Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 4 • 439-446
Praca poglądowa • Review Article
Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej
gruźlicy
Progress in contemporary tuberculosis laboratory diagnostics
Joanna Pendzich1, Wanda Maksymowicz-Mazur2, Jerzy Kozielski3
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Wydziału Farmaceutycznego i Oddziału Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny
w Katowicach, 2Pracownia Bakteriologii i Genetyki Gruźlicy, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 3 Śląskiego Uniwersytetu
Medycznego w Katowicach, 3Katedra i Klinika Chorób Płuc i Gruźlicy, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 3 Śląskiego Uniwersytetu
Medycznego w Katowicach
1
Streszczenie
U człowieka infekcja Mycobacterium tuberculosis może zostać pokonana przez siły obronne organizmu, ale może też przejść
w formę utajoną lub prowadzić do rozwinięcia się aktywnej choroby. Narzędzia diagnostyczne powinny pozwolić na precyzyjne
wykrycie w organizmie gospodarza prątków bez względu na formę, jaką przybrała infekcja.
W ciągu minionych lat opracowano i wprowadzono do laboratoriów diagnostycznych wiele nowych technik służących diagnostyce gruźlicy: nowe metody mikroskopowe i hodowlane, molekularne, serologiczne czy chromatograficzne. Są to jednak
w większości narzędzia diagnostyczne wymagające dużych nakładów finansowych (np. automatyczne platformy do badań
molekularnych, chromatografy, automatyczne aparaty hodowlane) oraz wykwalifikowanego personelu. Mimo ogromnego
postępu wciąż brakuje szybkiego, precyzyjnego, taniego, dostępnego i łatwego do przeprowadzenia testu diagnostycznego.
Summary
While the Mycobacterium tuberculosis infection can be defeated by the host response in humans, it can also be retained as a
latent infection or progress to active disease. Diagnostic methods have to enable the accurate detection of the tubercle bacilli
despite the infection category. Over the past few years, several new diagnostic tools have been developed and introduced to
laboratories, e.g., microscopy, culture, molecular, serologic and chromatographic procedures. Unfortunately, these are mostly
very expensive diagnostic devices such as automated molecular platforms, chromatographs or automated culture systems.
We still lack rapid, accurate, low-cost, accessible test easy-to-perform by low-skilled personnel.
Słowa kluczowe:gruźlica utajona, diagnostyka laboratoryjna gruźlicy, Mycobacterium tuberculosis, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), mikromacierze, test uwalniania interferonu gamma (IGRAs)
Key words:latent tuberculosis, tuberculosis laboratory diagnostics, Mycobacterium tuberculosis, polymerase chain reaction
(PCR), microarrays, interferon gamma release assays (IGRAs)
Wstęp
Gruźlica jest uznawana za najstarszą opisaną chorobę infekcyjną. Wg znawców przedmiotu w ciągu minionych 130 lat
odnotowano w historii gruźlicy trzy przełomowe wydarzenia
[9]: po pierwsze niemiecki badacz Robert Koch po raz pierwszy zobaczył pod mikroskopem prątki gruźlicy pochodzące
z materiału pobranego od chorych, a wyniki swoich badań
zaprezentował 24 marca 1882 roku w Berlinie przed członkami Towarzystwa Fizjologicznego (francuski lekarz wojskowy Jean-Antoine Villemin wykazał co prawda wcześniej
w modelu zwierzęcym, że gruźlica jest chorobą zakaźną,
jednak nie udało mu się wyizolować czynnika etiologicznego) [38, 39]; po drugie wprowadzono efektywną chemiotera-
pię choroby (w 1949 roku zastosowano pierwszy skuteczny
lek przeciw prątkom gruźlicy – streptomycynę [24]); po trzecie opracowano molekularne metody diagnozowania gruźlicy [9].
Oprócz metod diagnostycznych molekularnych, które są
uznawane za najszybsze i najbardziej obiecujące, udoskonala się i wprowadza do laboratoriów szereg innych metod
diagnozowania gruźlicy (nowe metody mikroskopowe i hodowlane, immunologiczne /w tym serologiczne/ czy chromatograficzne).
Zgodnie z zaleceniami WHO stwierdzenie przypadku gruźlicy wymaga w dalszym ciągu mikrobiologicznego potwierdzenia, co wiąże się z koniecznością wyizolowania bakterii
439
Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy
grupy Mycobacterium tuberculosis complex z materiału klinicznego, określenia gatunku wyizolowanych drobnoustrojów i oceny ich lekowrażliwości. Z kolei rutynowe diagnostyczne badania molekularne można wykonywać jedynie
w oparciu o komercyjne, zamknięte systemy genetyczne [2].
Metody stosowane w diagnostyce mycobacterium tuberculosis.
Metody tradycyjne.
Materiałami wykorzystywanymi w diagnostyce laboratoryjnej
gruźlicy są m.in. próby pochodzące z układu oddechowego
(np. plwocina, popłuczyny żołądkowe (gł. u dzieci), popłuczyny oskrzelowe z bronchofiberoskopii, aspirat oskrzelowy), płyny i wydaliny (np. płyn opłucnowy, płyn mózgowo–
rdzeniowy, płyn stawowy, mocz), krew lub bioptaty tkanek.
Wstępne przygotowanie materiału klinicznego.
Materiały nie zanieczyszczone bakteriami (z natury jałowe)
należy zagęścić, a następnie posiewać bezpośrednio na
podłoża hodowlane płynne i stałe. Materiały kliniczne, w których znajduje się flora towarzysząca należy przed posiewem
poddać dekontaminacji. Niektóre materiały wymagają dodatkowo ujednolicenia (homogenizacji). Do dekontaminacji
i homogenizacji stosuje się metodę Kubicy lub Petrofa [31].
W przypadku wyizolowania mykobakterii należy zbadać ich
wrażliwość na leki.
Posiew na podłoże stałe.
