docSekwencjonowanie genomu na każdą kieszeń,Sekwencjonowanie
download 
Reklamacja Transkrypt
Sekwencjonowanie genomu na każdą kieszeń,Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie genomu na każdą kieszeń 3 marca 2016 roku rozpoczęła się nowa epoka. Epoka powszechności analiz całego genomu [1]. Od czasu wprowadzenia na rynek pierwszych technik sekwencjonowania genomowego, jego koszt sukcesywnie malał. Ceny analizy genomu początkowo opiewały na dziesiątki tysięcy dolarów, stopniowo jednak obniżały się do kwot 4cyfrowych (w dolarach amerykańskich). Trzeciego marca bieżącego roku sytuacja uległa jednak zmianie. Firma Veritas Genetics (VG), należąca do założyciela Harvard Medical School, Dr. George’a Church’a zakomunikowała, że po raz pierwszy w historii oferuje analizę całego genomu, test „Veritas myGenome” za cenę 999 dolarów. Firma, o której mowa, jest znana ze swojego wcześniejszego projektu, Personal Genome Project [2], który pozwolił na zbadanie ok. 5000 genomów uczestników w ciągu roku. Był to niejako pilotażowy program, który miał sprawdzić „wydolność” placówki i wypróbować na gruncie komercyjnym, czy dalsze ambitne plany VG mają szansę powodzenia. Co ciekawe, uczestnictwo w projekcie było darmowe, zaś anonimizowane dane genomowe partycypujących osób zostały zdeponowane w domenie publicznej. Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Według zapowiedzi przedsiębiorstwa obecny projekt ma oferować kompletne sekwencjonowanie genomu, włączając pełną analizę bioinformatyczną, raport z podsumowaniem tejże analizy, dostęp do danych przez użytkownika za pośrednictwem przyjaznej w obsłudze aplikacji, bezpieczny dostęp do całości danych w celu późniejszego ich wykorzystania a także szybki dostęp do poradnictwa genetycznego we wiodących jednostkach na terenie USA (Massachusetts General Hospital, Dana Farber Cancer Institute, Boston Children’s Hospital, Mayo Clinic) lub w przyszłości w placówkach partnerskich VG w innych częściach globu, o ile takie partnerstwo zostanie zawiązane. Wykupienie usług Veritas Genetics ma także umożliwić klientowi dostęp do konsultingu genetycznego przez internet. Co już bardziej kontrowersyjne, pacjentowi mają być również przedstawione propozycje dotyczące trybu życia, dostosowane do określonych wariantów genowych, których jest nosicielem. Czy i na ile firma spełni swoje obietnice? Czas pokaże. Według oficjalnego komunikatu, w roku 2016 firma umożliwia wykonanie testu pięciu tysiącom osób, wyłącznie na terenie USA i jedynie na podstawie skierowania z poradni genetycznej. dr n.med. Marzena Wojtaszewska, diagnosta laboratoryjny, biotechnolog Piśmiennictwo: 1. PR NewsWire 2. Personal Genome Project Sekwencjonowanie nowej generacji w diagnostyce medycznej Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing, NGS) szturmem wkroczyło w dziedzinę nauk biomedycznych. Obecnie jakiekolwiek badania podstawowe, dotyczące genetyki i biologii molekularnej trudno opublikować, jeśli nie wykorzystano w nich analiz NGS. Powoli pojawiają się także możliwości wykorzystania tej technologii w rutynowej diagnostyce klinicznej. Gdzie znalazła już ona, albo ma szansę znaleźć w najbliższym czasie, zastosowanie? Jakie są ograniczenia jej stosowania praktyce klinicznej? Ograniczenia i szanse NGS w diagnostyce klinicznej Stosowanymi obecnie narzędziami w rutynowej laboratoryjnej genetyce medycznej są cytogenetyka (klasyczna i FISH) oraz cały wachlarz metod biologii molekularnej, bazujący na amplifikacji pojedynczych fragmentów DNA*. Cały ten warsztat badawczy pozwala albo na mało szczegółową analizę rearanżacji chromosomowych albo szczegółową analizę pojedynczych mutacji/rearanżacji genowych w skali średnio kilkuset par zasad. Większość chorób genetycznych może być spowodowana przez szereg mutacji punktowych, czynnikiem sprawczym niektórych są aberracje chromosomowe na tyle małe, że nie udaje się wykryć ich techniką klasyczną. W onkologii mutacje chorobotwórcze lub predysponujące do zachorowania są rozproszone w wielu różnych obszarach genomu. W mikrobiologii metody molekularne rzadko stosowane są w celach przesiewowych zwykle są jedynie narzędziem pomocniczym z uwagi na możliwość wykrycia niewielu patogenów w pojedynczej reakcji. To tylko niektóre wady testów cytogenetycznych i molekularnych, które nie pozwalają na tak szerokie ich zastosowanie, jakbyśmy sobie tego życzyli. Przezwyciężyć wiele z tych kwestii technicznych może technologia głębokiego sekwencjonowania, która w zależności od zastosowania może zamienić się w wysokorozdzielcze narzędzie analizy cytogenetycznej, technikę molekularną wykrywającą kilkaset lub kilka tysięcy mutacji naraz, czuły test przesiewowy na obecność konkretnych typów drobnoustrojów, czy też potężny panel badań, wykrywający jednocześnie wiele spośród onkogenów złego rokowania [1,2]. Problem z technologią głębokiego sekwencjonowania polega z jednej strony na konieczności zastosowania zupełnie nowego i kosztownego zaplecza aparaturowego (sekwenatory i ich urządzenia peryferyjne, niezwykle wydajny sprzęt komputerowy, software i ogromna pamięć dyskowa) a z drugiej strony wymaga zatrudnienia zupełnie nowego typu fachowców, wyszkolonych bioinformatyków, zajmujących się niełatwą analizą terabajtów danych. Zastosowanie NGS do diagnostyki in vitro musi także spełniać określone normy jakości, gwarantujące określone wartości graniczne parametrów analitycznych [1,2]. Według danych amerykańskich, pod koniec roku 2013 jedynie ok. 50 laboratoriów w całych Stanach Zjednoczonych posiadało możliwość wykonywania testów (certyfikowanych przez FDA) techniką NGS. Obecnie może to już być kilkaset placówek [3]. Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Przyszłość jest teraz Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Illumina na przykład wypuściła gotowe testy przeznaczone na platformę MiSeq Dx, przeznaczone do diagnostyki mutacji warunkujących mukowiscydozę i wrodzone choroby serca. Chińska firma BGI specjalizuje się w produkcji testów przeznaczonych dla diagnostyki związanej z prokreacją – posiada w ofercie testy screeningowe na najczęstsze choroby genetyczne dla przyszłych rodziców czy też testy przesiewowe dla noworodków i niemowląt. Ich flagowym produktem jest zaś test Nifty do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej, który można wykonać także w Polsce. Podobny test, Harmony, oferuje firma Ariosa Diagnostics. Kolejną ważną gałęzią diagnostyki, dla której dostępne są certyfikowane testy NGS, jest oczywiście onkologia. Propozycje Thermo Scientific pozwalają na przykład analizować mutacje w guzach litych, oraz ekspresję kilku newralgicznych onkogenów. Singapurska firma Vela wypuściła testy Sentosa SQ, które umożliwiają detekcję mutacji w komórkach czerniaka