pobierz

Acta Haematologica Polonica 2010, 41, Nr 1, str. 65–74
PRACA ORYGINALNA – Original Article
PAWEŁ ROBAK1, BARBARA CEBULA-OBRZUT1, ANNA LINKE-SZEWCZYK2,
PIOTR SMOLEWSKI1
Cytotoksyczne działanie nowych analogów etodolaku, SDX-101 i SDX-308,
na komórki przewlekłej białaczki limfocytowej ex vivo
Cytotoxic effect of New etodolac analogues: SDX-101 and SDX-308 on chronic
lymphocytic leukemia cells ex vivo
1
Zakład Hematologii Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Piotr Smolewski
2
Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Robak
STRESZCZENIE
Niektóre wyniki doświadczeń i obserwacje kliniczne wskazują, Ŝe niesteroidowe leki przeciwzapalne, zwłaszcza nowe
pochodne etodolaku, wykazują działanie przeciwnowotworowe w róŜnych guzach litych oraz rozrostach układu
krwiotwórczego.
Celem przeprowadzonych badań była ocena i poznanie mechanizmów działania cytotoksycznego SDX-101 i SDX308 w odniesieniu do komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL). Badania przeprowadzono ex vivo na komórkach jednojądrowych, wyizolowanych od 100 nieleczonych wcześniej chorych na PBL, inkubowanych przez 24
godziny. Cytotoksyczność związków oceniono testem z jodkiem propidyny. Badano markery apoptozy za pomocą
wykrywania aktywnej kaspazy 3 oraz testu z anneksyną-V. Ponadto oceniano cytometrycznie ekspresję wybranych
białek regulujących apoptozę, w tym p73, Bax, Bak, Bcl- oraz Mcl-1.
Wykazano wysoką aktywność przeciwbiałaczkową zarówno SDX-101, jak i SDX-308. Znamienny efekt działania
SDX-308 (w odniesieniu do hodowli kontrolnych, prowadzonych bez dodatku leków) osiągnięto przy zastosowaniu
dawki ośmiokrotnie niŜszej niŜ w przypadku SDX-101. Głównym mechanizmem działania obydwu leków była indukcja apoptozy zaleŜnej od aktywacji kaspaz. Obserwowane zmiany w ekspresji białek regulatorowych róŜniły się w
przypadku zastosowania SDX-101 i SDX-308. NaleŜy podkreślić, Ŝe obydwa leki wykazywały selektywny efekt
przeciwbiałaczkowy, nie wywołując znaczącego działania cytotoksycznego na komórki jednojądrowe izolowane od
osób zdrowych.
Podsumowując, wybrane pochodne etodolaku, szczególnie SDX-308, mogą być rozwaŜane jako nowe preparaty o potencjalnej aktywności klinicznej u chorych na PBL. Interesujące wydaje się zbadanie ich interakcji z lekami stosowanymi rutynowo, o potwierdzonej juŜ skuteczności w PBL.
SŁOWA KLUCZOWE: Niesteroidowe leki przeciwzapalne – Etodolak – SDX-101 – SDX-308 – Przewlekła białaczka
limfocytowa – Apoptoza
SUMMARY
Some non-steroidal anti-inflammatory drugs, especially etodolac derivates, have been recently found to inhibit proliferation and invasive growth or induce cell apoptosis in several tumors and some hematologic malignancies, including
chronic lymphocytic leukemia (CLL).
The aim of this study was to evaluate an anti-tumor effect of etodolac analogues, SDX-101 and SDX-308, on CLL
cells. The cytotoxicity and specific pro-apoptotic effects of the studied drugs on B-CLL cells were assessed ex vivo in
samples obtained from 100 untreated CLL patients. Cytotoxicity was evaluated by propidium iodide assay. Apoptosis
was detected by both caspase-3 activation and Annexin-V tests. Moreover, expression of some apoptosis-regulating
proteins, including p73, Bax, Bak, Bcl- and Mcl-1 was assessed.
66
P. ROBAK i wsp.
Both analogues proved to be highly effective against CLL cells, however SDX-308 was found to be much stronger, as
compared to SDX-101, when the dosage used was eight times lower. The main mechanism of SDX-101 and SDX-308
action was caspase-dependent apoptosis. Expression of apoptosis-regulating proteins slightly differed in response to
both drugs. Importantly, SDX-101 and SDX-308 had selective anti-leukemic effect, with no significant cytotoxicity
against healthy lymphocytes.
In summary, the examined etodolac analogues, especially SDX-308 could be considered as new agents with potential
clinical activity in CLL. It would be interesting to assess their interactions with drugs routinely used in CLL treatment,
with already confirmed effectiveness in this disease.
