Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w

Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w

Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 3, zeszyt 2, 108-116, 2010
Zastosowanie nowoczesnych technik
cytogenetyki molekularnej w diagnostyce
wrodzonych wad rozwojowych
KRZYSZTOF SZCZAŁUBA, EWA OBERSZTYN, TADEUSZ MAZURCZAK
Streszczenie
W patomechanizmie wad rozwojowych istotną rolę odgrywają czynniki genetyczne, a wśród nich aberracje chromosomowe. Do niedawna ich identyfikacja możliwa była jedynie poprzez zastosowanie rutynowych technik diagnostyki cytogenetycznej, takich jak analiza prążkowa chromosomów. W świetle udokumentowanych w ostatnich latach możliwości diagnostycznych, jakie stwarzają technika
fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), MLPA oraz najnowsza technika porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy (aCGH), należy przypuszczać, że submikroskopowe rearanżacje chromosomowe, takie jak mikrodelecje i mikroduplikacje, spełniają ważną rolę w etiopatogenezie wrodzonych wad rozwojowych. U większości chorych dzieci, w tym noworodków, przyczyna
wystąpienia wad rozwojowych, które fenotypowo nie odpowiadają określonym zespołom genetycznym, pozostaje nieznana. Wiele
spośród tych wad, w szczególności wtedy, gdy występują w postaci mnogich wad rozwojowych, ma charakter letalny, czyli skutkuje
wczesnym zgonem dziecka, nierzadko przed wdrożeniem procesu diagnostycznego. W pracy przedstawiono obecny stan wiedzy
na temat przydatności nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w identyfikacji przyczyn wrodzonych wad rozwojowych.
Zaproponowano także sposób postępowania diagnostycznego w przypadku stwierdzenia dużej wady rozwojowej lub mnogich wad
wrodzonych u noworodka.
Słowa kluczowe: wada rozwojowa, aberracja chromosomowa, FISH, MLPA, CGH
Wrodzone wady rozwojowe jako problem kliniczny
Termin wrodzona wada rozwojowa oznacza wewnętrzną lub zewnętrzną nieprawidłowość morfologiczną dotyczącą struktur ciała, powstałą w okresie życia wewnątrzmacicznego i obecną przy urodzeniu, niezależnie od patogenezy, etiologii i czasu rozpoznania [1]. W praktyce klinicznej jest więc to każde wrodzone odstępstwo od prawidłowej budowy anatomicznej powstałe w wyniku zaburzenia złożonych mechanizmów rozwojowych na różnych
etapach embriogenezy. Wśród nich wymienia się: deformacje, malformacje, przerwania i dysplazje [2]. Wrodzone
wady rozwojowe mogą występować pojedynczo jako wady izolowane lub jako wady mnogie (wielowadzie). Szacuje się, że 2/3 wszystkich wad rozwojowych to wady izolowane, a pozostałą 1/3 stanowią mnogie wady wrodzone.
Według Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych (PRWWR) wada izolowana to jedna lub kilka wad
w obrębie jednego układu [3]. Wielowadzie definiowane
jest natomiast jako obecność dwóch lub więcej dużych
wad rozwojowych dotyczących co najmniej dwóch z wymienionych układów: sercowo-naczyniowego, moczowopłciowego, szkieletowego, pokarmowego, oddechowego
lub ośrodkowego układu nerwowego. W zależności od
patogenezy, wyróżnia się różnego typu defekty morfologiczne występujące pod postacią mnogich wad rozwojowych, takie jak zespoły, sekwencje, skojarzenia (asocjacje)
oraz kompleksy wad wrodzonych [2]. Do najlepiej poznanych zespołów wad, czyli różnych defektów morfologicznych o wspólnej, najczęściej genetycznej etiologii należą
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie
m.in. zespół Downa, Edwardsa, Williamsa lub Smitha-Lemlego-Opitza. W sekwencjach (np. Potter lub Pierre‘a Robina) pojedynczy defekt (np. agenezja nerek lub małożuchwie) zapoczątkowuje kaskadę określonych wad rozwojowych. Skojarzenie wad oznacza nielosowe, częstsze
niż przypadkowe i niestałe występowanie wad o nieznanej
etiologii (np. w asocjacji VATER, w której współistnieją wady kręgów, zarośnięcie odbytu, przetoka tchawiczo-przełykowa, wady nerek). Termin określający skojarzenie jest zazwyczaj akronimem pochodzącym od nazw występujących w nim wad.
Duże wady rozwojowe, czyli takie, które powodują poważne następstwa dla zdrowia płodu lub noworodka
w wielu przypadkach mają charakter letalny. Z kolei, małe
wady (tzw. drobne anomalie lub cechy dysmorficzne) z reguły nie zagrażają życiu lub zdrowiu, jednak mogą mieć
znaczenie w diagnostyce tzw. zespołów dysmorficznych.
Do tej grupy zalicza się takie anomalie jak m.in. polidaktylia, syndaktylia, wyrośla przeduszne, hiperteloryzm lub
szczelina tęczówki.
W praktyce klinicznej i poradnictwie genetycznym uznaje się, iż pojedyncza wada rozwojowa u prawidłowo fizycznie i umysłowo rozwijającej się osoby ma etiologię
wieloczynnikową. Oznacza to, że o powstaniu izolowanej
wady wrodzonej decyduje predyspozycja genetyczna
uwarunkowana obecnością zmian w wielu genach i wyzwalana działaniem trudnych do zdefiniowania czynników
środowiskowych. Nierzadko jednak z pojedynczym defektem rozwojowym (lub częściej z wielowadziem) współ-
Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych
istnieje niepełnosprawność intelektualna, zaburzenia rozwoju fizycznego oraz cechy dysmorfii (z ang. Multiple Congenital Anomalies/Mental Retardation syndromes – MCA/
MR). Identyfikacja u chorego dziecka powyższych objawów powinna sugerować podejrzenie choroby jednogenowej lub zespołu aberracji chromosomowej (tzw. fenotyp chromosomowy).
