Fotochemia i spektroskopia UV białek enzymatycznych i kwasów

Fotochemia i spektroskopia UV białek enzymatycznych i kwasów

Fotochemia i spektroskopia UV białek enzymatycznych i kwasów nukleinowych
Kazimierz Lech
Wierzchowski
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul.
Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa; e-mail:
[email protected]

Artykuł otrzymano 6 lipca 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 27 lipca 2015 r.
Słowa kluczowe: fotochemia białek, fotochemia kwasów nukleinowych, fotodimeryzacja
pirymidyn, fotohydratacja pirymidyn
Wykaz skrótów: APA — kwas apurynowy;
Cyd — cytydyna; DMT — 1,3-dimetylotymina;
DMU — 1,3-dimetylouracyl; DOPA — 3,4-dihydroksyfenyloalanina; DPNH — zredukowana postać nukleotydu difosfopirydynowego; 5-FU — 5-fluorouracyl; spektroskopia
IR — spektroskopia w podczerwieni; NAD
— dinukleotyd nikotynamidoadeninowy;
NADH — zredukowana postać NAD; 6-4PP
— fotoprodukty 6-4; Urd — urydyna; UV —
promieniowanie ultrafioletowe; 6-4TC — 6-4’-[
pyrimidin-2’-one]- cytozyna; 6-4TT — 6-4’-[pyrimidin-2’-one]-tymina
STRESZCZENIE
W
artykule przedstawiona jest krótka historia badań Davida Shugara w zakresie fotochemii i spektroskopii UV białek i kwasów nukleinowych prowadzonych przez niego od
końca lat 40. do początku lat 70. XX wieku, na tle ówczesnego stanu rozwoju badań w tych
dziedzinach.
WPROWADZENIE
Pierwsze opublikowane prace naukowe Davida Shugara dotyczące problemów biologii powstały we Francji, w Paryżu, gdzie w latach 1948–1950 pracował
najpierw w Instytucie Pasteura, jako stypendysta rządu francuskiego, a potem w
Instytucie Fizykochemicznej Biologii, Fundacji Rothschildów. Poznał tam wielu wybitnych badaczy wytyczających kierunki dalszego rozwoju biochemii. W
Instytucie Pasteura byli to m. in. biochemicy i przyszli nobliści François Jacob
i Jacques Monod oraz Claude Fromageot, wirusolog Andrè Lwoff i bioenergetyk Luise Rapkine. Z tym ostatnim podjął współpracę nad cieplną inaktywacją i reaktywacją dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicyny [1], jednego z
enzymów cyklu glikolitycznego. Po śmierci Luise Rapkine w grudniu 1948 r.,
Shugar kontynuował prace nad inaktywacją i fotoreaktywacją tego enzymu
przez promieniowanie UV oraz na drodze fotosensybilizacji ryboflawiną [2-4].
W Instytucie Fizykochemii Biologicznej pracował w Zakładzie Biofizyki, kierowanym przez Renè Wurmsera, fizykochemika, profesora Sorbony, wybitnego
badacza procesów fotochemicznych leżących u podstaw fotosyntezy, entuzjastę
i promotora interdyscyplinarnych podejść do problemów biologii. W Instytucie
tym poznał także Marianne Grunberg-Manago, niebawem odkrywczynię enzymu, fosforylazy polinukleotydowej (1955) w laboratorium przyszłego Noblisty
prof. Severo Ochoa w Nowym Jorku. Kolejnym, ważnym etapem w karierze naukowej Shugara był jego pobyt w Laboratorium Fizjologii Zwierząt na Wolnym
Uniwersytecie w Brukseli, na zaproszenie jego kierownika Jean Brachet’a, embriologa i cytochemika, współpracującego wcześniej z laboratorium L. Rapkine.
Brachet zajmował się wówczas lokalizacją DNA i RNA w organellach komórek
zwierzęcych. Jednym z narzędzi w tych badaniach były enzymy nukleolityczne,
m. in. rybonukleaza. David Shugar przeprowadził tam pierwsze dokładne badania widma UV RNazy w rejonie absorpcji tyrozyny i wiązań disiarczkowych
[5]. Opisał też inaktywację lizozymu przez promieniowanie UV [6]. Wraz z
przebywającym na stażu podoktorskim J.J. Foxem, specjalizującym się w chemii
nukleozydów, wspólnie przeprowadzili spektrofotometryczne badania widm
absorpcyjnych naturalnych zasad i nukleozydów występujących w kwasach nukleinowych oraz ich syntetycznych analogów [7-9].
Po przyjeździe do Polski w 1952 r. David Shugar kontynuował podjęte we
Francji i Belgii wątki badawcze, dotyczące spektroskopii i fotochemii białek enzymatycznych: początkowo w Zakładzie Biochemii PZH, a od 1954 r. także w
stworzonej przez siebie Pracowni Fizykochemii Biologicznej Zakładu Biochemii
PAN, przekształconej później w Zakład Biofizyki Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN. Nowym przedmiotem jego zainteresowania stała się jednak stopniowo
fotochemia kwasów nukleinowych.
Celem tego artykułu jest przegląd ważniejszych wyników badań Davida Shugara i jego współpracowników w zakresie fotochemii i spektroskopii białek oraz
kwasów nukleinowych na tle ówczesnego stanu wiedzy w tej dziedzinie.
FOTOCHEMIA I SPEKTROSKOPIA BIAŁEK
Na przełomie lat 40. i 50. XX w., kiedy David Shugar podejmował badania nad
termiczną i fotochemiczną inaktywacją enzymów były to dominujące wówczas
242www.postepybiochemii.pl
podejścia doświadczalne w poszukiwaniu związku pomiędzy biochemiczną aktywnością i budową białek. Znany był
wprawdzie skład aminokwasowy niektórych białek, ale
nie ich sekwencyjna budowa i przestrzenna struktura. Sekwencja reszt aminokwasowych pierwszego białka, insuliny, oraz metoda sekwencjonowania białek została ustalona
dopiero w 1953 r. przez F. Saengera [10]. Nieco wcześniej
pojawiła się hipoteza Paulinga i Coreya (1951 r.) fałdowania łańcuchów polipeptydowych w strukturę alfa-helisy i
beta-kartki, jednakże doświadczalne potwierdzenie ich występowania przyniosły dopiero badania rentgenograficzne
kryształów mioglobiny (Kendrew, 1957) i hemoglobiny
przez Maxa Perutza [10].
W pracach dotyczących dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicyny [2-4] Shugar opisał inaktywację tego enzymu przez promieniowanie 253,7 nm i wykazał, że wydajność kwantowa reakcji nie zależy od stanu utlenienia
związanego z białkiem koenzymu NAD+/NADH. W zredukowanej formie (NADH) w widmie UV koenzymu pojawia się pasmo absorpcji w rejonie 340 nm, w którym białko
praktycznie nie absorbuje. Naświetlanie inaktywowanego
fotochemicznie enzymu w kompleksie z NADH promieniowaniem 310-380 nm powodowało jego częściową reaktywację. Enzym w nieobecności czynnika redukującego występuje częściowo w formie utlenionej. Jednakże w pełni zredukowany enzym nie ulegał reaktywacji UV w obecności
cysteiny, przyjęto zatem, że fotoreaktywacja dotyczy tylko
utlenionej formy i związana jest przypuszczalnie z redukcją
jakiegoś istotnego dla funkcji enzymu mostka SS na drodze
przeniesienia energii wzbudzenia z DPNH.
Badania nad chemiczną budową i strukturą rybonukleazy dopiero się wówczas zaczynały, m. in. w laboratoriach
Christiana Anfinsena, Harolda Scheragi i Kai LindenstrømLanga. Było wiadomo, że spośród aromatycznych aminokwasów absorbujących silnie w bliskim ultrafiolecie enzym
zawiera jedynie resztę tyrozynową. Jednakże widmo UV
rybonukleazy było znane tylko z stosunkowo mało dokładnych pomiarów spektrograficznych [11]. W celu określenia
roli reszt tyrozynowych w budowie tego enzymu Shugar
przeprowadził pierwszą spektrofotometryczną charakterystykę widma rybonukleazy w funkcji pH roztworu [5],
określił liczbę reszt tyrozyny w cząsteczce enzymu i wykazał, że u 60% tych reszt grupa fenolowa dysocjuje z pK
zbliżoną do wolnej tyrozyny, natomiast pozostałe mogą
ulegać dysocjacji dopiero po termicznej denaturacji białka
lub jego trawieniu pepsyną. Na podstawie analizy tych danych sformułował hipotezę, że ujawniające się w wyniku
denaturacji białka reszty tyrozyny w natywnej rybonukleazie zaangażowane są nie tylko w wewnątrzcząsteczkowe
wiązania wodorowe, ale również w znacznie silniejsze oddziaływania elektrostatyczne z dodatnio naładowanymi
resztami aminokwasowymi. Praca ta wzbudziła szerokie
zainteresowanie i do dziś może uchodzić za fundamentalną
i standardową metodycznie.
W doświadczeniach nad fotochemiczną inaktywacją lizozymu wykorzystał opracowaną przez siebie szybką i
dokładną metodę pomiaru aktywności enzymu, opartą na
ciągłym spektrofotometrycznym pomiarze gęstości optycznej zawiesiny bakterii Micorcoccus lysodeicticus. NaświePostępy Biochemii 61 (3) 2015
tlanie promieniowaniem 253,7 nm powodowało szybką
inaktywację enzymu, niezależną od pH roztworu. Ciemna
następcza reakcja manifestowała się wzrostem absorbcji w
widmie UV i zanikiem zawartości tryptofanu, spowodowanym zapewne jego fotoutlenieniem. Enzym ulegał bowiem
fotosensybilizowanej ryboflawiną inaktywacji [2], której nie
obserwowano dla pozbawionej tryptofanu RNazy.
