Dorota Żabicka - "Metody detekcji i identyfikacji bakterii"

Dorota Żabicka - "Metody detekcji i identyfikacji bakterii"

METODY DETEKCJI I IDENTYFIKACJI BAKTERII
dr n.med. Dorota Żabicka
Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, Narodowy Instytut Leków, Warszawa
Mikrobiologia, czyli nauka o drobnoustrojach (wirusach, bakteriach, pierwotniakach,
grzybach drożdżopodobnych i pleśniowych) stanowi szeroką i niezwykle dynamicznie rozwijająca się
dziedzinę wiedzy. Drobnoustroje występują we wszystkich środowiskach, kolonizując zarówno glebę i
wodę, jak i organizmy żywe. Poznanie fizjologii i genetyki drobnoustrojów, ich interakcji z
otaczającym środowiskiem jest niezwykle istotne zarówno dla profilaktyki zakażeń u ludzi i zwierząt ,
jak i dla ochrony środowiska i rozwoju wielu gałęzi przemysłu.
Bakterie stanowią najliczniejszą pod względem liczby gatunków grupę wśród drobnoustrojów.
Są to jednokomórkowe organizmy prokariotyczne, czyli nie posiadające jądra komórkowego. Zamiast
jądra komórkowego występuje u nich zanurzony w cytoplazmie chromosom bakteryjny (nukleoid),
zbudowany z jednej, koliście zamkniętej, splątanej, powiązanej z białkami cząsteczki DNA.
Zewnętrzne osłony komórki bakterii stanowią: białkowo-lipidowa błona komórkowa oraz ściana
komórkowa, która nadaje komórce kształt charakterystyczny dla poszczególnych gatunków bakterii
(kulisty, cylindryczny lub spiralny). Niektóre z gatunków bakterii posiadają także wielocukrowe
otoczki chroniące przed działaniem środowiska zewnętrznego (np. układu odpornościowego
człowieka i zwierząt), pile umożliwiające przyleganie do kolonizowanych powierzchni oraz wici
umożliwiające poruszanie się bakterii.
Stwierdzenie obecności drobnoustrojów i ich identyfikacja w badanym materiale pobranym od
zakażonego człowieka lub zwierzęcia lub też w próbce pobranej ze środowiska stanowi cel badania
mikrobiologicznego. Tok badania mikrobiologicznego można podzielić na następujące etapy:
pobranie materiału i jego transport do laboratorium mikrobiologicznego;
badanie materiału z zastosowaniem różnych metod badawczych.
Materiał pobiera się z zachowaniem zasad aseptyki, czyli w sposób zapobiegający kontaminacji próbki
przez drobnoustroje z otoczenia. Pobrany materiał transportowany jest w jałowych pojemnikach lub w
podłożach i buforach transportowych, odpowiednich dla rodzaju materiału oraz wykorzystywanych
metod badawczych. Metody stosowane rutynowo w laboratorium mikrobiologicznym można podzielić
na metody klasyczne oraz metody molekularne. Do metod klasycznych zaliczamy:
badanie mikroskopowe;
hodowlę i identyfikację drobnoustrojów na podstawie cech biochemicznych;
oznaczanie wrażliwości wyhodowanych bakterii na antybiotyki;
metody immunologiczne.
1
Metody molekularne wykorzystują różne techniki wykrywania charakterystycznych sekwencji DNA
lub RNA drobnoustrojów. Obecnie do detekcji i identyfikacji bakterii coraz częściej stosowane są
również nowe metody takie jak spektrometria MALDI-TOF lub metody wykorzystujące bakteriofagi.
Wszystkie wymienione metody zostaną omówione w dalszej części niniejszego opracowania.
BADANIE MIKROSKOPOWE
Badanie mikroskopowe pozwala na stwierdzenie obecności bakterii w badanym materiale i
obserwację morfologii komórek bakteryjnych. W większości przypadków badanie to stanowi tylko
pierwszy etap identyfikacji drobnoustroju, ukierunkowując dalsze etapy badania mikrobiologicznego.
