AmpliTest PRRSV (Real Time PCR)

AmpliTest PRRSV (Real Time PCR)
Zestaw do wykrywania sekwencji RNA specyficznych
dla wirusa PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome) techniką Real Time PCR
Nr kat.: RV02-50
Wielkość zestawu: 50 oznaczeń
Objętość pojedynczej reakcji: 20 µL
Limit detekcji: 12 kopii RNA wirusa
Przed użyciem zestawu należy uważnie zapoznać się z niniejszą instrukcją.
Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska 9 54-427 Wrocław Polska, NIP: 8943052339, KRS: 0000501830
www.amplicon.pl email: [email protected], tel. +48 71 733 67 06, fax +48 71 733 67 24
ZASTOSOWANIE
Zestaw AmpliTest PRRSV (Real Time PCR) jest przeznaczony do wykrywania
sekwencji RNA specyficznych dla wirusa PRRS (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome) w próbkach RNA uzyskanych od zwierząt. Materiałem
wyjściowym do izolacji RNA może być krew lub inne płyny ustrojowe. W
przypadku padłych zwierząt można pobrać próbki narządów wewnętrznych
(płuca, migdałki, węzły chłonne i wątroba). W celu uniknięcia problemów z
wydajnością reakcji Real Time PCR próbki RNA powinny być uzyskane przy
użyciu metod pozwalających uzyskać wysokiej jakości RNA pozbawiony
inhibitorów reakcji PCR. Zalecane są zestawy do izolacji RNA oparte o złoża
krzemionkowe (tzw. zestawy kolumienkowe).
ZAKRES STOSOWANIA
 Diagnostyka weterynaryjna in vitro
 Badania i rozwój (B+R)
SKŁADNIKI ZESTAWU
Nazwa
Opis
RM
Mieszanina reakcyjna
PC
Kontrola pozytywna
NC
Kontrola negatywna
RT
Odwrotna transkryptaza
Rin
Inhibitor RNAz
Woda
Woda wolna od nukleaz
Ilość
2 × 275 µL
2 × 50 µL
2 × 50 µL
1 × 10 µL
1 × 20 µL
1 × 500 µL
Kolor wieczka
Zielony
Czerwony
Niebieski
Czarny
Żółty
Biały
TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE
 Transport odbywa się w suchym lodzie. Po otrzymaniu przesyłki należy ją
natychmiast rozpakować.
 Składniki testu przechowywać -20°C;
 UNIKAĆ EKSPOZYCJI SKŁADNIKA RM NA ŚWIATŁO;
 Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania składników testu, w
szczególności składnika RM. Trzy cykle zamrożenia i rozmrożenia
składnika RM nie wpływa znacząco na jakość wyników. WSKAZÓWKA: na
etykietach probówek zawierających składnik RM znajdują się pola, w
których można zaznaczać ilość rozmrożeń danej porcji.
 Składniki RM oraz PC zawierają RNA – należy je chronić przed działaniem
rybonukleaz.
 Nie używać składników testu po upływie daty przydatności do użycia.
2
ZASADA DZIAŁANIA
Wirus PRRS jest wirusem typu RNA należącym do rodziny Arteriviridae. Do jego
detekcji metodą Real Time PCR konieczny jest proces odwrotnej transkrypcji
polegający na syntezie cząsteczek cDNA na podstawie RNA. Zestaw AmpliTest
PRRSV (Real Time PCR) jest zestawem typu one-step. Dzięki temu procesy
odwrotnej transkrypcji i amplifikacji sekwencji specyficznych dla wirusa PRRS
zachodzą w jednej probówce. Zestaw AmpliTest PRRSV (Real Time PCR)
zawiera startery umożliwiające namnożenie sekwencji charakterystycznych dla
wirusa PRRS. Detekcja obecności wirusowych sekwencji następuje dzięki
specyficznej sondzie typu TaqMan®, która przyłączając się do powstającego
amplikonu (powielanego fragmentu DNA wirusa) ulega hydrolizie. Podczas
hydrolizy z sondy jest uwalniany barwnik fluorescencyjny FAM, który następnie
jest wykrywany przez układ optyczny aparatu do Real Time PCR. Odpowiednio
dobrane
sekwencje
starterów
i
sondy
zapewniają
wysoką
czułość
i
specyficzność reakcji.