Istotnym problemem w zwalczaniu gruźlicy jest brak szybkiej i dostatecznie swoistej metody diagnostycznej. Za „złoty
standard” wciąż uważany jest posiew materiału pobranego
od chorego na podłoże hodowlane. Zasadniczą wadą tej
metody jest konieczność oczekiwania na uzyskanie widocznych gołym okiem kolonii prątków przez okres 2 do 6 tygodni
[19, 33], a czasami nawet znacznie dłużej, bo przez okres
od 6 do 10 tygodni [41], a także konieczność prowadzenia
hodowli w laboratorium o stopniu bezpieczeństwa BSL 2-3
(BSL, ang. biosafety level) [33].
Wstępnie opracowany materiał kliniczny (osad) posiewa się
na podłoże stałe Loewensteina-Jensena. Obserwowana jest
szybkość wzrostu kolonii (prątki gruźlicy to bakterie wolnorosnące) oraz ich zdolność do tworzenia pigmentu. Chromogenne są prątki „atypowe”, zwane też prątkami „niegruźliczymi” (NTM, ang. nontuberculous mycobacteria) czyli grupa
prątków aktualnie nazywana MOTT (ang. Mycobacteria Other
Than Tuberculosis, prątki inne niż gruźlicze). Jeśli kolonie nie
wytwarzają pigmentu, czyli w przypadku stwierdzenia obecności prątków niechromogennych, przeprowadza się test
niacynowy, służący do odróżnienia M. tuberculosis od pozostałych prątków. Dodatni wynik testu świadczy o obecności
prątków gruźlicy. Hodowle prątków dające ujemny wynik testu niacynowego należy wystawić na działanie światła na 5
godzin, a następnie inkubować je przez kolejnych 18 godzin.
Pozwoli to na przyporządkowanie bakterii do grupy prątków
niechromogennych, fotochromogennych bądź skotochromogennych. Taki model identyfikacji prątków uwzględnia cechy
charakterystyczne dla grup Runyona [19, 42].
440
Pełna diagnostyka mikrobiologiczna gruźlicy metodami konwencjonalnymi (hodowla, identyfikacja gatunku, ocena lekowrażliwości) trwa od 2 do 4 miesięcy.
Analiza mikroskopowa.
Pierwszym etapem diagnostyki laboratoryjnej gruźlicy poza posiewem - jest analiza mikroskopowa pobranych od
pacjenta próbek. Pobrane materiały barwi się zwykle metodą Ziehl–Neelsena i ogląda pod mikroskopem świetlnym
w poszukiwaniu komórek kwasoopornych. Odpowiednio
przygotowane materiały kliniczne można także wybarwiać
auraminą–rodaminą i oglądać w mikroskopie fluorescencyjnym. Obecność komórek kwasoopornych jest wstępnym dowodem zakażenia mykobakteriami [31].
W 2009 roku Strategic and Technical Advisory Group for Tuberculosis (STAG-TB) zarekomendowała w WHO jako alternatywę dla klasycznego mikroskopu świetlnego mikroskop
fluorescencyjny [35].
Ostatnio Światowa Organizacja Zdrowia (WHO, World Health Organization) zaleca, by stosować technikę LED (ang.
light-emitting diode) i auraminę jako barwnik we wszystkich
laboratoriach, w których stosowany jest mikroskop fluorescencyjny [34]. MODYFIKACJE METOD HODOWLANYCH
Ciągle poszukuje się szybszych i bardziej wiarygodnych metod wykrywania prątków gruźlicy.
Opracowano szereg nowych systemów hodowli prątków nie
wymagających specjalnej aparatury:
–– Septi-Chek AFB (BD, USA) to komercyjny, prosty i tani
sposób hodowli prątków. W 1 butelce umieszcza się 3 różne płytki ze stałymi pożywkami (dla M. tuberculosis, dla
prątków MOTT i do detekcji zanieczyszczeń). Dodatkowo hodowla jest prowadzona w drugiej butelce z płynną
pożywką. Wzrost prątków może być obserwowany już po
7 dniach inkubacji [40].
–– MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube; BD, USA) to
kolejny test komercyjny: hodowla prowadzona jest w pożywce płynnej Middlebrooka 7H9 z odczynnikiem fluorescencyjnym reagującym na obniżanie się poziomu tlenu
w pożywce zachodzącym w czasie namnażania się prątków. Odczyt polega na analizie efektu reakcji fluorescencyjnej w transiluminatorze UV lub w lampie Wooda. Wynik
uzyskuje się po 7-8 dniach inkubacji. System ten pozwala
na ocenę wrażliwości prątków na izoniazyd i rifampicynę
[40].
–– MB Redox (Biotest Diagnostics, USA), to test komercyjny,
w którym hodowlę prowadzi się w pożywce płynnej Kirchnera z surowicą z dodatkiem soli tetrazolowych. Odczyt
wizualny polega na stwierdzaniu tworzenia się barwnego
formazanu (od żółtego do czerwonego) poprzez redukcję
soli tetrazolowych przez prątki. System umożliwia ocenę
lekowrażliwości prątków oraz ich typowanie [40].
Powstały także nowe systemy automatyczne wymagające
specjalistycznej aparatury:
–– Skrócenie czasu oczekiwania na wynik do 7-8 dni [19]
J. Pendzich, W. Maksymowicz-Mazur i J. Kozielski
(4-8 dni) przyniósł jeden z pierwszych zautomatyzowanch,
komercyjnych systemów hodowli prątków BACTEC (BD,
USA). Badanie polega na pomiarze radiometrycznym wydzielonego z hodowli dwutlenku węgla, znakowanego izotopem węgla 14C [19].
–– W systemie 460TB BACTEC można zastosować test TB
NAP BACTEC służący do różnicowania kompleksu prątka gruźlicy (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M.
microti) od innych prątków (MOTT). Badanie trwa 3-5 dni.