W medycynie w niektórych przypadkach wykonanie i obejrzenie preparatu mikroskopowego jest
wystarczające do identyfikacji drobnoustroju, odpowiedzialnego za wywołanie zakażenia. Dzieje się
tak wtedy, gdy w materiale pobrany od chorego z określonymi objawami klinicznymi stwierdza się
drobnoustroje o charakterystycznym, typowym dla nich kształcie. Przykładami tego typu zakażeń są
zakażenia przenoszone drogą płciową (kiła, rzeżączka) czy zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych
wywoływane przez grzyby Cryptococcus neoformans.
W laboratorium mikrobiologicznym do badań mikroskopowych stosowany jest zwykle
mikroskop świetlny z obiektywem immersyjnym o dużych powiększeniach (zwykle 100x) i wysokiej
zdolności rozdzielczej (apertura 1,4-1,6). Najpowszechniej stosuje się preparaty barwione z
zastosowaniem
różnych
metod
barwienia.
Preparaty
przygotowywane
są
na
szkiełkach
mikroskopowych bezpośrednio z materiału pobranego od pacjenta zawieszonego w kropli soli
fizjologicznej (0,9% roztwór NaCl) lub też w postaci rozmazu zawiesiny wyhodowanych komórek
bakteryjnych w kropli soli fizjologicznej. Następnie preparaty suszy się na powietrzu i utrwala
poprzez ogrzanie preparatu nad płomieniem palnika.
Najczęściej stosowaną metodą barwienia jest metoda Grama, która różnicuje bakterie na dwie
grupy: barwiące się fioletowo bakterie Gram-dodatnie i barwiące się różowo bakterie Gram-ujemne.
Różnice barwy wynikają z różnicy w budowie ściany komórkowej obu grup bakterii. Bakterie Gramdodatnie posiadają ścianę komórkową zbudowaną z grubej warstwy peptydoglikanu (złożonego
polimeru N-acetyloglukozoaminy i kwasu N-acetylomuraminowego oraz peptydowych mostków i
łańcuchów bocznych) i przenikających przez peptydoglikan cząstek kwasów lipotejchojowych (LTA).
Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych ma bardziej złożoną strukturę. Składa się ona z cienkiej
warstwy peptydoglikanu i błony zewnętrznej, połączonych mostkami utworzonymi z lipoproteiny.
Petydoglikan i błona zewnętrzna oddzielone są tzw. przestrzenią periplazmatyczną. Błona zewnętrza o
strukturze typowej błony białkowo-lipidowej w zewnętrznej warstwie lipidowej zawiera
lipopolisacharyd (LPS) o składzie charakterystycznym dla poszczególnych gatunków bakterii Gramujemnych. Przenikanie substancji przez błonę zewnętrzną jest możliwe dzięki obecności białkowych
kanałów porynowych.
2
Oprócz metody Grama powszechnie stosowanymi metodami barwienia są także metody
specjalne, z zastosowaniem różnych barwników, dzięki którym uwidacznia się specyficzne struktury
wewnętrzne komórki bakteryjnej (np. barwienie na obecność zarodników) oraz barwienie negatywne,
gdzie tuszem barwi się powierzchnię szkiełka mikroskopowego w celu uwidocznienia otoczek
bakteryjnych (preparat tuszowy).
Metodą stosowaną głównie do stwierdzenia obecności drobnoustrojów bezpośrednio w
materiale pobranym od pacjenta jest mikroskopia fluorescencyjna. Przygotowanie preparatów
oglądanych w mikroskopie fluorescencyjnego polega na nałożeniu na utrwalony preparat roztworu
przeciwciał wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym, skierowanych przeciwko poszukiwanemu
drobnoustrojowi, a następnie dokładnym wypłukaniu niezwiązanych z drobnoustrojami przeciwciał.