KEY WORDS: Non-steroidal anti inflammatory drugs – Etodolac – SDX-101 – SDX-308 – B-cell chronic lymphocytic
leukemia – Apoptosis
WSTĘP
Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), strukturalnie naleŜą do innych grup chemicznych, lecz
charakteryzują się podobnym działaniem. Powszechnie stosuje się je w róŜnych chorobach, w tym
w schorzeniach reumatoidalnych, wykorzystując ich właściwości przeciwzapalne, przeciwgorączkowe
oraz przeciwbólowe. Są takŜe stosowane jako leki hamujące agregację płytek krwi. Główny mechanizm
działania NLPZ polega na hamowaniu działania aktywności cyklooksygenazy (COX) i w konsekwencji
hamowaniu syntezy prostaglandyn [1].
Ponadto istnieją doniesienia wskazujące, Ŝe niektóre NLPZ mogą mieć działanie przeciwnowotworowe, pomocne zarówno w prewencji, jak i w leczeniu schorzeń onkologicznych. Stwierdzono równieŜ,
Ŝe NLPZ mogą wpływać na częstość występowania chorób nowotworowych układu chłonnego i ostrych
białaczek [2].
Wyniki badań i obserwacje kliniczne wskazują, Ŝe działanie przeciwnowotworowe wykazują nowe
pochodne etodolaku – SDX-101 oraz SDX-308 [3]. Etodolak jest powszechnie dostępnym lekiem będącym mieszaniną racemiczną dwóch form izomerycznych, lewo- i prawoskrętnej (S i R) [4]. Forma S
związku hamuje COX, podczas gdy forma R nie wykazuje takiej aktywności. Oddzielenie obu form,
pozwala na uniknięcie działań niepoŜądanych, związanych z blokadą receptora COX-2. Poza tym, forma
R jest metabolizowana w organizmie człowieka znacznie wolniej i pozwala osiągnąć dziesięciokrotnie
wyŜsze stęŜenie w surowicy krwi [5, 6]. Nowy analog z grupy NLPZ, SDX-308, otrzymano przez podstawienie grupy bromkowej do pierścienia aromatycznego R-etodolaku oraz redukcję grupy acetylowej
do alkoholu pierwszorzędowego w chiralnym centrum cząsteczki [3].
W 2002 roku Nardella i LeFevre opisali przeciwbiałaczkowe działanie SDX-101 stosowanego
u chorego na PBL z powodu dolegliwości bólowych [3]. Ponadto istnieją doniesienia, Ŝe SDX-101 indukując cytotoksyczność, przełamuje lekooporność komórek nowotworowych oraz nasila działanie innych leków przeciwnowotworowych w szpiczaku mnogim (SzM) [21]. Nowy analog SDX-101, SDX308, charakteryzuje się silniejszym działaniem przeciwnowotworowym przeciw komórkom SzM [7].
Celem przeprowadzonych badań była ocena działania cytotoksycznego SDX-101 i SDX-308 w odniesieniu do komórek PBL, a takŜe ocena jego mechanizmów. W przedstawionych badaniach własnych,
przeprowadzonych na komórkach PBL ex vivo, wykazano wysoką aktywność cytotoksyczną zarówno
SDX-101, jak i SDX-308, stosowanych pojedynczo,
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono na komórkach jednojądrowych, izolowanych z krwi 100 nieleczonych
wcześniej chorych na PBL. Charakterystykę kliniczną chorych przedstawiono w Tabeli 1.
Materiał do badań stanowiła krew obwodowa chorych, pobierana przy okazji rutynowych badań.
Próbki te wykorzystywano do izolacji komórek jednojądrowych, oceny immunofenotypu oraz badania
Cytotoksyczne działanie nowych analogów etodolaku
67
ekspresji białka ZAP-70 w komórkach białaczkowych. Komórki jednojądrowe izolowano takŜe z krwi
zdrowych ochotników.
