Biotechniki stosowane w rozrodzie koni

Biotechniki stosowane w rozrodzie koni

Biotechniki stosowane w rozrodzie koni
lek.wet. Anna Pinkowska
Założeniem stosowania biotechnik w rozrodzie koni jest zwiększenie możliwości
uzyskania potomstwa od cennych klaczy i ogierów o stwierdzonej obniżonej płodności.
Erę biotechnologii rozrodu koni rozpoczęła sztuczna inseminacja. Początkowo stosowana,
aby ograniczyć szerzenie się chorób przenoszonych drogą płciową, w tej chwili szeroko
używana w związkach hodowlanych na całym świecie, zwiększa dostępność cennego
materiału genetycznego i tym samym ma duży wpływ na postęp hodowlany.
Przez ostatnią dekadę odnotowano znaczny rozwój biotechnologii rozrodu zarówno klaczy
jak i ogiera. Niektóre biotechniki przyjęły się i są wykorzystywane komercyjnie w wielu
ośrodkach na świecie, podczas gdy inne powoli z fazy badań przechodzą do codziennej
praktyki. Niektóre prawdopodobnie nigdy nie znajdą zastosowania w praktyce. Powodzenie
metody związane jest głównie z jej efektywnością a także możliwością wykonania procedury
w warunkach terenowych.
EMBRIOTRANSFER
Jedną z najbardziej rozpowszechnionych biotechnik stosowanych w rozrodzie koni,
oprócz wcześniej wspomnianej sztucznej inseminacji jest embriotransfer. Metoda ta powstała
z myślą o umożliwieniu uzyskania potomstwa od klaczy o obniżonej płodności, lecz dużo
szersze zastosowanie znalazła w pozyskiwaniu potomstwa od cennych klaczy sportowych.
Embriotransfer pozwala nam uzyskać potomstwo od klaczy czynie biorących udział w
zawodach sportowych bez przerywania ich kariery. Dodatkowo umożliwia pozyskanie
potomstwa już od 2 letnich klaczy czy uzyskanie więcej niż jednego źrebięcia od danej
samicy w jednym sezonie rozrodczym. Nie wyklucza się stosowania tej metody u klaczy o
obniżonej płodności, lecz należy wtedy zwrócić uwagę na przyczynę obniżonej płodności i
liczyć się z niższą skutecznością tej metody niż w przypadku klaczy
zdrowych.(1,2).Dodatkowo transfer zarodków używany jest w programach ochronnych
zagrożonych ras koniowatych jak zebry czy Koń Przewalskiego.
Pozyskiwanie zarodków
Zarodki końskie pozyskuje się 6,7 lub 8 dnia ciąży, licząc dzień owulacji jako dzień 0.
W momencie gdy zarodek przemieszcza się z jajowodu do macicy znajduje się w stadium
moruli. W przeciągu zaledwie kilku dni przechodzi w stadium blastocysty a co za tym idzie
dochodzi do znacznego wzrostu jego objętości. Zarodek w stadium moruli w dniu 6 jest
znacznie mniejszy ( 150-160 µm) w porównaniu do stadium blastocysty w dniu 8 (500- 900
µm).
W początkowych badaniach nad embriotransferem u klaczy do pozyskiwania zarodków
stosowano metodę chirurgiczną polegającą na śródoperacyjnym płukaniu jajowodów. W tej
chwili z powodzeniem wykorzystywana jest metoda bezkrwawa polegającą pozyskiwaniu
zarodka poprzez płukanie macicy.
Identyfikacji zarodków dokonuje się pod mikroskopem stereoskopowym przy 15 krotnym
powiększeniu. Zlokalizowany zarodek powinien zostać poddany ocenie morfologicznej.
Obecnie używana jest pięciostopniowa skala Vanderwalla, według której 1 to zarodek
doskonały, a 5 to zarodek słaby, zdegenerowany.