Oświetlenie preparatu światłem UV wywołuje świecenie barwnika fluorescencyjnego i uwidacznia
komórki o kształcie charakterystycznym dla danego gatunku jedynie wtedy, gdy nastąpiło połączenie
przeciwciał z poszukiwanym drobnoustrojem
Zdecydowanie rzadziej niż preparaty barwione stosuje się preparaty wilgotne, gdzie
przygotowany rozmaz nakrywa się szkiełkiem nakrywkowym. Tak przygotowany preparat może być
oglądany w mikroskopie kontrastowo-fazowym, który pozwala obserwować zarówno kształt jak i
szczegóły struktury komórki bakteryjnej lub też w mikroskopie z ciemnym polem widzenia, gdzie
lepiej widoczne są drobnoustroje o niewielkich rozmiarach i spiralnej budowie (np. krętek blady –
Treponema pallidum, bakteria wywołująca kiłę).
Oglądanie preparatów w mikroskopie elektronowym pozwala na uwidocznienie szczegółów
struktury komórek drobnoustrojów: wielkości, kształtu, obecności i wielkości pili lub wici oraz
organelli wewnątrzkomórkowych, a także obserwowanie kolejnych faz podziału komórek
bakteryjnych.
HODOWLA
I
IDENTYFIKACJA
DROBNOUSTROJÓW
NA
PODSTAWIE
CECH
BIOCHEMICZNYCH
Hodowle drobnoustrojów prowadzi się w warunkach najbardziej odpowiednich dla wzrostu
poszukiwanych drobnoustrojów. Bakterie mogą rosnąć w bardzo różnych warunkach temperatury, pH,
wilgotności, ciśnienia osmotycznego i zawartości tlenu. Wzrost bakterii obserwowano w zakresie
temperatur od 0°C (psychrofile) do 60°C (termofile), przy czym większość gatunków optimum
wzrostu osiąga w temperaturze w zakresie 20-40°C. Dla większości gatunków optymalne jest pH
neutralne, w zakresie 6,5-7,5, oraz ciśnienie osmotyczne aw~0,99. Bakterie w zależności od
zapotrzebowania na tlen można podzielić na:
bakterie tlenowe, czyli rosnące dobrze w obecności tlenu w takiej ilości jak w powietrzu
atmosferycznym;
bakterie beztlenowe rosnące dobrze w obecności 0,5-1% tlenu;
bakterie mikroaerofilne wymagające do wzrostu 5% tlenu i 10% dwutlenku węgla.
3
Wiele bakterii chorobotwórczych takich jak np. pałeczka okrężnicy Escherichia coli czy gronkowiec
złocisty Staphylococcus aureus dobrze rośnie zarówno w warunkach tlenowych jak i o obniżonej, aż
do warunków beztlenowych, zawartości tlenu.
W zależności od gatunku drobnoustrojów hodowle prowadzi się:
w organizmie wrażliwych na zakażenie zwierząt: np. krętek blady Treponema pallidum
namnażany w organizmie królików;
z użyciem hodowli komórkowych komórek zwierzęcych lub ludzkich: np. wirusy, niektóre
bakterie namnażające się wewnątrzkomórkowo np. Chlamydophila pneumoniae;
na komórkach bakteryjnych: bakteriofagi;
na pożywkach płynnych lub stałych: większość bakterii chorobotwórczych, bakterie
środowiskowe.
Bakterie do wzrostu wymagają obecności źródła węgla w postaci CO2 dla gatunków autotroficznych
lub związków organicznych w pożywce (cukry, aminokwasy, peptydy, lipidy) dla gatunków
heterotroficznych takich jak bakterie chorobotwórcze. Wszystkie gatunki bakterii wymagają także
obecności w pożywce soli nieorganicznych, a często także niektórych witamin. Bakterie rozmnażają
się poprzez podział komórki macierzystej na dwie komórki potomne. Czas prowadzenia hodowli do
uzyskania widocznego wzrostu bakterii jest uzależniony od ich tempa namnażania i może wynosić od
kilku, kilkunastu godzin jak w przypadku większości gatunków bakterii chorobotwórczych, aż do
kilkunastu dni jak w przypadku prątka gruźlicy Mycobacterium tuberculosos.