złośliwego, raka tarczycy, jelita grubego, raka płuca i białaczek. Inny test dla hematoonkologii, dedykowany dla diagnostyki chłoniaków, posiada w ofercie firma Invivoscribe. Służy on do wykrywania klonalności rearanżacji TCR i IGH. BGI w swojej ofercie posiada natomiast test przesiewowy do detekcji wariantów 21 genów predysponujących do zachorowania na raka jajników i sutka (w tym BRCA1 i 2). I co dalej? Podane przykłady nie wyczerpują długiej listy dostępnych obecnie zestawów diagnostycznych, a ich lista z dnia na dzień rośnie. NGS zyskuje uznanie szczególnie w badaniach mikrobiologicznych (genotypowanie wirusów, m.in. HIV, analizach epidemiologicznych i diagnostyce drobnoustrojów z płynów ustrojowych pacjenta) oraz w badaniach rearanżacji chromosomowych, które były dotychczas domeną cytogenetyków. Na etapie walidacji są testy skriningowe dla wielu jednogenowych chorób rzadkich, związanych zarówno z genomem jądrowym, jak i mitochondrialnym. Na chwilę obecną poważnym ograniczeniem technologii jest stopień skomplikowania analizy bioinformatycznej i wymóg otrzymania odpowiedniej gwarantowanej ilości odczytów dla analizowanych amplikonów, co powoduje, że firmy produkujące zestawy diagnostyczne nie wykorzystują całkowicie potencjału tego narzędzia (np. ograniczając się do panelu kilkudziesięciu wariantów genowych, zamiast umożliwić wykrywanie kilkuset lub kilku tysięcy mutacji) [4]. Prawdopodobnie nie ma takiego badania genetycznego, w którym nie znajdzie zastosowania głębokie sekwencjonowanie. Pytanie brzmi nie „czy”, ale „kiedy” technologia ta upowszechni się w każdej dziedzinie genetyki medycznej. * Bardzo rzadko korzysta się z metod porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) ze względu na wysoki koszt oraz MLPA, za sprawą jej niszowości. Pozwalają one na przezwyciężenie niektórych trudności, o których mowa w tekście Piśmiennictwo: 1. Pant S. et al. Navigating the Rapids: The Development of Regulated NextGeneration Sequencing-Based Clinical Trial Assays and Companion Diagnostics. Front Oncol, 2014; 4: 78. 2. Meldrum C.et al. Next-Generation Sequencing for Cancer Diagnostics: a Practical Perspective Clin Biochem Rev. 2011; 32, 4: 177–195. 3. Hughes MD. Molecular Diagnostics Market Trends and Outlook. IVD MarketReach, 2013. 4. Rizzo JM., Buck MJ. Key Principles and Clinical Applications of “NextGeneration” DNA Sequencing. Cancer Prevention Research, 2012. Nowy biomarker raka piersi Naukowcy z Augusta University donoszą, że analiza mutacji w obrębie genu GT198 ma duży potencjał diagnostyczny w nowotworach piersi oraz może pomóc w ustanowieniu nowego celu terapeutycznego. Przeprowadzono badania na grupie 254 kobiet ze zdiagnozowanym rakiem sutka. Mutacje w obrębie genu GT198 zaobserwowano w przypadku wczesnych stadiów raka piersi oraz jajnika. Naukowcy udowodnili, że gen o zdolnościach naprawczych DNA może z powodu mutacji przyspieszać rozwój raka. Mutacje GT198 odnotowano zarówno we krwi jak i w tkankach guza. Naukowcy wierzą, że mutacja genu indukuje wzrost guza nowotworowego. Mutacje linii zarodkowych w obrębie GT198 są obecne u chorych na raka piersi i jajnika. Mutacje somatyczne GT198 odnotowano już wcześniej w komórkach zrębu guza jajnika. W najnowszym badaniu udowodniono, że komórki zrębu guza piersi również posiadają mutacje somatyczne w obrębie GT198. Użyto produktu genu GT198 jako biomarkera raka piersi. GT198 znany jako TBPIP (ang. TBP-1 interacting protein) jest także koaktywatorem receptorów steroidowych. Jego aktywność jest regulowana przez estrogen. Mutacje w obrębie GT198 mogą wywoływać niekontrolowany wzrost guza nowotworowego bez wsparcia ze strony estrogenu. W tkance gruczołu piersiowego dotkniętej nowotworem naukowcy stwierdzali pojawianie się wielu problemów. Nie byli oni jednak w stanie w pełni wytłumaczyć zmian obserwowanych w obrębie adipocytów, fibroblastów, perycytów (komórki słabo zróżnicowane związane z siecią małych naczyń krwionośnych, mogą być wbudowywane w sieć naczyń w celu ich wzmacniania) czy komórek mioepitelialnych. Najnowsze badania dają podstawy tłumaczące odstępstwa od fizjologii, pokazując że mutacje GT198 bezpośrednio wpływają na komórki macierzyste znajdujące się w naczyniach krwionośnych, które tworzą poszczególne struktury gruczołu sutkowego. Zmutowane białko GT198 powodowało w hodowlach komórkowych aktywację czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. vascular endothelial growth factor, VEGF), co może wpływać na angiogenezę i adipogenezę. To składa w całość obserwowane dotąd zmiany nowotworowe w sutku. Dzięki badaniom wyłania się także nowy cel terapeutyczny w leczeniu raka piersi. Wiemy, że mutacje GT198 wpływają na różne typy komórek zrębu tkanki piersi, ponieważ wszystkie one wywodzą się z komórek progenitorowych. Powstaje związek przyczynowo-skutkowy: zmutowane GT198 doprowadza do pojawienia się nieprawidłowych komórek różnego typu. Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Kolejnym krokiem będzie rozwój terapii celowanych nie tylko w nowotworowo zmienione komórki, ale także w komórki progenitorowe, które z powodu mutacji genowych „zboczyły na złą drogę”. Pozwoli to na zniszczenie komórek odżywiających guz, co powinno być bardziej efektywne niż celowanie w same komórki nowotworowe. ** Autorzy w 2013 roku prowadzili badania nad mutacjami GT198 również w raku jajnika. Już wtedy wskazali oni na możliwość indukcji rozwoju nowotworu z powodu mutacji w genie GT198 . Jednymi z pierwszych znanych genetycznych czynników ryzyka raka piersi i jajnika były BRCA1 oraz BRCA2. Okazuje się, że 4% dziedzicznych raków piersi posiada także mutacje germinalne w obrębie GT198. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Yang Z. et al. GT198 Expression Defines Mutant Tumor Stroma in Human Breast Cancer. A J Path, 18 Mar 2016. Peng M. et al. Inactivating Mutations in GT198 in Familial and Early-Onset Breast and Ovarian Cancers.Genes Cancer, 2013; 4, 1-2: 15–25. Brokuły kontra rak wątroby Regularne spożywanie brokułów obniża ryzyko zachorowania na wiele typów nowotworów na czele z nowotworem piersi, prostaty czy okrężnicy. Najnowsze badania prowadzone na University of Illinois wskazują, że dieta bogata w to warzywo może nas chronić także przed rakiem wątroby. Dieta wysokotłuszczowa, bogata w cukry oraz nieprawidłowy wskaźnik BMI są związane z rozwojem niealkoholowego stłuszczenia wątroby, które nieleczone może prowadzić do marskości czy nowotworów złośliwych wątroby. W związku z intensywnym trybem życia współczesnego społeczeństwa i utrzymywaniem często nieprawidłowych nawyków żywieniowych, wzrost częstości występowania raka wątroby nie wydaje się być abstrakcją. W badaniach nazwano ten styl odżywiania dietą narzuconą przez zachodnią kulturę (ang. Westernized-style diet, WD). Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Wiadomo, że brokuły zawierają wiele związków bioaktywnych, które mogą utrudniać kumulację tłuszczu w wątrobie. Bazując na tej wiedzy naukowcy postanowili sprawdzić wpływ spożywania brokułów na metabolizm lipidów i progresję niealkoholowego stłuszczenia wątroby w raka wątrobowokomórkowego. W badaniu eksperymentalnym podzielono myszy na 4 grupy: kontrolną, myszy mające dietę WD oraz zwierzęta którym podawano lub nie podawano brokułów. Uzyskany rezultat określano po 6 miesiącach diety, biorąc pod uwagę ekspresję genów, stłuszczenie oraz guzy wątroby. U myszy na diecie WD zaobserwowano wzrost liczby i wielkości guzów nowotworowych wątroby. Dodatek brokułów do diety znacząco zmniejszał liczbę guzów, nie wpływając zasadniczo na ich wielkość. Co więcej, u myszy z WD stłuszczenie wątroby stopniowo postępowało w przeciwieństwie do grupy karmionej warzywem. Brokuły wydają się tutaj wykazywać rolę protekcyjną zatrzymując gromadzenie tłuszczu w wątrobie i zwiększając uwalnianie lipidów z narządu. Dodatek brokułów do diety nie wpłynął na masę ciała myszy, ale utrzymał je w lepszej kondycji zdrowotnej: zaobserwowano znacząco niższy poziom trójglicerydów w wątrobie, obniżone stężenie aminotransferazy alaninowej, supresję aktywacji makrofagów CD68+ a także spowolnioną inicjację i progresję neoplazji w narządzie. Naukowcy sugerują, że nie tylko brokuły, ale także inne pokrewne warzywa takie jak kalafior czy brukselka mogą wywoływać podobny efekt. Już we wcześniejszych badaniach udowodniono, że spożywanie brokułów po odpowiedniej obróbce: świeżo pokrojonych lub sporządzonych na parze, jest doskonałym sposobem na utrzymanie zdrowia. brokuły zawierają bowiem sulforafan – naturalny izotiocyjanian o właściwościach przeciwutleniacza. Brokuły wykazują wyjątkowe cechy prozdrowotne. Są niskokaloryczne, mają właściwości przeciwnowotworowe, korzystnie wpływają na funkcjonowanie wzroku, regulują poziom cukru we krwi. Najnowsze badania udowadniają także, że długoterminowe spożywanie tego warzywa wpływa znacząco na stan wątroby. Pomimo faktu, iż wpływ brokułów na organizm ludzki nadal wymaga dogłębnych badań, dotychczasowe wyniki badań eksperymentalnych są obiecujące. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Chen YJ. et al. Dietary Broccoli Lessens Development of Fatty Liver and Liver Cancer in Mice Given Diethylnitrosamine and Fed a Western or Control Diet. Am Soc Nutr, 2016; 146, 3: 542-550. Nowoczesna diagnostyka laboratoryjna raka jajnika W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat zapadalność na nowotwory złośliwe znacznie wzrosła. Wśród kobiet w średnim wieku nowotwory są przyczyną co drugiego zgonu. Rak jajnika jest jednym z nowotworów najczęściej występujących u kobiet, tuż po nowotworach piersi, płuca i jelita grubego, będąc przyczyną 6% zachorowań i 8% zgonów. W Polsce w 2011 roku odnotowano 3527 nowych zachorowań na raka jajnika, podczas gdy dekadę wcześniej zachorowalność wynosiła 3193. Na przestrzeni lat 2001-2011 śmiertelność wzrosła o ponad 18%. Amerykańska agencja National Cancer Institute oraz Centers for Disease Control and Prevention we współpracy z National Center for Health Statistics oceniły, że zapadalność na raka jajnika w Stanach Zjednoczonych w 2014 roku wyniesie 22 tysiące nowych przypadków, natomiast śmiertelność utrzyma się na poziomie ponad 14 tysięcy zgonów. W porównaniu do 1997 roku liczba nowych zachorowań zmniejszy się o 18%, natomiast śmiertelność wzrośnie o 0,5% [1,2,3].Trudna sytuacja epidemiologiczna zmusza do poszukiwania nowych metod wykrywających nowotwór we wczesnym stadium choroby. Aktualnie w skriningu raka jajnika wykorzystuje się zwykle dwa podstawowe badania: USG dopochwowe oraz marker CA125. USG pozwala na wykrycie masy, która może być guzem, ale nie stwierdza czy zmiana jest łagodna czy złośliwa. Ca125 to białko, którego poziom znacznie wzrasta raku jajnika. Marker jest pomocny w monitorowaniu leczenia i progresji nowotworu. Spadek poziomu CA125 świadczy o skuteczności leczenia. Niestety istnieje szereg czynników, niezwiązanych z rakiem jajnika, które mogą podwyższać poziom CA125. Zastosowanie CA125 ogranicza fakt, że rzadko wzrasta on w raku śluzówkowym i jasnokomórkowym oraz w guzach granicznych. Co więcej, jego poziom może być podwyższony w przebiegu innych nowotworów (płuc, wątroby i trzustki) oraz w innych chorobach (mięśniaki macicy, endometrioza, niezłośliwe guzy jajników, marskość wątroby, choroby zapalne w obrębie miednicy). Poziom CA125 u kobiet waha się w przebiegu cyklu miesiączkowego. Wartością graniczną jest 35 U/mL [4,5,6,8,14 ]. Niektóre nowotwory zarodkowe jajników powodują uwalnianie do krwi dużych ilości innych czynników takich jak gonadotropina kosmówkowa (HCG) oraz alfafetoproteina (AFP), stąd można wykorzystać te parametry do monitorowania leczenia [4,7]. Ponieważ oznaczenie poziomu Ca125 nie jest idealnym narzędziem diagnostycznym, naukowcy i klinicyści poszukiwali innych rozwiązań, czego efektem było zarejestrowanie w 2008 roku przez FDA antygenu HE4 jako nowego markera nowotworów jajnika. Pokładano w nim duże nadzieje na poprawę diagnostyki różnicowej oraz skriningowej [5,6]. Czułość HE4 ocenia się na 67%, a specyficzność na 96%. Marker ten ulega zwiększonej ekspresji w nabłonkowych rakach jajnika. Pomimo faktu, że czułość HE4 jest porównywalna do czułości CA 125, stężenie HE4 rzadziej bywa zwiększone u kobiet z chorobami nienowotworowymi i pozostaje stałe u 75% kobiet bez progresji choroby. Wartością graniczną HE4 jest 150 pmol/L. Marker ten może być wykorzystywany w różnych stadiach zaawansowania nowotworu. Jego poziom wzrasta o 25% lub więcej u 60% kobiet z nawrotem raka jajnika lub progresją choroby.Ponieważ niektóre histologiczne rodzaje raka jajnika nie wykazują ekspresji HE4 (nowotwory śluzowe i zarodkowe), oznaczenie poziomu HE4 nie może być stosowane jako bezwzględny dowód na obecność lub brak procesu nowotworowego. Ogranicza to zastosowanie testu w ustalaniu rozpoznania [5,8,14,16]. Dalszy postęp w diagnostyce nowotworów doprowadził do wprowadzenia dwóch nowych testów o dużej przydatności diagnostycznej: testu OVA1 oraz algorytmu ROMA [7]. Algorytm ROMA klasyfikuje kobiety z guzem przydatków do grup ryzyka raka nabłonkowego jajnika. Algorytm jest modelem matematycznym, łączącym oznaczanie HE4 i CA125, z uwzględnieniem statusu menopauzalnego pacjentki. Został on po raz pierwszy zaproponowany w 2009 roku przez Moore i wsp. [17]. Czułość testu jest wysoka i szacuje się ją na 92% u kobiet po menopauzie i 76% przed menopauzą, natomiast swoistość wynosi 75%. Wartości graniczne algorytmu różnią się w zależności od laboratorium oraz stosowanej metody analitycznej. Rozważa się