Test NAP BACTEC umożliwia też szybkie wykrycie obecności M. tuberculosis [3]. System umożliwia również ocenę
wrażliwości prątków na izoniazyd, streptomycynę, rifampicynę, etambutol i pirazynamid w ciągu 5-8 dni, a także na
określenie przynależności badanego szczepu do jednej
z 2 grup: M. tuberculosis complex lub MOTT (5-7 dni od
wyhodowania bakterii) [40]. System ten w ciągu ostatnich
lat podlegał licznym modyfikacjom. Obecnie ze względu
na wycofywanie znaczników izotopowych system BACTEC 460 TB jest zastępowany przez system MGIT 960
(BD, USA), wykorzystujący pomiar fluorescencji w zależności od zużycia przez prątki tlenu w hodowli [19].
–– MB/BacT (BioMērieux, Francja) to komercyjny system
kolorymetryczny. Prowadzi się hodowlę w pożywce Middlebrook 7H9 zawierającej zestaw PANTA. Do butelki
hodowlanej z pożywką i mieszaniną gazów CO2, N2 i O2
w czasie wzrostu prątków wydzielany jest CO2, którego
wzrost powoduje zmianę zabarwienia wskaźnika kolorymetrycznego. Wzrost prątków obserwuje się w okresie od
6-7 dni do 6 tygodni inkubacji. System ten umożliwia ocenę wrażliwości prątków na 5 podstawowych leków przeciwgruźliczych [40].
METODY IMMUNOLOGICZNE
Badania nad opracowaniem skutecznego testu immunologicznego pozwalającego na zdiagnozowanie gruźlicy trwają
praktycznie od XIX wieku, czyli od zaobserwowania, iż prątki
gruźlicy mogą być aglutynowane przez surowicę osób chorych na gruźlicę.
Na rynku są dostępne antygeny A60 oraz 38 kDa uzyskane z M. bovis BCG. Odpowiedź organizmu człowieka na
podane antygeny bada się techniką immunoenzymatyczną
ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay). Wykorzystywane są również proste, komercyjne testy paskowe
lub płytkowe zawierające antygen A60. Przeprowadzenie takiego testu nie wymaga specjalnej aparatury i spełniać może
pomocniczą rolę w diagnostyce gruźlicy [40, 42].
Do najnowszych osiągnięć należy niewątpliwie zaliczyć
opracowanie dwóch rodzajów komercyjnych testów IGRA
(ang. interferon gamma release assays) różniących się sposobem przeprowadzenia: /1/ Quantiferon-TB Gold (Cellestis
Ltd, Australia) - testu polegającego na ocenie ilości uwalnianego interferonu w krótkotrwałych hodowlach komórek pełnej krwi obwodowej stymulowanych antygenami prątka oraz
/2/ T-spot-TB (Oxford, Immunotec, Wielka Brytania) - testu
polegającego na ustaleniu liczby komórek wytwarzających
interferon w wyniku ekspozycji na antygeny prątka.
Do konstrukcji obu rodzajów testu IGRA zastosowano wczesne antygeny prątka gruźlicy ESAT-6 (ang, Mycobacterium
tuberculosis-early secreted antigenic target 6kDa) i CFP-10
(ang. culture filtrated protein). Wymienione dwa antygeny
są wydzielane w ilościach 1:1 w krótkotrwałych hodowlach
prątków. Antygeny ESAT-6 oraz CFP-10 są kodowane przez
geny regionu RD-1. Region ten nie występuje we wszystkich
podtypach szczepu BCG oraz u większości prątków niegruźliczych (za wyjątkiem M. szulgai, M. marinum i M. kansasi).
Homolog antygenu ESAT-6 obserwuje się u prątków trądu
(M. leprae). Antygeny ESAT-6 i CFP-10 są preferencyjnie
rozpoznawane oraz są głównymi stymulatorami produkcji
interferonu gamma we wczesnych fazach eksperymentalnego zakażenia prątkiem. Odpowiedź na ESAT-6 i CFP-10 jest
komplementarna, dlatego wskazana jest ocena odpowiedzi
na oba antygeny.
Wprowadzenie testów IGRA opartych na antygenach, które
nie występują u szczepu BCG umożliwia odróżnienie odczynowości poszczepiennej od wywołanej utajonym zakażeniem
gruźlicą. Test ten stwarza unikalną możliwość określenia
w sposób bezpośredni obecności zakażenia M. tuberculosis
w populacji, w której szczepienie przeciwko gruźlicy jest powszechnie stosowane [11].
Testy komercyjne QuantiFERON-TB Gold In Tube (Celestis,
Australia) i T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Wielka Brytania)
wymagają dobrego wyposażenia laboratorium. Wymienione
narzędzia diagnostyczne są jednak mało czułe w przypadku
pacjentów z HIV. Służą one głównie do wykrywania latentnej
(utajonej) postaci gruźlicy [33].
Wyniki porównań dostępnych testów:
Efthimiou P. i wsp. [14] z powodzeniem wykrywali gruźlicę
utajoną przy pomocy testu QuantiFERON TB-Gold (QFT-G)
u osób z reumatoidalnym zapaleniem stawów i ujemnym wynikiem tuberkulinowego testu skórnego (TST).
Dinnes J. i wsp. [13] dokonali przeglądu i oceny szybkich
testów stosowanych w diagnostyce gruźlicy aktywnej i utajonej. Wśród testów wykrywających formę utajoną gruźlicy
wyróżnili testy oparte o antygeny kodowane przez region
RD-1 (antygeny ESAT-6 i CFP-10), których wyniki lepiej
korelowały z intensywnością ekspozycji i były bardziej niezależne od szczepienia BCG oraz infekcji HIV, niż inne analizowane testy tej grupy. Podstawowe testy komercyjne to
testy oparte na technikach immunoenzymatycznych ELISA
(ang. whole blood interferon enzyme-linked immunosorbent
assay) i ELISPOT (ang. enzyme-linked immunospot assay).
Przydatność szybkich testów serologicznych/immunologicznych służących do diagnostyki aktywnej gruźlicy wymaga
dalszych badań.