Badania nad fotochemiczną inaktywacją RNazy [12]
podjął ze względu na brak w niej reszty tryptofanowej oraz
podobną do lizozymu masę cząsteczkową i termostabilność. Dla pomiaru jej aktywności enzymatycznej opracował
przedtem kolorymetryczną metodę opartą na uwalnianiu
się wolnych grup kwasowych [13]. Inaktywacji towarzyszyły zmiany w widmie UV wskazujące na uwalnianie się
wolnych grup fenolowych i spadek ich liczby. Wydajność
kwantowa reakcji okazała się zależna od stanu jonizacji grup
fenolowych tyrozyny, malejąc wraz z ich uwalnianiem się w
środowisku alkalicznym, mimo wzrostu absorpcji enzymu
w rejonie 253,7 nm. Zaobserwowano zachodzenie wtórnej,
ciemnej reakcji, podobnie jak w przypadku lizozymu. Wykluczono jednak jej związek z fotooksydacją reszt tyrozyny
do 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA). Nie stwierdzono także powstawania niskocząsteczkowych peptydów w
wyniku ewentualnego rozerwania wiązań peptydowych.
Postulowana w literaturze możliwość ich fotochemicznego
rozrywania została także podważona przez wykazanie, że
alifatyczny, zasadowy polipeptyd, protamina, hydrolizujący kwas apurynowy, jest nadal aktywny po naświetleniu
253,7 nm, podczas gdy rybonukleaza i lizozym traktowane
tą samą dawką promieniowania ulegały inaktywacji [14].
Badania nad kinetyką cieplnej inaktywacją lizozymu i
rybonukleazy w funkcji temperatury roztworu [15,16] pokazały, że termodynamiczne parametry tego procesu są
tego samego rzędu wielkości jak dla wielu zwykłych reakcji chemicznych. Podważało to rozpowszechniony wówczas pogląd, że za utrzymanie stabilnej struktury aktywnych enzymatycznie białek odpowiedzialne są głównie
wewnątrzbiałkowe wiązania wodorowe między grupami
fenolowymi tyrozyny i resztami karboksylowych aminokwasów. Pogląd ten był oparty w dużej mierze na interpretacji spektralnych badań nad dysocjacją grup fenolowych
w owoalbuminie [17], które sugerowały, że część grup nie
ulega temu procesowi. Jednakże zarówno występowanie
efektu izotopowego H/D w cieplnej inaktywacji rybonukleazy [18], jak i badania Hvidt [19] nad kinetyką wymiany H/D w tym białku wskazywały na występowanie też
innych oddziaływań. W związku z tym Tramer i Shugar
[20] przeprowadzili spektralne pomiary dysocjacji grup
fenolowych ujawniających się w trakcie cieplnej denaturacji i utleniania kwasem nadmrówkowym rybonukleazy,
owoalbuminy i albuminy osocza wołu. Cieplnej inaktywacji rybonukleazy towarzyszyło stopniowe ujawnianie się
wszystkich wolnych grup fenolowych, natomiast w pozostałych białkach część ich pozostawała nadal zamaskowana. We wszystkich utlenionych białkach grupy fenolowe miareczkowały się podobnie jak w wolnej tyrozynie.
Wyniki te nie wykluczały występowania postulowanych
wiązań wodorowych, wskazywały jednak na obecność innych, silniejszych elektrostatycznych oddziaływań stabilizujących cząsteczki białek.
243
Na początku lat 60. XX wieku McLaren i Shugar w obszernej monografii [11] przedstawili krytyczny przegląd
podstaw teoretycznych i metod doświadczalnych fotochemii oraz stanu wiedzy i badań w tej dziedzinie nad białkami i kwasami nukleinowymi. W jego świetle omówione
powyżej prace Shugara mieściły się w głównym nurcie badań mających na celu poznanie ugrupowań i oddziaływań
odpowiedzialnych za aktywność enzymatyczną białek i termodynamiczną ich stabilność.
FOTOCHEMIA I SPEKTROSKOPIA
KWASÓW NUKLEINOWYCH
Stopniowe ugruntowanie się na przełomie lat 40. i 50.
poglądu, że informacja genetyczna zakodowana jest w
strukturze kwasów nukleinowych, w połączeniu z wiedzą,
że to one są głównie odpowiedzialne za absorpcję bakteriobójczego promieniowania ultrafioletowego w komórkach,
spowodowało rozwój badań nad fotochemicznymi uszkodzeniami kwasów nukleinowych i elementów ich budowy.
Wcześniej badania te były prowadzone przy użyciu bardzo
dużych dawek promieniowania UV powodujących daleko
idącą fotochemiczną destrukcję elementów budowy DNA
i samego polimeru [11,21]. Przełom w tych badaniach nastąpił po odkryciu w 1949 r. przez Roberta Sinsheimera i
R. Hastingsa [22,23] fotochemicznej reakcji dla uracylu, urydyny i kwasu 5’-cytydylowego prowadzącej do powstania
nietrwałych fotoproduktów, rozpadających się w kwaśnym
środowisku z odtworzeniem wyjściowych związków. Odkrycie to spowodowało skierowanie uwagi badaczy na pierwotne uszkodzenia kwasów nukleinowych indukowane
znacznie niższymi dawkami promieniowania, zbliżonymi
do dawek powodujących inaktywację wirusów i bakterii.
Dodatkowym impulsem do tych badań stało się odkrycie
w tym samym czasie procesów spontanicznej reaktywacji
(E.H. Anderson) i fotoreaktywacji inaktywowanych promieniowaniem UV bakterii (Albert Kelner) i bakteriofagów
(Renato Dulbecco), których nie obserwowano u bakterii inaktywowanych promieniowaniem jonizującym (James Watson) [24]. Sprzyjał im też szybki rozwój badań nad chemią i
strukturą kwasów nukleinowych uwieńczony pojawieniem
się w 1953 r. modelu budowy DNA Cricka i Watsona [25].
David Shugar, zanim zainteresował się fotochemią kwasów nukleinowych, wspólnie z J.J. Foxem przeprowadził
pierwsze w literaturze spektrofotometryczne pomiary
widm absorpcji w ultrafiolecie zasad pirymidynowych: uracylu, tyminy i cytozyny oraz ich nukleozydów w funkcji pH
[7-9]. Na tej podstawie zostały wyznaczone wartości pKa
dla równowag jonizacyjnych 2,4-diketopirymidyn (uracyl,
tymina) i 2-keto-4-amino-pirymidyny (cytozyna). Porównanie widm zasad z widmami ich N- i O- metylowanych
pochodnych, pokazało, że w zakresie fizjologicznych wartości pH uracyl i tymina występują w formie ketonowej, a
cytozyna w amino-ketonowej.
Znajomość właściwości spektralnych tych związków stała się podstawą badań nad fotochemicznymi przemianami
pirymidynowych elementów budowy kwasów nukleinowych, zainicjowanych w 1955 r. przez Davida Shugara w
Zakładzie Biochemii PAN [11,21]. Było już wówczas wia-
domo, że fotohydratacja pierścienia uracylu polega na nukleofilowej addycji cząsteczki wody do podwójnego wiązania C(5)=C(6) pierścienia pirymidynowego z utworzeniem 1,3-dimetylo-5,6-dihydro-6-hydroksyuracylu [26,27].
Natomiast pytanie, czy fotoaddycja cząsteczki wody do
pierścienia cytozyny prowadzi do powstania analogicznego produktu pozostawało otwarte. Z tego powodu przedmiotem prac Shugara w początkowym okresie badań stała
się fotochemia cytozyny, cytydyny, kwasów cytydylowych
i poli(C) [28-32]. Nieco później objęły one również analogi
uracylu [33], oligonukleotydy i poli(U) [34].
FOTOHYDRATACJA PIRYMIDYN
Postęp reakcji fotochemicznej i ciemnej, następczej reakcji mierzono spektrofotometrycznie, jako spadek względnie
przyrost absorpcji w głównym paśmie widma UV badanego
związku, powodowany przyłączeniem lub eliminacją cząsteczki wody do wiązania C(5)=C(6) w pierścieniu pirymidyny. Reakcje fotochemiczne inicjowano promieniowaniem
niskociśnieniowych lamp rtęciowych emitujących głównie
promieniowanie rezonansowe Hg o długości fali 253,7 nm,
eliminując bardziej krótkofalowe promieniowanie przy pomocy odpowiednich filtrów optycznych. Natężenie wiązki
czynnego fotochemicznie promieniowania, potrzebne do
wyznaczenia wydajności kwantowych reakcji, wyznaczano
metodą chemicznej aktynometrii.
Związki potrzebne do tych badań, poza naturalnymi
zasadami i ich nukleozydami, były wówczas w większości niedostępne komercyjnie. Niewielkie ich ilości David
Shugar otrzymywał od badaczy zajmujących się chemią
kwasów nukleinowych: m. in. od późniejszego Noblisty
dr. A.R. Todda (Cambridge), dr A.M. Michelsona (Dublin) i dr. L. Heppela (National Institute of Health, Bethesda), a polirybonukleotydy i syntetyzujący je enzym, fosforylazę polinukleotydową, od jego odkrywców, prof.
Severo Ochoa (przyszłego Noblisty) i dr. Marianne Grunberg-Manago (Nowy Jork). Dopiero po przyjściu do jego
laboratorium Włodzimierza Szera, który zorganizował
pracownię chemicznej syntezy substratów dla polinukleotydowej fosforylazy i otrzymywania polirybonukleotydów, mogliśmy się stopniowo uniezależnić od koleżeńskiej pomocy.
Już nasze wstępne doświadczenia z naświetlaniem RNA
i kwasu apurynowego (APA) promieniowaniem λ253,7 nm
[28,29], pokazały, że spadek absorpcji w ich widmach UV
można częściowo odwrócić przez ogrzewanie roztworu,
co wskazywało na zachodzenie reakcji fotohydratacji reszt
uracylu i cytozyny w RNA i reszt cytozyny w APA. Wtedy było bowiem już wiadomo, że obecna w APA tymina
nie ulega tej reakcji [11]. Dla przewidywania i interpretacji
przebiegu fotochemicznych reakcji w naturalnych kwasach
nukleinowych, konieczne było zatem poznanie wpływu
na wydajność kwantową powstawania fotohydratów obu
zasad oraz na ich trwałość termiczną i chemiczną: (i) podstawienia azotu N(1) w pirymidynie rybozą lub dezoksyrybozą, (ii) fosforylacji reszt cukrowych w nukleozydach, (iii)
wbudowania nukleotydów w oligo- i polinukleotydy oraz
w dwułańcuchowe kompleksy zbudowane z komplementarnych polinukleotydów pirymidynowych i purynowych.