wykorzystanie CA125 i HE4 jako wskaźników odpowiedzi na chemioterapię. Ich zastosowanie w tym zakresie jest ograniczone, niemniej jednak uzupełnienie oznaczeń o markery epigenetyczne, może znacznie zwiększyć czułość i specyficzność badania [6,10,15,16]. Test OVA1 jest nowoczesnym narzędziem diagnostycznym, wprowadzonym w 2009 roku, służącym do wykrywania raka jajnika. Test wykorzystuje fakt, że u chorych na raka jajnika poziom CA125 oraz β2-mikroglobuliny wzrasta, natomiast stężenie apolipoproteiny A1, prealbuminy i transferryny jest niższe, niż u zdrowych kobiet. OVA1 łączy oznaczenie tych 5 parametrów, pozwalając na określenie prawdopodobieństwa rozpoznania złośliwego nowotworu jajnika, zgodnie z uzyskaną liczbą punktów: u kobiet przed menopauzą 5,0 punktów oraz u kobiet po menopauzie 4,4 lub więcej punktów świadczy o wysokim ryzyku. Czułość testu określa się na 96%. Test jest rzadko wykorzystywany w diagnostyce, nie tylko ze względu na wysoką cenę, ale także fakt, że zarówno swoistość jak i powtarzalność wyników nie jest zadowalająca [9,11,16]. Wciąż trwają poszukiwania doskonalszych narzędzi diagnostycznych. W ciągu ostatnich dwóch lat ukazało się wiele badań dotyczących obiecujących kandydatów na markery nowotworowe raka jajnika. Wśród nich należy wymienić osteopontynę (sOPN), wariant 6 sCD44 (sCD44-v6) oraz białko adhezyjne sVCAM-1. Jerman i wsp. proponują określenie ich poziomu w płynie z jamy otrzewnej i płynie z zatoki Douglasa jako markerów wczesnego stadium raka jajnika oraz wskaźników progresji nowotworu [18]. Zespół badawczy Park zwraca uwagę na tioredoksynę 1 jako marker raka jajnika, który może być badaniem uzupełniającym CA125 [19]. Pojawiają się także sugestie wykorzystania markerów znanych i wykorzystywanych w innych nowotworach. Takim przykładem jest określenie stężenia CA19-9 w surowicy jako markera uzupełniającego CA125 w przypadkach wymagających różnicowania zmian łagodnych od złośliwych w obrębie jajników oraz braku wzrostu poziomu CA125 [20]. Li i wsp. sugerują wykorzystanie oznaczenia poziomu HMGB1 (ang. high mobility group box chromosomal protein 1) w surowicy jako markera oceny progresji choroby oraz wykorzystania go w celach prognostycznych [21]. Pojawiło się również wiele doniesień dotyczących wartości prognostycznych markerów molekularnych takich jak ekspresja białka Fli-1 (ang. Friend leukemia integration 1 transcription factor), mRNA APOA1 (ang. mRNA apolipoprotein A1), ROR1 (ang. receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor 1) i wielu innych [22,23,24]. Wiedza na temat immunologii nowotworów doprowadziła do opracowania nowych strategii leczenia. W latach 80. XX wieku klinicyści zainteresowali się rodziną przezbłonowych receptorów czynników wzrostu z własną aktywnością kinazy tyrozynowej. Do nadekspresji receptorów HER/ErbB dochodzi w nowotworach pochodzenia nabłonkowego, co wiąże się ze złym rokowaniem. Wykrywanie nadekspresji HER2/NEU w tkance stało się pomocne w stosowaniu przeciwciała monoklonalnego (znane jako herceptyna – trastuzumab), które blokuje przekazywanie sygnału aktywacji podziałów komórkowych. Pomimo, że większość doniesień związanych z nadekspresją receptorów HER2 dotyczy raka piersi, to amplifikację genu HER2/NEU z towarzyszącą nadekspresją receptorów p185 HER2 obserwowano także w nowotworach nabłonkowych jajnika, zwykle w zaawansowanych stadiach choroby oraz w rakach nisko zróżnicowanych. Ocena stężenia HER2/NEU w płynach torbieli i wysiękach istniejących w rakach jajnika jest dobrym wskaźnikiem biologicznej agresji nowotworu. Nadekspresję HER2 stwierdza się u 18-43 % chorych na raka jajnika. Obecnie ekspresję HER2 określa się rutynowo dzięki zastosowaniu immunohistochemii (IHC) oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Dzięki temu możliwa jest weryfikacja wątpliwych wyników IHC. Przy pomocy metody IHC wykrywa się obecność wewnątrzkomórkowej domeny receptora, natomiast FISH pozwala na bezpośrednią detekcję amplifikacji genu HER2 kodującego białko receptorowe. Nowoczesnymi metodami, alternatywnymi do FISH, jest chromogenna hybrydyzacja in situ (CISH) oraz hybrydyzacja srebrem in situ (SISH). Obie metody to kombinacja cech IHC oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ [25,26]. Odkrycie w latach 90-tych XX wieku genu BRCA1 oraz BRCA2 rzuciło nowe światło na diagnostykę dziedzicznych nowotworów piersi i jajnika. Powyższe geny są zaangażowane we wzrost komórek, ich podział oraz w naprawę uszkodzeń DNA. Pojawienie się mutacji w obrębie genów powoduje brak naprawy uszkodzonego DNA i może prowadzić do rozwoju niektórych typów nowotworów. Mutacje w BRCA1 oraz BRCA2 wiążą się zazwyczaj z nowotworami piersi i jajnika. Niemniej jednak, mogą one pojawiać się także w innych nowotworach. Przykładem są mutacje BRCA2 i ich związek z rakiem prostaty czy rakiem trzustki. Szacuje się, że 39% kobiet z mutacją w obrębie BRCA1 i 11-17% z mutacją BRCA2 zachoruje na raka jajnika, podczas gdy powyższe prawdopodobieństwo u kobiet ogólnej populacji wynosi zaledwie 1,4% [12,13]. Najnowsze badania kliniczne dowodzą, że uszkodzenia epigenetyczne takie jak metylacja DNA są ściśle powiązane z zapoczątkowaniem procesu nowotworowego w obrębie jajników. Hipermetylacja promotora genu BRCA1, RASSF1A, APC, p14ARF, p16INK4A lub DAPK była obserwowana w 41 na 50 przypadków raka jajnika. Określenie miejsc metylacji może pomóc w ukierunkowaniu badań na nowe biomarkery o dużym znaczeniu w prewencji, ocenie ryzyka, szybkim wykrywaniu zmian oraz wartościach prognostycznych [15]. Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Wybiórcze zastosowanie w diagnostyce oznaczania markerów nowotworowych oraz szersze wykorzystanie możliwości biologii molekularnej może przyczynić się do wykrywania złośliwych zmian nowotworowych na wczesnym etapie rozwoju. Pomimo faktu, że diagnostyka i monitorowanie nowotworów jajnika wciąż nie są doskonałe, już w chwili obecnej klinicysta posiada do dyspozycji szereg badań, które analizowane równocześnie mogą skutecznie ukierunkować leczenie. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1.National Cancer Institute. New directions in Ovarian Cancer Research. Report of the strategic planning conference, monograph, Dec 8-9, 1997. 2.Dane Zakładu Epidemiologii i Prewencji Nowotworów Centrum Onkologii – Instytut w Warszawie. 3.Didkowska J et al. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku. Wyd. Studio Mediana, Warszawa 2013. 4.National Cancer Institute. Ovarian epithelial cancer treatment. Access: 24-06-2014. 5.Kulpa JK. i wsp. HE4 i CA125 – porównanie metod oznaczeń. Diagn Lab, 2012; 48: 41-49. 6.Nowak-Markwitz E. Oznaczanie HE4, CA 125 i algorytm ROMA w diagnostyce i różnicowaniu guzów jajnika. LabForum, 2013; 55: 3-5. 