Mitochondrialne tRNA w chorobach nowotworowych

Mitochondrialne tRNA w chorobach nowotworowych

Mitochondrialne
tRNA
chorobach nowotworowych
w
Mitochondria jako autonomiczne organella występujące w komórkach
eukariotycznych są bardzo interesującym obiektem badań. Pierwsze prace,
w których pokazano, że zaburzenia pracy mitochondriów mogą być
podstawą do występowania różnych chorób, opublikowano w latach 60. Od
tego czasu ukazało się wiele publikacji wskazujących na korelację między
mutacjami w mitochondrialnym DNA a występowaniem chorób
mitochondrialnych. Jednak mitochondria i występujące w nich mutacje
można wiązać nie tylko z chorobami mitochondrialnymi. Publikowane są
doniesienia prezentujące pojawianie się mutacji w mitochondrialnym DNA
w powiązaniu z występowaniem chorób nowotworowych. Jednym z takich
przypadków są mutacje punktowe występujące w genach
mitochondrialnych tRNA.
Mitochondria ze względu na swoją budowę, funkcje i pochodzenie są dość
szczególną częścią komórki. To miejsce, gdzie w wyniku procesu oddychania
komórkowego powstaje adenozynotrifosforan (ATP), będący źródłem energii dla
komórki. Są szczególne również ze względu na swoją autonomię, która wynika z
posiadania własnego genomu z niezależnym mechanizmem transkrypcji i
translacji. Poza mitochondriami podobną autonomią cieszą się występujące u
roślin chloroplasty. Jak już wspomniano mitochondria posiadają własny genom.
Występuje w nich DNA, w postaci kolistej cząsteczki, w którym zapisany jest
genom mitochondrialny. U ludzi genom ten składa się z 16569 par zasad (tzw.
sekwencja Cambridge , ang. the Cambridge reference sequence – CRS). Można w
nim wyróżnić geny kodujące trzynaście białek niezbędnych do przetwarzania
energii (cytochrom c, ATPaza 6, cytochrom b), geny podjednostek 12S i 16S rRNA
i dwudziestu dwóch cząsteczek tRNA niezbędnych do syntezy wspomnianych już
białek [1, 2]. Mitochondrialne tRNA można podzielić na dwie grupy, związane z
umiejscowieniem genów odpowiedzialnych za sekwencje mt tRNA na niciach mt
DNA: ciężką (heavy) i lekką (light). Pierwszą z tych grup tworzy osiem
mitochodrialnych tRNA (Heavy (nić light): tRNA(Pro) (16023-15955), tRNA(Glu)
(9990-10058), tRNA(Ser(UCN)) (7516-7445), tRNA(Tyr) (5891-5825), tRNA(Cys)
(5826-5861), tRNA(Asn) (5729-5656), tRNA(Ala) (5655-5587), tRNA(Gln)
(4400-4329)), a drugą czternaście cząsteczek. (Light (nić Heavy): tRNA(Phe)
(576-647), tRNA(Val) (1602-1670), tRNA(Leu(UUR)) (3229-3304), tRNA(Ile)
(4262-4331), tRNA(Met) (4401-4469), tRNA(Trp) (5511-5579), tRNA(Asp)
(7518-7585), tRNA(Lys) (8295-8364), tRNA(Arg) (10405-10469), tRNA(His)
(12138-12206), tRNA(Ser(AGY)) (12207-12265), tRNA(Leu(CUN)) (12266-12236),
tRNA(Glu) (14742-14674), tRNA(Thr) (15888-15953))
Najważniejszą funkcją tRNA jest udział w procesie biosyntezy białka.