244www.postepybiochemii.pl
Program ten był konsekwentnie realizowany w następnych
latach.
produktów na większą skalę i badania ich chemicznej budowy, aby doświadczalnie zweryfikować tę sugestię.
Odpowiedzi na pytanie, czy fotochemiczna przemiana
cytozyny prowadzi do utworzenia analogicznego związku
jak w przypadku fotohydratacji uracylu poszukiwaliśmy
poprzez porównanie kinetyki tej reakcji i reakcji eliminacji
wody w H2O i D2O dla wybranych związków z obu grup.
Występowanie podobnej wielkości efektu izotopowego
H/D wskazywałoby na analogiczny mechanizm obu reakcji w obu grupach związków. Rzeczywiście, zgodnie z teoretycznym oczekiwaniem, stosunek zmierzonych stałych
szybkości reakcji fotochemicznej k(H2O) /k(D2O) ≈ 2 okazał się podobny dla 1-metylouracylu, cytozyny i cytydyny
[28,31]. Efekt izotopowy dla reakcji eliminacji wody miał
jednak bardziej złożony mechanizm, ponieważ w ciężkiej
wodzie występuje szybka wymiana H/D na węglu C(5)
pierścienia pirymidyny, co powoduje, że eliminacji z fotoproduktu może ulegać także cząsteczka HDO. W związku z
tym zmierzone zostały stałe szybkości eliminacji wody dla
fotohydratów urydyny i cytydyny: Urd.H2O, Urd.D2O, Cyd.
H2O i Cyd.D2O zarówno w H2O jak i w D2O. Analiza ich
wartości pozwoliła na zaproponowanie schematu przebiegu reakcji dehydratacji zgodnego z doświadczalnie zaobserwowanymi różnicami w wielkości efektu izotopowego między urydyną i cytydyną. Pomiary efektu izotopowego H/D
potwierdzały więc pośrednio hipotezę, że fotochemiczna
przemiana cytozyny, podobnie jak dla uracylu, polega na
addycji cząsteczki wody do wiązania C(5)=C(6) z utworzeniem odpowiedniej 5,6- dihydro-6-hydroksy pochodnej a
ciemna reakcja na eliminacji przyłączonej cząsteczki wody.
Również bliskie podobieństwo widm UV fotohydratów
i odpowiadających im 5,6-dihydropirymidyn, opisanych
przez Janion i Shugara [35], popierało tę hipotezę.
Dopiero w latach 90. XX w. innym badaczom [38,39]
udało się ustalić, że końcowym produktem reakcji fotochemicznej 5-metylocytozyny (lub jej nukleozydów) jest 3-amino-2-metyloakryloamidyna.Tego typu związek powstaje
również w wyniku naświetlania cytozyny, jako produkt
uboczny głównej reakcji fotohydratacji [38]. Mechanizm tej
reakcji polega także na ataku cząsteczki wody, ale na karbonylowy atom węgla C-2 wzbudzonej elektronowo cząsteczki, połączony z przeniesieniem atomu wodoru do grupy
karbonylowej, przerwaniem wiązania C(2)-N(1), otwarciem
pierścienia pirymidynowego i utworzeniem nietrwałej pochodnej kwasu karbaminowego, który ulega szybkiej dekarboksylacji do 3-amino-2-metyloakryloamidyny.
Kilka lat później Wachter i Smith [36] w oparciu o pomiary widm NMR zaproponowali wspólny dla pochodnych
uracylu i cytozyny schemat mechanizmu reakcji eliminacji
D2O i H2O z fotohydratów uwzględniający ich stereoizomeryczne formy i szybką wymianę izotopową na C(5). Jednak
struktura fotohydratu aglikonu cytydyny, jako 5,6-dihydro-6-hydroksycytozyny została definitywnie ustalona dopiero po 20 latach przez Liu i Yang’a na drodze analizy widm
NMR fotoproduktów [37].
Ponieważ tymina, czyli 5-metylouracyl, nie ulegała fotohydratacji, powstawało pytanie czy inne C(5) i/lub C(6)
podstawione pochodne uracylu i cytozyny zachowują się
podobnie. Spektrofotometryczne badania fotochemicznych
właściwości tak podstawionych grupami CH3, CH2OH,
NH2 uracyli i ich N(1), N(3) mono- i dimetylowanych pochodnych wykazały [33], że tylko fotoprodukt 1,3,6-trimetylouracylu zachowywał się jak fotohydrat. Także 5-metylocytozyna i 5-metylohydroksycytozyna (występująca w
DNA T-parzystych bakteriofagów) oraz ich nukleozydy, nie
ulegały odwracalnej fotohydratacji. Powstający fotoprodukt
cechował się nadal silnym pasmem absorpcji w widmie UV
przesuniętym długofalowo o ok. 10 nm i obecnością silnie
zasadowej grupy aminowej. Sugerowało to zachowanie w
nim pierścienia cytozyny i przyjęcie przez grupę aminową
formy iminowej. Pod koniec lat 50. nie mieliśmy jeszcze w
laboratorium technicznych warunków do preparatyki fotoPostępy Biochemii 61 (3) 2015
Badania nad wpływem zastąpienia w 1-metylocytozynie grupy metylowej dezoksyrybozą lub rybozą pokazały,
że początkowa wydajność kwantowa fotohydratacji pierścienia cytozyny w nukleozydzie w środowisku obojętnym
zwiększa odpowiednio ok. 4-krotnie i 5-krotnie. Wprowadzenie grupy fosforanowej na 2’ i 3’ grupy hydroksylowe rybozy lub 3’-OH dezoksyrybozy powodowało dalszy wzrost
wydajności kwantowej reakcji, jednakże obecność tej grupy na grupie 5’-OH w obu nukleozydach prowadziła do jej
obniżenia, w przypadku dCp nawet ponad 2-krotne. Wskazywało to na przestrzenne oddziaływanie grupy aminowej
cytozyny z grupami hydroksylowymi w nukleozydzie i
fosfoestrowymi w nukleotydach. Oddziaływanie to miało
jeszcze większy wpływ na trwałość chemiczną fotohydratu,
zależną od miejsca estryfikacji reszty cukrowej. Był on najsilniej wyrażony w kwasach 5’-cytydylowym i 5’-dezoksycytydylowym powodując ok. 5-krotny wzrost szybkości reakcji eliminacji wody w porównaniu z macierzystym nukleozydem. Katalizowana kwasowo-zasadowo reakcja była na
tyle szybka, że nawet w warunkach maksymalnej trwałości
fotohydratu, czas jego półtrwania w temperaturze 25°C był
rzędu kilkudziesięciu minut. Jej szybkość korelowała się z
odległością grupy fosfoestrowej od pierścienia aglikonu, co
wskazywało na jej rolę, jako lokalnego rezerwuaru protonów. W rezultacie, w trakcie naświetlania układu ustalał się
stan pozornej równowagi między wyjściowym związkiem
i jego fotohydratem, zależny od temperatury, pH roztworu
i natężenia wiązki promieniowania UV [29,31]. Aby otrzymać wiarygodne wartości początkowej wydajności kwantowej fotohydratacji, pomiary trzeba było wykonywać w
niskiej temperaturze i w neutralnym roztworze wodnym.
Kolejna praca nad właściwościami fotochemicznymi N-amino-metylowanych pochodnych cytozyny [40] pokazała, że zarówno mono- jak i dimetylacja tej grupy powoduje
znaczne obniżenie wydajności kwantowej reakcji fotohydratacji oraz zwiększenie trwałości fotohydratów w porównaniu ze związkiem macierzystym.
Dla nukleozydów i nukleotydów uracylu również obserwowano wzrost wydajności kwantowej fotohydratacji jak i
zależność trwałości fotohydratów nukleotydów od miejsca
estryfikacji cukru, ale efekty te były wyraźnie mniejsze niż
w grupie analogicznych pochodnych cytydyny [34]. Wydajności kwantowe reakcji fotohydratacji 1,3 dimetylouracy-
245
lu, urydyny i kwasu urydylowego okazały się zależne od
stężenia związku w roztworze. Przyczyny tej zależności
zostały później przez nas wyjaśnione, jako skutek pojawiania się w roztworze warstwowych agregatów, w których
występowała reakcja dimeryzacji (zobacz niżej). Fotohydraty uracylu, jego N-metylowanych pochodnych oraz
urydyny i różnych kwasów urydylowych okazały się w
warunkach fizjologicznych (pH 7,5, 37°C) znacznie trwalsze
termicznie od fotohydratów analogicznych związków cytozyny. Na przykład stała szybkości reakcji eliminacji H2O z
fotohydratu Up jest o około dwa rzędy wielkości mniejsza
niż dla fotohydratu Cp, a czas półtrwania fotohydratu wynosi odpowiednio 4 dni i 50 minut [41].
W pojedynczych łańcuchach kwasów nukleinowych zasady pirymidynowe sąsiadujące z zasadami purynowymi
oddziałują z sobą warstwowo, można się było więc spodziewać występowania sterycznej zawady dla reakcji fotohydratacji, a także przekazywania energii wzbudzenia elektronowego z puryn do pirymidyn i zwiększenia tym samym
wydajności kwantowej reakcji fotochemicznej. W związku
z tym zbadaliśmy przebieg reakcji fotohydratacji uracylu i
cytozyny w di- i trinukleotydach purynowo-pirymidynowych, obliczając jej wydajność kwantową przy założeniu, że
czynne fotochemicznie jest tylko promieniowanie absorbowane przez ulegającą fotohydratacji zasadę [42]. Reakcja fotohydratacji reszt U w oligomerach: ApUp, UpGpA, GpApU i GpUpA była praktycznie w pełni odwracalna termicznie i przebiegała bez mierzalnego uszkodzenia reszt A i G.