Tabela 1. Charakterystyka chorych
Table 1. Patient characteristics
Wiek (lata)
Płeć
Leukocytoza (1×109/l)
StęŜenie hemoglobiny (g%)
Liczba płytek krwi (1×109/l)
Okres kliniczny wg Rai
Ekspresja antygenu CD38 (%)
Ekspresja białka ZAP-70 (%)
Mediana
Zakres
Kobiety
MęŜczyźni
Mediana
Zakres
Mediana
Zakres
Mediana
Zakres
St.0
St.I
St.II
St.III
St. IV
Mediana
Zakres
Mediana
Zakres
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
70
37–100
49(%)
51(%)
33
6,9÷300
12,9
5,2÷17
152
2÷453
44
20
4
8
23
8,25
0,21÷98
6,53
0,02÷99,14
Izolacja komórek jednojądrowych
W celu izolacji komórek jednojądrowych krew heparynizowaną wirowano w gradiencie gęstości Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics, inc. ST.Louis, MA, USA). Krew nawarstwiano na powierzchnię
odczynnika i wirowano przy 3600 obr na min przez 20 minut. Następnie, komórki zawieszone w interfazie odpłukiwano przez wirowanie w płynie Hanksa (Biomed, Lublin, Polska), a następnie w medium
hodowlanym RPMI-1640 (BioWhitaker, Lonza, Verviers, Belgia). W celu oceny immunofenotypowej
limfocyty z pełnej krwi obwodowej znakowano za pomocą standardowego panelu przeciwciał monoklonalnych przeciw antygenom CD19, CD20, CD23, CD5, CD3, CD4, CD8, CD56. 50µl krwi przenoszono do probówki cytometrycznej, a następnie inkubowano przez 15 minut z odpowiednimi przeciwciałami (dodawanymi w ilości zgodnej z zaleceniami producenta). Następnie materiał poddano 15minutowej lizie, bez późniejszego płukania (metoda lyse - no wash). Wszystkich pomiarów dokonywano
przy uŜyciu cytometru przepływowego FACS Calibur (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA).
W trakcie kaŜdej analizy mierzono fluorecensję 10000 komórek na próbkę.
Inkubacja komórek PBL ex vivo z pochodnymi etodolaku
Zawiesinę komórek jednojądrowych dodawano do 24- i 48- dołkowych płytek (Nunc, Roskilde,
Dania) lub do naczynka o pojemności 1000 ml (Nunc Roskilde, Dania). Wyjściowa gęstość komórek
w zawiesinie wynosiła 0,5 mln/ml. Komórki hodowano w przygotowanym medium RPMI–1640, z dodatkiem 10% surowicy, 3 ml L-glutaminy, 5 ml antybiotyku – streptomycyny i penicyliny (wszystkie
odczynniki – Sigma, Taufkirchen, Niemcy). Izolacja komórek i zakładanie hodowli odbywały się
w warunkach jałowych.
Wyizolowane komórki inkubowano przez 24 godziny z dodatkiem SDX-101 lub SDX-308 (Salmedix, Inc., San Diego, CA, USA), w stęŜeniach od 10 do 2000 µM 400 µM SDX-101 oraz 50 µM
SDX-308, w stęŜeniach 1 do 1000 µM. Kontrolę stanowiły prowadzone równolegle zawiesiny komórek
jednojądrowych krwi obwodowej bez dodatku leków.
68
P. ROBAK i wsp.
Stopień cytotoksycznego działania leków oceniano za pomocą testu z jodkiem propidyny (JP) (Sigma Taufkirchen, Niemcy), (20 µg/ml przez 5 min), stosując skompensowany indeks cytotoksyczności
(SIC). Jest to róŜnica pomiędzy odsetkiem komórek JP+ (indeks cytotoksyczności, IC) w poszczególnych próbach inkubowanych komórek z lekami, a IC komórek kontrolnych. Oceny apoptozy dokonywano na podstawie wykrywania aktywnej kaspazy 3 oraz za pomocą testu z anneksyną-V (Ann-V).
Aktywność kaspazy 3 określano przy uŜyciu zestawu firmy Becton Dickinson (Becton Dickinson,
San Jose, Ca, USA). Komórki po inkubacji z lekami permabilizowano i utrwalano za pomocą roztworu
Cytofix/Cytoperm (20 minut, na lodzie), a następnie dwukrotnie przemywano i wirowano w roztworze
Perm/Wash. Do komórek przygotowanych w opisany sposób dodawano przeciwciało przeciw aktywnej
kaspazie 3 w ilości 50 µl na 100 µl zawiesiny komórek. Następnie komórki inkubowano przez 30 minut
w temperaturze pokojowej., a po tym czasie przemywano roztworem Perm/Wash i dokonywano pomiaru przy uŜyciu cytometru przepływowego (kanał FL1) (wszystkie odczynniki Becton Dickinson, San
Jose, Ca, USA). Dla oceny nasilenia apoptozy w poszczególnych hodowlach obliczano indeks apoptotyczny (IA), czyli odsetek komórek apoptotycznych (wykazujących aktywację kaspazy 3). RóŜnica pomiędzy IA w komórkach z lekami, a IA w równoległych kontrolach była określana pojęciem skompensowanego IA (SIA).
