Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej

Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki
roślinnej i zwierzęcej
METODY BADANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH:
1. TECHNIKI MIKROSKOPOWE
A. MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA
Mikroskop elektronowy jest urządzeniem, którego zakres rozdzielczości wynosi 0,2-20 nm, co
umoŜliwia oglądanie organelli komórkowych, wirusów i makrocząsteczek biologicznych (np. DNA),
niemniej jednak ograniczeniem mikroskopu elektronowego jest brak moŜliwość oglądania próbek
materii Ŝywej.
Najbardziej popularną techniką uwidaczniania DNA jest metoda Klein-Schmidta. W tej technice
kroplę roztworu DNA w octanie amonu zawierającym cytochrom c, nanosi się na powierzchnię octanu
amonu. Po dotknięciu przez kroplę powierzchni, tworzy się na niej cienki film zdenturowanego
cytochromu c. Film ten zawiera pewną ilość cząsteczek DNA, do której przyłącza się cienka warstwa
cytochromu. JeŜeli do tego filmu zostanie przyłoŜony mały obiekt kulisty, to dołączy się do niego kropla
zawierająca część filmu. Usunięcie fazy wodnej np. poprzez zanurzenie w alkoholu, spowoduje stabilne
przyleganie warstwy do filmu pokrywającego kulisty obiekt. Technika ta zawiera wstępne barwienie
pozytywne, np. octanem uranu. Metoda ta jest stosowana do określania długości i formy DNA.
Zmodyfikowana metoda Klein-Schmidta pozwala natomiast zlokalizować specyficzne obszary w DNA
m.in. określić pozycje końców liniowego DNA w formie kolistej, identyfikować bardzo długie
cząsteczki izolowane z E.coli zainfekowanych fagiem λ oraz określić kierunek replikacji DNA faga λ.
B. SKANINGOWA MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA
Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwala na badanie cech strukturalnych obiektów
biologicznych o wymiarach 3-20 nm w buforach czy w warunkach zbliŜonych do fizjologicznych.
Znalazła ona zastosowanie w badaniach nad zginaniem DNA na skutek róŜnych oddziaływań z
białkami, oddziaływaniem przeciwciał z róŜnymi formami DNA, w analizie relacji stechiometrycznych
kompleksów białek z kwasami nukleinowymi i badaniach struktury chromatyny.
C. MIKROSKOPIA SKANINGOWO-TUNELOWA
Mikroskopia skaningowo-tunelowa jest precyzyjną techniką charakteryzującą się wysoką
rozdzielczością - co najmniej 0,02×0,3 nm, pozwalająca uzyskiwać obraz trójwymiarowy. Za pomocą
mikroskopu skaningowo-tunelowego bada się m.in. kompleksy białek z kwasami nukleinowymi oraz
topografię DNA.
2. ELEKTROFOREZA
Elektroforeza jest obecnie jedna z głównych metod identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania
kwasów nukleinowych. W wersji podstawowej jest to prosta i szybka technika uŜywana do rozdzielania
1
cząsteczek DNA, które nie mogą być rozdzielone innymi technikami np. przez wirowanie w gradiencie
gęstości.
Do fizycznego opisu elektroforezy słuŜą takie parametry jak: wielkość molekularna DNA - ND,
średnia wielkość porów w Ŝelu - α, natęŜenie pola elektrycznego - ε;
ND ≡
MD
a
QaEa
;α ≡ ; ε ≡
Ma
bD
2kBT
gdzie Ma jest wielkością fragmentów DNA, które „pasują” do typowej wielkości porów Ŝelu a,
Qa = MalDλD – ładunek cząsteczki o wielkości scharakteryzowanej przez Ma.
A. ELEKTROFOREZA W śELU AGAROZOWYM
Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów. Jest to polisacharyd zbudowany z około
800 liniowo połączonych reszt heksozy (inaczej – 400 reszt agarobioza). Agarobioza jest dwucukrem
zbudowanym z D-galaktozy i 3,6-anhydro-L-galaktozy. Powstawanie Ŝelu agarozowego jest reakcją
odwracalną, w wyniku której pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową,
helikalną strukturę III-rzędową, które rozgałęziają się tworząc sieć. Wielkość porów Ŝelu agarozowego
zaleŜy od stęŜenia agarozy i określa zakres cięŜaru makrocząsteczek np. DNA, RNA, które moŜna w
niej elektroforetycznie rozdzielać.