Z kolei Steingardt i wsp. dokonali przeglądu dostępnych testów serologicznych, służących do wykrywania prątków. Wyniki analizy wskazują, że w przypadku gruźlicy płuc testy te
są mało przydatne, bądź też w ogóle nieprzydatne. Czułość
testów jest wyższa w przypadku pacjentów z pozytywnym
wynikiem badania rozmazu, w porównaniu do pacjentów
441
Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy
z negatywnym wynikiem badania rozmazu. Etap diagnostyki polegający na badaniu rozmazu nie może zostać
zastąpiony przez testy serologiczne. Konieczne jest poszukiwanie nowych antygenów o potencjale immunodiagnostycznym [30].
W Korei przeprowadzono badania antygenów zrekombinowanych (rESAT-6, rHSP-X, rCFP-10) oraz natywnych (Ag85
i PstS1) o potencjalnym znaczeniu dla serodiagnostyki gruźlicy. Antygen HSP-X okazał się najbardziej przydatny, gdy
w teście wykorzystano tylko jeden antygen. Test wykazał
najwyższą specyficzność i czułość, gdy zastosowano równocześnie wszystkie 5 badanych antygenów. Test z zastosowaniem wszystkich 5 badanych antygenów (coctail ELISA)
okazał się dostatecznie użyteczny do wykrywania aktywnej
gruźlicy [29].
Bradshaw L. i wsp. (2011) [6] wykorzystali w swoich badaniach test komercyjny QuantiFERON-TB Gold In-Tube (Cellestis Ltd, Carnegie, Australia) i stwierdzili, że jego wynik dodatni wskazuje na wcześniejszy kontakt z prątkami gruźlicy,
a nie na obecność aktywnej choroby.
METODY CHROMATOGRAFICZNE
Metody chromatograficzne zostały wprowadzone do identyfikacji prątków w latach 90-tych i stosowano je do badań
naukowych. Służą one do analizy składu ilościowego i jakościowego kwasów mykolowych prątków, co umożliwia identyfikację gatunków i podgatunków tych bakterii. Najbardziej
przydatna okazała się technika cieczowej chromatografii wysokosprawnej (HPLC, ang. High Performance Liquid Chromatography). Czas jednej analizy to kilka minut. Technika ta
wymaga jednak specjalistycznej aparatury, dobrze wyszkolonego personelu oraz uprzedniego wyhodowania bakterii
[40]. Zastosowanie metod chromatograficznych w diagnostyce gruźlicy ogranicza się praktycznie do laboratoriów referencyjnych prątka [42].
Metody chromatograficzne w połączeniu z molekularnymi
znajdują również zastosowanie w ocenie oporności prątków
gruźlicy na leki (szczegóły w podrozdziale Wykrywanie lekooporności prątków gruźlicy z zastosowaniem metod molekularnych) [15].
METODY MOLEKULARNE
Rozwój biologii molekularnej umożliwił wykrywanie obecności prątków w badanym materiale w ciągu 1-2 dni, a nawet
w ciągu kilku godzin, zależnie od zastosowanej techniki
diagnostycznej. Zdaniem części badaczy testy genetyczne
mogą co prawda znacznie przyspieszyć postawienie diagnozy, ale należy je stosować jedynie jako uzupełnienie innych metod diagnostycznych (nie powinny one zastępować
metod nie-genetycznych) [2]. Jest to zresztą zgodne ze stanowiskiem WHO, wg której za przypadek gruźlicy uważa się
przypadek potwierdzony bakteriologicznie [42]. Wśród metod molekularnych wyróżnia się następujące grupy:
Sondy genetyczne: technika identyfikacji mikroorganizmów
polega na hybrydyzacji kwasów nukleinowych danego mi442
kroorganizmu z komplementarną, wyznakowaną sondą genetyczną. Dawniej znakowano sondy izotopami 32P i 125J. Aktualnie sondy znakowane są barwnikami fluorescencyjnymi.
Wykorzystywane są sondy do rozpoznawania DNA i RNA.
–– Sondy systemu komercyjnego AccuProbe (Gen-Probe,
USA) znakowane są estrami akrydyny.
–– W technice SNAP stosowane są sondy znakowane alkaliczną fosfatazą.
Dwuniciowe hybrydy wykrywa się metodami chemiluminescencji (test komercyjny AccuProbe) lub w formie reakcji
barwnej (SNAP: po dodaniu substratu dla alkalicznej fosfatazy; test komercyjny Syngene System, USA). Są to metody
wymagające uprzedniej hodowli badanego materiału klinicznego. Dostępne są sondy dla 5 gatunków prątków, w tym dla
Mycobacterium tuberculosis [40].
Amplifikacja kwasów nukleinowych: szybki rozwój technik
biologii molekularnej stworzył nowe możliwości w diagnostyce gruźlicy. Znalazła tu zastosowanie metoda łańcuchowej
reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR)
pozwalająca na amplifikację wybranego fragmentu DNA,
rRNA lub mRNA (RT-PCR, ang. reverse transcriptase-PCR,
odwrotna transkrypcja-PCR) [19, 20], który wykrywa się następnie przy pomocy sondy genetycznej lub elektroforezy.
W metodzie tej czas oczekiwania na wynik wynosi zaledwie
kilka godzin [19].
Dostępnych jest wiele testów służących do wykrywania
w próbach klinicznych DNA sekwencji insercyjnej IS6110
[26], specyficznej dla M. tuberculosis complex. Testy te pozwalają na diagnostykę gruźlicy z dokładnością co najmniej
dorównującą tradycyjnym metodom hodowlanym w próbach
klinicznych pochodzących z układu oddechowego i większą
w materiałach skąpoprątkowych, takich jak płyn mózgowo–
rdzeniowy czy płyn opłucnowy [9].
PCR
–– Test komercyjny MTDT (ang. Mycobacterium tuberculosis Direct Test; Gen-Probe, USA) to test bezpośredni
służący do wykrywania obecności Mycobacterium tuberculosis. Jest to test stosunkowo nowy. Istotą testu
jest amplifikacja 16S rRNA prątków należących do grupy Mycobacterium tuberculosis complex. Czułość testu
wynosi 75–100%, specyficzność 95–100%, pozytywna
wartość prognostyczna 78–100%, a negatywna wartość
prognostyczna 95-100%. Metoda ta pozwala na szybką identyfikację Mycobacterium tuberculosis w próbach
klinicznych, w których wykryto prątki techniką rozmazu
[20]. Test ten pozwala na wykrycie w badanym materiale
nawet 1 komórki prątka. Badanie trwa jeden dzień.