Do pomiaru ekspresji białek zaangaŜowanych w proces apoptozy uŜyto komórek, które po inkubacji
z badanymi związkami zostały utrwalone w 1% formaldehydzie (10 minut, w temperaturze 0oC), a następnie w 80% alkoholu (30 minut, w temperaturze 0oC). Po dwukrotnym przemyciu w PBS dokonano
znakowania przeciwciałami przeciw poszczególnym białkom (30 minut, w temperaturze pokojowej,
w ciemności). UŜyto następujących przeciwciał:
1. Przeciwciało anty-p73 (NeoMarkers, Fremont, CA, USA);
2. Przeciwciało anty-Bax (DAKO Cytomation, Glostrup, Dania);
3. Przeciwciało anty-Bak (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania);
4. Przeciwciało anty-Bcl-2 (DAKO Cytomation, Glostrup, Dania);
5. Przeciwciało anty-Mcl-1 (Abcam, Cambridge, Wielka Brytania).
Analiza statystyczna wyników
Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono przy uŜyciu programu STATISTICA
5.0 (Tulsa, USA). Określano średnią arytmetyczną (X), odchylenie standardowe (SD), medianę oraz
zakres wartości (minimum – maksimum). Do porównania róŜnic pomiędzy próbami traktowanymi lekami, a odpowiednimi kontrolami stosowano test Mann-Whitney’a. Do oceny istnienia związków statystycznych pomiędzy wynikami uŜywano test korelacji rang Spearman’a. Za istotne statystycznie uznawane były róŜnice, dla których poziom istotności p był mniejszy od 0,05.
WYNIKI
Wpływ SDX-101 i SDX-308 na komórki PBL
W celu wybrania optymalnej dawki obu analogów etodolaku wykonano serię wstępnych doświadczeń. Prowadzono 24 godzinne inkubacje in vitro komórek izolowanych z krwi chorych na PBL z dodatkiem SDX-101 w stęŜeniach od 10 do 2000 µM. śywotność komórek oceniano za pomocą testu z JP.
Wartość IC50 została osiągnięta dla stęŜenia 800 µM SDX-101, natomiast SIC50 uzyskano przy uŜyciu
stęŜenia 1250 µM SDX-101. Do dalszych badań wybrano stęŜenie 400 µM SDX-101, indukujące po 24
godzinach hodowli SIC na poziomie poniŜej 15% JP+ (mediana 13,1%; vs. kontrola – p=0,0003) (Rycina 1).
Cytotoksyczne działanie nowych analogów etodolaku
69
Jodek propydyny SDX 101
100
Cytotoksyczność (%kom.+)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
2000
1750
1500
1250
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
50
10
kontrola
0
StęŜenie SDX 101 µM
Ryc. 1. Cytotoksyczność komórek jednojądrowych izolowanych z krwi chorych na PBL po inkubacji przez 24h w obecności
SDX-101 w zakresie stęŜeń 10-2000 µM. Na Rycinie przedstawiono wartości X±SD
Fig. 1. The choose of the optimal cytotoxic dose of SDX-301. X±SD values are shown
Podobnie, jak w przypadku SDX-101, dla wybrania optymalnej dawki SDX-308 wykonano serię
wstępnych doświadczeń. Prowadzono 24 godzinne inkubacje ex vivo komórek pobranych od chorych na
PBL, do których dodano SDX-308 w stęŜeniach od 1 do 1000 µM. Wartość IC50 została osiągnięta dla
stęŜenia 50 µM SDX-308, natomiast SIC50 uzyskano przy uŜyciu 75 µM SDX-308. Do dalszych badań
wybrano stęŜenie 50 µM, indukujące po 24 godzinach hodowli cytotoksyczność (SIC) na poziomie ok.
20% (vs. kontrola – <0,0001) (Rycina 2).
Jodek propydyny SDX-308
100
śywotność (%komórek+)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
500
250
1000
StęŜenie SDX-308 µM
200
150
100
75
50
20
10
5
1
kontrola
0
Ryc. 2. Cytotoksyczność komórek jednojądrowych izolowanych z krwi chorych na PBL po inkubacji przez 24h w obecności
SDX-308 w zakresie stęŜeń 1-1000 µM. Na Rycinie przedstawiono wartości X±SD
Fig. 2. The choose of the optimal cytotoxic dose of SDX-308. X±SD values are shown
Mechanizmy cytotoksyczności SDX-101 i SDX-308 na komórki PBL
Głównym mechanizmem cytotoksycznego działania SDX-101 na komórki PBL była apoptoza zaleŜna od aktywacji kaspaz. Po 24 godzinach inkubacji komórek mediana SIA mierzonego aktywnością
kaspazy 3 wynosiła 10,6% (vs. kontrola – p=0,002). Odsetek ten korelował z poziomem komórek apoptotycznych ocenianym testem z Ann-V oraz odsetkiem komórek JP+ określonym w teście cytotoksyczności (Ŝywotności komórek) leku (Rycina 3). Proces apoptozy zaleŜnej od aktywności kaspaz był rów-