Jej wydajność kwantowa była w pewnym stopniu zależna
od położenia U w sekwencji oligonukleotydu (wahała się w
granicach 0,0045 – 0,0105 mol* E-1), ale wyraźnie niższa niż
dla wolnego Up (0,02). W oligomerach ApC i ApApC oraz
GpCp i GpCpGpCp wydajność kwantowa fotohydratacji
reszt C była wyższa wówczas, gdy sąsiadowała z A (0,0082),
a niższa w przypadku sąsiedztwa z G (0,0055), ale w obu
grupach zdecydowanie niższa niż dla wolnego Cp (0,0125).
Wskazywało to na występowanie zawady przestrzennej dla
fotohydratacji, ale wykluczało istotny wkład przenoszenia
energii wzbudzenia puryna → pirymidyna. Także obecność
tlenu w roztworze nie miała wpływu na wydajność kwantową reakcji, co wykluczało przenoszenie energii stanu tripletowego w temperaturze otoczenia, postulowane przez
innych autorów [11,41].
W CpU bliskie sąsiedztwo zasad pirymidynowych nie
miało większego wpływu na wydajność kwantową dominującej reakcji fotohydratacji (90%) i trwałość hydratów
składowych nukleotydów, zmierzone wydajności były bliskie obserwowanym dla wolnych nukleotydów. Natomiast
w oligomerach CpCp i CpCpCp początkowa wydajność
kwantowa reakcji była wyraźnie wyższa (ø ≈ 0,012 ) i spadała do wartości ø ≈ 0,0075 po ok. 20% przebiegu fotolizy, przy czym wydajność ciemnej reakcji nie przekraczała
90%. W poli(C) reakcja przebiegała z podobną wydajnością
kwantowa jak w oligomerach, jednakże jej odwracalność
była niższa [32]. W dwuniciowym helikalnym kompleksie
poli(C) z komplementarną poli(I) [42], odporną na fotolizę
podobnie jak poli(G), reakcja fotohydratacji przebiegała z
ok. dwukrotnie niższą wydajnością kwantową (ø ≈ 0,004)
niż w samym poli(C) i z ok. 80% wydajnością fotochemiczną, mierzoną jako maksymalny przyrost gęstości optycznej
w głównym paśmie absorpcji cytozyny przy 270 nm. Jednakże towarzyszący reakcji dehydratacji spadek absorbcji
przy 240 nm w widmie fotohydratu był znacznie niższy
od oczekiwanego, co wskazywało na obecność w reaktywowanym pod wpływem temperatury poli(C) innego, termicznie trwałego fotoproduktu bez podwójnego wiązania
C(5)=C(6). Jak się później okazało był to nietrwały dimer cytozyny przekształcający się w wyniku dezaminacji w dimer
uracylu.
Badania nad przebiegiem reakcji fotohydratacji w di- i
trinukleotydach oraz w poli(U) [34] ujawniły jeszcze wyraźniej występowanie w tych układach dodatkowej fotochemicznej reakcji charakteryzującej się zanikiem głównego pasma absorpcji w widmie UV uracylu, podobnie jak w
reakcji fotohydratacji, z kilkakrotnie wyższą początkową
wydajnością kwantową niż dla reakcji fotohydratacji, nieodwracalną termicznie i na drodze kwasowo-zasadowej
katalizy oraz niewykazującej izotopowego efektu H/D.
Poprzedzała ona reakcję fotohydratacji, która ujawniała się
dopiero po przereagowaniu ok. 25% reszt uracylu, a jej wydajność chemiczna rosła do 50–60% wraz z długością łańcucha oligonukleotydu.
Fotochemicznej reakcji poli(U) w kompleksie z poli(A)
[42], indukowanej λ 253,7 nm, towarzyszyła stopniowa
zmiana jego temperaturowego profilu topnienia (obniżenie
Tm i poszerzenie) wskazująca na powstawanie w helikalnym
dupleksie lokalnie zdenaturowanych obszarów w wyniku
utraty przez hydratowane reszty uracylu zdolności do parowania z komplementarnymi resztami adeniny. Natomiast
zmiany w widmie UV były wypadkową przyrostu absorpcji
spowodowanej malejącym efektem hypochromowym dupleksu i jej spadku z postępem fotohydratacji. W tej sytuacji
ilość utworzonych fotohydratów można było oceniać dopiero po enzymatycznej hydrolizie RNazą składowego poli(U)
do kwasu urydylowego. Tak mierzona początkowa wydajność kwantowa reakcji fotohydratacji w dupleksie okazała
się aż 25-krotnie mniejsza niż w wolnym poli(U), ale potem
wzrastała wraz z jej postępem. Dopiero po przekroczeniu
ok. 40% fotolizy ujawniała się nieodwracalna reakcja fotochemiczna obejmująca ok. 20% reszt U. Poli(A) nie ulegał
przy tym mierzalnemu uszkodzeniu, zgodnie z wynikami
naszych doświadczeń, które wykazały, że zasady purynowe w polinukleotydach są znacznie bardziej odporne na
działanie UV niż w mononukleotydach [42]. Otrzymany
doświadczalny opis fotochemicznej przemiany prowadził
do wniosku, że w dupleksie poli(A) · poli(U) występuje
strukturalna bariera dla reakcji fotohydratacji, która obniża
się po pojawieniu się pierwszych fotoproduktów i lokalnej
denaturacji dupleksu dla pozostałych reszt U w tym rejonie.
FOTODIMERYZACJA PIRYMIDYN
Na przełomie lat 50. i 60., Baranowska i Shugar [43] postanowili sprawdzić stosowalność opracowanej przez siebie nowej, czulszej metody barwienia DNA radioaktywnie
znakowanymi barwnikach [44] do badania indukowanej
przez promieniowanie ultrafioletowe jego agregacji w filmie otrzymywanym przez odparowanie wodnego roztworu DNA na szkle [11]. W tym celu mierzyli ilość 14C-zieleni metylowej wiązanej przez naświetlone DNA w funkcji
246www.postepybiochemii.pl
zaaplikowanej dawki promieniowania 253,7 nm. Postęp
agregacji obserwowali również przy pomocy mikroskopu. Zdjęcia mikroskopowe ujawniły, że naświetlany DNA
tworzy nierozpuszczalne w wodzie, usieciowane włókna o
rosnących wraz z dawką promieniowania rozmiarach i powinowactwie do barwnika. Podobne włókna tworzyły się
w filmach utworzonych z kwasu apurynowego, poli(U) i
poli(C), nie obserwowano jednak ich pojawiania się w analogicznych doświadczeniach z poli(A) i poli(G), a także z
polisacharydami. Ponadto stwierdzono, że w widmie UV
naświetlanego poli(U) zanika pasmo absorpcji uracylu przy
260 nm. Nie ulegało zatem wątpliwości, że za agregację i
pojawianie się włókien odpowiedzialne są fotoprodukty pirymidyn, ale inne niż fotohydraty. W związku z tym wysunęli oni hipotezę, że przyczyną agregacji jest powstawanie
wiązań krzyżowych między cząsteczkami DNA w wyniku
międzyłańcuchowej dimeryzacji pirymidyn z udziałem podwójnych wiązań C(5)=C(6), podobnie jak to obserwowano
w liniowych nienasyconych poliestrach [11].
Zaobserwowaliśmy również, że w poli(T) wyodrębnionym z APA [45], reszty tyminy ulegają nieodwracalnej termicznie reakcji z wydajnością kwantową malejącą nieliniowo wraz z jej postępem do wartości odpowiadającej wolnej
tyminie [42].
Jednocześnie Beukers i Berends [46] stwierdzili, że tymina w zamrożonych roztworach wodnych ulega fotodimeryzacji z wysoką wydajnością kwantową, natomiast ponowne
naświetlenie odmrożonego roztworu powoduje dysocjację
dimeru z odtworzeniem wyjściowego związku. Była to więc
reakcja postulowana przez Baranowską i Shugara. Wkrótce
potem Wulff i Fraenkel [47] w oparciu o analizę widm NMR
dimeru 1,3-dimetylotyminy ustalili, że w dimerze pierścienie tyminy połączone są pierścieniem cyklobutanowym powstałym przez addycję wiązań C(5)=C(6).
W laboratorium Shugara nie mieliśmy już wtedy wątpliwości, że jest to ta fotochemiczna reakcja, której ulegają
sąsiadujące ze sobą reszty tyminy w poli(T) [42], a prawdopodobnie również reszty uracylu w oligonukleotydach
i w poli(U) [33], a także w bardziej stężonych roztworach
monomerycznych pochodnych uracylu [34].
W tym samym czasie Marmur i Grossman [47], zainspirowani pracą Baranowskiej i Shugara oraz odkryciem
Beukersa i Berendsa, wykazali metodą ultrawirowania w
gradiencie chlorku cezu DNA znakowanego w jednym z
łańcuchów izotopami 14C i 15N, że w DNA naświetlonym
promieniowaniem UV pojawia się frakcja nieulegająca denaturacji formamidem, w wyniku powstania w nim krzyżowych, kowalentnych wiązań między składowymi łańcuchami dupleksu, oraz że zawiera ona dimery tyminy, które
można było usunąć fotoreaktywującym enzymem in vitro.
David Shugar, zdając sobie doskonale sprawę z wagi
tych odkryć dla fotochemii kwasów nukleinowych i mutagennego działania promieniowania UV w komórkach, a
także dla interpretacji wyników naszych wcześniejszych
prac, postanowił niezwłocznie zająć się fotodimeryzacją
2,4-diketopirymidyn. Wraz z Agnieszką Śmietanowską
otrzymali dimery uracylu, tyminy i szeregu ich N1-, N3- i
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
C6- metylowanych pochodnych, metodą naświetlania w
zamrożonym roztworze wodnym; opisali ich widma UV
w funkcji pH i wyznaczyli stałe równowagi między diketonową i anionową (C(4)-O-) formą dimerów [49]. W
widmach UV form anionowych dimerów w środowisku
alkalicznym główne pasmo absorpcji okazało się przesunięte długofalowo w porównaniu z formą ketonową. Na
tej podstawie zaproponowali analityczną metodę detekcji fotodimerów przez ich fotodysocjację w środowisku
alkalicznym promieniowaniem λ 257,3 nm rezonansowej
lampy rtęciowej.