–– W testach, w których amplifikowane są fragmenty IS
6110 (wstawka insercyjna) wykrywa się 10-100 komórek
prątka w badanym materiale.
–– Wykrycie prątków gruźlicy możliwe jest także, gdy amplifikacji poddawane są fragmenty IS 986, geny kodujące
antygeny HPB 70 i HPB 64 [40], a także geny kodujące
białka 65 kDa [26, 40] i 38 kDa [26].
J. Pendzich, W. Maksymowicz-Mazur i J. Kozielski
–– Test komercyjny Xpert MTB/RIF (Cepheid Inc., USA)
umożliwia równoczesne wykrywanie bakterii M. tuberculosis oraz ich oporności na rifampicynę poprzez amplifikację
pięciu zachodzących na siebie sond (Becton-Dickinson,
USA), które są komplementarne do całkowitego fragmentu 81 par zasad determinującego oporność na rifampicynę
u M. tuberculosis w obrębie genu rpoB [5, 33].
–– GTMD (GenoType Mycobacteria Direct) to stosunkowo
nowy komercyjny test molekularny firmy Hain Lifescience GMBH (Nehren, Niemcy) służący do wykrywania mykobakterii grupy Mycobacterium tuberculosis complex,
M. avium, M. intracellulare, M. kansasii i M. malmoense
bezpośrednio w próbach klinicznych (metoda nie wymaga wcześniejszego wyhodowania kolonii prątków).
Stwierdzono, że czułość, specyficzność oraz wartości
prognostyczne pozytywna i negatywna wynoszą, odpowiednio 92, 100, 100 i 77% [16].
–– Safianowska i wsp [2009] badali przydatność komercyjnego testu GenoType system (HAIN Lifescience, Niemcy) do wykrywania prątków gruźlicy i innych prątków. System ten składa się z 5 niezależnych testów, które można
zastosować w bezpośrednim badaniu prób klinicznych
lub w badaniu wyizolowanych z hodowli szczepów bakterii. Metoda umożliwia również ocenę lekowrażliwości
prątków na rifampicynę i izoniazyd (test komercyjny GenoType MTBDRplus; Hain Lifescience GMBH, Nehren,
Niemcy). Stwierdzono, że test ten może zastąpić technikę chromatograficzną HPLC w rutynowej diagnostyce
gruźlicy. Wprowadzenie tego testu do rutynowej diagnostyki gruźlicy może znacznie przyspieszyć wykrywanie
prątków wielolekoopornych [27].
–– Amplicor Mycobacterium Kit (Roche Diagnostics, Japonia) jest najczęściej stosowanym komercyjnym zestawem do diagnostyki zakażeń prątkami, zwłaszcza
wywołanymi przez M. tuberculosis complex, M. avium
i M. intracellulare. Stwierdzono, że jest to wiarygodna i
szybka metoda diagnostyczna [22].
W USA, w diagnostyce gruźlicy standardowo stosowane
są metody molekularne oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych [33]. FDA akceptuje do wykrywania prątków
w materiałach pochodzących z dróg oddechowych real-time
COBAS TaqMan MTB (Roche Molecular Systems, USA) bez
względu na wynik badania rozmazu (pozytywny lub negatywny) oraz AMPLIFIED M. Tuberculosis Direct Test w wersji
podstawowej i unowocześnionej (Gen-Probe, USA) do badania próbek, w których wykryto prątki w rozmazie [33]. Inne
stosowane zestawy komercyjne to Roche LightCycler Mycobacterium detection kit (Roche Applied Science, IN, USA),
Seeplex TB detection kit (Seegene, Korea) i ProbeTec Direct
oraz pólautomatyczny system ProbeTec ET (BD, USA).
Badania z wykorzystaniem innych metod diagnostycznych opartych na PCR:
Opracowano i przetestowano nowy eksperymentalny ze-
staw diagnostyczny służący do wykrywania M. tuberculosis w materiałach klinicznych, w którym zastosowano
technikę F-PCR (fluorescencyjny PCR). Charakteryzuje
się czułością 89,2%, specyficznością 98,8% i wydajnością
93,6% [8].
Amplifikację DNA przeprowadza się również w aparacie
LightCycler PCR (LCxPCR). Jedna z eksperymentalnych
technik, w której zastosowano trzy sondy oligonukleotydowe specyficzne dla genu kodującego 16S rRNA, pozwala na
odróżnienie gatunków należących do M. tuberculosis complex i M. avium oraz mykobakterii nie wywołujących gruźlicy.
Metodą tą można wykryć w badanym materiale nawet pięć
kopii genu kodującego 16S rRNA. Metoda ta jest jak dotąd
najszybszą metodą pozwalającą na rozróżnienie mykobakterii w hodowli [25].
Podjęto także próbę wykrycia prątków w pochodzących od
pacjentów z podejrzeniem gruźlicy w skrawkach parafinowych i utrwalonych w formalinie. Zastosowano trzy różne
metody PCR oraz Southern blotting. Stwierdzono, że PCR
jest czułą, specyficzną i szybką metodą diagnostyczną [17].
W latach 1976-1994 zastosowano metodę PCR do wykrywania fragmentu IS6110 DNA M. tuberculosis complex w parafinowych skrawkach bioptatów skóry z histopatologicznie
zdiagnozowanym zapaleniem tkanki podskórnej. Obecność
prątków stwierdzono w 77% prób klinicznych. Dopiero wprowadzenie technik biologii molekularnej umożliwiło prawidłową diagnostykę choroby [4].
Opracowano metodę multiplex PCR z wykorzystaniem
trzech par starterów, służącą do wykrywania M. tuberculosis
w materiałach klinicznych. Metoda ta umożliwia wykrywanie
prątków gruźlicy w czasie krótszym niż jeden dzień [10].