7.National Cancer Institute. Genetics of breast and ovarian cancer. Access: 11-07-2014. 8.ARUP Laboratories. Human Epididymis Protein 4 (HE4). For monitoring recurrence of progressive disease in women with epithelial ovarian cancer. Salt Lake City, 2014. 9.Li AJ. Nowe markery biologiczne w raku jajnika. Przydatność OVA1 i ROMA w ustaleniu rozpoznania. Ginekologia po dyplomie, 2012; 7: 14-19. 10.Woźniak S. i wsp. Guz jajnika u kobiety w późnym wieku rozrodczym – jak ocenić ryzyko onkologiczne.Przegl Menopauzalny, 2013; 1: 78-82 . 11.Toss A. et al. Ovarian cancer: Can proteomics give new insights for therapy and diagnosis? Int J Mol Sci, 2013; 14: 8271-8290. 12.National Cancer Insitute. BRCA1 and BRCA2: Cancer Risk and Genetic Testing. Access: 22-01-2014. 13.Petrucelli N. et al. BRCA1 and BRCA2 Hereditary Breast and Ovarian Cancer [In:] Gene Reviews, ed. Pagon RA. et al. University of Washington, Seattle, 1993-2014. 14.Zhen S. et al. Comparison of serum human epididymis protein 4 and carbohydrate antigen 125 as markers in ovarian cancer: A meta-analysis. Mol Clin Oncol, 2014; 2, 4: 559-566. 15.Koukoura O. et al. DNA methylation profiles in ovarian cancer: Implication in diagnosis and therapy. Mol Med Rep, 2014; 10, 1: 3-9. 16.Menon U. et al. Ovarian cancer screening—Current status, future directions. Gynecol Oncol, 2014; 132, 2: 490-195. 17.Moore RG. et al. A novel multiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction of ovarian cancer in patients with a pelvic mass. Gynecol Oncol, 2009; 12, 1: 40-46. 18.Jerman KG. et al. Control values of ovarian cancer tumor markers and standardisation of a protocol for sampling peritoneal fluid and performing washing during laparoscopy. World J Surg Oncol, 2012; 12: 278. 19.Park BJ. Et al. Thioredoxin 1 as a serum marker for ovarian cancer and its use in combination with CA125 for improving the sensitivity of ovarian cancer diagnoses. Biomarkers, 1 Sep 2014: 1-7. 20.Cho HY., Kyung MS. Serum CA19-9 as a predictor of malignancy in primary ovarian mucinous tumors: a matched case-control study. Med Sci Monit, 2014; 20: 1334-1339. 21.Li Y. et al. Serum high mobility group box protein 1 as a clinical marker for ovarian cancer. Neoplasma, 2014;61,5: 579-584. 22.Song W. et al. Oncogenic Fli-1 is a potential prognostic marker for the progression of epithelial ovarian cancer. BMC Cancer, 2014, 14: 424. 23.Tuft Stavnes H et al. APOA1 mRNA expression in ovarian serous carcinoma effusions is a marker of longer survival. Am J Clin Pathol, 2014; 142, 1: 51-57. 24.Zhang H. et al. ROR1 expression correlated with poor clinical outcome in human ovarian cancer. Sci Rep, 2014; 4:5811. 25.Sedlaczek P., Sobańska E., Gryboś M. i wsp. Ocena zależności między ekspresją HER2/NEU (C−ERBB−2) w tkance a stężeniem w surowicy i płynach nowotworowych u chorych na raka jajnika. Adv Clin Exp Med 2005; 14, 4: 663–669. 26. English DP., Roque DM., Santin AD. HER2 Expression Beyond Breast Cancer: Therapeutic Implications for Gynecologic Malignancies. Mol Diagn Ther, PMC 1 Apr 2014. Wczesny biomarker Alzheimera Naukowcy z Ludwig Maximilians Universitaet (LMU) w Monachium zidentyfikowali biomarker powiązany z aktywacją odpowiedzi immunologicznej na uszkodzenie nerwowe obserwowane podczas wczesnych stadiów choroby Alzheimera. Alzheimer to postępująca choroba neurodegeneracyjna wynikająca z akumulacji toksycznych dla neuronów depozytów białkowych w mózgu. Istnieje kilka hipotez powstawania choroby. Jedną z nich jest hipoteza amyloidowa głosząca, że najważniejszą rolę w jej patogenezie odgrywają depozyty β-amyloidu. Nierozpuszczalne agregaty zaczynają się formować wiele lat przed ujawnieniem jakichkolwiek objawów demencji. Najnowsze doniesienia sugerują, że stężenie białka sTREM2 w płynie mózgowordzeniowym wzrasta znacząco we wczesnych stadiach choroby Alzheimera, co łączy to białko z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Naukowcy wskazują TREM2 jako białko o wysoce istotnej roli w progresji choroby, przypuszczając, że może ono mieć duże znaczenie także w innych rodzajach demencji. Jest ono bowiem zaangażowane w mechanizm obronny, który eliminuje uszkodzone neurony i toksyczne depozyty białkowe jakie tworzy βamyloid. TREM2 jest receptorem powierzchniowym kluczowym dla funkcji fagocytów ośrodkowego układu nerwowego (mikroglej). Komórki mikrogleju rozpoznają i niszczą uszkodzone i toksyczne elementy m.in. poprzez wzrost poziomu czynników o funkcji immunologicznej. TREM2 uwalniane jest do przestrzeni zewnątrzkomórkowej w postaci rozpuszczalnej (sTREM2), której poziom może być mierzony w płynie mózgowo-rdzeniowym. Już wcześniej naukowcy udowodnili, że mutacje utraty funkcji w obrębie TREM2 zmniejszają zdolność mikrogleju do usuwania agregatów amyloidu i uszkodzonych fragmentów tkanek. Przebadali oni 400 pacjentów chorych na Alzheimera. Dzięki wnikliwej analizie biochemicznej odkryto, że osoby z łagodnym deficytem funkcji poznawczych miały wyższe stężenie poszczególnych fragmentów TREM2 niż osoby w zaawansowanym stadium choroby. Obecnie nie wiadomo czy wahania stężenia białka to przyczyna czy konsekwencja progresji schorzenia. Najnowsze badania wskazują, że zmiany poziomu sTREM2 znakomicie odzwierciedlają rozwój wczesnego stadium choroby Alzheimera, co lokuje białko na pozycji interesującej z terapeutycznego punktu widzenia. Co więcej, wzrastające stężenie sTREM2 w płynie mózgowo-rdzeniowym wykazuje związek z innymi markerami neurodegeneracyjnymi (stężenie całkowite białka tau i jego fosforylowana postać fosfo-tau181P) Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Naukowcy z LMU planują rozpoczęcie długofalowych badań klinicznych, w których określą stężenie TREM2 w płynie mózgowo-rdzeniowym chorych z mutacjami o udowodnionym związku z chorobą Alzheimera. sTREM2 jako nowy biomarker choroby mógłby posłużyć jako czynnik monitorujący wydajność odpowiedzi przeciwzapalnej w leczeniu Alzheimera oraz pomóc we wczesnym rozpoczęciu zwalczania lub kontrolowania schorzenia. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Suárez‐Calvet M. et al. sTREM2 cerebrospinal fluid levels are a potential biomarker for microglia activity in early‐stage Alzheimer’s disease and associate with neuronal injury markers. EMBO Molecular Medicine, 3 Mar 2016. Cytometria przepływowa w pigułce Technika cytometrii przepływowej jest obecnie szeroko stosowana zarówno w badaniach podstawowych, jak i diagnostyce medycznej. Na czym polega ta metoda i jak posługiwać się nią w praktyce? 