Przytoczona powyżej klasyfikacja wad rozwojowych
częściowo uwzględnia ich patogenezę. Przyjmuje się, iż do
rozwoju wady przyczyniają się zarówno czynniki egzo-, jak
i endogenne, co ilustruje tabela 1. Zgodnie z przytoczonymi w niej danymi, aż w 70% przypadków etiologia wad
rozwojowych pozostaje nieznana, a jedynie u 30% chorych
możliwe jest ustalenie ich przyczyny. Warto zaznaczyć, iż
przedstawione w tabeli 1 dane oznaczają relatywny wpływ
danego czynnika w odniesieniu do ogólnej częstości wad
rozwojowych, bez uwzględnienia podziału na wady izolowane i mnogie.
Tabela 1. Czynniki etiologiczne wrodzonych wad rozwojowych
[28]. W tabeli nie uwzględniono podziału na wady izolowane
lub mnogie (komentarz w tekście)
nieznane
1 (w tym prawdopodobne uwarunkowanie
wielogenowe lub wieloczynnikowe)
2
genetyczne, w tym:
2a jednogenowe
2b aberracje chromosomowe
środowiskowe
(w tym choroby matki, leki, infekcje,
3
substancje chemiczne, hipertermia,
czynniki mechaniczne)
70%
20%
15%
5%
10%
Zgodnie z danymi PRWWR dotyczącymi obszaru 13
województw Polski w latach 2003-2004, częstość występowania wszystkich dużych wad rozwojowych wynosiła
200,1 na 10 000 urodzeń, co oznacza, że w Polsce rodzi się
rocznie ponad 7000 dzieci z co najmniej jedną poważną
wadą rozwojową. Wśród najczęściej występujących wad
wrodzonych wymienia się wady serca (74,4 na 10 000
żywo urodzonych noworodków), nieco rzadziej rozszczep
wargi i/lub podniebienia (15,6 na 10 000) oraz wady cewy
nerwowej (8,1 na 10 000). Poważne skutki kliniczne większości wad wrodzonych powodują, że stanowią one obecnie jedną z najczęstszych przyczyn hospitalizacji oraz
główną przyczynę śmiertelności u 20% noworodków i niemowląt [4]. W roku 2004 w USA hospitalizacje osób we
wszystkich grupach wiekowych z powodu wad rozwojowych były średnio o 1,4 dnia dłuższe (6,3 vs. 4,9) i o ponad
10 000 $ droższe (18 600 $ vs. 8200 $) w porównaniu
z wszystkimi pobytami szpitalnymi w danym okresie [5].
Poza aspektem medycznym i społecznym, jaki niesie
ze sobą urodzenie dziecka z wadą/wadami rozwojowymi,
należy zwrócić uwagę na często bardzo dramatyczny wymiar rodzinny tego problemu. Rodzice chorego dziecka
109
nie tylko pragną ustalić optymalny sposób postępowania
terapeutycznego, ale także poznać przyczynę wystąpienia
wady oraz ryzyko jej powtórzenia w przypadku kolejnej
ciąży. Tymczasem, jak wykazują badania, nawet u około
połowy chorych etiopatogeneza stwierdzanych defektów
rozwojowych pozostaje nieznana. Z badań epidemiologicznych wynika także, że około 10-15% płodów dotkniętych
jest pojedynczą lub mnogą wadą wrodzoną, podczas gdy
częstość ich występowania u żywo urodzonych noworodków wynosi 2-3%. Świadczy to o tym, że wiele spośród
tych wad ma charakter letalny, czyli skutkuje zgonem dziecka w okresie okołoporodowym zanim zostanie ustalone
rozpoznanie choroby. Bywa, że rodzina, której ten problem dotyczy, nigdy nie uzyskuje wiarygodnej, zależnej od
właściwego rozpoznania choroby, porady genetycznej.
W tym kontekście szczególne znaczenie ma znajomość nie
tylko etiologii wad wrodzonych, ale również współczesnych możliwości wykorzystania różnych metod diagnostyki cytogenetyczno-molekularnej. Ze względu na fakt, iż
to najczęściej neonatolodzy lub pediatrzy inicjują opiekę
nad rodzinami ryzyka genetycznego, powinni oni mieć
świadomość złożonych i nierzadko trudnych aspektów
poradnictwa genetycznego w tych rodzinach. Dotyczy to
w szczególności wyboru właściwych, czyli umożliwiających weryfikację rozpoznania klinicznego, badań cytogenetycznych i molekularnych, a w dalszej kolejności umiejętności interpretacji uzyskanych wyników oraz udzielenia
wiarygodnej porady genetycznej. Celem niniejszej pracy
jest przybliżenie aktualnego stanu wiedzy o nowoczesnych technikach cytogenetyki molekularnej, które znajdują zastosowanie w diagnostyce noworodka lub dziecka
z wadą (-ami) rozwojową (-ymi).
Rola cytogenetyki klasycznej w diagnostyce przyczyn
wad rozwojowych
Aberracje chromosomowe stwierdza się u około 0,9%
żywo urodzonych noworodków. W okresie płodowym występują one jednak znacząco częściej (50-60%), o czym
świadczą wyniki badań kariotypu płodów z poronień samoistnych [6]. Najczęstszą przyczyną wczesnych (tj.
w I trymestrze ciąży) poronień samoistnych jest w takich
przypadkach występowanie u płodu dużej wady / mnogich wad rozwojowych uniemożliwiającej(-ych) jego dalsze przeżycie. Istotny udział w tej patologii mają liczbowe
i strukturalne aberracje chromosomowe powodujące brak
lub zaburzenie funkcji genów znajdujących się w odpowiednich regionach chromosomów. Prowadzi to w konsekwencji do ujawnienia tzw. „fenotypu chromosomowego”
pod postacią wad wrodzonych, cech dysmorficznych oraz
opóźnienia rozwoju psychoruchowego.
Klasyczne techniki cytogenetyczne polegają na analizie obrazu prążkowego chromosomów, uzyskiwanego
dzięki zastosowaniu specjalnych technik barwienia. Każda
para chromosomów ma specyficzny, charakterystyczny
dla siebie, układ poprzecznych prążków, różniących się
110
K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak
wielkością i intensywnością zabarwienia. Liczba uzyskanych w standardowym badaniu kariotypu prążków (zazwyczaj 450-550 w haploidalnym zestawie chromosomów)
decyduje o czułości badania i w efekcie o wielkości rozpoznawanych aberracji. W praktyce oznacza to możliwość
identyfikacji zmian o wielkości nie mniejszej niż 5 milionów
par zasad (Mpz). Niekiedy, przy zastosowaniu technik o wysokiej rozdzielczości (HRT, z ang. High Resolution Techniques), przy uzyskiwanej liczbie 550-850 prążków, można
wykazać obecność rearanżacji o wielkości do około 3 Mpz.