śel agarozowy stosuję się do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Wadą
elektroforezy w Ŝelu agarozowym jest słaba rozdzielczość frakcji DNA róŜniącego się poniŜej 5%
wielkości.
StęŜenie agarozy [%] Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA [kp.z]
0,3
5-60
0,6
1-20
0,7
0,8-10
0,9
0,5-7
1,2
0,4-6
1,5
0,2-3
2,0
0,1-2
Elektroforeza w Ŝelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział
elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM
EDTA, pH 8) lub TAE×1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8).
Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc
umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody. DNA o tych samych masach
cząsteczkowych, ale róŜnych konformacjach charakteryzuje róŜna ruchliwość elektroforetyczna. Im
dłuŜsza jest cząsteczka DNA lub RNA tym dłuŜej odnajduje ona drogę poprzez pory Ŝelu. JeŜeli
umieścimy DNA w Ŝelu agarozowym i przyłoŜymy niskie napięcie to prędkość migracji DNA o róŜnych
cięŜarach cząsteczkowych jest proporcjonalna do napięcia. Aby otrzymać optymalny rozdział DNA o
wielkości większej niŜ 2 kp.z, elektroforeza prowadzona jest w polu elektrycznym o natęŜeniu nie
większym niŜ 5V/cm. PowyŜej tego napięcia fragmenty DNA przemieszczają się z prędkością
odwrotnie proporcjonalną do logarytmu ich cięŜaru cząsteczkowego. Elektroforetyczne zachowanie
DNA w Ŝelu agarozowym nie zaleŜy od składu zasad azotowych i słabo zaleŜy od temperatury. Jednak
jeŜeli stosuje się Ŝele agarozowe o stęŜeniu mniejszym niŜ 0,5% naleŜy elektroforezę prowadzić w
temperaturze około 4°C.
Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny
(EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo EtBr do
jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). NaleŜy pamiętać, Ŝe obecność związku interaklującego do
DNA w Ŝelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. Innym
2
barwnikiem DNA jest np. SYBR Green, którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25
razy większa niŜ EtBr.
B. ELEKTROFOREZA W śELU POLIAKRYLAMIDOWYM (PAGE)
Elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym jest wykorzystywana do rozdzielania i analizy małych
fragmentów DNA lub białek. Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niŜ 1000
par zasad. W Ŝelach tych moŜna efektywnie rozdzielać takŜe jednoniciowe fragmenty DNA i RNA.
śel poliakrylamidowy powstaje w wyniku polimeryzacji N,N’-metylenobisakrylamidu z monomerami
akryloamidu w obecności wolnych rodników dostarczonych przesz nadsiarczan amonu i
stabilizowanych przez TEMED (N,N,N’,N’-tetrametylenodiamina). Stopień usieciowana Ŝelu (udział
procentowy N,N’-metylenobisakrylamidu) stanowi czynnik wpływający na rozdzielenie fragmentów
jednoniciowego DNA.
Elektroforezę w Ŝelach poliakrylamidowych prowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo,
a więc migracja cząsteczek DNA jest zgodna z kierunkiem siły ciąŜenia, gdzie jednoniciowe DNA
charakteryzują się spowolnioną, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracja w Ŝelu. Rozdział
elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1. DNA w Ŝelu poliakrylamidowym moŜna
wybarwiać za pomocą np. EtBr lub Sybr Gold.
StęŜenie poliakrylamidu [%] Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA [kp.z]
3,5
5,0
8,0
12,0
15,0
20,0
-
1000-2000
80-500
60-400
40-200
25-150
6-100
śele poliakrylamidowe mają przewagę nad Ŝelami agarozowymi z kilku przyczyn:
zdolność rozdzielcza Ŝeli poliakrylamidowych jest tak duŜa, Ŝe moŜna rozdzielać cząsteczki DNA
róŜniące się o 1 p.z.