P. ROBAK i wsp.
70
nieŜ głównym mechanizmem cytotoksycznego działania SDX-308 na komórki PBL. Po 24 godzinach
inkubacji z tym lekiem mediana SIA mierzonego aktywnością kaspazy 3 wynosiła 18,3% (vs. kontrola –
p<0,044). Ten mechanizm cytotoksyczności SDX-308 został potwierdzony poprzez ocenę eksternalizacji fosfatydyloseryny w błonie komórkowej (test z Ann-V). Odsetek komórek zawierających aktywną
kaspazę 3 korelował z poziomem komórek apoptotycznych oznaczonym przy pomocy testu z Ann-V
oraz z odsetkiem komórek JP+ w teście oceny cytotoksyczności (Ŝywotności) (Rycina 3).
SDX-101
70
SDX-308
60
% komórek dodatnich
50
40
30
20
10
0
Jodek propydyny
Aneksyna-V
Kaspaza 3
Ryc. 3. Porównanie efektu cytotoksycznego (test z jodkiem propydyny, JP) i proapototycznego (test z Ann-V, aktywacja kaspazy 3) pochodnych etodolaku - SDX-101 i SDX-308. Na Rycinie przedstawiono wartości X±SD
Fig. 3. Comparison of the cytoxicity (propydium iodide, PI test) and proapoptotic effect (Ann-V, caspase 3 activation) of SDX101 and SDX-308. X±SD values are shown.
Ekspresja białka (wzrost n-krotny)
1,8
1,6
1,4
1,2
Kontrola
1
SDX-101
0,8
SDX-308
0,6
0,4
p=0,037
0,2
0
Bax
Bak
Bcl-2
Mcl-1
p-73
Ryc. 4. Ekspresja białek regulujących apoptozę po 24 godzinnej inkubacji komórek PBL w obecności SDX-101 i SDX-308. Na
osi Y przedstawiono wielokrotność zmiany ekspresji badanych białek.
Fig. 4. Expression of apoptosis regulating proteins in the 24-hours cultures with SDX-101 and SDX-308 alone. Y-axis shows a
grade of change in protein expression (n-fold; the proportion between protein expression in cells treated with drugs to their
expression in untreated controls).
Cytotoksyczne działanie nowych analogów etodolaku
71
SDX-101 istotnie zwiększał poziom ekspresji białka p73 – indukując około 1,7-krotny jego wzrost
w stosunku do kontroli (p=0,032). Ponadto SDX-101 jedynie nieznacznie wpływał na wzrost ekspresji
Bax oraz powodował spadek ekspresji białka Bcl-2 w komórkach PBL (p>0,05) (Rycina 4). Z kolei
SDX-308 nieznacznie podwyŜszał ekspresję białka Bax (1,17-krotny wzrost) w porównaniu do kontroli
(p>0,05) oraz p73 (1,22-krotny wzrost w stosunku do kontroli (p>0,05). Ponadto SDX-308 nieznacznie
obniŜał poziom ekspresji Bcl-2 w komórkach PBL do wartości 0,93 względem kontroli (p>0,05) oraz
Mcl-1 do wartości 0,91 względem kontroli (p>0,05) (Rycina 4).
Wpływ SDX-101 i SDX-308 na prawidłowe komórki jednojądrowe
SDX-101 stosowany pojedynczo nie wykazywał znamiennego efektu cytotoksycznego na komórki
jednojądrowe izolowane z krwi zdrowych dawców, niezaleŜnie od zastosowanej dawki. Mediana SIC
wynosiła odpowiednio: 0, 2 i 4% dla stęŜenia 200, 400 i 600 µM SDX-101
SDX-308 stosowany pojedynczo na komórki otrzymane z krwi zdrowych dawców wykazał efekt cytotoksyczny zaleŜny od dawki. Mediana SIC wynosiła odpowiednio: 6, 18 i 68% dla stęŜenia 25, 50
i 75 µM SDX-308.
StęŜenie 25 µM SDX-308 indukowało śmierć komórek PBL w stopniu znamiennie wyŜszym niŜ
prawidłowych komórek jednojądrowych (p=0,0006). Dawka 75 µM SDX-308 wykazywało podobną
cytotoksyczność na komórki zdrowe i PBL.