W celu zwiększenia wiarygodności wyników Zestaw AmpliTest PRRSV (Real
Time PCR) zawiera kontrolę wewnętrzną (egzogenny fragment RNA) oraz układ
starterów i sondy do jej amplifikacji i detekcji. Detekcja kontroli wewnętrznej
odbywa się dzięki uwalnianiu przez sondę barwnika fluorescencyjnego HEX.
Obecność kontroli wewnętrznej pozwala na monitorowanie prawidłowego
przebiegu odwrotnej transkrypcji i reakcji Real Time PCR. Amplifikacja kontroli
wewnętrznej nie wpływa na wydajność wykrywania sekwencji specyficznych dla
wirusa PRRS. Pozytywny wynik kontroli wewnętrznej stanowi potwierdzenie
prawidłowego przebiegu odwrotnej transkrypcji i reakcji Real Time PCR.
3
POTRZEBNY SPRZĘT I DODATKOWE MATERIAŁY
 Aparat do Real Time PCR:
LightCycler 480 (Roche)
LightCycler 96 (Roche)
LightCycler 2.0 (Roche)
RotorGene 3000/6000 (Qiagen)
Inne urządzenia umożliwiające detekcję barwników fluorescencyjnych FAM
i HEX.
Zestaw AmpliTest PRRSV (Real Time PCR) nie zawiera barwnika
normalizacyjnego
ROX.
W
przypadku
urządzeń
wymagających
takiej
normalizacji należy do mieszaniny reakcyjnej dodać barwnik ROX do
odpowiedniego stężenia. Barwnik ROX nie jest dołączony do zestawu.





Probówki reakcyjne (próbówki PCR, płytki PCR, kapilary w zależności od
posiadanego urządzenia do Real Time PCR)
Wirówka do probówek reakcyjnych
Wirówka stołowa
Pipety automatyczne w zakresie 1-1000 µL
Sterylne końcówki z filtrami do pipet automatycznych
Zestaw do izolacji RNA
W zależności od użytego zestawu do izolacji RNA może być potrzeby
dodatkowy sprzęt i materiały.
IZOLACJA RNA
Z uzyskanego materiału (krew lub inne płyny ustrojowe, fragmenty narządów
wewnętrznych) należy wyizolować RNA. Ilość potrzebnego materiału
biologicznego zależy od użytej metody izolacji RNA. Ze względu na dużą
podatność RNA na degradację czas pomiędzy pobraniem materiału
biologicznego a izolacją RNA powinien być jak najkrótszy. Do chwili izolacji RNA
uzyskany materiał biologiczny powinien być odpowiednio zabezpieczony
(przechowywany w -20°C, ewentualnie w +4°C, najlepiej w środowisku
hamującym aktywność nukleaz, np. w obecności EDTA). Niewłaściwe
przechowywanie pobranego materiału biologicznego skutkować degradacją
RNA, co będzie prowadzić do uzyskania wyników fałszywie negatywnych.
Do izolacji RNA zaleca się stosowanie zestawów opartych o złoża krzemionkowe
(tzw. zestawów kolumienkowych), gdyż zapewniają one uzyskanie próbek RNA o
odpowiedniej jakości pozbawionych inhibitorów reakcji PCR. W przypadku
4
innych metod izolacji preparat RNA może zawierać związki, które istotnie
zmniejszają wydajność reakcji PCR. Prowadzi to do obniżenia czułości testu, a w
skrajnych przypadkach do braku amplifikacji DNA. Próbki RNA należy
przechowywać w -20°C (krótki okres przechowywania) lub w -80°C (długi okres
przechowywania). Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
próbek RNA i chronić je przed kontaktem z nukleazami. W tym celu należy
korzystać z materiałów (woda, probówki, końcówki do pipet itp.) wolnych od
nukleaz (potwierdzonych odpowiednimi certyfikatami).