studzienkę Ŝelu poliakrylamidowego moŜna załadować znacznie większą ilością DNA niŜ w Ŝelu
agarozowym
DNA odzyskany z Ŝelu poliakrylamidowego jest czysty (nie wymaga dodatkowego czyszczenia przy
stosowaniu w biologii molekularnej)
C. ELEKTROFOREZA W POLU PULSYJĄCYM (PFGE)
Elektroforeza w polu pulsującym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o bardzo
duŜej masie cząsteczkowej, np. DNA chromosomalnego wyŜszych eukariota, którego długość wynosi
powyŜej 7000 p.z. W metodzie tej zastosowano zmienne, pulsujące, wzajemnie prostopadłe pole
elektryczne. Cząsteczki DNA znajdujące się w Ŝelu, do którego zostanie przyłoŜone takie pole,
potrzebuje czasu aby zmienić swoje ułoŜenie na zgodne z orientacją pola. Czas ten jest tym dłuŜszy im
większa jest masa cząsteczki, a DNA będzie rozdzielana według masy, poniewaŜ czas trwania impulsu
elektrycznego jest krótszy niŜ czas potrzebny na reorientacje cząsteczki DNA w Ŝelu. Granica
rozdzielczości elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym zaleŜy m.in. od stopnia jednorodności
stosowanych pól elektrycznych, długości trwania impulsu, względnych wartości natęŜenia obydwu pól.
D. ELEKTROFOREZA W POLU INWERSYJNYM (FIGE)
Elektroforeza w polu inwersyjnym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o długości
20-2000 p.z., przy czym rozdzielczość tej metody jest około 100-krotnie wyŜsza niŜ w przypadku
zwykłej elektroforezy agarozowej. Zastosowano tu elektryczne pole inwersyjnym którego wektor
natęŜenia pola zmienia zwrot na przeciwny w określonych momentach. Stosunek czasu trwania impulsu
dodatniego do ujemnego wynosi 3:1, a wartości bezwzględne natęŜenia pola obydwu impulsów są
3
równe. Podczas elektroforezy w polu inwersyjnym łańcuchy DNA ulegają cyklicznym, synchronicznym
zmianom konformacyjnym, które trwają do chwili zmiany zwrotu wektora natęŜenia pola elektrycznego
na przeciwny.
E. ELEKTROFOREZA KAPILARNA (CE)
Elektroforeza kapilarna jest stosowana do analizy krótkich, jednoniciowych oligonukleotydów
oraz sekwencjonowania DNA. W elektroforezie kapilarnej stosuje się kolumny (kapilary), których
wewnętrzna średnica wynosi najczęściej 50-100 µm, natęŜenie prądu 10-20 µA, a natęŜenie pola
elektrycznego w Ŝelu około 300 V/cm przy zastosowaniu buforu o niskiej przewodności. W tej
elektroforezie wykorzystano efekt elektrosomozy. Kapilary wykonane są ze stopionej krzemionki, która
zawiera wolne grupy silanolowe ulegające jonizacji pod wpływem działania elektrolitu o pH<2, na
skutek czego wewnętrzna powierzchnia kapilar zostaje naładowana ujemnie, a gęstość jej ładunku
zaleŜy od pH. Przylegająca warstwa jonów dodatnich z roztworu znajdującego się w kapilarze po
przyłoŜeniu pola elektrycznego porusza się, powodując przepływ cieczy z zewnętrznego zbiornika przez
kapilary. Detekcja odbywa się najczęściej przez monitorowanie absorbancji UV na kolumnie. Objętość
próbki jest rzędu nanolitrów, co pozwala analizować składniki pojedynczych komórek.
F. ELEKTROFOREZA W śELACH DENATURUJĄCYCH (CGGE)
Elektroforeza w Ŝelach denaturujących jest głównie wykorzystywana do wykrywania i analizy
mutacji. Wykorzystuje się tu fakt, Ŝe temperatura topnienia wiązań wodorowych między zasadami
azotowymi DNA zaleŜy od składu zasad komplementarnych nici. Stosuje się tu czynnik denaturujący,
głównie mocznika lub formamidu. Elektroforeza prowadzona jest w temperaturze bliskiej temperaturze
topnienia danego DNA, zazwyczaj w 55-60°C. Temperatura topnienia DNA zaleŜy od składu ilościowo
puryn i pirymidyn w DNA (temperatura topnienia dla G i C jest wyŜsza niŜ dla A i T).
3. SPEKTROSKOPIA ABSORPCYJNA
W pomiarach spektroskopowych zasadnicze znaczenie ma znajomość stęŜeń molowych kwasów
nukleinowych. StęŜenie moŜna otrzymać z pomiaru absorpcji przy długości fali
λ = 260 nm (maksymalna absorpcja promieniowania nadfioletowego przez DNA), jeŜeli znamy molowy
współczynnik ekstynkcji ε:
A260
C=
ε •l
gdzie l – to długość drogi optycznej w kuwecie. Przyjmuje się, ze wartości współczynnika ekstynkcji
wynosi 6600 M-1cm-1.