DYSKUSJA
Dwa badane analogi etodolaku, tj. SDX-101 i SDX-308 wywoływały efekt cytotoksyczny ex vivo
w stosunku do komórek PBL w stopniu zaleŜnym od stosowanej dawki leków. Aktywność SDX-101
i SDX-308 była jednak odmienna. SDX-308 wykazywał znacznie silniejszą cytotoksyczność przy zastosowaniu w wielokrotnie niŜszym stęŜeniu niŜ SDX-101. Wartość SIC50 dla SDX-101 uzyskano po
zastosowaniu stęŜenia 1250 µM, podczas gdy ten sam poziom cytotoksyczności pozwoliło osiągnąć
stęŜenie 75 µM SDX-308. Wydaje się to istotne, gdyŜ moŜliwość tak znaczącego obniŜenia dawki analogu etodolaku moŜe mieć waŜne znaczenie kliniczne, pozwalając na istotne zmniejszenie ryzyka wystąpienia objawów niepoŜądanych.
Wyniki dotychczasowych badań wskazują, Ŝe pochodne etodolaku wykazują cytotoksyczność wobec komórek SzM [21], ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) [8], raka wątroby [9] oraz raka prostaty
[10]. Yasui i wsp., oceniając wpływ SDX-308 na komórki SzM takŜe zaobserwowali, Ŝe związek ten
działa znacznie silniej niŜ SDX-101 [21].
Mechanizm działania przeciwnowotworowego obydwu analogów etodolaku, naleŜących do grupy
NLPZ, nie został jednak dotąd w pełni wyjaśniony. Główny mechanizm działania NLPZ polega na hamowaniu biosyntezy prostanoidów – TXA2, prostacykliny i PG [20]. Zahamowanie wytwarzania PG
jest spowodowane blokowaniem przez te leki receptora COX-2. Zaobserwowano istotny wzrost poziomu mRNA kodującego receptor COX-2, jak równieŜ poziom białka COX-2 w zmienionej nowotworowo błonie śluzowej jelita [11–13, 32, 33]. Stwierdzono równieŜ wzrost ekspresji tego receptora w nowotworach piersi, prostaty i płuc [14, 15]. Istnieje więc duŜe prawdopodobieństwo, Ŝe zablokowanie COX2 moŜe wywoływać efekt przeciwnowotworowy.
SDX-101, jako forma prawoskrętna etodolaku, jest pozbawiony działania za pośrednictwem COX.
Z kolei SDX-308, stanowiący mieszaninę racemiczną form R i L, równieŜ nie wykazuje aktywności
wobec receptora COX. Odpowiada za to redukcja reszty acetylowej do alkoholu pierwszorzędowego
[7]. Dane te sugerują, Ŝe za większy efekt cytotoksyczny SDX-308 moŜe być dodatkowo odpowiedzialny inny mechanizm [16].
Przyjmuje się, Ŝe podstawowym zaburzeniem w PBL jest defekt regulacji apoptozy. W badaniach
własnych wykazano, Ŝe głównym mechanizmem działania cytotoksycznego obydwu badanych leków,
72
P. ROBAK i wsp.
jest m.in. indukcja apoptozy zaleŜnej od aktywacji kaspaz. Stwierdzono istotne zwiększenie poziomu
aktywnej kaspazy 3 w komórkach PBL po 24 godzinach inkubacji zarówno z SDX-101, jak i SDX-308.
Efekt ten potwierdziły wyniki analizy innego markera apoptozy - eksternalizacji fosfatydyloseryny
w błonie komórkowej (test z Ann-V).
Aktywność proapoptotyczna, obydwu związków (wpływ na ekspresję białek regulujących apoptozę), wydaje się być odmienna. SDX-101 stosowany pojedynczo istotnie zwiększał poziom ekspresji p73,
białka z rodziny p53, przyczyniając się do blisko dwukrotnego wzrostu w stosunku do kontroli
(p=0,032). Ponadto związek ten w niewielkim stopniu wpływał na ekspresję Bax oraz prowadził do
spadku ekspresji białka Bcl-2 w komórkach PBL (p>0,05). Na podkreślenie zasługuje, Ŝe SDX-101
powodował wzrost ekspresji antyapoptotycznego białka Mcl-1 w komórkach PBL. Wyniki te pozostają
w zgodzie z jedynym dostępnym doniesieniem, w którym wykazano zwiększenie poziomu proapoptotycznego wariantu białka Mcl-1 – Mcl-1s (ang. splicing variant of Mcl-1), w komórkach SzM traktowanych kombinacją SDX-101 i deksametazonu [21]. W cytowanym przypadku nie zaobserwowano
zmiany w aktywacji białek Bcl-xL, Bax oraz Bcl-2 pod wpływem stosowanych leków.