Szacuje się, że tradycyjne techniki cytogenetyczne
umożliwiają identyfikację przyczyny zaburzeń u około
3-4% chorych wykazujących cechy niepełnosprawności intelektualnej, wady rozwojowe oraz dysmorfię w budowie
ciała.
Nowoczesne techniki cytogenetyki molekularnej
i ich aplikacje kliniczne
W latach 80. ubiegłego wieku powstała nowa gałąź
cytogenetyki klinicznej – cytogenetyka molekularna. Wykorzystuje ona osiągnięcia biologii molekularnej, takie jak
klonowanie i automatyczne powielanie sklonowanych fragmentów DNA metodą PCR. Uzyskane w ten sposób określone sekwencje DNA wykorzystywane są jako sondy
molekularne komplementarne do odpowiednich regionów
chromosomów, co stanowi podstawę techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH, z ang. Fluorescence In
Situ Hybridization) [7]. Technika FISH znajduje zastosowanie w przypadkach klinicznego podejrzenia określonego
zespołu genetycznego uwarunkowanego niewidocznymi
w rutynowym badaniu cytogenetycznym submikroskopowymi aberracjami, takimi jak mikrodelecje lub mikroduplikacje.
Nowocześniejszą alternatywą dla FISH jest technika
multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligazy
(MLPA, z ang. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) oraz porównawcza hybrydyzacja genomowa
(CGH, z ang. Comparative Genomie Hybridization) [8, 9].
Metodę MLPA wykorzystuje się obecnie głównie do identyfikacji zmian w obrębie końców chromosomów (tzw.
aberracji subtelomerowych) oraz znanych zespołów mikrodelecyjnych. Jest to technika charakteryzująca się dużą
wydajnością wyrażoną liczbą analizowanych w jednym badaniu regionów chromosomowych (do 48 loci genowych),
a także przystępną ceną.
Zdecydowanie szersze zastosowanie ma technika
CGH, umożliwiająca analizę całego genomu z praktycznie
nieograniczoną rozdzielczością. W tabeli 2 porównano różne techniki cytogenetyczno-molekularne stosowane obecnie w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych.
Technika FISH w praktyce klinicznej
W technice FISH stosuje się różnego typu sondy molekularne, których wybór zależy od wymagającego wyjaśnienia problemu diagnostycznego. Z punktu widzenia zarów-
Tabela 2. Techniki cytogenetyczne i cytogenetyczno-molekularne
stosowane w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych
(uwzględniono rozdzielczość wyrażoną w milionach
lub tysiącach par zasad)
Technika
Rozdzielczość
Analiza kariotypu
(do 550 prążków)
>5 Mpz
Analiza kariotypu metodą HRT
(do 800 prążków)
>3 Mpz
Metoda HR-CGH
>3 Mpz
Metoda FISH
>0,04-0,25 Mpz
Metoda MLPA subtelomerowe
śr. 40 Kpz
aCGH z sondami BAC
>1 Mpz
aCGH z sondami
oligonukleotydowymi
>0,001 Mpz (śr. 3-100 Kpz)
Mpz – milion par zasad; Kpz – tysiąc par zasad
Tabela 3. Wybrane aberracje submikroskopowe z towarzyszącymi
wadami rozwojowymi identyfikowane przy użyciu techniki FISH
a) zespół Williamsa
del 7q11.23
b) zespół Beckwitha-Wiedemanna
del 11p15
c) zespół Millera-Diekera
del 17p13.3
d) zespół DiGeorge’a
del 22q11.2
e) zespół monosomii 1p36
del 1p36
f)
zespół kociego krzyku
del 5p
g) zespół Smitha-Magenis
del 17p11.2
h) zespół Wolfa-Hirschhorna
del 4p
i)
del 15q11-13
zespół Pradera-Williego/Angelmana
równo klinicznego, jak i cytogenetycznego, istotne jest wyróżnienie tzw. sond locus-specyficznych (celowanych na
określone miejsce chromosomu), centromerowych oraz
malujących. Należy podkreślić, że niezbędnym warunkiem
użycia sond hybrydyzujących do określonego fragmentu
chromosomu jest uprzednie sformułowanie klinicznego
podejrzenia obecności aberracji tego regionu.
Zastosowanie sond locus-specyficznych w diagnostyce
przyczyn wad wrodzonych umożliwiło identyfikację szeregu nowych zespołów mikrodelecyjnych/mikroduplikacyjnych, a więc takich, w których defekt ma zwykle charakter
submikroskopowy, tzn. nie jest widoczny przy stopniu rozdzielczości obrazu prążkowego chromosomów możliwym
do uzyskania w rutynowej ocenie kariotypu. Wybrane,
częściej występujące, zespoły mikrodelecyjne/mikroduplikacyjne o znanym fenotypie przedstawiono w tabeli 3.
Choć niektóre z przedstawionych aberracji mogą być identyfikowane rutynowymi metodami badaniu kariotypu,
wielkość zmiany może być na tyle mała, że dopiero zastosowanie techniki FISH umożliwia ostateczne potwierdzenie lub wykluczenie rozpoznania klinicznego. Zarówno
z punktu naukowego, jak i klinicznego istotne jest także
wykorzystanie metody FISH w celu określenia minimalnej
Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych
wielkości tzw. regionu krytycznego warunkującego określony zespół kliniczny. Umożliwia to zawężenie badanego
regionu do zaledwie kilku-kilkunastu genów, wyodrębnienie tzw. genów kandydujących, odpowiedzialnych za ekspresję określonych objawów klinicznych oraz dokonanie
oceny korelacji genotypowo-fenotypowej.