Reakcja przyłączenia swoistego aminokwasu do tRNA jest katalizowana przez
syntetazy aminoacylo-tRNA, które rozpoznają strukturalnie podobne specyficzne
tRNA. Proces ten ma wielkie znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania
mechanizmu biosyntezy białka. Jest to dwuetapowa reakcja podczas której, w
trakcie pierwszego etapu następuje aktywacja aminokwasu (AA) przez syntetazę
(AARS) i ATP, powstaje aminoacyloadenylan. W drugim etapie reakcji aminokwas
zostaje przeniesiony na cząsteczkę odpowiedniego tRNA. Podstawą doboru tRNA,
w celu przeniesienia na tę cząsteczkę aminokwasu, jest stworzenie specyficznego
kompleksu między syntetazą aminoacylo-tRNA a cząsteczką tRNA.
Najważniejszymi czynnikami decydującymi o swoistości tego procesu są:
rozpoznawanie i identyczność tRNA. Z tego powodu bardzo ważną rolę ogrywa
budowa tRNA. Rozpoznawanie oznacza identyfikację danego tRNA przez
odpowiednią syntetazę przy wykorzystaniu w tym celu specyficznych elementów
strukturalnych tRNA (ang. recognition elements). Natomiast identyczność tRNA
dotyczy tych elementów kwasu nukleinowego, które są rozpoznawane przez
odpowiednią syntetazę i zarazem są to cechy strukturalne uniemożliwiające
rozpoznanie tRNA przez niehomologiczna syntetazę (ang. discrimination
elements).
Warto więc przyjrzeć się budowie tRNA, a szczególnie mitochondrialnych tRNA.
Budowa cytoplazmatycznych tRNA została stosunkowo nieźle poznana i jest
obiektem licznych prac badawczych. Drugorzędowa struktura tRNA została
opisana w 1965 roku przez Holley’a, dla drożdżowego tRNA alaninowego
(tRNA(Ala)) Model ten przedstawiany jako „liść koniczyny” opiera się na zdolności
tworzenia się wewnątrz cząsteczkowych par zasad według reguł Watsona-Cricka.
Przewidują one, że wszystkie tRNA posiadają 4 jednoniciowe regiony zwane
pętlami, które razem z sąsiadującymi regionami spiralnymi tworzą struktury
zwane ramionami. Licząc od końca 5’ do 3’ wyróżnia się: ramię dihdrourydynowe
(D), ramię antykodonowe (A), posiadające jedynie pętlę ramię dodatkowe
nazywane również zmiennym (V – ang.: variable), ramię psedourydynowe (TΨC),
oraz ramię akceptorowe (AA), nie posiadające pętli [3].
Ryc. 1 Schemat struktury drugorzędowej cytoplazmatycznego, drożdżowego
tRNA(Phe). Kolorem zielonym zaznaczone są miejsca istotne do rozpoznania
tRNA(Phe) przez PheRS. Po lewej struktura drugorzędowa w klasycznym
schemacie „liścia koniczyny”, po prawej przedstawienie tRNA w układzie
zbliżonym do przestrzennego w kształcie litery „L”. Opracowanie własne.
Drożdżowy tRNA(Phe) jest złożony z 76 nukletydów. Siedem par tworzy ramię
akceptorowe. Dwa kolejne nukleotydy (8 i 9) licząc od końca 5’ w kierunku 3’
tworzą połączenie (łącznik) między ramieniem akceptorowym i ramieniem D,
które składa się z dwóch regionów: spiralnego (dupleksu) zbudowanego z
czterech par nukleotydów oraz pętli w skład której wchodzi 8 nukleotydów.
Nukleotyd w pozycji 26 łączy ramie D z ramieniem antykodonu złożonego również
zbudowanego z 5 par nukleotydów i pętli zawierającej 7 nukleotydów. Kolejnym
elementem tworzącym fenyloalaninowy tRNA jest ramię dodatkowe w postaci
pętli złożonej z 5 nukleotydów. Kolejne z ramion tego tRNA, ramię
pseudourydynowe jest złożone z dwóch regionów: dupleksu – 5 par nukleotydów i
pętli – 7 nukleotydów.