Ponieważ było wiadomo, że tymina nie ulega fotohydratacji, jako modelowy układ do badania reakcji fotodimeryzacji w oligomerach w roztworze wodnym wybrane
zostały przez Shugara dinukleotydy tyminy. Wraz z Ewą
Sztumpf [50] szczegółowo zbadali jej przebieg w TpT,
pTpT oraz w dinukleotydach rozdzielonych wiązaniem
fosfodiestrowym T3’pp3’T i T5’pp5’T. W celu poznania
jej zależności od długości fali promieniowania UV posłużyli się odpowiednio dobranymi filtrami optycznymi
oraz zaproponowaną wcześniej metodą detekcji dimerów
w alkalicznym roztworze. Opisali kinetykę i zmierzyli
wydajność kwantową obu reakcji fotochemicznych, fotodimeryzacji i fotodysocjacji dimerów. Udokumentowali
też pozorną równowagę, jaka ustala się między obu reakcjami w zależność od długości fali czynnego promieniowania, spowodowaną dużą odległością między pasmami
absorpcji w widmach UV monomeru i dimeru. Wydajność kwantowa dimeryzacji w dinukleotydach tyminy
w normalnej temperaturze (0,01 mol*E-1) była o rząd
wielkości mniejsza od wydajności tej reakcji dla tyminy
w zamrożonym roztworze (0,10). Świadczyło to o dużej
dynamice konformacyjnej dinukleotydu powodującej, że
populacja konformerów TpT o odpowiedniej przestrzennej orientacji reszt tyminy dla zajścia reakcji dimeryzacji
jest stosunkowo niewielka.
Po odkryciu, że także cytozyna może ulegać fotodimeryzacji [51], uznaliśmy, że obserwowana przez nas niepełna
termiczna odwracalność fotochemicznej przemiany w olignukleotydach, poli(C) i w dupleksie poli(C · poli(I) była
najprawdopodobniej spowodowana powstawaniem dimerów cytozyny [42].
Potwierdzili to kilka lat później Freeman, Hariharan
i Johns [52] rozdzielając i identyfikując fotoprodukty
powstające w [32P]-CpC w funkcji długości fali promieniowania UV. W początkowej fazie przemiany fotochemicznej przy λ 280 nm dominowała reakcja dimeryzacji,
ale zanikała w miarę powstawania mono- i dihydratów
cytozyny. Dimery C<>C ulegały szybkiej dezaminacji
do dimerów U<>U i były kwantyfikowane jako te ostatnie. Nasz opis reakcji fotochemicznych w kompleksie
poli(C) · poli(I) potwierdzili Setlow ze współpracownikami [50]. Ponieważ położenie równowagi monomer ↔
dimer dla cytozyny znacznie silniej zależy od długości
fali promieniowania niż dla tyminy i uracylu, w naszych
doświadczeniach przy naświetleniu λ 253,7 nm maksymalna zawartość dimerów C<>C była dużo mniejsza niż
w cytowanych pracach i nie przekraczała kilku procent.
247
Kolejnym naszym krokiem w kierunku poznania efektywności reakcji fotodimeryzacji tyminy w DNA, uwarnukowanej jego dwuniciową, helikalną strukturą, były badania modelowych polinukleotydów zawierających tyminę:
poli(rT), poli(dT) i ich kompleksów z poli(A) [53]. Pokazały
one, że w jednołańcuchowej formie obu homopolinukleotydów, rT i dT, pozbawionych uporządkowanej drugorzędowej struktury, początkowa szybkość fotodimeryzacji
jest odpowiednio 2- i 3-krotnie większa od obserwowanej
w modelowym dwunukleotydzie TpTp. W dwuniciowej
formie poli(rT) reakcja była nawet 4-krotnie szybsza. Jednakże w kompleksie poli(dT) · poli(A) oraz trójniciowym
kompleksie poli(rA) · 2poli(rT) reakcja fotochemiczna
w początkowej fazie okazała się silnie zahamowana, postęp dimeryzacji obserwowano dopiero po ujawnieniu
się uszkodzeń w drugorzędowej strukturze kompleksów
mierzalnym obniżeniem ich temperatury topnienia, ale ze
zmniejszoną szybkością w porównaniu z homopolimerami rT i dT. Usztywnienie struktury i ograniczenie w niej
konformacyjnych fluktuacji było niewątpliwie przyczyną
niskiej wydajności fotodimeryzacji. Wcześniej Deering i
Setlow [54] stwierdzili, że fotodimeryzacja praktycznie nie
zachodzi w dwuniciowym kopolimerze poli(dA-dT), w którym reszty tyminy występują naprzemiennie z resztami A
w przeciwległych łańcuchach. Tak, więc w dwuniciowych
kompleksach nie tylko usztywnienie struktury, ale i niekorzystne usytuowanie przestrzenne reszt tyminy decydują o
prawdopodobieństwie zajścia reakcji dimeryzacji.
253,7 nm na korzyść monomerów, w naszych doświadczeniach na początku przemiany dominowała odwracalna termicznie fotohydratacja. W doświadczeniach grupy Johnsa
równowaga ta dla λ 280 nm była przesunięta praktycznie
całkowicie w stronę dimeru, tak więc fotodimeryzacja wyprzedzała reakcję fotohydratacji (fotohydraty powstawały z
większym prawdopodobieństwem w Ura sąsiadującymi z
utworzonym już dimerem U<>U), przy czym szybkość obu
procesów w porównaniu z ich przebiegiem w poli(U) była
odpowiednio 5- i 10-krotnie zredukowana.
Kilka lat później Harold A. Johns ze współpracownikami
[55] zbadali ponownie przebieg reakcji fotodimeryzacji w
TpT oraz obu konkurujących reakcji dimeryzacji i fotohydratacji w UpU [56] oraz poli(U) [57], potwierdzając generalnie nasze wcześniejsze ustalenia. Jednakże zastosowanie
przez nich znakowanych [32P]dinukleotydów, w połączeniu
z chromatograficznym rozdziałem, kwantyfikacją fotoproduktów i identyfikacją streoizomerycznych form dimerów,
pozwoliło im na uszczegółowienie opisu przebiegu obu reakcji. Okazało się, że w początkowej fazie reakcji indukowanej promieniowanie 253,7 nm głównym fotoproduktem
w TpT jest wewnątrzcząsteczkowy dimer o konfiguracji cis-syn, powstający z 5-krotnie większą wydajnością od izomeru trans-syn. W UpU również wewnątrzcząsteczkowy
dimer o konfiguracji cis-syn był dominującym produktem
w początkowej fazie przemiany fotochemicznej dla promieniowania λ 248 nm; dopiero po ustaleniu się równowagi
dimer ↔ monomer równocześnie biegnąca reakcja fotohydratacji stawała się dominującą reakcją. W poli(U) reakcje
dimeryzacji i fotohydratacji przebiegały z podobną wydajnością do zmierzonej w dinukleotydach; zaobserwowano
jednak tendencję do powstawania kolejnych dimerów między resztami U sąsiadującymi w sekwencji z utworzonym
już dimerem, co wskazywało na zwiększenie prawdopodobieństwa dimeryzacji w zaburzonych już konformacyjnie regionach polinukleotydu. Analogiczne badania fotochemicznej przemiany reszt uracylu w dwuniciowym kompleksie
poli(U) · poli(A) przy 280 nm) [58], częściowo potwierdziły nasze wnioski dla tego układu wysnute z doświadczeń
wykonanych przy λ 253,7 nm, opartych wyłącznie o pomiary i interpretację zmian w widmach UV [41,42]. Ze względu na przesuniecie równowagi dimer ↔ monomer przy λ
W świetle opisanych streochemicznych uwarunkowań
przebiegu reakcji fotodimeryzacji pirymidyn w polinukleotydach logicznym krokiem było poznanie jej mechanizmu
i wydajności kwantowej w kryształach pirymidyn o znanej,
usztywnionej strukturze. Z wcześniejszych, półilościowych
danych było wiadomo, że w agregatach wytrąconych z
roztworu wodnego przez zamrażanie i w krystalicznych
proszkach fotodimeryzacja pirymidyn przebiega z wysoka
wydajnością kwantową. W kryształach cząsteczki pirymidyn lub ich wodorowo powiązane pary, upakowane są warstwowo w sposób analogiczny do ich warstwowego ułożenia w polinukleotydach, jednakże wzajemna ich orientacja,
odległość i swoboda ruchu jest zdeterminowana i ograniczona siecią krystaliczną. Kryształy wybranych 2,4-diketopirymidyn (metylowane pochodne tyminy i uracylu) zawieszaliśmy w sprasowanych, przezroczystych matrycach
KBr i przebieg reakcji fotodimeryzacji/fotodysocjacji dimerów obserwowaliśmy spektrofotometrycznie w widmach
UV i IR [60]. Okazało się, że generalnie wysoka wydajność
kwantowa fotodimeryzacji w warstwowo upakowanych
kryształach koreluje z odległością wiązań C(5)=C(6) sąsiadujących cząsteczek, natomiast wydajność kwantowa dysocjacji dimeryzacji jest bliska jedności, co sugerowało, że
obie reakcje zachodzą w singletowym, ekscimerowym stanie wzbudzonym cząsteczek. Forma izomeryczna dimerów
odpowiadała ich wzajemnej orientacji w sieci krystalicznej.