Po identyfikacji zarodki za pomocą mikromanipulatora umieszczane są w sterylnych
słomkach o pojemności 0,25 ml, przy czym roztwór z zawieszonym w nim zarodkiem musi
być otoczony z obu stron pęcherzykami powietrza a dalej roztworem ,który służył nam do
płukania.
Podczas gdy wskaźnik pozyskiwania zarodków w dniu 7 czy 8 jest porównywalny, w
przypadku dnia 6 jest znacznie niższy (3,4).Przyczyną tego stanu może być mniejszy
rozmiar zarodka w dniu 6, co negatywnie wpływa na identyfikację w wypłukanym z macicy
płynie. Zarodki w stadium moruli wykazują większą tendencję do opadania na dno macicy
niż zarodki w stadium blastocysty, przez co pozyskanie ich przez płukanie macicy jest
trudniejsze. Kolejnym elementem , który może mieć wpływ na obniżone wskaźniki
pozyskiwania zarodków w dniu 6 jest występujące czasem u starszych klaczy opóźnienie
zejścia zarodka do jamy macicy. Efektem tego jest nieobecność zarodka podczas płukania
macicy w dniu 6.
Transfer zarodka
Istotnym elementem sukcesu transferu zarodka jest dobór odpowiednich klaczy
biorczyń. Preferowane są zdrowe klacze w wieku od 3 – 10 lat, o budowie zbliżonej do
klaczy dawczyń. W programach transferu zarodków cenione są klacze, które odchowały już
jedno lub dwa zdrowe źrebięta .
W procesie embriotransferu niezbędna jest synchronizacja cyklu rujowego klaczy biorczyni i
klaczy dawczyni. Uważa się, że owulacja u klaczy biorczyni powinna wystąpić od jednego
(+1) do 3 dni (0,-1,-2,-3) po wystąpieniu owulacji u klaczy dawczyni.
W początkowych próbach transferu zarodków u koni, zarodki przenoszone były do
klaczy biorczyni metodą chirurgiczną (laparotomia w linii słabizny na stojącym koniu). W tej
chwili metoda ta nie jest już stosowana, gdyż procedura bezkrwawego transferu daje rezultaty
podobne do krwawej metody. Do transferu zarodka stosuje się specjalistyczne pistolet, który
pozwala na wprowadzenie zarodka do trzonu macicy, bez zbędnej manipulacji w obrębie
szyjki macicy.
Konserwacja zarodka
Przechowywanie zarodków w obniżonej temperaturze przez 24 h daje możliwość transportu
zarodków w momencie, gdy nie mamy dostępu do klaczy biorczyni na miejscu. W takiej
sytuacji zarodek może zostać przesłany do ośrodków komercyjnie zajmujących się
embriotransferem, które posiadają duże stada klaczy biorczyń. Wahania temperatur podczas
transportu są wysoce niewskazane, stąd też należy zadbać aby transport odbywał się w
opakowaniach utrzymujących właściwą temperaturę. W praktyce najczęściej używa się
pojemnika Equitainer ®, który służy zarówno do transportu nasienia jak i zarodków.
Kriokonserwacja zarodków niesie za sobą kilka nowych rozwiązań wspomagających
efektywność embriotransferu u klaczy. Zapewnia przechowywanie zarodków przez długi
okres czasu , co umożliwia międzynarodowy transport zarodków bez jakichkolwiek
ograniczeń czasowych, jednocześnie daje szanse przechowywania cennego materiału
genetycznego dla zachowania zagrożonych ras lub przedłużenia cennych linii
rodowodowych. Mrożenie zarodków pozwala również na ograniczenie kosztów związanych
z synchronizacją i utrzymaniem stada matek biorczyń.
Jednakże sukces mrożenia zarodków uzależniony jest od wielkości i fazy rozwojowej zarodka
Tylko krioprezerwacja małych zarodków ( <300µm), które pozyskiwane są około 6,5 dnia po
owulacji, pozwala na uzyskanie zadowalających wskaźników zaźrebiania (8). Jednakże,
wskaźnik pozyskanych zarodków jest wyższy, gdy zarodki wypłukuje się w 7 lub 8 dniu po
owulacji, kiedy zarodek jest już duży(>300µm)(9). Rezultaty prób mrożenia dużych
zarodków dotychczas były niezadowalające (10).