Widmo absorpcji moŜe być wykorzystane do określenia stęŜenia i czystości próbki DNA. Pomiar
stęŜenia DNA w roztworze oznacza się poprze pomiar absorpcji przy długości fali λ = 260 nm,
określanej często jako OD – gęstość optyczna. Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych
DNA to bufor o niskim stęŜeniu jonów, np. bufor TE. JeŜeli A260 równa się 1 to stęŜenie dwuniciowego
DNA (dsDNA) wynosi około 50 µg/ml, jednoniciowego DNA (ssDNA) 36 µg/ml, RNA - 40 µg/ml, a
oligonukleotydów 30 µg/ml. NaleŜy jednak pamiętać, Ŝe jest to wartość przybliŜona, poniewaŜ wartość
współczynnika ekstynkcji zaleŜy od składu zasad azotowych w DNA. Stosunek A260/A280 jest natomiast
często stosowna miarą czystości roztworu DNA, a ściślej miarą zanieczyszczenia DNA białkami
(maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm). Ogólnie preparat DNA uznaje się za czysty jeŜeli
A260/A280 wynosi 1,8-2,0. JeŜeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A260/A280 jest
bliŜsza 2,0, natomiast jeŜeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A260/A280 jest niŜsza niŜ
1,8. Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące od
węglowodorów, białek lub fenolu. W przypadku czystych próbek wartość A260/A230 powinna wynosić
2,2. Absorpcja mierzona przy długości fali 325 nm moŜe być wyznacznikiem wytrąceń w roztworze lub
zanieczyszczeń samej kuwety.
4
4. MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY
Magnetyczny rezonans jądrowy ma zastosowanie w badaniach struktury Z-DNA, obszarów
przejść B→Z-DNA oraz dynamiki tych przejść. NMR stosowany jest takŜe w badaniach nad
oddziaływaniem DNA z róŜnymi ligandami np. w badaniach nad oddziaływaniem m.in. leków
przeciwnowotworowych z DNA.
5. SPEKTROSKOPIA PROMIENIOWANIA RENTGENOWSKIEGO
Spektroskopia promieniowania rentgenowskiego stosowana jest w badaniach krystalograficznych
struktury DNA, w szczegółową charakterystykę w tym błędnie tworzone pary zasad czy zasady
pozahelikalne. Za pomocą tej metody moŜna takŜe badać kompleksy DNA z róŜnymi związkami jak
substancje przeciwnowotworowe i antybiotyki.
6. SPEKTROSOKOPIA RAMANA
Spektroskopia Ramana opisuje rotacyjne i oscylacyjne widma cząsteczek. Pozwala ona na
poznanie struktury pojedynczych grup atomów w układach biologicznych, a takŜe pozwala na uzyskanie
informacji o szybkich zmianach strukturalnych zachodzących w cząsteczkach biologicznych. W
klasycznej metodzie Ramana do wzbudzenia stosowany jest laser argonowy, gdzie DNA moŜna badać w
roztworze, w formie odwodnionego włókna lub postaci krystalicznej.
7. SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI
Spektroskopia w podczerwieni była jednym z klasycznych narzędzi w badaniach nad strukturą i
oddziaływaniem małych cząsteczek takich jak jony metali czy leki łączące się z DNA poprzez
interkalację.
8. SPEKTROSKOPIA FLUORESCENCYJNA
DNA nie wykazuje mierzalnej fluorescencji wewnętrznej z wyjątkiem niskich temperatur. Z
DNA wiąŜą się natomiast znaczniki intekalatorowe jak EtBr czy barwniki akrydynowe, które
fluorescencję wykazują. Jednak mają one tę wadę, Ŝe wiąŜą się z DNA niespecyficznie wzdłuŜ całej
długości helisy. W przeciwieństwie do DNA fluorescencję wykazują białka, których fluorescencja w
wielu przypadkach nie zmienia się po związaniu z DNA.