Wyniki prowadzonych równolegle badań w laboratorium Richarda Setlowa nad fotochemicznymi przemianami
DNA z różnych bakterii [59] okazały się generalnie zgodne z wnioskami wypływającymi z prac nad modelowymi
polinukleotydami. W badaniach tych używano DNA z 14C
znakowanymi tyminą i cytozyną, napromieniowany preparat hydrolizowano enzymatycznie do zawierających dimer
trójnukleotydów pXpP<>pPy (żadna ze znanych wówczas
nukleaz nie hydrolizowała wiązań fosfodiestrowych miedzy dimerami), które rozdzielano chromatograficznie i
kwantyfikowano. Ilość dimerów utworzonych w natywnym DNA po naświetleniu niską dawką promieniowania
UV (280 nm) w przedziale 103–104 erg* mm-2) była rzeczywiście znikoma. Na przykład w DNA z E. coli, na jednostkę
masy 1 daltona DNA (ok. 3000 nukleotydów) przypadało
średnio zaledwie ok. 30 różnych fotodimerów, wśród nich
były to głównie dimery T<>T (20) i mniejsze ilości dimerów
C<>T (8) i C<>C(2).
W związku z zaobserwowaną przez nas zależnością wydajności kwantowej fotohydratacji 1,3-dimetylouracylu,
urydyny i kwasu urydylowego od stężenia ich wodnych
roztworów, jak i literaturowymi doniesieniami o kontrolowanej dyfuzyjnie fotodimeryzacji pochodnych tyminy w
248www.postepybiochemii.pl
roztworze wodnym via długożyjący stan tripletowy [41],
przeprowadziliśmy badania fotodimeryzacji łatwo rozpuszczalnych w wodzie 1,3-dimetylotyminy [61] i 1,3-dimetylouracylu [62] w szerokim zakresie stężeń tych związków.
Z naszych osmometrycznych badań nad ich agregacją w
roztworze wodnym wynikało, że wraz ze wzrostem stężenia tworzą one warstwowo upakowane liniowe asocjaty
[63]. Wydajność kwantowa reakcji dimeryzacji DMT i DMU
w warstwowych kompleksach asocjacyjnych w roztworze wodnym wynosiła odpowiednio 0,065 i 0,028 mol*E-1,
a dystrybucja dimerów między izomeryczne formy cis-syn
i trans-syn odzwierciedlała preferowaną orientację cząsteczek monomeru w warstwowych asocjatach w roztworze
wodnym, sprzyjającą powstawaniu dimerów, podobnie jak
to ma miejsce w polinukleotydach i DNA. Obecność w roztworze tlenu, wygaszającego stany tripletowe cząsteczek,
zmniejszała wydajność dyfuzyjnie kontrolowanej dimeryzacji DMT, ale nie miała wpływu na jej przebieg w asocjatach, co wskazywało, że w warstwowych kompleksach
reakcja zachodzi bardzo szybko we wzbudzonym stanie
singletowym cząsteczek, podobnie jak w kryształach.
Zmierzone przez nas wydajności kwantowe fotodimeryzcji w poli(dT) i w kryształach zasad pirymidynowych
zostały ostatnio przytoczone w kontekście wyników badań
kinetyki tej reakcji w oligomerze dT18 [64] metodą rozdzielczej w czasie femtosekundowej spektrometrii IR. Wyniki tej
pracy dowodzą, że dimery powstają w czasie ok. 1 pikosekundy od momentu wzbudzenia i tylko między tymi zasadami, które w tym momencie znajdują się w odpowiedniej
wzajemnej odległości i orientacji. Wobec tego wydajność
kwantowa reakcji jest tożsama z populacją zdolnych do
dimeryzacji konformerów. Potwierdzona została zatem zasadność naszych wcześniejszych interpretacji dotyczących
szybkości reakcji fotodimeryzacji i zależności jej wydajności
kwantowej od stopnia swobody konformacyjnej i dynamiki
układu, w którym ona zachodzi (agregat warstwowy, oligomer, polimer, kryształ).
NOWE REAKCJE FOTOCHEMICZNE
W związku z pracami nad fotochemią cytozyny i 5-metylocytozyny badaliśmy też fotochemiczne reakcje dla innych 4-aminopirymidyn. Doprowadziły one do odkrycia
wewnątrzcząsteczkowej reakcji izomeryzacji 4-amino-2,6-dimetylopirymidyny do α-cyjano-β-diiminy [65,66] prawdopodobnie via nietrwały związek Dewara z wiązaniem
między węglami C(2)-C(5) w pierścieniu pirymidynowym.
Związek ten ulegał hydrolizie kolejno do aminoketonu cyjanoacetyloacetonu i cyjanoacetyloacetonu. Ze względu
na interesujące właściwości nieznanych dotychczas obu
pochodnych cyjanoacetyloacetonu scharakteryzowaliśmy
szczegółowo ich widma UV i IR [67-69].
Pojawienie się interesujących z fotobiologicznego punktu
widzenia doniesień, że zastąpienie 5-fluorouracylem połowy uracylu w RNA roślinnego wirusa TMV nie powoduje
zmian w jego wirulentności, zwiększając jednocześnie ok.
5-krotnie jego wrażliwość na działanie promieniowania UV,
a w przypadku wyizolowanego z wirusa RNA w stopniu
proporcjonalnym do ilości zawartego w nim 5-FU, skłoniły nas do zbadania fotochemicznej przemiany tego związPostępy Biochemii 61 (3) 2015
ku [70,71]. Przedmiotem doświadczeń był głównie łatwo
rozpuszczalny w wodzie 1,3-dimetylo-5-fluouracyl, ale
również 5-fluorouracyl, 5-fluorourydyna i kwas poli(5-FU).
Przebieg przemiany fotochemicznej śledzono spektrofotometrycznie korzystając z wcześniej opisanych widm UV
halogenowanych uracyli w funkcji pH [72]. Okazało się, że
główną reakcją indukowaną promieniowaniem długofalowym (λ ≥ 270 nm) jest fotohydratacja, podobnie jak w przypadku 1,3-dimetylouracylu. Fotoprodukt otrzymano w formie krystalicznej, co pozwoliło na określenie jego struktury
metodami chemicznymi i spektroskopii IR jako 1,3-dimetylo-5,6-dihydro-6-hydroksy-5-fluorouracylu. Natomiast pod
działaniem bardziej krótkofalowego promieniowania λ <
270 nm początkowo powstający fotohydrat po absorpcji kolejnego kwantu promieniowania tracił cząsteczkę fluorowodoru i przekształcał się w kwas 1,3-dimetylobarbiturowy.
Fotochemiczne właściwości pozostałych związków były
bardzo podobne.
Badania Fikus i Shugara nad przebiegiem reakcji eliminacji wody z fotohydratów wybranych 2,4-diketopirymidyn, urydyny i innych nukleozydów uracylu w środowisku alkalicznym [73] doprowadziły do wykrycia nowego
mechanizmu tej reakcji polegającego na hydrolitycznym
otwarciu pierścienia uracylu między atomami N(1) i C(6)
z utworzeniem przejściowego związku z maksimum absorpcji przy 290 nm, a następnie eliminacji cząsteczki wody
i ponownym zamknięciu pierścienia. Reakcja ta przebiegała ilościowo tylko w obecności jonów amonowych w roztworze. Późniejsze badania tej reakcji dla dwóch wyizolowanych diasteroizomerów Urd i dUrd pokazały, że ulega
jej tylko jeden z nich [74]. W ostatnio opublikowanej pracy
[75], poświęconej reakcji fotohydratów nukleozydów i polinukleotydów uracylu i cytozyny z alifatycznymi aminami i
aminokwasami Shetlar i Chung sugerują, że jednym z przejściowych związków w procesie dehydratacji w środowisku
alkalicznym, proponowanym przez Fikus i Shugara, może
być addukt amoniaku do otwartego pierścienia uracylu.
Ponadto wskazują, że analogiczna reakcja fotohydratów z
N-końcowymi grupami aminowymi aminokwasów może
prowadzić do powstawania w komórkach wiązań krzyżowych między DNA i/lub RNA a związanymi z nimi funkcjonalnie białkami.
W związku z pracami nad wpływem zastąpienia grupy
metylowej w tyminie grupą etylową na termodynamiczne
właściwości kompleksów poli(5-EtU) z poli(A) oraz zastępowaniem tymidyny w DNA 5-etylourydyną w komórkach
bakterii i w bakteriofagach T3. Pietrzykowska i Shugar badali
fotochemiczną przemianę 5-etylouracylu i 5-etylourydyny.
Przyniosły one odkrycie nowej reakcji, wewnątrzcząsteczkowej fotoaddycji grupy etylowej do wiązania C(5)=C(6) z
utworzeniem 5,6dihydro-5,6-cyklobutanylo uracylu (urydyny) [76,77]. Związki te powstawały pod działaniem promieniowania λ ≥ 265 nm. Bardziej krótkofalowe promieniowanie 254 nm prowadziło do eliminacji etylenu z odtworzeniem pierścienia uracylu, a nie wyjściowego związku,
jak w przypadku pochodnych tyminy. W związku z tym
zbadano również fotochemiczne właściwości 5-propylo i
5-izopropylo podstawionych uracyli oraz ich nukleozydów
[78,79], a także 5-heksylourydyny [80]. Okazało się, że ulegają one analogicznym przemianom fotochemicznym jak
249
5-etylo-pochodne. Naświetlanie uracylu (urydyny) w obecności nienasyconego węglowodoru prowadziło do odtworzenia pierwotnych wewnętrznych fotoadduktów. Związki
te zostały zaliczone do nowej klasy pochodnych w grupie
5,6-dihydropirymidyn.
PODSUMOWANIE
Podjęty przez Davida Shugara w połowie lat 50. program
badań nad fotochemią kwasów nukleinowych praktycznie
dobiegł swojego końca w pierwszej połowie lat 70. ubiegłego wieku. Wyniki tych badań wnosiły znaczący wkład
do stopniowo kształtującej się wiedzy o fotochemicznych
przemianach pirymidynowych zasad. Wzajemnie uzupełniające się i sumujące wyniki prac kilkunastu laboratoriów
na świecie doprowadziły w ciągu tych 20 lat do poznania
podstawowych procesów fotochemicznych indukowanych w DNA i RNA przez promieniowanie ultrafioletowe,
uszkadzających ich strukturę i funkcje biologiczne. David
Shugar stał się uznanym autorytetem, a kierowane przez
niego Zakłady Biofizyki IBB PAN i Uniwersytetu Warszawskiego ważnymi ośrodkami badań w tej dziedzinie. Wyrazem uznania dla dokonań Davida Shugara było zaproszenie
go do grona redaktorów — założycieli nowego, międzynarodowego czasopisma Photochemistry and Photobiology
(1962 r., Pergamon Press) oraz wyróżnienie go Złotym Medalem im. Nielsa Finsena przez International Committee on
Photobiology w 1976 r.