Do chwili obecnej zostały opracowane dwie główne metody kriokonserwacji zarodków:
konwencjonalne stopniowe(powolne) mrożenie oraz witryfikacja. Pierwsza z nich polega na
stopniowym obniżaniu temperatury za pomocą komputerowo sterowanego frezera.
Witryfikacja polega natomiast na mrożeniu z bardzo szybkim spadkiem temperatury co
powoduje przejście ze stanu ciekłego w stan stały z pominięciem etapu tworzenia kryształów
lodu, które uszkadzają zarodek. Należy jednak zaznaczyć , iż podczas witryfikacji stosowane
są wyższe stężenia embriotoksycznych krioprotektantów.[...]
Piśmiennictwo
1. Carnevale E. M and Ginther O. J. Reproductive Function in Old Mares. Proceedings
AAEP.40 :15,1994.
2. Carnevale EM, Ginther OJ ,Defective oocytes as a cause of subfertility in old mares.
Biology of Reproduction Monograph Series 1: 209-214.,1995
3. Iuliano MF, Squires EL, Cook VM ,Effect of age of equine embryos and method of
transfer on pregnancy rate. Journal of Animal Science. 60: 258-263,1995
4. Jacoba J.C.F, Santosa G.O, Oliveira J.P , Gastalb M.O , Gastalc E.L. Evaluation of
reproductive parameters in a commercial equine embryo transfer program. Animal
Reproduction Science 121S: S305–S306,2010
5. Koblischke P, Budik S, Muller J and Aurich C. Practical Experience with the Treatment
of Recipient Mares with a Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug in an Equine Embryo
Transfer Programme. Reproduction in Domestic Animals Volume 45, Issue 6, pages 1039–
1041,2010
6. Moussa M, Bersinger I, Doligez P, Guignot F, Duchamp G, Vidament M, Mermillod P,
Bruyas J.F. In vitro comparisons of two cryopreservation techniques for equine embryos: Slowcooling and open pulled straw (OPS) vitrification.Theriogenology, Volume 64, Issue 7, Pages
1619-1632,2005
7.ObersteinN., O’Donovan M, Bruemmer J.E. . Cryopreservation of equine embryos by open
pulled straw, cryoloop, or conventional slow cooling methods. Theriogenology 55,607-613,2005
8. Slade N.P, Takeda T, Squires E.L, Elsden R.P, Seidel Jr. G.E. A new procedure for the
cryopreservation of equine embryos. Theriogenology, Volume 24, Issue 1, Pages 45-58,1985
9. Squires E.L, Seidel Jr. G.E., Collection and Transfer of Equine Embryos, public. 8, Animal
Reproduction and Biotechnology Laboratory, Colorado State University, Bulletin, 1995
10. McKinnon A.O and Squires E.L. Embryo transfer and related technologies. Proceedings
AAEP,Vail, Colorado 27-57,2009
11.Carnevale EM ,Squires EL, Maclellan LJ et al: Use of oocyte transfer in a commercial
breeding program for mares with reproductive abnormalities. Journal Veterinary Medicine
Association;218:87-91,2001
12.Samper JC,Equine breeding Managment and Artificial Insemination, 209-219,Saunders
2009
13.Carnevale EM, Coutinho da Silva MA,Maclellan LJ et al: Effects of culture media and
time of insemination on oocyte transfer. Theriogenology 58:759-762,2002
14. Cochran R, Meintjes M, Reggio B, et al. Live foals produced from sperm-injected oocytes
derived from pregnant mares. Journal of Equine Veterinary Science 18:736–740,1998
15. Galli C, Crotti G, Turini P, et al. Frozen-thawed embryos produced by ovum pick up of
immature oocytes and ICSI are capable to establish pregnancies in the horse. Theriogenology
58:705–708,2002