W przypadku innych tRNA możliwe są pewne różnice w budowie cząsteczki
najczęściej widoczne w pętli ramienia D (dodatkowe cztery nukleotydy), oraz w
ramieniu dodatkowym (poza pięcioma występującymi zasadniczo, możliwych jest
jeszcze dziewiętnaście nukleotydów), w efekcie liczba nukleotydów nie jest
identyczna we wszystkich izoakceptorach.
Innego rodzaju zaburzeniami w drugorzędowej strukturze tRNA jest
występowanie par nukleotydów niezgodnych z regułami Watsona-Cricka,
przykładem mogą być pary takie jak U•U, A•A, C•U [4].
Struktura trzeciorzędowa tRNA spełnia ważną role w rozpoznawaniu
transferowych RNA przez syntetazę aminoacylo-tRNA.
Prawidłowa budowa cząsteczki pozwala, bowiem syntetazie natrafić na zestaw
elementów niezbędnych do prawidłowego rozpoznania tRNA. Bardzo dokładny
opis budowy tRNA można znaleźć dla drożdżowego tRNA(Phe), którego budowa
została opisana na podstawie różnych badań, w tym również badań
krystalograficznych.
Struktura trzeciorzędowa tRNA(Phe) drożdży, przypomina swoim kształtem literę
„L”. Drugorzędowa struktura tej cząsteczki jest zwinięta tak, że ramiona:
akceptorowe i TΨC tworzą jedno z ramion litery „L”, a antykodon i ramie D drugie
z ramion. Każde ramię ma około 60Å, a średnica około 20 Å. Przeciwległych
końców tRNA o kształcie litery „L” wynosi 80 Å. Kąty między osiami ramion
wynoszą: akceptorowego i TΨC – 15°, a między o D i antykodonu 25°. Między
dwiema częściami cząsteczki tworzącej kształt litery „L” – 90°. Struktura
trzeciorzędowa jest utrzymywana przez szereg oddziaływań występujących
między poszczególnymi nukloetydami. Są to oddziaływania międzycząsteczkowe
(jony magnezu, cząsteczki wody, poliaminy), oraz wewnątrzcząsteczkowe
(wiązania wodorowe, asocjacja warstwowa zasad, energia konformacyjna
cząsteczki). Jako miejsca występowania trzeciorzędowych interakcji należy
wymienić pozycje: 8-14-21; 9-23-12; 25-10-45; 13-22-46; 15-48; 18-55; 19-56;
26-44; 54-58 [5]. Stabilizujący wpływ na strukturę tRNA spełniają chemiczne
modyfikacje nukleozydów. W strukturze wprowadzane są po trankskrypcji tRNA,
na etapie dojrzewania pre-tRNA. Kolejność wystąpienia modyfikacji, zależy od
struktury pre-tRNA w określonym etapie dojrzewania oraz od lokalizacji w
komórce enzymów modyfikujących [6].
Dwadzieścia dwa mitochondrialne tRNA tworzą typową dla tRNA strukturę
drugorzędową. Istnieją jednak wśród nich dwa wyjątki. Są dwa izoakceptory
serynowe: tRNA o antykodonie AGY a drugi UCN. Pozostałe mitochondrialne
tRNA posiadają typową budowę drugorzędową, zasadniczo porównywalną z tRNA
cytoplazmatycznymi. Szczególną cechą mitochondrialnego tRNA(Ser(UCN)) jest
dłuższe o jedną parę nukleotydową ramię antykodonu. Drugą wyraźną różnicą w
stosunku do innych tRNA serynowych jest brak długiego ramienia dodatkowego,
które jest jednym z elementów pozwalających na identyfikację tego izoakceptora
przez aminoacylosyntetazę serynową [7]. Cząsteczka mitochondrialnego
tRNA(Ser(UCN)) została poddana badaniom z użyciem sond enzymatycznych i
chemicznych [8], przeprowadzono też komputerowe modelowanie struktury
przestrzennej [9]. Przedstawiono model w którym występują oddziaływania
trzeciorzędowe między pętlami D i T (Ψ55-G18, C56-G19), oraz w pętli T (T54A58).