Zmieniającą się liczbę komórek bakterii w określonej objętości hodowli płynnej można
przedstawić w postaci krzywej, gdzie po krótkiej fazie przystosowania metabolizmu komórki do
nowych warunków (faza lag) następuje logarytmiczny wzrost liczby komórek bakteryjnych. Wraz z
czasem i wyczerpywaniem się składników odżywczych następuje faza stacjonarna, gdzie obserwuje
się równowagę liczby komórek obumierających i nowych, powstających w wyników podziałów
komórkowych, a następnie faza zamierania hodowli i zmniejszania się liczby komórek bakteryjnych.
Na podłożach stałych bakterie rosną w postaci kolonii, które powstają w wyniku podziałów
jednej wyjściowej komórki bakteryjnej. W diagnostyce mikrobiologicznej zakażeń wywoływanych
przez bakterie chorobotwórcze stosuje się kilka różnych grup stałych podłoży bakteriologicznych.
Najpowszechniej stosowane są bogate podłoża wzrostowe wzbogacone krwią, zapewniające
optymalne warunki do wzrostu ogromnej większości gatunków bakterii. Niektóre gatunki bakterii
produkują hemolizyny powodujące lizę erytrocytów, co jest widoczne w postaci strefy przejaśnienia
dookoła kolonii bakteryjnych. Oprócz podłoży wzbogaconych krwią stosuje się także bogate podłoża
specjalne, takie jak podłoże Mueller-Hinton agar do oceny wrażliwości na leki, czy podłoża
czekoladowe wzbogacone o składniki umożliwiające wzrost niektórych gatunków bakterii np. dwoinki
zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych Neisseria meningitidis. Stosowane są także podłoża:
4
wybiórcze, zawierające składniki hamujące wzrost niektórych grup bakterii np. podłoże
MacConkey agar hamujący wzrost ziarniaków Gram-dodatnich, czy też podłoża z zawartością
antybiotyków hamujących wzrost bakterii wrażliwych na dany lek;
podłoża chromogenne zawierające składniki, które metabolizowane przez bakterie nadają
koloniom bakteryjnym określonych gatunków charakterystyczne zabarwienie, np. podłoże
CPS do hodowli bakterii wywołujących zapalenie dróg moczowych i pozwalające po kolorze
wstępnie zidentyfikować gatunek wywołujący zakażenie.
Podłoża chromogenne z dodatkiem antybiotyków stosowane są także do badań przesiewowych w celu
wykrycia chorych skolonizowanych w drogach oddechowych lub w przewodzie pokarmowym
bakteriami opornymi na antybiotyki, stanowiącymi duży problem epidemiologiczny w szpitalach.
Podłoża takie mają zastosowanie do wykrywania MRSA (szczepów gronkowca złocistego Staphylococcus aureus opornych na meticylinę, co oznacza oporność na wszystkie antybiotyki
-
laktamowe), wykrywania VRE (opornych na wankomycynę szczepów enterokoków) oraz wykrywania
szczepów pałeczek Gram-ujemnych produkujących ESBL (enzymów zdolnych do hydrolizy wielu
antybiotyków -laktamowych) czy też produkujących karbapenemazy (KPC, NDM-1) rozkładające
karbapenemy.