SDX-308 stosowany pojedynczo nieznacznie zwiększał poziom ekspresji białek Bax i p73, i prowadził do spadku ekspresji Bcl-2 i Mcl-1 w komórkach PBL (p>0,05). Badania te wymagają niewątpliwie
kontynuacji i poszerzenia ich zakresu, w tym o ocenę stanu aktywacji szlaku zewnątrzpochodnego indukcji apoptozy. W dotychczasowym piśmiennictwie nie odnotowano doniesień na temat zmian w ekspresji białek regulujących szlak mitochondrialny apoptozy pod wpływem SDX-308.
Dostępne w literaturze wyniki wskazują takŜe na inne drogi działania proapoptotycznego analogów
etodolaku. Badania molekularne wykazały m.in. silną ekspresję genu z rodziny Wnt w komórkach PBL
w porównaniu z komórekami B i T krwi ludzi zdrowych [17]. Rodzina glikoprotein Wnt odpowiedzialna jest za regulację dojrzewania i przeŜycia komórek B we wczesnym stadium rozwoju. Wydaje się, Ŝe
zaburzona aktywacja drogi przewodnictwa glikoprotein Wnt moŜe wykazywać zasadnicze znaczenie
w onkogenezie [18, 19]. Istnieją dane przemawiające za tym, Ŝe SDX-101 i SDX-308 cechuje działanie
toksyczne w odniesieniu do szlaku Wnt. Lu i wsp. wykazali Ŝe SDX-101 wprowadzony do komórek linii
HEK293 (ang. Human Embryonic Kidney 293) ex vivo hamuje przekaźnictwo Wnt/β-kateniny i zmniejsza ich przeŜycie [24]. Behari i wsp., badając wpływ SDX-101 na komórki raka wątroby równieŜ zaobserwowali, Ŝe lek ten wykazuje cytotoksyczność za pośrednictwem zmniejszenia poziomu β-kateniny
[25]. Autorzy wykazali, Ŝe SDX-101 wykazuje aktywność na dwóch poziomach, tj. 1. aktywuje kinazę
GSK-3β, doprowadzając do eliminacji β-kateniny, 2. hamuje transkrypcję genu β-kateniny, zmniejszając
jej poziom w komórce. Yasui i wsp. takŜe potwierdzili, Ŝe lek ten powoduje spadek ekspresji β-kateniny
na poziomie transkrypcji [21]. W konsekwencji dochodzi do zahamowania syntezy białek c-myc oraz
surwiwiny, przedstawiciela rodziny IAP, hamującego aktywację kaspazy 3, a w efekcie wewnątrzkomórkowy szlak apoptozy.
Stwierdzono, Ŝe SDX-308 moŜe działać cytotoksycznie równieŜ w innych mechanizmach [29]. Jednym z nich jest indukcja ekspresji białek antyapoptotycznych przez czynnik transkrypcyjny NFκB (ang.
nuclear factor kappa B) [26]. W prawidłowych komórkach linii B, cząsteczki NFκB gromadzą się w cytosolu, gdzie wchodzą w reakcję z inhibitorem, IκB, hamującym ich wiązanie z DNA [27]. Efektem działania czynników karcynogennych, jest aktywacja fosforylacji inhibitora IκB i uwolnienie go z kompleksu
NFκB, co wywołuje aktywację tego czynnika transkrypcyjnego [28]. Skutkuje to zwiększeniem transkrypcji białek antyapoptotycznych Bcl-2 i XIAP, co w konsekwencji hamuje apoptozę indukowaną zarówno
poprzez wewnątrzpochodny jak i zewnątrzpochodny szlak aktywacji kaspaz [28]. Feng i wsp. wykazali, Ŝe
SDX-308 istotnie wpływa na spadek poziomu NF-κB w komórkach SzM [29]. Badania te potwierdziły
silne hamowanie zarówno fosforylacji, jak i translokacji jądrowej NF-κB w SzM, zarówno w sposób konstytutywny, jak i zaleŜny od TNFα. W efekcie obserwuje się zahamowanie wzrostu komórek SzM, jak
równieŜ tworzenie i aktywność osteoklastów w tej chorobie. Jednocześnie cytowani autorzy stwierdzili, Ŝe
Cytotoksyczne działanie nowych analogów etodolaku
73
SDX-308 hamuje proliferację komórek SzM w stęŜeniach 10–100 razy niŜszych niŜ SDX-101. Potwierdza
to, opisane wyŜej, spostrzeŜenia własne w odniesieniu do komórek PBL.