1. Zasada działania Rozłóżmy termin „cytometria przepływowa” na czynniki pierwsze. Nazwa techniki oznacza „pomiary [metria] komórek [cyto] podczas ich przepływu [przepływowa]” . Takie tłumaczenie w zasadzie zastępuje definicję, chociaż oczywiście nie wyczerpuje tematu. Jak dokonywany jest pomiar parametrów komórek i jak osiągane jest to podczas przepływu cieczy? Istotą metody jest ułożenie komórek do pomiaru pojedynczo, w rządku, a następnie dokonanie ich pomiaru przez odpowiednio skierowane światło lasera – czasami cytometrię nazywa się także „cytofluorymetrią”, ponieważ część pomiarów opartych jest na detekcji fluorescencji. https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio 2. Budowa cytometru Cytometr przepływowy złożony jest z: -komory, przez którą przepływają kolejno komórki, -plątaniny rurek z buforem płuczącym, który wymusza laminarny przepływ -lasera, którego wiązka światła rozprasza się na każdej z komórek i/lub wzbudza fluorescencję znaczników związanych z komórkami -rejestratorów wiązki światła, które przetwarzają sygnał na cyfrowy -układu optycznego, złożonego z zestawu filtrów i pryzmatów, które skupiają światło by umożliwić jego odczyt -sprzężonego z aparaturą komputera, który dokonuje interpretacji i obróbki danych. Centralną część cytometru przepływowego zajmuje komora, w której próbka, zawierająca heterogenną grupę komórek, jest poddana laminarnemu przepływowi roztworu płuczącego. Liniowy przepływ jest niezbędny, by komórki pojedynczo trafiały w okienko pomiarowe, gdzie pada na nie światło lasera – każdy pomiar sygnału powinien dotyczyć pojedynczej komórki. W jaki sposób komórki układają się po kolei w rządku niczym w komitecie kolejkowym? Taki efekt udało się otrzymać poprzez zastosowanie kilku strumieni roztworu NaCl o różnej prędkości, malejącej od zewnątrz do środka wiązki cieczy. Taki prąd laminarny wymusza na komórkach wejście w sam środek strumienia i rozcieńcza je odpowiednio. Generatorem światła o odpowiednio wysokiej energii jest laser, którego precyzyjna wiązka pada na komórkę. Światło odbite i rozproszone przez błonę komórkową i organelle pada na detektory pod innym kątem, pozwalając na prosty pomiar wielkości i ziarnistości komórki. Bardziej złożony pomiar fluorescencji wymaga zastosowania zestawu blend i pryzmatów, które kierują światło o odpowiedniej energii fali na detektor. Analizator sygnału przetwarza natężenie światła na odpowiedni sygnał cyfrowy, który jest interpretowany komputerowo. 2. Forward i Side Scatter Jak odbywa się pomiar światła i w jaki sposób przekłada się on na oszacowanie wielkości i struktury komórek? Otóż jeden z detektorów cytometru ustawiony jest na przeciwko wiązki światła padającej na komórkę, zbierając światło, które zostanie ugięte na brzegach komórki. Intensywność i kąt padania tej wiązki na czytnik zależy od wielkości komórki- im jest ona większa, tym mocniej ugina światło (rycina 1). Drugi z detektorów umieszczony jest prostopadle do wiązki światła padającej na komórkę. Część światła lasera załamuje się w różnych kierunkach po przejściu przez gęste obszary komórki, takie jak ziarnistości i organelle komórkowe. Im bardziej skomplikowana struktura wewnętrzna komórki, tym silniej światło jest załamywane i więcej go trafia na detektor boczny. Odczyt światła z detektora przedniego nazywany jest z angielska „forward scatter” (FSC), zaś odczyt z detektora bocznego „side scatter” (SSC). (rycina 1) Rycina 1: Odczyt sygnału fluorescencyjnego w komorze cytometru polega na detekcji ilości światła odbitego i załamanego przez detektory znajdujące się z boku oraz naprzeciw wiązki lasera. W przypadku dużej, ziarnistej komórki takiej jak neutrofil, znaczna ilość światła zostanie skierowana na oba detektory, co na wykresie scatterplot zostanie przestawione jako sygnał w górnej prawej ćwiartce. 3. Pomiar fluorescencji Oprócz tych dwóch form odczytu cytometr potrafi przeprowadzić także odczyt fluorescencji. Próbka, która została wcześniej wyznakowana odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z barwnikami jest identyfikowana przez czytnik boczny z zastosowaniem filtrów, przepuszczających tylko fale świetlne odpowiedniej barwy. Światło lasera pada na komórkę, która na powierzchni zawiera dany antygen ze związanym przeciwciałem i fluorochromem. Fluorochrom jest wzbudzany przez energię lasera i dochodzi do emisji fluorescencji we wszystkich kierunkach. Część energii fali świetlnej przechodzi przez filtr do detektora bocznego i zostaje zinterpretowana jako emisja fluorescencji. (rycina 2) Rycina 2: Pomiar fluorescencji w komorze cytometru. Grafika została stworzona przez firmę Coulter Corporation, Miami, USA. Pobrano z http://www.biotech.univ.gda.pl/odl/modern/fcm.html 4. Opis subpopulacji komórkowych i immunofenotypowanie Prawidłowe zastosowanie parametrów FSC, SSC i jednoczesne wykorzystanie kombinacji różnych barwniwków pozwala na wielowymiarową interpretację danych i kompleksowy opis subpopulacji komórek. Cytofluorymetria znalazła zastosowanie głównie w diagnostyce hematoonkologicznej jako uzupełnienie metod patomorfologicznych, jej zastosowań jest jednak o wiele więcej. Spróbujmy prześledzić, w jaki sposób możemy wyodrębnić subpopulację cytotoksycznychi regulatorowych limfocytów T spośród komórek z próbki krwi. 1. Przygotowujemy próbkę, dokonując osmotycznej lizy erytrocytów. 2. Znakujemy próbkę odpowiednim zestawem znakowanych przeciwciał. Będą nam potrzebne przeciwciała pozwalające wyróżnić całą pulę dojrzałych limfocytów (anty-CD3) oraz przeciwciała nacelowane na antygeny limfocytów cytotoksycznych (anty-CD8) i pomocniczych (anty-CD4). 3. Rozpoczynamy analizę. Na wykresie scatterplot zaznaczamy tę część populacji komórek, która odpowiada limfocytom, czyli małe i ubogoziarniste komórki 4. Wśród zaznaczonych komórek musimy wytypować populację CD3-dodatnią. Na histogramie zaznaczamy tylko komórki o wysokiej intensywności sygnału CD3+ 5. Następnie wykonujemy wykres 2D, na którym na jednej odkładamy fluorescencję barwnika dla CD4+, na drugiej dla barwnika CD8+. W próbce krwi osoby zdrowej powinniśmy otrzymać dwie wyraźne populacje – przeważająca większość komórek plasuje się w ćwiartce CD4+,CD8-, mniejszość w ćwiartce CD8+,CD4-. 