W kontekście konieczności sformułowania rozpoznania klinicznego oraz wskazania określonego regionu w genomie, w którym spodziewamy się aberracji, szczególnie
ważna jest prawidłowa ocena kliniczna chorego. Uwzględniać ona powinna specyfikę określonych wad występujących w różnych zespołach mikrodelecyjnych, np. wady
stożka tętniczego w mikrodelecji 22q11.2, nadzastawkowe
zwężenie aorty w mikrodelecji 7q11.23, otwór w przegrodzie międzyprzedsionkowej lub międzykomorowej w mikrodelecji 4p (zespół Wolfa-Hirschhorna). Znajomość specyfiki obrazu klinicznego poszczególnych zespołów mikrodelecyjnych, w tym współistniejących cech dysmorficznych oraz fenotypu behawioralnego, stanowi jeden z warunków określających skuteczność techniki FISH dla weryfikacji rozpoznania.
Sondy locus-swoiste stosowane są także w celu identyfikacji aberracji w regionach subtelomerowych chromosomów. Używa się w tym celu zestawu 48 sond molekularnych specyficznych dla końcowych fragmentów chromosomów, których rearanżacje są trudne do uwidocznienia
w rutynowym badaniu kariotypu. Wykorzystanie sond
subtelomerowych umożliwiło m.in. identyfikację i/lub
scharakteryzowanie szeregu nowych zespołów mikrodelecyjnych, w tym zespołu monosomii fragmentu krótkiego
ramienia chromosomu 1 pary (del1p36), monosomii fragmentu długiego ramienia chromosomu 2 pary (del2q37)
oraz monosomii fragmentu długiego ramienia chromosomu 22 pary (del22q13). Przyczyniło się również do wykrycia submikroskopowych, często o charakterze rodzinnym, rearanżacji strukturalnych w regionach subtelomerowych, m.in. translokacji (przemieszczeń materiału genetycznego pomiędzy chromosomami) lub inwersji (odwrócenia fragmentu chromosomu). Według danych z piśmiennictwa medycznego, u 6% nosicieli zrównoważonych aberracji chromosomowych za patologię kliniczną odpowiadają submikroskopowe aberracje w punktach złamań
chromosomów lub zaburzenie funkcji genu (-ów) w regionie złamania [10]. Do zaburzenia funkcji genu dochodzi
w mechanizmie przerwania genu lub jego sekwencji regulatorowej (tzw. efekt pozycji) lub wskutek ujawnienia fenotypu choroby autosomalnej recesywnej (defekt także na
chromosomie homologicznym niezaangażowanym w translokację).
Ocenia się, iż z pomocą techniki FISH z sondami subtelomerowymi możliwa jest identyfikacja przyczyny zaburzeń u około 5-6% chorych z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi, cechami dysmorfii w budowie oraz prawidłowym wynikiem analizy kariotypu [11].
Opracowano nawet szczegółowe, wyrażone w skali punk-
111
towej, kryteria kwalifikacji chorych do badań [12]. Uwzględniają one wywiad rodzinny niepełnosprawności intelektualnej, pre- i postnatalne zaburzenia wzrastania, obecność wad rozwojowych oraz cech dysmorfii w budowie.
Obecnie technika FISH w diagnostyce aberracji subtelomerowych została zastąpiona nowszymi technikami
cytogenetyczno-molekularnymi, tzw. MLPA subtelomerowym (omówione w dalszej części pracy) oraz CGH do
mikromacierzy.
W odróżnieniu od FISH z sondami locus-swoistymi,
sondy centromerowe wykorzystywane są głównie do
identyfikacji aberracji liczbowych chromosomów oraz tzw.
chromosomów markerowych. Spośród zastosowań FISH
z sondami centromerowymi w cytogenetyce klinicznej,
szczególnie istotne było opracowanie szybkich testów
w diagnostyce pre- i postnatalnej częściej występujących
zespołów aneuploidii chromosomów 13, 18, 21 pary oraz
X i Y, ze względu na towarzyszące tym zespołom wady
rozwojowe. Otrzymanie wyniku badania już po 24-48 godzinach jest możliwe dzięki zastosowaniu FISH w niedzielących się komórkach interfazowych. W praktyce, szybkie
testy FISH z powodzeniem wykorzystuje się głównie
w diagnostyce prenatalnej, przy czym czułość i specyficzność badania są zbliżone do uzyskiwanych innymi technikami [13]. Wadą tych metod jest jednak istotny odsetek
wyników fałszywie ujemnych w porównaniu z rutynowym
badaniem kariotypu (około 1 na 100 niezidentyfikowanych
techniką FISH aberracji w amniocytach oraz około 1 na 40
w komórkach trofoblastu) [14]. Należy także pamiętać, iż
badanie techniką FISH w komórkach interfazowych jest
badaniem celowanym, czyli dotyczy identyfikacji tylko
aneuploidii określonych chromosomów. Nie wyklucza zatem obecności innych aberracji chromosomowych w badanym materiale. W praktyce, w ramach diagnostyki prenatalnej zaleca się zatem stosowanie techniki FISH z jednoczasową oceną standardowego kariotypu [14]. Powyższa
wskazówka dotyczy także metody ilościowego fluorescencyjnego PCR (QF-PCR, z ang. Quantitative Fluorescent
Polymerase Chain Reaction), która w wielu ośrodkach
z powodzeniem zastąpiła FISH interfazową.
Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ występuje w różnych modyfikacjach, spośród których najbardziej znane są metody wielobarwnej oceny chromosomów
(m.in. M-FISH oraz SKY) wykorzystujące tzw. sondy malujące. Ich podstawową zaletą jest identyfikacja wszystkich
chromosomów podczas jednej hybrydyzacji, co czyni je
szczególnie przydatnymi w charakterystyce nadliczbowych chromosomów markerowych, dodatkowego materiału genetycznego (addycji) oraz translokacji [7]. Zastosowanie sond malujących umożliwia m.in. szybką weryfikację pochodzenia chromosomu markerowego i określenie jego znaczenia klinicznego w świetle opisywanych
u dziecka cech fenotypowych lub, w ramach diagnostyki
prenatalnej, w sytuacji identyfikacji chromosomu markerowego u płodu. Ostateczna charakterystyka chromosomu
112
K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak
markerowego z użyciem sond malujących często umożliwia prognozowanie przebiegu choroby oraz udzielenie
w rodzinie ryzyka genetycznego wiarygodnej porady genetycznej. Jest to szczególnie istotne w przypadku identyfikacji chromosomu markerowego w diagnostyce prenatalnej. Dla celów poradnictwa genetycznego ważne jest wówczas, oprócz szczegółowej charakterystyki cytogenetyczno-molekularnej chromosomu markerowego, potwierdzenie lub wykluczenie jego obecności u obojga rodziców
oraz znajomość jego skutków klinicznych.