Wstępna identyfikacja bakterii wyrastających na podłożach stałych polega na ocenie
wielkości, kształtu i koloru kolonii, a na podłożach z krwią także obecności hemolizy. Dobór testów
do identyfikacji dokonywany jest po ocenie morfologii komórek bakteryjnych w preparacie
barwionym metoda Grama i przeprowadzeniu prostych testów np., zdolności do produkcji enzymu
katalazy rozkładającej nadtlenek wodoru. Dokładną identyfikację do gatunku prowadzi się z
zastosowaniem szeregu podłoży stałych lub płynnych w probówkach, umożliwiających wykrycie
produkcji określonego enzymu (np. ureazy rozkładającej mocznik), czy też zdolności wzrostu w
obecności jednego cukru (np. podłoże z laktozą do zbadania zdolności rozkładu laktozy). Obecnie do
identyfikacji i oceny lekowrażliwości drobnoustrojów można również zastosować gotowe zestawy
identyfikacyjne do odczytu wizualnego lub tez do odczytu w systemach automatycznych różnych
producentów (np. Phoenix BD Diagnostic Systems, VITEK 2 Compact BioMerieux).
OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI
W leczeniu zakażeń początkowo stosuje się tzw. terapię empiryczną, czyli dobraną zgodnie z
analizą wrażliwości na proponowany lek wszystkich gatunków bakterii mogących wywołać dany typ
zakażenia oraz oceną skuteczności klinicznej leczenia proponowanym antybiotykiem. Ocena
lekowrażliwości bakterii wyhodowanych z materiału pobranego od pacjenta umożliwia wprowadzenie
tzw. terapii celowanej, zgodnej z profilem wrażliwości na leki wyhodowanego szczepu. W
laboratoriach do oznaczania lekowrażliwości stosuje się następujące metody:
5
metodę rozcieńczeniową, w której do podłoża płynnego lub stałego z antybiotykiem w
określonym stężeniu dodaje się taką sama liczbę komórek bakteryjnych i ocenia wzrost w
obecności antybiotyku;
metodę dyfuzyjną, w której antybiotyk dyfunduje z krążka nasączonego określoną ilością leku
lub z paska nasączonego gradientem antybiotyku do podłoża stałego obsianego równomiernie
na powierzchni zawiesiną bakterii o znormalizowanej liczbie komórek bakteryjnych; odczyt
polega na zmierzeniu średnicy strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka lub odczycie przy
jakim stężeniu antybiotyku pojawia się strefa zahamowania wzrostu dookoła paska.
Odczytaną wartość stężenia antybiotyku hamującego wzrost badanych drobnoustrojów lub średnice
strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka porównuje się z wartościami granicznymi dla szczepów
wrażliwych i opornych i następnie interpretację „wrażliwy” lub „oporny” wpisuje się do wyniku
oznaczana lekowrazliwości badanego szczepu bakterii. W Polsce od wielu lat stosuje się wartości
graniczne zgodne z rekomendacjami amerykańskimi CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standards
Institute). Od 2011 roku stosowane będą zalecenia Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania
Lekowrażliwości EUCAST (ang. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing).
Informacje o rekomendacjach doboru testów do oznaczania lekowrazliwości drobnoustrojów są
dostępne na stronie internetowej Krajowego Ośrodka ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów
www.korld.edu.pl, natomiast informacje o antybiotykach i leczniu na stronach Narodowego Programu
Ochrony Antybiotyków www.antybiotyki.pl i stronie Konsultanta Krajowego w dziedzinie
mikrobiologii lekarskiej www.mikrobiologia.pl .