Zainteresowanie Davida Shugara promutagennymi
uszkodzeniami struktury DNA nie ograniczało się do wywoływanych przez promieniowanie UV. Równolegle zajmował się innymi chemicznymi modyfikacjami zasad nukleinowych, ich mutagennym działaniem i enzymatyczną
naprawą. Wyniki tych badań omawia w tym numerze Postępów Biochemii Jarosław Kuśmierek.
Czytelników zainteresowanych dalszym rozwojem i
osiągnięciami fotochemii i fotobiologii kwasów nukleinowych odsyłam do cytowanych poniżej artykułów przedstawiających aktualny stan wiedzy w tej dziedzinie. Przełom w badaniach uszkodzeń fotochemicznych DNA in vivo
przyniosło zastosowanie wysokosprawnej chromatografii,
w połączeniu z tandemową metodą masowej spektrometrii
(HPLC-MS/MS), do ich detekcji i identyfikacji [81,82].
Głównymi produktami działania promieniowania UVB i
UVC na DNA w komórkach różnych organizmów okazały
się cyklobutanowe dimery T<>T, C<>T i C<>C oraz tzw.
potocznie fotoprodukty 6-4 (6-4PP). Te ostatnie to swego
rodzaju dimery zbudowane z dwóch pierścieni tyminy
lub tyminy i cytozyny połączonych pojedynczym kowalencyjnym wiązaniem między węglami C(6) jednej z nich
i C(4’) drugiej (chemiczne nazwy odpowiednio: 6-4’-[pyrimidin-2’-one]-tymina i 6-4’-[pyrimidin-2’-one] - cytozyna).
Zostały one odkryte jeszcze pod koniec lat 70. XX wieku
wśród fotoproduktów tyminy naświetlanej w zamrożonym wodnym roztworze [83]. W naszych pracach, opartych
głównie na spektrofotometrycznych obserwacjach, powstawanie ich było niewykrywalne. Co się tyczy nietrwałych
fotohydratów cytozyny, dopiero odpowiednia modyfikacja metody HPLC-MS/MS, polegająca na wcześniejszej ich
dezaminacji do hydratów uracylu, pozwoliła na ustalenie
ich zawartości w wyizolowanym DNA z komórek i wykazanie, że powstają one z wydajnością o przynajmniej dwa
rzędy wielkości mniejszą od wydajności cyklobutanowych
dimerów oraz 6-4TT i 6-4TC łącznie. Niewielka ich ilość i
chemiczna nietrwałość powoduje, że nie mają zapewne
znaczącego wpływu na inicjację promutagennych procesów w komórkach. Natomiast pojawiające się w wyniku
ich dezaminacji i dehydratacji reszty uracylu odgrywają
istotną rolę w mutagenezie [84]. Dokonał się także wielki
postęp w poznaniu mechanizmów enzymatycznej naprawy
uszkodzonego fotochemicznie DNA [24], zwłaszcza przez
spokrewnione ze sobą komórkowe fotoliazy, specyficzne w
stosunku do cyklobutanowych dimerów i 6-4PP produktów
[85,86]; poznana została ich struktura i struktura naprawczych kompleksów oraz fotofizyczne mechanizmy naprawy
DNA. Poznanie mechanizmów i kinetyki procesów naprawy było możliwe dzięki wprowadzeniu do badań femtosekundowej, rozdzielczej w czasie spektroskopii UV i IR [64,
86]. Daje ona też wgląd w mechanizmy dyssypacji energii
promieniowania UV pochłanianej przez DNA w zależności
od jego sekwencyjnej budowy [87], leżące u podstaw następczych procesów fotochemicznych.
PIŚMIENNICTWO
1. Rapkine L, Shugar D, Siminovitch L (1949) Reactivation par le chaleur
de la triosephosphate deshydrogenase. C R Hebd Seances Acad Sci
228: 1163
2. Shugar D (1951) Photosensitization of enzymes and of indole derivatives by riboflavin. Bull Soc Chim Biol (Paris) 33: 710-718
3. Shugar D (1951) Ultra-violet irradiation of triosephosphate dehydrogenase. Biochim Biophys Acta 6: 548-561
4. Shugar D (1951) Photoreactivation in the near ultra-violet of d-glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase. Experientia 7: 26-28
5. Shugar D (1952) The ultraviolet absorption spectrum of ribonuclease.
Biochem J 52: 142-149
6. Shugar D (1952) The measurement of lysozyme activity and the ultra-violet inactivation of lysozyme. Biochim Biophys Acta 8: 302-309
7. Shugar D, Fox JJ (1952) Spectrophotometric studies of nucleic acid derivatives and related compounds as a function of pH. I. Pyrimidines.
Biochim Biophys Acta 9: 199-218
8. Fox JJ, Shugar D (1952) Spectrophotometric studies of nucleic acid derivatives and related compounds as a function of pH. II. Natural and
synthetic pyrimidine nucleosides. Biochim Biophys Acta 9: 369-384
9. Fox JJ, Shugar D (1952) Absorption spectra and structure of barbituric
acid derivatives as a function of pH. Bull Soc Chim Belge 61: 44-63
10.Stryer L (1986) Biochemia, Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa
11.McLaren AD, Shugar D (1964) Photochemistry of proteins and nucleic
acids, Pergamon Press, Oxford, London, Edinburgh, New York, Paris,
Frankfurt.
12.Shugar D, Rzendowska F (1956) Studies on photochemistry of ribonuclease. Acta Biochim Polon 3: 595-605
13. Shugar D (1953) The binding of basic dyes by ribonucleic acid and
the measurement of ribonuclease activity. Bull Acad Polon Sci Cl II
1: 39-44
14.Shugar D, Adamiec A, Sztumpf E (1959) Role of peptide bond absorption in protein photochemistry. Acta Biochim Polon 1: 417-423
15.Gajewska E, Shugar D (1955) Kinetics of heat-inactivation of ribonuclease. Bull Acad Polon Sci Cl II 3: 117-121
16.Gajewska E, Shugar D (1956) The heat inactivation of ribonuclease in
the presence of foreign proteins. Bull Acad Polon Sci Cl II 4: 157-162
17.Crammer JL, Neuberger A (1943) State of tyrosine in egg albumin and
insulin as determined by spectophotometric titration. Biochem J 37:
302-310
250www.postepybiochemii.pl
18.Syruczek E, Shugar D (1954) Kinetics of inactivation of ribonuclease
with heat. Acta Physiol Pol 5: 634-635
irradiated films of nucleic acids and oligonucleotides. Acta Biochim
Polon 7: 505-520
19.Hvidt A (1955) Deuterium exchange between ribonuclease and water.
Biochim Biophys Acta 18: 306-308
44.Bitny-Szlachto S, Shugar D (1959) Quantitative staining with radioactive indicators. Preparation of 14C-labelled crystal violet and methyl
green. Bull Acad Polon Sci Ser Biol 7: 293-297
20. Tramer Z, Shugar D (1959) Studies on phenolic hydroxyl binding in
proteins. Acta Biochim Polon 6: 235-251
21.Shugar D, Wierzchowski KL (1958) Photochemistry of nucleic acids,
nucleic acid derivatives and related compounds. Postepy Biochem 4:
187-197; 4: 243-296
45.Adamiec A, Shugar D (1959) Products of thermal degradation of apurinic acid. Naturwissenschaften 44: 356-357
46.Beukers R, Berends W (1960) Isolation and identification of the irradiation product of thymine. Biochim Biophys Acta 41: 550-551
22.Sinsheimer RL, Hastings R (1949) A reversible photochemical alteration of uracil and uridine. Science 110: 525
47.Wulff DL, Fraenkel G (1961) On the nature of thymine photo-product.
Biochim Biophys Acta 51: 332-339
23.Sinsheimer RL (1954)The photochemistry of uridylic acid. Radiat Res
1: 505-513
48.Marmur J, Grossman L (1961) Ultraviolet light induced linking of deoxyribonucleic acid strands and its reversal by photoreactivating enzyme. Proc Natl Acad Sci USA 47: 778-787
24.Friedberg EC (2008) A brief history of the DNA repair field. Cell Res18:
3-7
25.Watson JD, Crick FHC (1953) Molecular structure of nucleic acids. A
structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737-738
26.Moore AM, Thomson CH (1955) Ultraviolet irradiation of pyrimidine
derivatives. Science 122: 594-595
27.Wang SY, Apicella M, Stone BR (1956) Ultraviolet irradiation of 1,3-dimethyluracil. J Am Chem Soc 78: 4180-4180
28.Shugar D, Wierzchowski K (1957) Reversible photolysis of pyrimidine
derivatives, including trials with nucleic acids. Biochim Biophys Acta
23: 657-658
29.Wierzchowski KL, Shugar D (1957) Photochemistry of cytosine nucleosides and nucleotides. Biochim Biophys Acta 25: 355-364
30.Shugar D, Wierzchowski K (1958) Structure and Photochemical Behavior of Nucleic Acid Acids and related components. J Polym Sci 31:
269-280
31.Wierzchowski KL, Shugar D (1961) Photochemistry of cytosine nucleosides and nucleotides. II. Acta Biochim Polon 8: 219-234
32.Wierzchowski KL, Shugar D (1960) Photochemistry of model oligoand polynucleotides. II. Homopolymers of adenylic, guanylic and
cytidylic acids and several heteropolymers. Acta Biochim Polon 7:
377-399
33.Wierzchowski KL, Shugar D (1960) Further studies on the photochemistry of pyrimidines, with special reference to 5-and 6-substituted
derivatives in relation to photoreactivation in the T-even bacteriophages. Acta Biochim Polon 7: 63-84
34.Wierzchowski KL, Shugar D (1959) Studies of reversible photolysis in
oligo-and poly-uridylic acids. Acta Biochim Polon 6: 313-334
35.Janion C, Shugar D (1960) Absorption spectra, structure and behavior
towards some enzymes of dihydropyrimidines and dihydro-oligonucleotides. Acta Biochim Polon 7: 309-329
36.Wechter WJ, Smith KC (1968) Nucleic acids. IX. The structure and
chemistry of uridine photohydrate. Biochemistry 17: 4064-4069
37.Liu F-T, Yang NC (1978) Photochemistry of cytosine derivatives. 2.