Zastosowanie techniki MLPA
w diagnostyce cytogenetycznej
Metoda MLPA (z ang. Multiplex Ligation-Dependent
Probe Amplification) umożliwia szybką diagnostykę submikroskopowych aberracji chromosomowych ograniczoną
jedynie liczbą zastosowanych sond w jednym badaniu.
W MLPA zhybrydyzowane do DNA sondy oligonukleotydowe są następnie łączone przez ligazę i powielane w reakcji PCR z odpowiednimi starterami. Liczba produktów
takiej reakcji jest proporcjonalna do liczby kopii badanej
sekwencji DNA. Niewątpliwą zaletą MLPA jest względna
prostota wykonania, niska cena oraz mała ilość DNA potrzebna do badania. Potencjalne zastosowanie techniki
MLPA może być bardzo szerokie. Umożliwia ona diagnostykę zespołów mikrodelecyjnych (w tym mikrodelecji
/ mikroduplikacji w regionach subtelomerowych) oraz,
ostatnio, szybką diagnostykę aneuploidii chromosomowych. Najszersze wykorzystanie znalazła ta metoda w diagnostyce submikroskopowych aberracji subtelomerowych
stanowiąc alternatywę dla bardziej czaso- i pracochłonnej
techniki FISH. Aplikacja techniki MLPA w grupie chorych
z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi, cechami dysmorfii oraz prawidłowym wynikiem
badania kariotypu umożliwia ustalenie rozpoznania dodatkowo u 2-6% pacjentów przy jednoczesnej wysokiej czułości i specyficzności metody [8]. Udowodniono także skuteczność techniki MLPA w diagnostyce znanych zespołów
mikrodelecyjnych, takich jak zespół delecji 1p36, zespół
Williamsa, DiGeorge’a, Sotosa lub Millera-Diekera poprzez
porównanie metody z badaniem FISH i wykazanie pełnej
zgodności obu technik [15]. Istotną modyfikacją techniki
MLPA jest tzw. MS-MLPA (z ang. Methylation-Specific)
umożliwiające analizę stanu metylacji m.in. w regionie krytycznym zespołów Pradera-Williego i Angelmana [16].
Należy zaznaczyć, że technika MLPA umożliwia badanie w kierunku wielu zespołów genetycznie uwarunkowanych w ramach jednego testu diagnostycznego. Gotowe
zestawy sond dostępne są na rynku w cenie konkurencyjnej w porównaniu z FISH.
Technika porównawczej hybrydyzacji genomowej
(CGH) i jej modyfikacje
Podstawowe ograniczenie technik FISH oraz w mniejszym stopniu MLPA dotyczy konieczności sformułowania
rozpoznania klinicznego konkretnego zespołu genetycznie
uwarunkowanego jeszcze przed wdrożeniem procesu diagnostycznego. Tymczasem, zwłaszcza u noworodków lub
niemowląt, jest to bardzo trudne ze względu na często
mało charakterystyczny obraz kliniczny, niespecyficzne
cechy fenotypowe, wspólne dla różnych zespołów genetycznych. Nie bez znaczenia jest ewolucja obrazu klinicznego, co powoduje, że niektóre objawy stają się łatwiejsze
do oceny dopiero w późniejszym wieku dziecka [17].
Przełomem w diagnostyce chorób genetycznych, w tym
także wad rozwojowych, okazało się zastosowanie techniki
porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH). Technika
CGH polega na hybrydyzacji dwóch genomowych DNA,
badanego i referencyjnego, wyznakowanych fluorescencyjnie i zmieszanych w proporcji 1:1, do prawidłowych
chromosomów metafazowych [18].
Inaczej niż w badaniu FISH, badanie metodą CGH
umożliwia identyfikację zmian w genomie bez uprzedniej
wiedzy (podejrzenia) o ich istnieniu. Porównawcza hybrydyzacja genomowa umożliwia bowiem ocenę wszystkich
chromosomów w jednym badaniu. Pod tym względem
przypomina ona analizę kariotypu. Podstawowymi zaletami techniki CGH są jednak czas badania, który nie przekracza zwykle kilku dni, oraz, w przypadku najnowszej jej
modyfikacji – tzw. CGH do mikromacierzy, możliwość
identyfikacji niewidocznych w standardowym badaniu cytogenetycznym aberracji submikroskopowych z niespotykaną jak dotąd rozdzielczością sięgającą kilkuset, a w niektórych przypadkach, kilku-kilkunastu par zasad. W cytogenetyce klinicznej, technika CGH znalazła zastosowanie
początkowo jako HR-CGH (z ang. High-Resolution CGH).
Umożliwiło to badanie genomu z dokładnością do 3
milionów par zasad, co przyczyniło się do identyfikacji
submikroskopowych rearanżacji chromosomowych u około 10% chorych z prawidłowym kariotypem oraz obecnością wad wrodzonych i cech niepełnosprawności intelektualnej o nieustalonej etiologii [19]. Dalsze zwiększenie
potencjału diagnostycznego osiągnięto poprzez wykorzystanie klonów bakteryjnych zamiast chromosomów
metafazowych (tzw. mikromacierze BAC). Umożliwiło to
analizę całego genomu w jednym badaniu z rozdzielczością zależną od liczby zastosowanych klonów i odległości
między nimi w genomie.