REAKCJA REAL TIME PCR
1. Określić liczbę próbek RNA poddawanych analizie (n).
2. Rozmrozić składniki testu, z wyjątkiem składników RT i Rin. Składniki po
rozmrożeniu przechowywać w +4°C lub na lodzie. UNIKAĆ EKSPOZYCJI
składnika RM NA ŚWIATŁO.
UWAGA: Składniki RT (odwrotna transkryptaza) i Rin (inhibitor RNAz) w miarę
możliwości utrzymywać przez cały czas w temperaturze poniżej 0°C, gdyż
pozostają one w postaci płynnej w tej temperaturze. Składniki te są wrażliwe na
temperaturę i ogrzewanie ich do temperatury powyżej 00°C może doprowadzić do
ich inaktywacji.
3. Określić ilość RNA dodawanego do reakcji (x µL).
Optymalna ilość RNA w reakcji wynosi 100-200 ng. Ilość RNA dodawanego do
reakcji nie powinna przekroczyć 1 µg. Duże ilości RNA dodanego do reakcji PCR
mogą negatywnie wypływać na obniżenie wydajności odwrotnej transkrypcji i
podwyższyć limit detekcji testu.
4. W probówce wolnej od nukleaz wymieszać następujące składniki:
RM
(n + 3) × 11 µL
RT
(n + 3) × 0,2 µL
Rin
(n + 3) × 0,4 µL
Woda
(n + 3) × (8,4 - x) µL
5. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, kapilar, studzienek na płytce
PCR) nanieść po (20 – x) µL mieszaniny przygotowanej w punkcie 4.
6. Do n probówek reakcyjnych dodać po x µL przygotowanych próbek RNA. Do
jednej z pozostałych dwóch próbówek reakcyjnych dodać kontrolę negatywną
NC, a do drugiej kontrolę pozytywną PC. UWAGA: Kontrolę pozytywną należy
dodać jako ostatnią.
7. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować.
5
8. Probówki reakcyjne upieścić w aparacie do Real Time PCR i wykonać reakcję
według następującego protokołu:
Odwrotna transkrypcja 45°C 15 min
Denaturacja wstępna
95°C 5 min
Amplifikacja (45 cykli)
95°C 10 s
58°C 25 s*
Schłodzenie aparatu
30-40°C 30s (zależnie od typu aparatu)
*Na końcu tego etapu ustawić odczyt fluorescencji w kanałach dla FAM i HEX.
Kanał dla FAM służy do wykrywania sekwencji specyficznych dla wirusa PRRS.
Kanał dla HEX służy do wykrywania kontroli wewnętrznej.
INTERPRETACJA WYNIKÓW
L.p.
1
2
3
4
Rodzaj próbki
FAM HEX Wynik
Kontrola pozytywna
+
+ Prawidłowy
Kontrola negatywna
+ Prawidłowy
Oznaczenie 1
+ Ujemny
Oznaczenie 2
+
+ Dodatni
Brak odczytu w kanale dla HEX* oznacza, że reakcja Real Time PCR nie
przebiegła w sposób prawidłowy. Jednoczesny brak pozytywnego odczytu
fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej
wskazuje na złą jakość Zestawu AmpliTest PRRSV (Real Time PCR) (niewłaściwe
przechowywanie, transport, wygaśnięcie terminu przydatności do użycia itp.)
Pozytywny odczyt fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli
pozytywnej i negatywnej i brak pozytywnego odczytu dla badanych próbek RNA
oznacza złą jakość próbek RNA (obecność związków hamujących reakcję PCR)
lub zbyt dużą ilość RNA użytego w reakcji. W tym przypadku należy do reakcji
dodać mniejszą objętość próbki RNA, jednocześnie zwiększając objętość wody
tak, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 µL.
*Przy bardzo wysokim mianie wirusa może wystąpić brak odczytu w kanale HEX przy
jednoczesnym odczycie w kanale FAM. Zaleca się wtedy powtórzenie reakcji z zmniejszoną
(10-100-krotnie) ilością RNA dodanego do reakcji.
