonalne „zerowego rzędu”. Z nim łączy się antygen, a
następnie po jego odpłukaniu używa się przeciwciała pierwszorzędowego — także
monoklonalnego,ale nakierowanego na inny epitop badanego białka. Pozwala to
na maksymalne zwiększenie specyficzności reakcji. Zwiększenie czułości
zapewnia przeciwciało drugorzędowe, sprzężone z enzymem.
Zalety metody
ELISA jest z pewnością jedną z najważniejszych technik immunoenzymatycznych.
Jej zalety to wysoka czułość, duża przepustowość, możliwość półautomatyzacji, a
przede wszystkim wynik ilościowy. ELISA w rutynowej diagnostyce znalazła
zastosowanie głównie w mikrobiologii lekarskiej i diagnostyce weterynaryjnej
(wykrywanie i monitoring leczenia patogenów), immunologii i serologii
(wykrywanie przeciwciał i autoprzeciwciał), toksykologii, onkologii, a także w
przemyśle (typowanie szczepów, wykrywanie zanieczyszczeń grzybowych
produktów spożywczych) i rolnictwie.
Literatura
1. Lequin R (2005), Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA), Clin. Chem. 51 (12): 2415–8. doi:10.1373/clinchem.2005.051532
2. S. Leng, J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel (October
2008). Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in
Inflammation and Aging Research. J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8): 879–84.
PMC 2562869. PMID 18772478.
Paulina Kłos-Wojtczak, Marzena Pieronkiewicz
Data publikacji: 16.04.2015r.