Prawdziwie rewolucyjne zmiany przyniosło jednak
dopiero zsekwencjonowanie genomu człowieka, a zwłaszcza poznanie zjawiska zmienności liczby kopii sekwencji
DNA (z ang. CNV, Copy-Number Variation). Zmienność
liczby kopii określonych fragmentów DNA powstaje wskutek różnych rearanżacji DNA, np. delecji lub duplikacji,
przy czym niektóre fragmenty DNA (tzw. LCR, z ang. LowCopy Repeats) są bardziej niż inne podatne na występowanie tego typu rearanżacji chromosomowych [7]. Ocenia
się, że CNV w większym stopniu niż zmiany pojedynczych
nukleotydów może odgrywać rolę w patogenezie chorób
[20]. Odkrycie tzw. wariantów patogennych CNV umożli-
Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych
wiło skonstruowanie odpowiednich sond oligonukleotydowych i identyfikację wielu niestwierdzanych dotychczas
nieprawidłowości, które mogą być odpowiedzialne za
patologię kliniczną. Do sond utrwalonych na specjalnych
szkiełkach, zwanych mikromacierzami, kompetycyjnie
hybrydyzują dwie różne sekwencje genomowego DNA
(jedna pochodząca od pacjenta i druga kontrolna), które
znakowane są odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi. Stanowi to podstawę techniki CGH do mikromacierzy (arrayCGH, aCGH). Badania przeprowadzane z zastosowaniem metody aCGH umożliwiają jednoczesną identyfikację aneuploidii, duplikacji, delecji oraz amplifikacji każdego z reprezentowanych na mikromacierzy loci genowych, z rozdzielczością limitowaną wyłącznie liczbą oraz
wielkością sond użytych do konstrukcji mikromacierzy.
Technika aCGH jest wykorzystywana głównie w diagnostyce klinicznej chorych z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi i dysmorfią. W ostatnio
opublikowanej metaanalizie 19 badań wykonanych techniką aCGH u około 14 tysięcy chorych z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi i prawidłowym
wynikiem badania cytogenetycznego zidentyfikowano
patogenne CNV u 10% chorych. Należy podkreślić, że wraz
ze wzrastającą rozdzielczością stosowanej macierzy zwiększał się odsetek chorych, u których stwierdzano obecność
aberracji (do 14% ogółu badanych) [21]. Technikę aCGH
wykorzystuje się od niedawna także w Polsce, m.in. w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka. Dotychczasowe wyniki badań wykonanych u 116 chorych
z niepełnosprawnością intelektualną i cechami dysmorfii
umożliwiły wyjaśnienie przyczyny zaburzenia u 11 pacjentów (11,8%) [19].
O ogromnym potencjale diagnostycznym CGH do
mikromacierzy świadczą m.in. wyniki badań z zastosowaniem techniki aCGH z sondami subtelomerowymi. Zgodnie
z nimi, w grupie ponad 5 tysięcy chorych, zidentyfikowano
przyczynę zaburzeń rozwoju u około 3% chorych z prawidłowym kariotypem oraz u około 43% chorych z nieprawidłowym wynikiem badania cytogenetycznego [22].
Metodę CGH do mikromacierzy z powodzeniem wykorzystuje się w celach diagnostycznych u dzieci urodzonych z mnogimi wadami rozwojowymi [23, 21]. Ze względu na fakt krótszej przeżywalności noworodków z wielowodziem, przypuszcza się, że w tej grupie pacjentów rearanżacje genomowe identyfikowane technikami submikroskopowymi występują istotnie częściej niż u dzieci
lub osób dorosłych. Jednocześnie, z uwagi na niedostateczną możliwość pełnej oceny potencjału poznawczego
noworodka, często jedynym objawem przemawiającym za
występowaniem zaburzenia rozwojowego jest obecność
wady/wad wrodzonych. W największej opublikowanej jak
dotąd z wykorzystaniem techniki aCGH pracy badawczej
w takiej grupie chorych, spośród 179 noworodków z rozpoznaniem wielowadzia z/bez innych problemów medycznych, patogenne rearanżacje chromosomowe wykryto
113
u 18% chorych [17]. U noworodków z wielowadziem z towarzyszącymi cechami dysmorfii w budowie odsetek ten
wynosił aż 27%. W badanych rodzinach stwierdzono zarówno znane zespoły mikrodelecyjne (m.in. mikrodelecję
regionu krytycznego zespołu DiGeorge’a), jak i nowe, dotychczas nieopisywane w piśmiennictwie, rearanżacje
o nieznanych skutkach fenotypowych [24]. Wśród nich były
także aberracje występujące w formie mozaikowej, które nie
zostały zidentyfikowane przy zastosowaniu konwencjonalnych metod oceny kariotypu [25]. Z badań Lu i wsp. wynika, że wykorzystanie mikromacierzy nowszej generacji
przekładało się na lepszą wartość diagnostyczną.
Technika aCGH o wysokiej rozdzielczości staje się
atrakcyjnym narzędziem badawczym w diagnostyce przyczyn specyficznych, izolowanych wad rozwojowych, np.
wady serca lub wady rozszczepowej wargi i podniebienia
bez towarzyszącej dysmorfii i/lub cech opóźnienia rozwoju. Chociaż, zważywszy na prawdopodobny wieloczynnikowy model uwarunkowania tych defektów, badania
cytogenetyczne wykonywane są w tych przypadkach niezwykle rzadko, to jednak zastosowanie tej techniki może
ujawnić obecność bardzo niewielkich rearanżacji obejmujących nierzadko pojedyncze geny, prowadząc do braku
lub zaburzenia ich funkcji [26]. W największej jak dotąd
pracy badawczej z zastosowaniem aCGH, Erdogan i wsp.
w grupie 105 dzieci z izolowaną wadą serca zidentyfikowali 18 zmian patogennych [27]. Przyczyniło się to do lepszego poznania etiopatogenezy wady i pośrednio umożliwiło wytypowanie nowych genów kandydujących, których
defekty przyczyniają się do jej powstania.
Na zakończenie, należy podkreślić, że, podobnie jak
każda technika diagnostyczna, porównawcza hybrydyzacja genomowa posiada istotne ograniczenia. Podstawową wadą CGH jest niemożność identyfikacji w badaniu
translokacji zrównoważonych lub inwersji, czyli takich
aberracji chromosomowych, które nie wiążą się z utratą
lub nadmiarem dodatkowego materiału genetycznego.