6
UWAGI DODATKOWE
 Zastosowane sondy TaqMan® posiadają wygaszacze (Quenchers) typu BHQ
(Black Hole Quencher™), które nie generują dodatkowych sygnałów
fluorescencyjnych. W aparatach, które tego wymagają (np. RotorGene 6000),
jako typ wygaszacza należy wybrać opcję „none”.
 Przygotowany test wykrywa powyżej 12 kopii RNA wirusa obecnych w dodanej
próbce RNA. Próbki RNA uzyskane z pojedynczych osobników można ze sobą
pulować i wykorzystywać w pojedynczym oznaczeniu. W tym celu równe
objętości próbek RNA (np. 10 µL) przeznaczonych do pulowania należy ze
sobą dokładnie wymieszać i użyć jako matrycy w reakcji Real Time PCR.
Należy jednak pamiętać, że pulowanie próbek RNA zmniejsza możliwość
uzyskania pozytywnego wyniku w przypadku próbek zawierających niewielką
ilość cząsteczek wirusa. Pulowaniu można poddać również próbki krwi lub
surowicy uzyskane od zwierząt, a następnie wyizolować RNA.
 Nie stosować objętości reakcji mniejszych niż 20 µL. Zmniejszenie objętości
reakcji powoduje zmniejszenie czułości testu.
 Należy zachować szczególną ostrożność podczas izolacji RNA, a materiał
biologiczny uzyskany od chorych zwierząt traktować jako potencjalnie
zakażony.
 Izolację RNA oraz detekcję obecności wirusa PRRS powinien wykonać
odpowiednio przeszkolony personel w laboratorium spełniającym odpowiednie
wymogi i dopuszczonym do pracy z zakażonym materiałem biologicznym.
Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas izolacji RNA nie doszło do
krzyżowego zanieczyszczenia próbek RNA izolowanych równolegle.
 W celu maksymalnego wyeliminowania fałszywych wyników powinno się
przestrzegać następujących zasad:
- w miarę możliwości wyznaczyć osobne stanowiska do izolacji RNA,
przygotowania reakcji Real Time PCR oraz jej wykonania/analizy.
- pomiędzy etapami izolacji RNA, przygotowania reakcji Real Time PCR
należy dokonać zmiany odzieży laboratoryjnej (fartucha) oraz zmiany
rękawiczek jednorazowych.
- powierzchnię stanowisk do izolacji RNA i przygotowania reakcji Real Time
PCR należy przemywać środkami usuwającymi/niszczącymi RNA.
- do pipet automatycznych należy stosować wyłącznie sterylne końcówki z
filtrem.
- podczas przygotowywania reakcji Real Time PCR Kontrolę pozytywną PC
należy dodać jako ostatnią. Przed jej dodaniem w miarę możliwości należy
zamknąć probówki z dodanymi próbkami DNA i kontrolą negatywną NC.
7
 RNA jest materiałem bardzo łatwo podatnym na degradację. Z tego względu
należy zadbać o odpowiednie zabezpieczenie materiału biologicznego do
czasu izolacji RNA (niska temperatura, środki inaktywujące nukleazy). Czas
pomiędzy pobraniem materiału biologicznego a izolacją RNA powinien być
możliwie jak najkrótszy. Izolację RNA należy wykonać ściśle według
wskazówek producenta odpowiedniego zestawu do izolacji RNA. Podczas
izolacji RNA szczególnie istotny jest etap homogenizacji materiału
biologicznego (w przypadku próbek narządów wewnętrznych). Należy zwrócić
szczególną uwagę, aby podczas homogenizacji nie doszło do degradacji RNA.
 Uzyskaną próbkę RNA chronić przed działaniem nukleaz (stosować
odpowiednio certyfikowane materiały wolne od nukleaz). Próbkę RNA należy
przechowywać w postać zamrożonej. Należy unikać jej wielokrotnego
zamrażania i rozmrażania.
 W celu zwiększania stabilności RNA, zarówno po jego wyizolowaniu, jak i na
etapie materiału biologicznego można używać preparatów poprawiających
stabilność RNA i hamujących działanie nukleaz.
TaqMan® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Applied Biosystems, Inc.
LightCycler® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Roche Diagnostics GmbH.
Black Hole Quencher™ jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Biosearch Technologies, Inc.
8