Ryc.
2
Schemat struktury drugorzędowej wołowego mt tRNA(Ser(UCN)), czerwone linie
pokazują proponowany model wiązań trzeciorzędowych opisany w literaturze.
Opracowanie własne.
Pierwsze badania, w efekcie których pokazano, że zaburzenia pracy
mitochondriów mogą być podstawą do występowania różnych chorób,
przeprowadzono w latach 60. W 1988 roku opublikowano wyniki wskazujące
mutacje w mitochondrialnym DNA, jako odpowiedzialną za występowanie jednej z
chorób mitochondrialnych – zespołu Lebera. Od tego czasu ukazało się wiele
publikacji wskazujących na korelację między mutacjami w mitochondrialnym DNA
a występowaniem chorób mitochondrialnych.
Efekty chorób mitochondrialnych prowadzą do zaburzeń w działaniu wielu
układów i narządów w organizmie, objawiających się problemami z
wytworzeniem energii koniecznej do prawidłowego funkcjonowania narządów i
układów.
Szczególnie jest to odczuwalne w układzie nerwowym i mięśniowym, ale może też
być przyczyną zaburzeń działania wątroby, nerek, czy trzustki. Trzeba też,
zwrócić uwagę, że na występowanie chorób mitochondrialnych mogą mieć wpływ
nie tylko mutacje występujące w mt DNA, ale też występujące w genach
jądrowych, które mają wpływ na białka mitochondrialne, kodowane w jądrowym
DNA.
Liczne mutacje punktowe występujące w genach mt tRNA są związane z
chorobami mitochondrialnymi.
Do porównania wybrano 68 mutacji powiązanych z chorobami mitochondrialnymi
i 64 mutacje polimorficzne, neutralne z punktu widzenia chorób powiązanych z
mitochondriami. Statystyczna analiza tych mutacji pokazała, że wszystkie domeny
mitochondrialnych tRNA są tak samo wrażliwe na oba typy mutacji [10].
Największą liczbę zmian niesie w sobie tRNA(Leu(UUR)), dla którego można
przytoczyć co najmniej 16 mutacji powiązanych z różnymi chorobami czy
syndromami chorób mitochondrialnych, których przykładem może być MELAS
[11]. Efektem mutacji punktowych są zmiany w sekwencji nukleotydowej tRNA,
które mogą mieć wpływ na strukturę tRNA. Z 12 teoretycznie możliwych
konwersji par WC do pojedynczych niesparowań dominują cztery: A-C, C-A, G-U, i
U-G. Ponad 30% wszystkich mutacji związanych z różnymi chorobami i
syndromami chorobowymi zawiera niesparowania C-A, w strukturze
drugorzędowej tRNA. Występowanie pojedynczych niesparowań ma wpływ na
trzeciorzędową strukturę tRNA [10]. Kluczem procesu biosyntezy białka jest
proces aminoacylacji transferowych RNA. Wszelkie zaburzenia tego procesu mają
wpływ na proces wytwarzania białka a więc są też przyczyną występowania
chorób mitochondrialnych, w przypadku defektów w mt tRNA.
Innym aspektem związanym z badaniami mutacji w genomie mitochondrialnym
jest ich występowanie nie tylko w chorobach mitochondrialnych, ale również
nowotworowych [12].
Zaobserwowano również korelacje chorób nowotworowych z mutacjami
punktowymi w genach kodujących mitochonrialne tRNA. W przypadku raka płuc
taka korelacja dotyczyła mutacji A7460G w tRNA(Ser(UCN)), G5563A w
tRNA(Trp) oraz A12172G w tRNA(His) [13].