Lekarz interpretujący wynik badania diagnostycznego
z użyciem CGH musi także mieć świadomość, że zidentyfikowana zmiana może być zmianą niepatogenną w odniesieniu do obecnych u pacjenta objawów. Dotyczy to
zwłaszcza sytuacji, gdy zmiana jest mała (poniżej 1 miliona
par zasad), ta sama aberracja identyfikowana jest u niewykazującego objawów klinicznych członka rodziny lub
jest zmianą „łagodną” stwierdzaną w populacji osób zdrowych (polimorfizm). Faktycznie, interpretacja każdego nieprawidłowego wyniku badania metodą CGH stanowi
w obecnych czasach wyzwanie zarówno dla wykonującego badanie cytogenetyka, jak i dla lekarza klinicysty.
Algorytm postępowania diagnostycznego w przypadku
stwierdzenia dużej wady rozwojowej lub zespołu mnogich wad wrodzonych (ryc. 1)
Proponowany poniżej sposób postępowania diagnostycznego dotyczy chorych w różnym wieku, jednak naj-
114
K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak
Ryc. 1. Algorytm postępowania diagnostycznego w przypadku stwierdzenia izolowanej wady rozwojowej
oraz mnogich wad wrodzonych u noworodka lub dziecka
częściej noworodków/niemowląt, u których stwierdza się
dużą wadę rozwojową. Zasadniczym czynnikiem prognostycznym w takich przypadkach jest, poza małą masą ciała
przy urodzeniu, współwystępowanie innych wad rozwojowych. Zarówno w wielowadziu, jak i w wadach izolowanych, kluczowym elementem badania chorego dziecka
jest, poza wywiadem i analizą rodowodu, ocena rozwoju
psychoruchowego oraz współistniejących cech dysmorficznych. Wynik tej oceny stanowi podstawę do wstępnego
zakwalifikowania chorego do dalszych badań diagnostycznych mających na celu identyfikację określonej aberracji
chromosomowej (badanie kariotypu lub techniką FISH)
lub zespołu monogenowego. U wielu chorych z opóźnieniem rozwoju psychoruchowego i/lub cechami dysmorfii
nie udaje się jednak sformułować rozpoznania znanej,
uwarunkowanej genetycznie choroby. Nieocenioną wartość diagnostyczną mają wówczas nowoczesne techniki
cytogenetyki klinicznej, zwłaszcza CGH do mikromacierzy.
Proces diagnostyczny powinien być zakończony udzieleniem rodzinie chorego dziecka w pełni wiarygodnej porady genetycznej. Warto jednak podkreślić, że równie
ważna, co zastosowanie szerokiego wachlarza badań diagnostycznych, jest rzetelna i długookresowa obserwacja
kliniczna w warunkach poradni genetycznej lub gabinetu
lekarza pediatry.
Podsumowanie
W obecnej dekadzie obserwujemy niezwykle dynamiczny postęp w zakresie rozwoju nowych metod identyfikacji aberracji chromosomowych jako przyczyny wad
Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych
wrodzonych oraz opóźnienia rozwoju psychoruchowego.
Powoduje to, iż coraz częściej rozpoznawane są aberracje
u chorych, u których sformułowanie rozpoznania konkretnej choroby genetycznie uwarunkowanej było dotychczas
niemożliwe. Przełomem w cytogenetyce klinicznej stało
się zwłaszcza wprowadzenie porównawczej hybrydyzacji
genomowej do mikromacierzy do diagnostyki przyczyn
niepełnosprawności intelektualnej ze współistniejącymi
wadami rozwojowymi. W aspekcie praktycznym przekłada
się to na istotnie lepszą opiekę nad chorymi, w tym zaplanowanie odpowiedniego postępowania terapeutycznego,
oraz poradnictwo genetyczne. Coraz szersza wiedza
o skutkach klinicznych określonej aberracji chromosomowej umożliwia także prognozowanie przebiegu choroby,
co ma istotne znaczenie dla rodziny chorej osoby ale również, poprzez fakt lepszego ukierunkowania opieki, znacznie ogranicza jej koszty. Poza znaczeniem nowej techniki
w diagnostyce przyczyn wystąpienia wielowadzia, metoda
aCGH umożliwia dokonanie próby korelacji fenotypowogenotypowej, a zatem identyfikację lub poszerzenie istniejącej wiedzy o nowych zespołach mikrodelecyjnych/
mikroduplikacyjnych oraz o roli określonych genów dla
prawidłowego rozwoju człowieka.
Naturalny postęp w dziedzinie nowoczesnych technik
cytogenetyczno-molekularnych, wyrażony coraz większą
liczbą stosowanych sond molekularnych, a zatem coraz
gęstszym pokryciem genomu, budzi nadzieje na przyszłość. Warto jednak na koniec przypomnieć, że zarówno
w przeszłości, jak i obecnie, nie dysponujemy jednym uniwersalnym badaniem diagnostycznym umożliwiającym
rozpoznanie wszystkich zespołów genetycznie uwarunkowanych, w tym zespołów z towarzyszącymi wrodzonymi
wadami rozwojowymi uwarunkowanych obecnością mutacji genowych. W ocenie wskazań do badań genetycznych należy więc najczęściej nadal polegać na wiedzy
i doświadczeniu lekarzy różnych specjalności, w tym pediatrów, neonatologów i genetyków klinicznych, pełniących opiekę nad osobami chorymi i ich rodzinami.
Podziękowanie
Autorzy dziękują prof. Ewie Bocian za cenne uwagi w trakcie przygotowywania pracy.
Piśmiennictwo
[1] Latos-Bieleńska A. (1998) Polski Rejestr Wrodzonych Wad
Rozwojowych. Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań.
[2] Korniszewski L. (2005) Typy wad wrodzonych. W: Dziecko
z zespołem wad wrodzonych, red. Korniszewski L. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa.
[3] Zespół Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych.
(2008) Wstęp. [w:] Wrodzone wady rozwojowe w Polsce
w latach 2003-2004. Dane z Polskiego Rejestru Wrodzonych
Wad Rozwojowych, red. Latos-Bieleńska A., Materna-Kiry-
luk A. Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań.
[4] Kalter H., Warkany J. (1983) Congenital malformations (second of two parts). N. Engl. J. Med. 308: 491-497.
[5] HCUP Statistical Brief #24 (2004) Hospitalizations for Birth
115
Defects. (http://www.hcup-us.ahrq.gov/reports/ statbriefs/
sb24.jsp)
[6] Thompson J.S., McInness R.R., Willard H.F. (1991) Genetics
in medicine. WB Saunders Company, London.