METODY IMMUNOLOGICZNE
Metody immunologiczne wykorzystują reakcję antygenów bakteryjnych z przeciwciałami
skierowanymi przeciwko tym antygenom. Reakcja zachodzi pomiędzy przeciwciałami a całymi
komórkami bakteryjnymi lub antygenami powierzchniowymi (wielocukry otoczkowe, białka
powierzchniowe) lub też toksynami wydzielanymi zewnątrzkomórkowo przez bakterie. W celu
ułatwienia uwidocznienia zajścia reakcji immunologicznej stosowane są różnego rodzaju znaczniki
przeciwciał. W metodzie mikroskopii fluorescencyjnej (opisanej wcześniej w podrozdziale „Metody
mikroskopowe”) znacznikiem jest barwnik fluorescencyjny. W metodzie aglutynacji lateksowej
przeciwciała opłaszczone są na cząsteczkach lateksu, a połączenie przeciwciał z antygenami
bakteryjnymi jest widoczne w postaci wytracających się grudek. Oznaczenie metodą aglutynacji
lateksowej wykonuje się najczęściej na szkiełkach mikroskopowych, płytkach z ciemnego szkła lub
specjalnych, dołączonych do zestawu powlekanych kartach. W metodach immunoenzymatycznych,
określanych często skrótem EIA, przeciwciała (jeśli w materiale poszukujemy antygenów
bakteryjnych) lub antygeny (jeśli poszukujemy przeciwciał w płynach ustrojowych pacjenta)
znakowane są enzymem i połączenie antygenu z przeciwciałami uwidacznia się w postaci reakcji
barwnej, która jest wynikiem działania enzymu związanego z kompleksem antygen-przeciwciało na
6
substrat dodany do roztworu reakcyjnego. Oznaczenia metodą immunoenzymatyczną są często
wykonywane w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych, a wynik odczytywany wizualnie lub z
użyciem czytników spektrofotometrycznych.
W laboratoriach diagnostycznych powszechnie stosowane są systemy automatyczne różnych
producentów (VIDAS BioMerieux, Architect Abbott Laboratories, różne aparaty Siemens), w których
oznaczenia wykonywane są z zastosowaniem różnorodnych metod immunologicznych. Ciągle
pojawiają się także nowe automatyczne systemy diagnostyczne, różniące się jedynie sposobem
detekcji reakcji immunologicznej.
SPEKTROMETRIA MATDI-TOF
W ciągu ostatnich kilku lat spektrometria masowa typu MALD-TOF stała się metodą coraz
powszechniej stosowaną w diagnostyce mikrobiologicznej. Metoda oparta jest na analizie białek
występujących w dużych ilościach, takich jak białka rybosomalne i pozwala zarówno na identyfikację
drobnoustrojów (bakterii, grzybów drożdżopodobnych, grzybów strzępkowych) jak i na analizę
pokrewieństwa w obrębie izolatów tego samego gatunku. W laboratoriach mikrobiologicznych
najczęściej obecnie stosowany jest system MALDI BioTyper firmy Bruker, który umożliwia
przeprowadzenie wiarygodnej identyfikacji wyhodowanych drobnoustrojów w ciągu kilku minut dla
pojedynczej próbki i ok. 1,5 godziny dla płytki z 96 próbkami. Do przeprowadzenia identyfikacji
wystarczający jest materiał zawierający 105 komórek bakteryjnych (pojedyncza kolonia lub próbka
hodowli płynnej). Pojawiły się także pierwsze doniesienia o możliwości identyfikacji drobnoustrojów
bezpośrednio w próbkach moczu pobranego od pacjenta lub w próbkach hodowli krwi. Wadą metody
jest jej wysoki koszt oraz brak możliwości oznaczenia wrażliwości na antybiotyki wyhodowanych
drobnoustrojów. Więcej informacji o tej metodzie można znaleźć na stronie www.bruker.pl
METODY MOLEKULARNE
W diagnostyce mikrobiologicznej stosowana są głównie techniki pozwalające na powielanie
genów bez ich klonowania, czyli oparte o technikę reakcji łańcuchowej polimerazy, w skrócie PCR:
Technika PCR została opracowana w latach 80. XX wieku, ale szersze zastosowanie znalazła dopiero
w drugiej połowie lat 90. Polega ona na wielokrotnym powielaniu dowolnej sekwencji DNA z
wykorzystaniem starterów, czyli krótkich, o długości ok. 20 nukleotydów, cząstek DNA, których
sekwencja jest komplementarna do końcowych sekwencji syntetyzowanego fragmentu DNA. Aby
zapewnić prawidłowy przebieg reakcji w mieszaninie reakcyjnej oprócz matrycy, czyli powielanego
DNA wyizolowanego z badanej próbki (hodowla drobnoustrojów, materiał pobrany od chorego)
znajduje się nadmiar trifosforanów nukleotydów oraz nadmiar starterów reakcji. Reakcja PCR składa
się z wielokrotnie (30-40 cykli) powtarzanych następujących etapów:
termiczna denaturacja DNA badanego w temperaturze ok 90 C;
przyłączanie starterów do matrycy w temperaturze obniżonej do 40-60 C;
7
polimerazycja, czyli synteza nowych nici DNA w temperaturze 72 C z wykorzystaniem
specjalnej polimerazy termostabilnej.