Opracowano także nową metodę amplifikacji w warunkach
izotermicznych DNA wyizolowanego z komórek M. tuberculosis (ICAN, ang. isothermal DNA amplification method).
W metodzie tej wykorzystywane są startery i sonda hybrydyzacyjna komplematrne do sekwencji insercyjnej IS6110.
Metodą tą można wykryć nawet jedną kopię DNA M. tuberculosis w ciągu około 3,5 godziny [28].
Hershkovitz i wsp. przedstawili wyniki badań molekularnych
kobiety i noworodka pochowanych razem w Atlit-Yam (Izrael,
Dystrykt Hajfy), na wschodnim wybrzeżu Morza Śródziemnego około 9250-8160 lat temu. Metodą PCR wykryto DNA
Mycobacterium tuberculosis w próbkach kości zawierających typowe zmiany obserwowane w przebiegu gruźlicy.
Wyniki badań zweryfikowano techniką HPLC (ang. high performance liquid chromatography), którą wykryto bezpośrednio kwasy mykolowe charakterystyczne dla Mycobacterium
tuberculosis complex [21].
Technika PCR, chociaż coraz powszechniej stosowana
w diagnostyce gruźlicy, ma pewne ograniczenia. Podstawowe z nich polega na tym, że techniką tą wykrywa się zarówno żywe, jak i martwe prątki. Poza tym reakcja amplifikacji
może być hamowana przez inhibitory znajdujące się w badanych próbkach, co wiąże się z ryzykiem uzyskania fałszywie ujemnych wyników [40].
443
Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy
RT-PCR
Metody biologii molekularnej, takie jak PCR są szeroko stosowane do wykrywania DNA mikroorganizmów powodujących infekcje. Metody polegające na wykrywaniu DNA nie
pozwalają jednak na stwierdzenie czy w badanym materiale obecne są żywe komórki bakterii wywołujących infekcje. Rozwiązaniem tego niezwykle istotnego problemu jest
opracowanie technik, w których materiałem wyjściowym jest
bakteryjny mRNA. Bakteryjny mRNA ma bardzo krótki okres
półtrwania, wynoszący średnio kilka minut.
Stosując technikę RT-PCR można stwierdzić obecność żywych komórek w badanym materiale. Metodę tę zastosowano m. in. do eksperymentalnego wykrywania mRNA genu
kodującego antygen 85B M. tuberculosis [26].
Opracowano również metodę STN RT–PCR (ang. single–tube nested RT–PCR - jednostopniowy gniazdowy RT-PCR)
wykorzystywaną w badaniach naukowych do wykrywania
mRNA genu kodującego antygen 85B M. tuberculosis. Specyficzność metody wynosiła 100%, a w materiale klinicznym
(plwocina) wykrywano nawet 12 CFU (ang. colony forming
unit - jednostka tworząca kolonię) [20].
Technika mikromacierzy (chipów):
Technika mikromacierzy może być stosowana do wykrywania prątków, ich identyfikacji do gatunku [18, 23], a także do
oceny ich oporności na leki [12].
Opracowano metodę szybkiego wykrywania prątków gruźlicy bezpośrednio w materiałach klinicznych metodą mikromacierzy (ang. gene chip, array, microarray). Skonstruowano
macierz membranową wykorzystując sekwencje fragmentów
13 genów prątków gruźlicy. Poziom wykrywalności prątków
gruźlicy w 80 próbkach plwociny, z których uzyskano wzrost
prątków w hodowli wynosił 85% i był wyższy, niż w przypadku użycia metody PCR-RFLP (62.5%) i techniki barwienia
prątków kwasoopornych (70%) [7].
Zhu i wsp. opracowali metodę macierzy (ang. biochip) pozwalającą na równoczesną identyfikację 17 pospolitych gatunków prątków wykorzystując różnice w obrębie ich 16S
rRNA. Badaniu można poddać bezpośrednio próbki kliniczne (plwocina) lub wyizolowane kolonie bakterii. Całkowity
czas trwania badania wynosi 6 godzin [37].
Dotąd nie opracowano komercyjnego testu wykrywania prątków gruźlicy techniką mikromacierzy.
Wykrywanie lekooporności prątków gruźlicy z zastosowaniem metod molekularnych:
Od około 20 lat metody biologii molekularnej stosowane są
do wykrywania oporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze. Jest to nowy i wielce obiecujący kierunek badań. Ze
względu na rozprzestrzenianie się szczepów wielolekoopornych i niedostatek leków pierwszej linii, ten kierunek badań
cieszy się szczególnym zainteresowaniem [9].
W Hiszpanii, w ciągu 7 lat zbadano fenotyp lekowrażliwości
w 964 izolatach M. tuberculosis. 3.9% izolatów było opornych na rifampicynę, 8,2% na izoniazyd, a 3,2% wykazywało
oporność przynajmniej na dwa wymienione chemioterapeutyki (szczepy wielolekooporne). W badaniach zastosowano
444
3 metody molekularne: SSCP (ang. single strand conformation polymorphism - polimorfizm konformacji pojedynczych
łańcuchów), RFLP (ang. restriction fragment length polymorphisms - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych)
oraz analizę sekwencyjną. Stwierdzono obecność kilku różnych mutacji w genach rpoB, katG oraz inhA. W obrębie promotora genu ahpC nie znaleziono mutacji [32].
Testy komercyjne gMTBDR(+), INNO-LiPA Rif.TB (INNO-LiPA; Innogenetics, Belgia), a także analizę RLFP oraz bezpośrednie sekwencjonowanie genów katG, rpoB i rpsL prątków
gruźlicy przeprowadzali też w celu wykrycia szczepów wielolekoopornych Al-Mutairi i wsp. [1].
Zatwierdzone przez WHO metody molekularne to metody komercyjne wykorzystujące sondy (LPAs, ang., molecular line
probe assays) do wykrywania prątków lekoopornych, takie jak
MDR-TB GenoType MTBDRplus (Hain Lifescience, Nehren,
Niemcy) i INNO-LiPA Rif TB (Innogenetics, Belgia) [33].