Pierwsza z nich to A7460G w tRNA(Ser(UCN)). Mutacja ta znajduje się w pętli T,
w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca potencjalnych oddziaływań trzeciorzędowych
jakie tworzy para 54-58. Jednak przeprowadzone badania z wykorzystaniem RNA
Fold Web Server (program z tzw. pakietu wiedeńskiego, gdzie podstawą
modelowania struktury drugorzędowej są wartości energii swobodnych dla
konformacji badanego RNA [14, 15]) pozwalających przewidywać strukturę
drugorzędową nie wykazują szczególnych zmian w strukturze tRNA. Należy też
dodać, że mutacja ta nie jest wymieniania w żaden sposób w odniesieniu do
chorób mitochondrialnych.
Ryc. 3 Schemat tRNA(Ser(UCN) z mitochondriów człowieka z zaznaczonym
miejscem występowania mutacji A7460G (U59C). Opracowanie własne.
Kolejnym opisywanym przypadkiem jest mutacja G5563A w tRNA(Trp). Jest to
mutacja, którą opisuje się jako polimorficzną w przypadku chorób
mitochondrialnych [16]. Również w tym przypadku próby modelowania struktury
drugorzędowej nie wskazują na poważniejsze zmiany w strukturze tRNA.
Ryc. 4 Schemat mt tRNA(Trp) z zaznaczonym miejscem występowania
mutacji G5563A. Opracowanie własne.
Ostatnią z trzech mutacji, jakie zaobserwowano w powiązaniu z rakiem płuc jest
A12172G w tRNA(His). Miejsce to jest zauważalne w odniesieniu do chorób
mitochondrialnych. Mutacja ta była uznawana za polimorficzną, jednak obecnie
jest określana jako potencjalnie patogenna. W jej przypadku różnice wartości
energii swobodnej pomiędzy mutantem i cząsteczka pozbawioną mutacji wskazują
na występowanie alternatywnych struktur, których nie będą w stanie
ustabilizować zmodyfikowane nukleotydy. W efekcie utrudniony bądź niemożliwy
staje się proces tworzenia kompleksu pomiędzy tRNA i odpowiednią dla niego
syntetazę a w konsekwencji ma to negatywny wpływ na proces biosyntezy białka.
Podobne mechanizmy były opisywane w przypadku mutacji związanych z
chorobami mitochondrialnymi na przykład w mt tRNA(Leu(UUR)). W przypadku
mutantów tego tRNA obserwowano rozluźnienie struktury pomiędzy pętlami
antykodonu i D [17, 18].
Ryc. 5 Schemat mt tRNA(His) z zaznaczonym miejscem występowania mutacji
A12172G. Opracowanie własne.
Warto wspomnieć o jeszcze jednej mutacji w mitochondrialnym tRNA, jaką można
powiązać z chorobami nowotworowymi. Jest to mutacja punktowa A12308G w
tRNA(Leu(CUN)), której występowanie zostało powiązane z rakiem jelita grubego
(CRC) [19].
Ryc. 6 Schemat mt tRNA(Leu(CUN) z zaznaczonym miejscem występowania
mutacji A12308G. Opracowanie własne.
Mutacja A12308G dotyczy pozycji 44 w ramieniu antykodonu jednocześnie w
sąsiedztwie ramienia zmiennego. Warto zwrócić uwagę na to, że jest to miejsce
biorące udział w jednym z potencjalnych wiązań trzeciorzędowych. Ponadto
sąsiednie nukleotydy z ramienia zmiennego również są miejscami potencjalnych
wiązań trzeciorzędowych. Tak więc możliwe jest tu dość poważne rozluźnienie
struktury trzeciorzędowej, co może mieć wpływ na proces rozpoznawania tRNA
przez odpowiednią syntetazę. Mutacja A12308G skorelowana jest również z
występowaniem zespołu przewlekłej postępującej zewnętrznej oftalmoplegii (ang.
Chronic progressive external ophthalmoplegia, CPEO) – jednej z chorób
mitochondrialnych [20].