6. U osób z chorobami autoimmunologicznymi, wrodzonymi zespołami niedoboru odporności, białaczkami i chłoniakami z linii T oraz zakażonych wirusem HIV stosunki ilościowe pomiędzy populacjami limfocytów mogą zostać zaburzone lub odwrócone. Całą opisaną powyżej procedurę wraz z ilustracjami można prześledzić na stronie http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player. html 5. Sortowanie komórek W ostatnich latach cytometria coraz bardziej zyskuje na znaczeniu ze względu nie tyle na samą umiejętność identyfikacji komórek, co na funkcję ich sortowania. Potęga tego narzędzia jest obecnie wykorzystywana w wielu wysokospecjalistycznych procedurach medycznych – m.in. w allotransplantacji macierzystych komórek krwiotwórczych, immunodeplecji (czyli usuwaniu) poszczegółnych linii komórkowych z materiału klinicznego czy też wzbogacaniu materiału do diagnostyki molekularnej w komórki wykazujące ekspresję pewnych antygenów. Co ciekawe, sortowanie komórek doskonale sprawdza się także w… hodowli zwierząt. W hodowli krów mlecznych nie jest potrzeba „produkcja” 50% byków. Ze względu na różnice w intensywności znakowania heterochromosomu X i Y stało się możliwe wzbogacanie spermy zwierząt w komórki żeńskie. Sortowanie odbywa się w przystosowanych do tego cytometrach z przystawką sortującą (FACS, fluorescence activated cell sorting). Modyfikacja metody polega na rozbiciu w momencie odczytu sygnału wiązki laminarnego przepływu cieczy na małe kropelki, zawierające pojedyncze komórki. Kropelki są natychmiast obdarzane ładunkiem w zależności od tego, czy wykazują odpowiednią fluorescencję czy nie. Spadając, krople trafiają w pole eletrostatyczne i ich trajektoria jest uginana w zależności od posiadanego ładunku. W konsekwencji krople obdarzone różnym ładunkiem trafiają do zbiorników gromadzących poszczególne subpopulacje. *Uwaga: w opracowaniu pominięto kwestię kompensacji sygnału fluorescencyjnego – w praktyce przed analizą fluorescencji należy przeprowadzić wyrównywanie różnic w emisji światła i korekcję tła różnych barwników przed wykonaniem analizy. Zainteresowanym polecam doskonałe opracowanie dotyczące tematu kompensacji. https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio Przewidywanie procesu starzenia Naukowcy z University of Georgia wykazali istnienie nowego sposobu genetycznej regulacji starzenia się, w którą zaangażowany jest czynnik wzrostu i różnicowania 11 (ang. growth differentiation factor 11, GDF 11). Już we wcześniejszych badaniach udowodniono, że poziom GDF 11 obniża się wraz z upływem czasu, a przywrócenie jego wcześniejszego poziomu odwraca proces starzenia w układzie sercowonaczyniowym u myszy oraz prowadzi do odmłodzenia mięśni i mózgu. Najnowsze badania potwierdziły związek obniżenia stężenia GDF 11 we krwi z przerostem mięśnia sercowego i wskazały na wiek średni jako czas największego spadku czynnika. GDF 11 może posłużyć jako nowy czynnik predykcyjny średniej długości życia ssaków. Badaniom poddano myszy dwóch szczepów wsobnych: C57BL/6J (B6) oraz BALB/cByJ (BALB). Myszy B6 żyły dłużej i miały znacznie wyższy poziom GDF 11 w porównaniu do myszy BALB. Dodatkowo przebadano 22 różne genetycznie szczepy wsobne myszy porównując poziom czynnika wzrostu i różnicowania 11 z długością przeżycia osobników. Eksperyment potwierdził wcześniejssze wyniki, ujawniając znaczny spadek GDF 11 w wieku średnim. Ustalono, że 74,52% różnic w poziomie badanego czynnika miało podłoże genetyczne. Jak dotąd wiedza na temat kontroli GDF 11 była niewielka. Nie poznano także skutków naturalnej różnorodności genetycznej GDF 11. Dzięki mapowaniu genowemu zespół zidentyfikował 7 genów – kandydatów, które mogą określać poziom GDF 11 we krwi. Ponadto po raz pierwszy wskazano na dziedziczność wysokiego poziomu GDF 11. Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Poczyniono kolejny krok, aby odpowiedzieć na pytanie dlaczego się starzejemy i jakie mechanizmy kryją się za tym procesem. Jest to z pewnością ważny kawałek układanki genetyki starzenia się. Kolejne badania kierują się ku ustaleniu dlaczego poziom czynnika wzrostu i różnicowania 11 spada wraz z wiekiem i czy można tą wiedzę wykorzystać w zapobieganiu różnym chorobom. *** GDF 11 jest członkiem nadrodziny białek transformującego czynnika wzrostu β (ang. transforming growth factor β, TGF-β), do której należą także aktywina, inhibina, inne białka morfogenetyczne kości czy AMH. GDF 11 znany jest także jako białko morfogenetyczne kości 11 (ang. bone morphogenetic protein 11, BMP-11). Czynnik ten działa jak cytokina. W roku 2014 został on ogłoszony „czynnikiem anty-starzeniowym”, niemniej jednak jego związek z procesem starzenia pozostawał wciąż niejasny [2,3]. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1. Zhou Y. et al. Circulating Concentrations of Growth Differentiation Factor 11 Are Heritable and Correlate With Life Span. J Gerontol A Biol Sci Med Sc., 16 Jan 2016. 2. Sinha M. et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science, 2014; 344, 6184: 649–652. 3. Katsimpardi L. et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science, 2014; 344, 6184: 630–634. VOMs nowym markerem nieswoistych zapaleń jelit Etiologia nieswoistych zapaleń jelit jest nieznana. Sugeruje się, że ważną rolę w patogenezie tej grupy chorób odgrywa dysbioza przewodu pokarmowego. To zjawisko może wpływać na zmiany składu i proporcji lotnych organicznych metabolitów kałowych (VOMs). Ostatnio nastąpił wzrost zainteresowania nieinwazyjnymi biomarkerami, które mogą być przydatne w ocenie aktywności chorób jelit i ich różnicowaniu. Bada się metabolity w kale, moczu, krwi oraz błonach śluzowych pacjentów i próbuje wykazać ich przydatność jako parametrów w nowej, nieinwazyjnej diagnostyce i monitorowaniu osób z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i chorobą Leśniewskiego- Crohna. VOMs to sybstancje chemiczne, które powstają w trakcie przemiany materii. W ich skład wchodzą m.in.: estry, ketony, aldehydy, kwasy, alkohole i alkany. Za pomocą chromatografii gazowej, a następnie spektrometrii mas, opracowano profile VOMs, które umożliwiają zrozumienie zmian w ludzkich reakcjach metabolicznych w stanach fizjologii i patologii. Istnieje coraz więcej dowodów, że zmiany składu VOMs w kale odzwierciedlają zaburzenia gastroenterologiczne i mogą dostarczyć informacji diagnostycznych o stanie jelit. Różnice w występowaniu w kale kwasów organicznych, alkoholi i estrów są powiązane ze zmianami trawienia i wchłaniania produktów dietetycznych, ale również mogą być spowodowane zmienionym składem jelitowej flory bakteryjnej, z uwagi na jej rolę w procesie fermentacji. Dysbioza w układzie pokarmowym wpływa na profil VOMs. Badania wskazały na zmiany występowania estrów w kale, a w szczególności zmniejszenie ilości estrów metylowych u pacjentów z aktywną chorobą Crohna i wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego w porównaniu z grupą osób zdrowych. Ponadto ujawniono różnice we wzorze VOMs na różnych etapach obu schorzeń. Ilości alkanów, zwłaszcza pentanu, butanu, etanu i propanu okazały się być podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną. Dodatkowo analizując metabolity w moczu stwierdzono, że pochodne aminokwasów i kwasów trikarboksylowych mogą pomóc rozróżnić pacjentów z chorobami zapalnymi jelit od osób zdrowych. Pierwsza tak tania analiza całego genomu w historii Źródło: Wikimedia Commons, Autor: Alena Kopytova, Licencja: CC-BY-SA-4.0 Wszystkie te badania otworzyły obiecującą dyskusję na temat klinicznego znaczenia metabolitów w diagnostyce