9. DICHROIZM KOŁOWY (CD)
Dichroizm kołowy jest zjawiskiem polegającym na zróŜnicowanym oddziaływaniu cząsteczek
(chiralnych) ze światłem o róŜnej polaryzacji kołowej. Kwasy nukleinowe ze względu na strukturę
helikalną i określoną skręcalność, bardzo dobrze nadają się do badań metodą CD. Metoda ta pozwala
róŜnicować struktury zawierające pętle oraz wykazujące róŜną skręcalność. Widmo CD zaleŜy od siły
jonowej i rodzaju roztworu, w którym się znajduje. Zmiany konformacyjne w kwasach nukleinowych
moŜna badać jako funkcje temperatury, pH, rozpuszczalnika. Technika ta jest szeroko stosowana w
badaniu przejść konformacyjnych DNA takich jak denaturacja i zmiana form B→A oraz B→A czy
rozróŜnienie DNA dwuniciowego od trójniciowego. Spektroskopia znajduje takŜe szerokie zastosowanie
w badaniu oddziaływań kwasów nukleinowych z substancjami małocząsteczkowymi jak chromofory
czy leki. Technika ta znalazła takŜe zastosowanie w badaniu oddziaływań typu: białko-białko czy
białko-DNA.
5
WYKONANIE ĆWICZENIA
Materiały i sprzęt
1. Roztwór TE (10 mM Tris-base, 1mM EDTA, pH 8)
2. 1% roztwór agarozy
3. Roztwór bromku etydyny (50 mg/ml)
4. Roztwór buforu elektroforetycznego TBE×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy,
2 mM EDTA, pH 8)
5. Roztwór obciąŜający LB (50% glicerol, 0,25% błękit bromofenylowy, 1 mM EDTA)
6. Kolba Erlenmeyer'a 25 ml
7. Cylinder miarowy
8. Aparat do elektroforezy
9. Pipety automatyczne: 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml
10. Probówki eppendorf
11. Spektrofotometr UV-Vis
12. Kuwety kwarcowe
•
•
•
•
•
•
•
•
•
a. Charakterystyka wyizolowanego DNA – widmo absorpcji UV
Rozcieńczyć 1:10 roztwór DNA przy pomocy buforu TE; w razie potrzeby przygotować
rozcieńczenie 1:100.
Zmierzyć z uŜyciem kuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy długości fali 230, 260 i
280 nm, stosując bufor TE jako odnośnik.
Wyznaczyć stęŜenie DNA.
b. Elektroforeza w Ŝelu agarozowym
NawaŜkę 0,3 g agarozy rozpuścić w 30 ml buforu elektroforetycznego TBE×1 poprzez jej
zagotowanie w kuchence mikrofalowej, tak aby agaroza nie tworzyła widocznych agregatów.
Ostudzić tak przygotowany roztwór do około 50°C i dodać 1 µl bromku etydyny.
Wlać roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej formy (stolik elektroforetyczny) z
umocowanym grzebieniem formującym studzienki do nanoszeni próbek.
Po zastygnięciu agarozy zalać Ŝel buforem elektroforetycznym TBE×1. Powierzchnia buforu
powinna znajdować się około 1 mm ponad górną powierzchnią Ŝelu. Powoli wyjąć grzebień, tak
aby nie uszkodzić studzienek Ŝelu.
Wymieszać w probówce eppendorfa 10 µl wcześniej przygotowanego roztworu DNA i 5 µl
roztworu obciąŜającego LB. Dokładnie rozpipetować. Całość umieść w jednej studzience Ŝelu.
Podłączyć elektrody aparatu elektroforetycznego do zasilacza. Elektroforezę prowadzić przez 3060 min przy napięciu 90 V.
Obejrzeć Ŝel umieszczony na transiluminatorze emitującej światło nadfioletowe λ = 302-312 nm.
Opracowanie wyników
1) Obliczyć stosunek absorpcji roztworu DNA przy 230, 260 i 280 nm (A260/A280, A260/A230).
Skomentować róŜnicę pomiędzy otrzymaną wartością a wielkością charakterystyczną dla
wysoce oczyszczonego DNA.
2) Obliczyć stęŜenie DNA (mg/ml) w roztworze TE i na tej podstawie całkowitą ilość otrzymanego
DNA i wydajność oczyszczania dla ludzkich komórek nowotworowych (A260 = 1 to CdsDNA = 50
µg/ml; 1 mln komórek ≈ 6 µg DNA)
3) Porównać wydajność i czystość DNA izolowanego z komórek roślinnych i zwierzęcych.
6
Literatura
1. Bryszewska M., Leyko W.: Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów, Warszawa: PWN 2000;
2. Techniki analizy i detekcji kwasów nukleinowych i białek, kurs zorganizowany przez Katedrę
Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Akademii Rolniczej w Poznaniu, 2003
3. Techniki elektroforetyczne oraz produkcja i oczyszczanie białek rekombinowanych, kurs
organizowany przez DNA-Gdańsk, 1998
7