Mutacje w mt tRNA mogą występować w chorobach nowotworowych
Mitochondria pochodzące z płuca ssaka - źródło Rippel E. M. Facility website,
autor Louisa Howard licencja PD
Mutacje w mitochondrialnych tRNA były dotychczas kojarzone głównie z
chorobami mitochondrialnymi lub tymi, które występuje w obrębie układu
nerwowego. Jak widać z powyższych przykładów mogą również być
odnotowywane w chorobach nowotworowych. Prezentuje to skomplikowany
mechanizm związany z chorobami nowotworowymi i jednocześnie pokazuje, że
mutacje w mitochondrialnym DNA mogą być spotykane nie tylko w wąskiej grupie
chorób mitochondrialnych. Jednak aby dokładnie ustalić rolę jaką w chorobach
nowotworowych mogą pełnić mutacje w genach mt tRNA potrzeba jeszcze wielu
kolejnych prac badawczych.
Piśmiennictwo:
1. Anderson S. et al. Sequence and organization of the human mitochondrial
genome. Nature, 1981; 290: 457-465.
2. Andrews RM. et al. Reanalysis and revision of the Cambridge reference
sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet, 1999 23: 147.
3. Holley RW. et al. Structure of a Ribonucleic Acid. Science, 1965; 147:
1462-1465.
4. Grosjean H. et al. Structure in tRNA data. Biochimie. 1982; 64, 6: 387-397.
5. Helm M. et al. Search for characteristic structural features of mammalian
mitochondrial tRNAs. RNA 2000.
6, 10:1356-1379. 6. Machnicka MA. et al. Distribution and frequencies of posttranscriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 2014; 11, 12:1619-1629.
7. Siatecka M. et al. Struktura i funkcja syntetaz aminoacylo-tRNA. Postepy
Biochem. 1993; 41, 4: 266-275.
8. Yokogawa T. et al. A novel cloverleaf structure found in mammalian
mitochondrial tRNA(Ser) (UCN). Nucleic Acids Res. 1991; 19: 6101-6105
9. Watanabe Y, et al. Higher-order structure of bovine mitochondrial
tRNA(SerUGA): chemical modification and computer modeling. Nucleic Acids Res.
1994; 22: 5378-5384.
10. Florentz C. et al. Disease-related versus polymorphic mutations in human
mitochondrial tRNAs. Where is the difference? EMBO Reports 2001; 21: 481-486.
11. Goto Y. et al. A new point mutation at nucleotide pair 3291 of the
mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) gene in a patient with mitochondrial myopathy,
encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS). Biochem
Biophys Res Commun 1994; 202: 1624-1630.
12. Księżakowska-Łakoma K. et al. Mitochondrial dysfunction in cancer. Prz
Menopauzalny. 2014; 13, 2: 136-144.
13. Wang L. et al. The role of mitochondrial tRNA mutations in lung cancer. Int J
Clin Exp Med 2015; 8, 8: 13341-13346.
14. Hofacker IL. Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res.
2003; 31, 13: 3429-3431.
15. Olszak K. Zanim sami zbudujemy RNA. Dolina Biotechnologiczna, 2012.
16. Maniura-Weber, K. et al. A novel point mutation in the mitochondrial
tRNA(Trp) gene produces a neurogastrointestinal syndrome. European Journal of
Human Genetics. 2004; 12, 6: 509-512.
17. Sohm B. et al. Towards Understanding Human Mitochondrial Leucine
Aminoacylation Identity. J. Mol. Biol. 2003; 328:995-1010.
18. Helm M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative holding
RNA. Nucleic Acids Res. 2006; 34:721-733.
19. Mohammed F. et al. Mitochondrial A12308G alteration in tRNA(Leu(CUN)) in
colorectal cancer samples. Diagn Pathol. 2015 Jul 19;10:115.
20. Pütz J. Et al. Mamit-tRNA, a database of mammalian mitochondrial tRNA
primary and secondary structures. RNA 2007; 13: 1184-1190.
Data publikacji: 29.02.2016r.