i monitorowaniu zapaleń jelit. Podkreśla się rolę mikrobiomu jelitowego, a w szczególności grzybów, w patogenezie choroby Leśniewskiego-Crohna i wrzodziejącego zapalenia jelia grubego. Dalsze zrozumienie VOMs może prowadzić do opracowania szybkich i prostych testów diagnostycznych. Piśmiennictwo: Ahmed I et al.: Investigation of faecal volatile organic metabolites as novel diagnostic biomarkers in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther, 2016; 43: 596-611. CE IVD bez tajemnic Czym jest, na czym bazuje i po co w ogóle to wprowadzono? Niniejszy artykuł dotyczy dyrektywy 98/79/EC i jej konsekwencji laboratoryjnych oraz prawno-ekonomicznych. Idea polityki jakości jest już dość leciwa, wymyślono ją dla celów wielkoskalowego przemysłu, bo takiego przemysłu nie stać na „brak jakości”. Czym w ogóle jest jakość? Jakość definiowana po konsumencku to przecież nie to samo, co jakość zawarta w procedurach i normach. Tak definiowana jakość oznacza wysoką powtarzalność parametrów produktów danego typu wykonanych w zgodzie z normą, a także bezpieczeństwo wytwórcy w procesie produkcyjnym i bezpieczeństwo odbiorcy podczas użytkowania. Taka definicja jakości wcale nie daje gwarancji, że produkt na przykład będzie stworzony z wysokiej jakości bawełny. Dlatego sceptycznie podchodzimy do znaczków CE na opakowaniach, które jednak są potrzebne, bo gwarantują bezpieczeństwo użytkowania i humanitarne warunki pracy wytwórców. Jednak skupmy się na diagnostyce in vitro: co ją odróżnia od reszty rynku konsumenckiego? Mamy wytwórcę, mamy użytkownika — diagnostę. Mamy jednak kogoś jeszcze. Pacjenta, który jest faktycznym beneficjentem i odbiorcą testu diagnostycznego, mimo że dzieje się to poza jego świadomością tego faktu. Po to właśnie, by chronić także chorego, którego przecież nie stać na pomyłki producenta testu (płaciłby swoim zdrowiem!) powstała dyrektywa UE „o medycznych przyrządach* do diagnostyki in vitro” (98/79/EC). Dlatego certyfikat jakości CE nie wystarcza jako gwarancja odpowiedniej jakości w diagnostyce medycznej. 98/79/EC… Cóż to za dokument i czego dotyczy? Jest to zestaw bardzo ogólnikowych norm, jakie muszą spełniać odczynniki i urządzenia używane w laboratoriach diagnostycznych. Jako „medyczne przyrządy* diagnostyczne” rozumie się wg dyrektywy nie tylko urządzenia, ale także systemy przechowywania próbek, odczynniki diagnostyczne oraz software do analizy danych. Wszelka aparatura i chemia, która ma styczność z próbką na którymkolwiek etapie analizy jest zatem traktowana jako medyczny przyrząd diagnostyczny i podlega tym wytycznym. Dyrektywa IVD mówi między innymi, że do diagnostyki in vitromoże by stosowany sprzęt/odczynnik który spełnia kryteria dla normy CE (działającej w oparciu o dokument EN ISO 9001) i dodatkowe kryteria, zawarte w aneksach (I- X). Ponadto pewne odrębne kryteria, inne niż dla odczynników używanych w laboratoriach, muszą spełnić urządzenia do samokontroli u pacjentów — glukometry, paski testowe itp. Z punktu widzenia laboratoriów najważniejszy jest załącznik 2. Zawarta jest w nim klasyfikacja badań o podwyższonym poziomie wymaganych norm jakości ze względu na istotność tych badań w kontekście zdrowia i życia pacjenta i personelu. W aneksie A mamy badania serologiczne grup krwi: systemu ABO, Rh (C, c, D, E, e) Kell, oraz badania wirusologiczne HIV, HTLV oraz badania wirusów wątrobowych. W aneksie B figurują grupy krwi Duffy i Kidd, przeciwciała przeciwkrwinkowe, typowanie tkankowe HLA (serologia), detekcja toksoplazmozy i różyczki, wirusa cytomegalii i chlamydiozy (mikrobiologia, wirusologia), testy na fenyloketonurię, oznaczenie trisomii 21 (genetyczne zaburzenia wrodzone), oznaczenia markeru nowotworowego PSA oraz glukozy we krwi. Oznacza to, że oprócz obowiązkowych wymagań z aneksu I i wymogu posiadania certyfikatu CE dla tych oznaczeń wymagane jest spełnienie kryteriów załączników IV-VIII, potwierdzone certyfikatami zgodności z drugą normą, DIN EN ISO 13485 i (najlepiej) oświadczeniem producenta że produkt może by stosowany w diagnostyce in vitro. Dla diagnostów ważne jest, co rozumie się przez stosowanie się do wytycznych dla oznaczeń z aneksów A i B: — testy używane w diagnostyce MUSZĄ być certyfikowane CE IVD — wszystkie urządzenia służące do wykonania oznaczeń, a wiec zarówno systemy do pobierania próbek, jak i pipety, plastiki laboratoryjne i inne urządzenia muszą spełniać takowe wymagania. O tym wiele laboratoriów zapomina. Zapomina się także o tym, że zestaw może być certyfikowany np. tylko dla krwi, bo firmie nie chciało się certyfikować zestawu dla innych typów materiału (to są koszty a firmy lubią je ciąć!), a my oznaczamy tym zestawem parametry np. w PMR. To błąd który nie powinien mieć miejsca. Za to powinno się karać i to surowo (a w Polsce jest z tym różnie). Dlaczego nie wszystkie laboratoria stosują się do wytycznych aneksów A i B? Bo jakość kosztuje. Zestawy z IVD są droższe, a konkurencyjność wymaga obniżania cen. Często kadra jest też nieprzeszkolona i żyje w błogiej niewiedzy. Niestety nieznajomość prawa nie jest usprawiedliwieniem. A dlaczego producenci znanych, rewelacyjnych marek sprzętu i odczynników na przykład do biologii molekularnej często uwzględniają adnotacje „for research use only”, mimo że ich odczynnikom można ufać bardziej niż KITom z IVD mało znanych firm? Ma to 2 przyczyny. Po pierwsze certyfikat podraża odczynnik, a adresatami odczynników do badań molekularnych są głównie jednostki naukowe, którym IVD nie jest absolutnie do niczego potrzebne. Po drugie zaś, firmy nie chcą brać na siebie odpowiedzialności prawnej. Wolą swoje enzymy sprzedać podwykonawcy, który produkuje KITy i sam stara się o certyfikację, sam też ponosi odpowiedzialność prawną w razie zaistnienia niezgodności. Tak więc np. bardzo znane polimerazy i odwrotne transkryptazy nie posiadają certyfikacji IVD, ale wchodzą w skład zestawów z IVD. Czyż to nie ironiczne? Tak jednak działa prawo, do którego, chcąc nie chcąc, powinniśmy się stosować. Oczywiście brak certyfikatu IVD przy wykazanym przez producenta fakcie, że produkt spełnia normę CE i kryteria załącznika I (obligatoryjne) wystarcza, by taki sprzęt znalazł się w laboratorium, w którym nie wykonuje się analiz z aneksu II. A więc przyrządy z oznaczeniem zgodności np. z EN ISO 13485 mogą być automatycznie traktowane jako mogące uczestniczyć w procesie diagnostycznym. Oczywiście jeśli podlegają przeglądom technicznym i są sprawne. * Uwaga: Używam określenia „przyrząd”, by nie mylił się on z terminem „urządzenie” używanym w polskich dokumentach-córkach. Kojarzy się on bowiem jednoznacznie z aparaturą mechaniczną, a nie chciałam wprowadzać zamętu podczas objaśnień. Piśmiennictwo: Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices.