Photohydration of cytosine derivatives. Proton magnetic resonance
study on the chemical structure and property of photohydrates. Biochemistry 17: 4877-4885
38. Celewicz L, Shetlar MD (1992) The photochemistry of 5-methylcytosine and 5-methyl-2’-deoxycytidine in aqueous solution. Photochem
Photobiol 55: 823-830
39.Celewicz L (1999) Reakcje Fotochemiczne Pochodnych Zasad Pirymidynowych, Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań
40.Fikus M, Wierzchowski KL, Shugar D (1962)Photochemistry of Cytosine Nucleosides and Nucleotides. III. Mono- and dimetylamino analogues. Photochem Photobiol 1: 325-335
41.Wierzchowski KL (1967) Fotochemiczne przemiany kwasów nukleinowych. Postepy Biochem 13: 127-160
42.Wierzchowski KL, Shugar D (1962) Photochemistry of model oligo- and polynucleotides. IV. Heteronucleotides and high molecular
weight single and twin-stranded polymer chains. Photochem Photobiol 1: 21-36
49.Śmietanowska A, Shugar D (1961) Photochemistry of model oligo and
polynucleotides.V. Properties of photodimers of uracil and thymine.
Bull Acad Polon Sci Cl II 9: 375-380
50.Sztumpf E, Shugar D (1962) Photochemistry of model oligo- and polynucleotides. VI. Photodimerization and its reversal in thymine dinucleotide analogues. Biochim Biophys Acta 61: 555-566
51.Setlow RB, Carrier WL, Bollum FJ (1965) Pyrimidine dimers in UV-irradiated polydI:dC. Proc Natl Acad Sci USA 53: 1111-1118
52.Freeman KB, Hariharan PV, Johns HE (1965) The ultraviolet photochemistry of cytidylyl-(3’-5’)-cytidine. J Mol Biol 13: 833-848
53.Tramer Z, Wierzchowski KL, Shugar D (1969) Influence of polynucleotide secondary structure on thymine photodimerization. Acta Biochim Polon 16: 83-107
54.Deering RA, Setlow RB (1963) Effects of ultraviolet light on thymidine
dinucleotide and polynucleotide. Biochim Biophys Acta 68: 526-534
55.Johns HE, Pearson ML, Leblanc JC, Helleiner CW (1964) The ultraviolet Photochemistry of of thymidylyl-(3’-5’)-thymidine. J Mol Biol
9: 503-524
56.Brown IH, Freeman KB, Johns HE (1966) Photochemistry of uridylyl-(3’-5’)-uridine. J Mol Biol 15: 640-662
57.Pearson M, Whillans DW, LeBlanc JC, Johns HE (1966). Dependence
on wavelength of photoproduct yields in ultraviolet-irradiated poly U.
J Mol Biol 20: 245-261
58.Pearson M, Johns HE (1966) Suppression of hydrate and dimer formation in ultraviolet-irradiated poly (A plus U) relative to poly U. J Mol
Biol 20: 215-229
59. Setlow RB, Carrier WL (1966) Pyrimidine dimers in ultraviolet-irradiated DNA’s. Mol Biol 17: 237-254
60.Lisewski R, Wierzchowski KL (1970) Solid state photochemistry of
thymine, its N- methylated derivatives and orotic acids in KBr matrices. Photochem Photobiol 11: 327-347
61.Lisewski R, Wierzchowski KL (1971) Photochemistry of 2,4-diketopyrimidines. Dimerization and stacking association of 1,3-dimethylthymine in aqueous solution. Mol Photochem 3: 231-254
62.Stepień E, Lisewski R, Wierzchowski KL (1973) Photochemistry of
2,4-diketopyrimidines. Photodimerization, photohydration and stacking association of 1,3-dimethyluracil in aqueous solution.Acta Biochim Polon 20: 313-324
63.Plesiewicz E, Stępień E, Bolewska K, Wierzchowski KL (1976) Osmometric studies of self-association of pyrimidines in aqueous solutions.
Evidence for involvement of hydrophobic interactions. Biophys
Chem 4: 131-141
64.Schreier WJ, Koller FO, Schrader TE, Gilch P, Crespo-Hernández CE,
Swaminathan VN, Carell T, Zinth W, Kohler B (2007)Thymine dimerization in DNA is an ultrafast photoreaction. Science 315: 625- 629
65.Wierzchowski KL, Shugar D, Katritzky AR (1963) Primary photoproduct of 2,6-dimethyl-4-aminopyrimidine. J Am Chem Soc 8: 827-828
66.Wierzchowski KL, Shugar D (1963) Photochemistry of 4-aminopyrimidines: 2,6-dimethyl-4-aminopyrimidine. Photochem Photobiol 2:
377-391
43.Baranowska J, Shugar D (1960) Photochemistry of model oligo and poly-nucleotides. III. Cross-linking and staining properties of ultraviolet
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
251
67.Wierzchowski KL, Shugar D (1965) The ultraviolet absorption spectra of cyanoacetylacetone and its aza-analogues. Spectrochim Acta 21:
931-941
68.Wierzchowski KL, Shugar D (1965) Infrared spectra of cyanoacetylacetone and the free enolate ions of acetyloacetone and cyanoacetylacetone. Spectrochim Acta 21: 943-954
69.Wierzchowski KL, Shugar D (1966) Infrared spectra of the aza-analogues of cyanoacetylacetone: β-amino-vinylketone and β-aminovinylimine. Rocz Chem 40: 793-808
70.Fikus M, Wierzchowski KL, Shugar D (1965) Photochemistry of 5-fluorouracil its nucleosides, nucleotides and of poly-FU. Photochem Photobiol 4: 521-536
71.Fikus M, Wierzchowski KL, Shugar D (1964) Photochemical reversible
transformation of 5-fluorouracil, 5-fluoro-polyurydilic acid and 5-fluorouracil analogues. Biochem Biophys Res Commun 16: 478-481
72.Berens K, Shugar D (1963) Ultraviolet absorption spectra and structure
of halogenated uracils and their glycosides. Acta Biochim Polon 10:
25-48
73.Fikus M, Shugar D (1966) Alkaline transformations of the photohydrates of some 2,4-diketopyrimidines and their glycosides. Acta Biochim Polon 13: 39-56
74.Pietrzykowska I, Shugar D (1969) Diastereoisomers of uracil glycoside
photohydrate. Biochim Biophys Res Commun 37: 225-232
75.Shetlar MD, Chung J (2011) Opened-Ring Adducts of 5-Methylcytosine and 1,5-Dimethylcytosine with Amines and Water and Evidence
for an Opened-Ring Hydrate of 2’-Deoxycytidine. Photochem Photobiol 87: 818-832
76.Pietrzykowska I, Shugar D (1968) 5-Ethyldeoxyuridine, a thymidine
analog: photochemical transformation. Science 161: 1248-1249
77.Pietrzykowska I, Shugar D (1970) Photochemistry of 5-ethyluracil and
its glycosides. Acta Biochim Polon 17: 361-384
78.Krajewska E, Shugar D (1971) Photochemical transformation of 5-alkyluracils and their nucleosides. Science 173: 435-437
79.Krajewska E, Shugar D (1972) 5,6-Dihydro-5,6-cyclobutanyluracils
and their nucleosides: intermediates in the photochemical dealkylation of 5-propyl- and 5-isopropyl uracils and their nucleosides. Acta
Biochim Polon 19: 207-226
80.Sztumpf-Kulikowska E, Shugar D (1974) Photochemical transformation of 5-hexyluridine, and cyclobutane photoadducts of 1-hexene
with uridine and 1-methyluracil. Acta Biochim Polon 21: 73-91
81.Cadet J, Sage E, Douki T(2005) Ultraviolet radiation-mediated damage
to cellular DNA. Mutation Res 571: 3-17
82.Douki T (2013) The variety of UV-induced pyrimidine dimeric photoproducts in DNA as shown by chromatographic quantification methods. Photochem Photobiol Sci 12: 1286-1302
83.Varghese AJ, Wang SY (1968) Thymine-thymine adduct as a photoproduct of thymine. Science 160: 186-187
84.Tu Y, Dammann R, Pfeifer GP (1998) Sequence and time-dependent
deamination of cytosine bases in UVB-induced cyclobutane pyrimidine dimers in vivo. J Mol Biol 284: 297-311
85.Beukers R, Eker APM, Lohman PHM (2008) Historical reflections. 50
years thymine dimer. DNA Repair 7: 530-543
86.Liu Z, Wang L, Zhong (2015) Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase. Phys Chem Chem Phys 17: 11933-11949
87.Buchvarov I, Wang Q, Raytchev M, Trifonov A, Fiebig T (2007) Electronic energy delocalization and dissipation in single- and double-stranded DNA. Proc Natl Acad Sci USA 104: 4794-4797
Photochemistry and UV Spectroscopy of Proteins and Nucleic Acids
Kazimierz L. Wierzchowski
Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 5a Pawińskiego St., 02-106 Warsaw, Poland

e-mail: [email protected]
Key words: photochemistry of proteins, photochemistry of nucleic acids, photodimerization of pyrimidine bases, photohydration of pyrimidine
bases
ABSTRACT
The article presents a short history of David Shugar studies in the field of photochemistry and UV spectroscopy of proteins and nucleic acids,
carried out since the late 1940s. to the beginning of the 1970s. of the 20th century, with some references to the state of related research in those
days.
252www.postepybiochemii.pl