[7] Nowakowska B., Bocian E. (2004) Cytogenetyka molekularna
– techniki badawcze i ich zastosowanie w diagnostyce klinicznej. Med. W. Rozw. tom VIII, część 1: 7-24.
[8] Ahn J.W., Ogilvie C.M., Welch A. et al. (2007) Detection of
subtelomere imbalance using MLPA: validation, development of an analysis protocol, and application in a diagnostic
centre. BMC Med. Genet. 8: 9.
[9] Shinawi M., Cheung S.W. (2008) The array CGH and its clinical applications. Drug Discov. Today 13: 760-770.
[10] Warburton D. (1991) De novo balanced chromosome rearrangements and extra marker chromosomes identified at
prenatal diagnosis: clinical significance and distribution of
breakpoints. Am. J. Hum. Genet. 49: 995-1013.
[11] De Vries B.B.A., Winter R., Schinzel A., van RawenswaaijArts C. (2003) Telomeres: a diagnosis at the end of the chromosomes. J. Med. Genet. 40: 385-398.
[12] De Vries B.B.A., White S.M., Knight S.J. et al. (2001) Clinical
studies on submicroscopic subtelomeric rearrangements:
a checklist. J. Med. Genet. 38: 145-150.
[13] Weremowicz S., Sandstrom D.J., Morton C.C. et al. (2001)
Fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid detection
of aneuploidy: experience in 911 prenatal cases. Prenat.
Diagn. 21: 262-269.
[14] Caine A., Maltby A.E., Patkin C.A. et al. (2005) Prenatal detec-
tion of Down syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: a cytogenetic risk assessment. Lancet 366: 123-128.
[15] Cho E.H., Park B.Y., Cho J.H., Kang Y.S. (2009) Comparing
two diagnostic laboratory tests for several microdeletion
causing mental retardation syndromes: multiplex ligation-dependent probe amplification vs. fluorescent in situ hybridization. Korean J. Lab. Med. 29: 71-76.
[16] Nygren A.O.H., Ameziane N., Duarte H.M.B. et al. (2005) Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection
of CpG methylation and copy number chan ges of up to 40
sequences. Nucleic Acids Res. 33: e128.
[17] Lu X.Y., Phung M.T., Shaw C.A. et al. (2008) Genomic imbalance in neonates with birth defects: high detection rates by
using chromosomal microarray analysis. Pediatrics 122:
1310-1318.
[18] Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P., Sudar D. et al. (1992) Com-
parative genomic hybridization for molecular cytogenetic
analysis of solid tumors. Science 258: 818-821.
[19] Nowakowska B., Stankiewicz P., Obersztyn E. et al. (2008)
Application of metaphase HR-CGH and targeted chromosomal microarray analyses to genomic characterisation of 116
patients with mental retardation and dysmorphic features.
Am. J. Med. Genet. (A) 146: 2361-2369.
[20] Menten B., Maas N., Thienpont B. et al. (2006) Emerging pat-
terns of cryptic chromosomal imbalances in patients with
idiopathic mental retardation and multiple congenital anomalies: a new series of 140 patients and review of the literature. J. Med. Genet. 43: 625-633.
[21] Sagoo G., Butterworth A., Sanderson S. et al. (2009) Array
CGH in patients with learning disability (mental retardation)
and congenital anomalies: updated systematic review and
meta-analysis of 19 studies and 13,926 subjects. Genet. Med.
11: 139-146.
[22] Shao L., Shaw C.A., Lu X.Y., Sahoo T. et al. (2008) Identifica-
tion of chromosome abnormalities in subtelomeric regions
by microarray analysis: a study of 5,380 cases, Am. J. Med.
Genet. (A) 146: 2242-2251.
116
K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak
[23] Ming J., Geiger E., James A. et al. (2006) Rapid detection of
submicroscopic chromosomal rearrangements in children
with multiple congenital anomalies using high density oligonucleotide arrays. Hum. Mutat. 27: 467-473.
[24] Slavotinek A. (2008) Novel microdeletion syndromes detected by chromosome microarrays. Hum. Genet. 124: 1-17.
[25] Cheung S., Shaw C., Scott D. et al. (2007) Microarray-based
CGH detects chromosomal mosaicism not revealed by conventional cytogenetics. Am. J. Med. Genet. (A) 143: 16791686.
[26] Vissers L., Veltman J., van Kessel A., Brunner H.G. (2005)
Identification of disease genes by whole genome CGH arrays. Hum. Mol. Genet. 14: R215-R223.
[27] Erdogan F, Larsen L, Zhang L et al. (2008) High frequency of
submicroscopic aberrations detected by tiling path array
comparative genome hybridisation in patients with isolated
congenital heart disease. J. Med. Genet. 45: 704-709.
[28] Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Birth Defects. March 11, 2009
J Krzysztof Szczałuba
Zakład Genetyki Medycznej,
Instytut Matki i Dziecka w Warszawie
01-211 Warszawa, ul. Kasprzaka 17A
e-mail: [email protected]
Application of novel molecular cytogenetics techniques in the diagnostics of congenital birth defects
Genetic factors, including chromosomal aberrations, significantly contribute to pathogenesis of birth defects. Until recently their recognition was possible merely by the use of routine cytogenetic techniques such as chromosome banding. In the light of well
documented novel diagnostic techniques, such as fluorescent in situ hybridization (FISH), MLPA or the latest method of array comparative genomic hybridization (aCGH), it is reasonable to assume that submicroscopic chromosomal rearrangements in the form
of microdeletions and microduplications play a significant role in ethiopathogenesis of congenital birth defects. In the majority of sick
children, including neonates, the causes of their birth defects, not reflecting phenotypically a known genetic syndrome, remain obscure. Many such abnormalities, especially if multiple, would be lethal, leading to early deaths, not infrequently before the diagnostic
process has ever begun. In this work, current knowledge about application of novel molecular cytogenetics techniques in the identification of causes of congenital birth defects has been presented. A diagnostic algorithm in the case of recognition of a major birth
defect or multiple defects in the neonate has been suggested.
Key words: congenital birth defect, chromosomal aberration, FISH, MLPA, CGH