Każda reakcja PCR prowadzona jest równolegle dla próbek badanych oraz kontroli pozytywnej i
negatywnej. Próbka mieszaniny reakcyjnej jest następnie poddawana elektroforezie w celu
uwidocznienia obecności cząstek DNA o określonej wielkości, odpowiadającej wielkości fragmentu
DNA pomiędzy starterami. Odmiana metody PCR, czyli PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR)
przeprowadzana w specjalnych aparatach i z zastosowaniem odpowiednio przygotowanych starterów,
nazywanych także sondami, umożliwia odczyt wyniku reakcji PCR w czasie jej przebiegu, poprzez
pomiar fluorescencji próbki, która jest proporcjonalna do ilości powstałego produktu.
Obie odmiany metody, czyli zarówno klasyczny PCR jak i real-time PCR stosowane są obecnie do
stwierdzania obecności drobnoustrojów (bakterii, wirusów, grzybów) w badanej próbce (krew, płyn
mózgowo-rdzeniowy) oraz stwierdzania obecności genów kodujących toksyny bakteryjne lub też
genów kodujących istotne mechanizmy oporności na antybiotyki u wyhodowanych bakterii. Na rynku
dostępne są zestawy odczynników różnych producentów umożliwiające przeprowadzenie reakcji
klasycznego PCR lub w aparatach real-time PCR po izolacji DNA z badanej próbki. Wykonanie tych
oznaczeń wymaga jednak odpowiedniego wyposażenia laboratorium oraz kompetentnego,
przeszkolonego personelu. Ostatnio pojawiły się także zamknięte, łatwe w obsłudze i interpretacji
zestawy reakcyjne do analizy w aparatach typu real-time PCR (np. GeneXpert firmy Cepheid),
umożliwiające wykrycie w czasie od 1 do 2 godzin istotnych drobnoustrojów w materiale pobranym
od chorego bezpośrednio przez personel w Izbie Przyjęć.
Wydaje się, że do detekcji istotnych klinicznie gatunków i szczepów bakterii będą w przyszłości
również stosowane mikromacierze DNA. Mikromacierz jest to płytka szklana lub plastikowa z
naniesionymi w regularnym układzie fragmentami DNA stanowiącymi sondy, które w wyniku
hybrydyzacji wykrywają komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA. Mikromacierze
obecnie mają jednak głównie zastosowanie do badania ekspresji genów.
ZASTOSOWANIE BAKTERIOFAGÓW W DETEKCJI BAKTERII
Bakteriofagi są wirusami bakteryjnymi zbudowanymi z kwasów nukleinowych (DNA lub rzadko
RNA) i białek. Najczęściej występujące bakteriofagi charakteryzują się złożoną strukturą, w której
wyróżniamy główkę zawierającą dwuniciowy DNA oraz ogonek zakończony różnymi białkowymi
strukturami receptorowymi, umożliwiającymi przyłączenie się bakteriofaga do receptorów na
powierzchni komórki bakteryjnej. Bakteriofagi są z reguły wysoce specyficzne gatunkowo, a część ma
zdolność przyłączania się jedynie do określonych szczepów bakteryjnych. Typowy lityczny cykl
życiowy bakteriofagów składa się z następujących etapów:
1. przyłączenie bakteriofaga do receptorów na powierzchni komórki bakteryjnej;
2. wstrzyknięcie DNA do wnętrza komórki bakteryjnej, białkowy kapsyd pozostaje na zewnątrz;
8
3. replikacja DNA bakteriofaga oraz produkcja białek kapsydu, powstawanie nowych cząstek
bakteriofagowych;
4. uwolnienie bakteriofagów potomnych po lizie komórki bakteryjnej.