Evans i wsp. wykorzystali metodę dHPLC (ang. denaturating
HPLC – denaturujący HPLC) do wykrywania mutacji w DNA
prątków związanych z opornością na rifampicynę. Najpierw
metodą PCR amplifikowano fragment genu rpoB o długości
400 par zasad, a następnie, wykorzystując fragmenty DNA
o znanej sekwencji uzyskiwano heterodupleksy, które analizowano metodą dHPLC. Stwierdzono, że metoda jest czuła
i specyficzna, i może być wprowadzona rutynowej diagnostyki laboratoryjnej gruźlicy [15].
Do wykrywania gruźlicy wielolekoopornej zastosowano
również mikromacierze umożliwiające wykrywanie mutacji
w genie rpoB związanej z opornością na rifampicynę oraz
mutacji w genach katG i inhA, odpowiedzialnych za oporność na izoniazyd. Stwierdzono, że metoda mikromacierzy
to metoda szybka, wydajna, specyficzna i czuła, i można ją
z powodzeniem zastosować w diagnostyce gruźlicy wielolekoopornej [36].
Gruźlica, chociaż jest chorobą wyleczalną, w dalszym ciągu pozostaje ważną, infekcyjną przyczyną śmierci ludzi
na całym świecie. Mimo inwestycji i ogromnego postępu
w diagnostyce (co opisano pokrótce w niniejszej pracy) oraz
terapii (np. program terapii nadzorowanej DOTS (ang. directly observed therapy), niedostateczna liczba wykrywanych
przypadków gruźlicy jest głównym problemem w globalnej
kontroli tej choroby. Jak dotąd, nie nastąpił przełomowy, zdecydowany krok w kierunku eliminacji gruźlicy.
Co niezwykle ważne, w ciągu minionej dekady opracowano
wiele obiecujących technik diagnostycznych. Jednak, poza
nowoczesnymi, czułymi, drogimi automatycznymi platformami molekularnymi do wykrywania prątków gruźlicy i oceny
ich wrażliwości na leki, brakuje w dalszym ciągu prostego,
niedrogiego, szybkiego testu diagnostycznego, umożliwiającego wykrywanie prątków gruźlicy w warunkach terenowych,
w krajach biednych, których nie stać na inwestycje w drogą
aparaturę do diagnostyki molekularnej oraz przeszkolenie
i utrzymywanie wyspecjalizowanej w badaniach molekularnych kadry medycznej [34].
J. Pendzich, W. Maksymowicz-Mazur i J. Kozielski
Piśmiennictwo
1. Al-Mutairi NM, Ahmad S, Mokaddas E. Performance comparison
of four methods for detecting multidrug-resistant Mycobacterium
tubrculosis strains. Int J Tuberc Lung Dis 2011; 15: 110-115.
2. Augustynowicz-Kopeć E, Zwolska Z. Postępy w diagnostyce
i epidemiologii molekularnej Mycobacterium tuberculosis. Post
Mikrobiol 2010; 49: 151-156.
3. BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit: Becton, Dickinson and
Company, 7 Loveton Circle Sparks, MD 21152 USA 800-6388663 www.bd.com/ds (stan na lipiec 2011).
4. Balsega E, Margall N, Barnadas M i wsp. Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in Lobular Granulomatous Panniculitis (Erythema Induratum – Nodular Vasculitis). Arch Dermatol
1997; 133: 457 – 462.
5. Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D i wsp. Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance. N Engl J Med
2010; 363: 1005–1015.
6. Bradshaw L, Davies E, Devine M i wsp. The role of the Interferon Gamma Release Assay in Assessing Recent Tuberculosis
Transmission in a Hospital Incident. PloS One 2011; 6: 6.
7. Chang HJ, Huang MY, Yeh CS i wsp. Rapid diagnosis of tuberculosis directly from clinical specimens using a gene chip. Clin
Microbiol Infect 2010, 16: 1090-1096.
8. Cheng G, He YS, Zhou XY i wsp. Development and clinical trial
of fluorescence PCR diagnostic kit to detect Mycobacterium tuberculosis. Di Yi Jun Yi Da Xue Bao 2002; 22: 533 – 535.
9. Collazos J. Molecular Biology Applied to Tuberculosis: The Third
Landmark. Chest 1996; 110: 1381 – 1382.
10. Cormican M, Glennon M, Riain UN i wsp. Multiplex PCR for
identifying mycobacterial isolates. J Clin Pathol 1995; 48: 203
– 205.
11. Demkow U. Testy uwalniania interferonu gamma nowym narzędziem do wykrywania ukrytego zakażenia prątkiem gruźlicy.
Pneumonol Alergol Pol 2011; 79: 261–263.
12. Deng JY, Zhang XE, Lun HB i wsp. Multiplex detection of mutations in clinical isolates of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by short oligonucleotide ligaton assay on DNA chips.
J Clin Microbiol 2004; 42: 4850-4852.
13. Dinnes J, Deeks J, Kunst H i wsp. A systematic review of rapid
diagnostic tests for the detection of tuberculosis Infection. Health
Technol Assess 2007; 11: 1-196.
14. Efthimiou P, Sood S. Quantiferon TB gold test: The new standard for screening of latent tuberculosis in patients with rheumatoid arthriti? Ann Rheum Dis 2007; 66: 276.
15. Evans JT, Parveen A, Smith GE i wsp. Application of denaturing HPLC to rapidly identify rifampicin-resistant Mycobacterium
tuberculosis in low- and high-prevalence areas. J Antimicrobial
Chemotherapy 2009; 63: 295–301.
16. Franco-Alvarez de Luna F, Ruiz P, Gutierrez J i wsp. Evaluation of the GenoType Mycobacteria Direct Assay for Detection
of Mycobacterium tuberculosis Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical Samples. J Clin Microbiol 2006;
44: 1095-1137.
17. Frevel T, Schäfer KL, Böcker W, Dockhorn – Dworniczak B. PCR
based detection of mycobacteria in paraffin wax embedded material routinely processed for morphological examination. Mol
Pathol 1999; 52: 283 – 288.
18. Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H i wsp. Detection and
identification of Mycobacterium tuberculosis Species Isolates by
DNA Microarray. J Clin Microbiol 2003; 41: 2605-2615.
19. Garbacz K, Piechowicz L, Galiński J i wsp. Zastosowanie metody PCR do wykrywania Mycobacterium tuberculosis – complex
w różnych materiałach klinicznych. Diagn lab 2001; 37: 493
– 498.
20. Gladwin MT, Plorde JJ, Martin TR. Clinical Application of the
Mycobacterium tuberculosis Direct Test: Case Report, Literature Review, and Proposed Clinical Algorithm. Chest 1998; 114:
317 – 323.
21. Hershkovitz I, Donoghue HD, Minnikin DE i wsp. Detection and
Molecular Characterization of 9000-Year-Old Mycobacterium
tuberculosis from a Neolithic Settlement in the Eastern Mediterranean. PLoS ONE 2008; 3: 1-6.
22. Higurashi Y, Miyake K, Okuzumi K i wsp. Reliability of Amplicor
Mycobacteria Kit for detection of M. tuberculosis complex and
M. Intracellulare: results of cooperative study among 331 laboratories in 2000. Kekkaku 2002; 77: 449 – 455.
23. Kostić T, Weilharter A, Rubino S i wsp. A microbial diagnostic microarray technique for the sensitive detection and identification
of pathogenic bacteria in a background of nonpathogens. Anal
Biochem 2007; 360: 244-254.
24. Kuś J. Leczenie gruźlicy. W: Rowińska-Zakrzewska E. (red.)
Gruźlica w praktyce lekarskiej. Wyd. 1. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2000.
25. Lachnik J, Ackerman B, Bohrssen A i wsp. Rapid – cycle PCR
and fluorimetry for detection of mycobacteria. J Clin Microbiol
2002; 40: 3364 – 3373.
26. Negi SS, Anand R, Pasha ST, Gupta S, Basir SF, Khare S,
Lal S. Diagnostic potential of IS6110, 38kDa, 65kDa and 85B
sequence-based polymerase chain reaction in the diagnosis of
Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Indian J Med
Microbiol 2007; 25: 43-49.
27. Safianowska A, Walkiewicz R, Nejman-Gryz P i wsp. Diagnostic utility of the molecular assay GenoType MTBC (HAIN Lifescience, Germany) for identification of tuberculous mycobacteria. Pneumonol Alergol Pol 2009; 77: 517–520.
28. Shimada M, Hino F, Sagawa H i wsp. Development of the detection system for Mycobacterium tuberculosis DNA by using the
isothermal DNA amplification method ICAN. Rinsho Byori 2002;
50: 528 – 532.
29. Shin AR, Shin SJ, Lee KS i wsp. Improved Sensitivity of Diagnosis of Tuberculosis in Patients in Korea via a Cocktail EnzymeLinked Immunosorbent Assay Containing the Abundantly Expressed Antigens of the K Strain of Mycobacterium tuberculosis.
Clin Vacc Immunol 2008; 15: 1788–1795.
30. Steingart KR, Henry M, Laal S i wsp. Commercial Serological
Antibody Detection Tests for the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis: A Systematic Review PloS Medicine 2007; 4: 10411060.
31. Szarapińska-Kwaszewska J. Diagnostyka gruźlicy i mykobakterioz. W: Szewczyk EM. Diagnostyka bakteriologiczna. PWN
Warszawa 2005; 269-279.
32. Torres MJ, Criado A, Gonzalez N i wsp. Rifampin and isoniazid
resistance associated mutations in Mycobacterium tuberculosis
clinical isolates in Seville, Spain. Int J Tuberc Lung Dis. 2002;
6: 160-163.
33. Van Rie A, Page-Shipp L, Scott L i wsp. Xpert® MTB/RIF for
point-of-care diagnosis of TB in high-HIV burden, resource-limited countries: hype or hope? Expert Rev Mol Diagn 2010; 10:
937–946.
34. Wallis RS, Pai M, Menzies D i wsp. Tuberculosis 4. Biomarkers
and diagnostics for tuberculosis: progress, needs, and translation into practice. Lancet 2010; 375: 1920–37.
35. WHO. Strategic and Technical Advisory for Tuberculosis. Report of the Ninth Meeting. 9–11 November 2009. WHO, Geneva,
Switzerland, 2009.
36. Yao C, Zhu T, Li Y i wsp. Detection of rpoB, katG and inhA gene
mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from
Chongqing as determined by microarray. Clin Microbiol Infect
2010; 16: 1639–1643.
37. Zhu L, Jiang G, Wang S i wsp. Biochip System for Rapid and
Accurate Identification of Mycobacterial Species from Isolates
and Sputum. J Clin Microbiol 2010; 48: 3654–3660.
38. Zwolska Z. Robert Koch-twórca bakteriologii chorób zakaźnych.
VIA MEDICA Gdańsk 2006.
445
Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy
39. Zwolska Z. Koch i jego dokonania-rys historyczny. Post Mikrobiol 2010; 3: 139-150.
40. Zwolska Z. Mikrobiologia gruźlicy. W: Rowińska-Zakrzewska E.
(red. nacz.) Gruźlica w praktyce lekarskiej. PZWL Warszawa
2000: 13-30.
41. Zwolska Z. Współczesne problemy diagnostyki mikrobiologicznej gruźlicy. Medycyna po Dyplomie. Wydanie Specjalne: Mikrobiologiczna diagnostyka gruźlicy. Luty 2005; 49-55.
42. Zwolska Z, Augustynowicz-Kopeć E, Lange J i wsp. Przewlekłe
zakażenia układu oddechowego. W: Materiały z kursu pt. Wybrane zagadnienia mikrobiologicznej diagnostyki gruźlicy. Kierownik naukowy: prof. dr hab. Z. Zwolska. Zakład Mikrobiologii
IGiCHP. Marzec 2008; 237-272.
Zaakceptowano do publikacji: 22.09.2011
Adres do korespondencji:
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny
41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1
tel. (32) 364 10 21, fax (32) 364 10 20
e-mail: [email protected]
446