Niektóre z bakteriofagów tzw. bakteriofagi łagodne mogą przechodzić w stan lizogenii, który polega
na wbudowaniu się DNA bakteriofaga do chromosomu bakteryjnego, najczęściej w ściśle określonej
lokalizacji i namnażaniu się wbudowanego profaga wraz z chromosomem bakteryjnym. Profagi mogą
pod wpływem różnorodnych bodźców zostać uwolnione z chromosomu bakteryjnego i przejść w cykl
lityczny. Bakteriofagi łagodne w swoim DNA oprócz informacji o budowie białek wirusa mogą także
zawierać geny kodujące czynniki zjadliwości bakterii, takie jak toksyny bakteryjne (np. toksyna
przecinkowca cholery – Vibrio cholerae, odpowiedzialna za wywoływanie wodnistej biegunki w
przebiegu cholery).
Bakteriofagi już w latach 50. XX wieku znalazły zastosowanie w typowaniu różnych
gatunków bakterii (np. gronkowca złocistego - Staphylococcus aureus, pałeczki ropy błękitnej
Pseudomonas aeruginosa) i w dochodzeniach epidemiologicznych. Do typowania stosowana jest
metoda nakraplania roztworu zawierającego określoną liczbę cząstek bakteriofagów na półpłynne
podłoże agarowe zawierające komórki badanego szczepu bakterii. Liza komórek bakteryjnych przez
bakteriofagi widoczna jest w postaci tzw. łysinek, czyli przejaśnień hodowli bakteryjnej w miejscu
nakroplenia zawiesiny bakteriofagów na powierzchnię agaru. Typowanie bakteriofagowe ze względu
na dużą pracochłonność i koszty związane z koniecznością utrzymywania lizatów fagowych i
szczepów kontrolnych oraz niską powtarzalność wyników, związaną z rozróżnianiem szczepów ze
względu na fenotyp obecności specyficznych receptorów białkowych na powierzchni badanego
szczepu bakterii, jest obecnie zastępowane przez coraz doskonalsze i szybsze metody genetyczne.
Ostatnie lata przyniosły szereg publikacji donoszących o możliwości zastosowania
bakteriofagów w terapii zakażeń oraz w detekcji i identyfikacji bakterii. Biorąc pod uwagę
publikowane wyniki dotychczas prowadzonych eksperymentów, zastosowanie bakteriofagów w
terapii wydaje się obiecujące, ale wymaga dalszych badań laboratoryjnych i klinicznych, w celu oceny
bezpieczeństwa i efektywności stosowania takiej terapii. Również obiecujące i, jak się wydaję, mające
większe szanse na szybkie zastosowanie w rutynowych badaniach laboratoryjnych jest wykorzystanie
bakteriofagów jako składowych biosensorów wykrywających obecność drobnoustrojów w badanej
próbce. W tego typu testach różnego rodzaju systemy sensoryczne (bioluminescencyjne,
magnetoelastyczne, powierzchniowy rezonans plazmowy SPR, systemy optyczne) są wykorzystywane
jako detektory przyłączania się obecnych w badanej próbce komórek bakteryjnych do połączonych z
systemami sensorowymi bakteriofagów, specyficznych dla danego gatunku bakterii. W publikacjach
prezentowano możliwość zastosowania tego typu metod do wykrywania różnych gatunków bakterii, w
tym bakterii chorobotwórczych takich jak prątki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis), pałeczki
Salmonella spp., laseczki wąglika (Bacillus anthracis) czy opornych na meticylinę szczepów
gronkowca złocistego (MRSA).
9