Coraz więcej dowodów wskazuje, Ŝe zablokowanie procesu apoptozy w komórkach PBL wywołane
jest między innymi przez szlak aktywacji czynnika NFκB [30, 31]. Furman i wsp. podkreślają, Ŝe komórki PBL wykazują wysoki poziom aktywnego NFκB w porównaniu do zdrowych komórek B [31].
Obydwa opisane powyŜej mechanizmy sugerują, Ŝe analogi etodolaku przełamują wewnątrzkomórkowe mechanizmy antyapoptotyczne, prowadząc w konsekwencji do indukcji apoptozy i śmierci komórek PBL. Potwierdzają to wyniki badań własnych. Stwierdzono prawie dwukrotnie silniejszy efekt cytotoksyczny SDX-308 w dawce ośmiokrotnie niŜszej niŜ SDX-101, co moŜe sugerować istnienie dodatkowego mechanizmu indukującego apoptozę w odpowiedzi na ten analog etodolaku. Wyjaśnieniem tego
faktu mogą być wspomniane badania Feng i wsp. [29] przeprowadzone na komórkach SzM. Badacze ci
wykazali, Ŝe opisany powyŜej mechanizm hamowania nagromadzenia cząsteczek NFκB i indukcji apoptozy zaleŜnej od receptorów TNF (szlak zewnętrzny) jest charakterystyczny wyłącznie dla SDX-308.
W ich opinii SDX-101 wpływał na ten mechanizm nieznacznie lub wcale.
Otrzymane przez nas wyniki ujawniły pewne róŜnice w działaniu badanych analogów etodolaku
równieŜ wobec prawidłowych komórek jednojądrowych. Obydwa leki wykazywały selektywny efekt
przeciwbiałaczkowy, szczególnie w niŜszych dawkach. SDX-101 w stosowanych stęŜeniach nie wykazywał efektu cytotoksycznego wobec komórek jednojądrowych krwi obwodowej ludzi zdrowych, podczas gdy wyŜsze stęŜenie SDX-308 (75 µM) indukowała cytotoksyczność zarówno komórek PBL jak
i prawidłowych.
Wyniki te potwierdzają obserwacje Yasui i wsp., którzy analizując wpływ SDX-101 na prawidłowe
komórki równieŜ nie stwierdzili cytotoksyczności tego analogu etodolaku [21]. TakŜe Feng i wsp. oceniając aktywność SDX-101 i SDX-308 na komórki progenitorowe CD34+ w 14-dniowej hodowli nie
wykazali efektu toksycznego [29]. Z przedstawionych danych wynika więc, Ŝe leki te wykazują stosunkowo niewielkie działanie toksyczne na komórki prawidłowe, a jedynie SDX-308 w większych dawkach moŜe eliminować prawidłowe komórki. Sugeruje to zasadność stosowania kilkakrotnie mniejszego
stęŜenia SDX-308, co moŜe wpłynąć na większą selektywność przeciwnowotworową leku.
PIŚMIENNICTWO
1.
Chandrasekharan NV, Dai H, Roos KL, i wsp. Cox – 3, a cyklooxygenase – 1 varint inhibited by acetaminophen and other
analgesic/antipyretic drugs; cloning, structure and expression. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 15: 13926-31.
2. Bosetti C, Gallus S, La Vecchia C. Aspirin and cancer risk: a summary review to 2007. Recent Results Cancer Res. 2009;
181: 231-51.
3. Nardella FA i LeFevre JA. Enhanced clearance of leukemic lymphocytes in B-cell lymphocytic leukemia with etodolac.
Blood. 2002; 99: 2625-2626.
4. Jones RA. Etodolac: An overview of a selective COX-2 inhibitor. Inflammopharmacology. 1999; 7: 269-275.
5. Bernstein L i Ross RK. Prior medication use and health history as risk factors for non-Hodgkin’s lymphoma: preliminary
results of a case control study in Los Angeles county. Cancer. Res. 1992; 52: 5510-5516.
6. Skeith KJ, Brocks DR. Pharmacokinetic optimisation of the treatment of osteoarthritis. Clin. Pharmacokinet. 1994; 26:
233-342.
7. Lindhagen E., Nissle S., Aleskog A. i wsp. R – etodolac (SDX-101) and the related indole-pyran analogues SDX-308 and
SDX-309 potentiate the antileukemic activity of standard cytotoxic agents in primary chronic lymphocytic leukemia cells.
Cancer Chemother. Pharmacol. 2007; 60: 545-553.
8. Shiff SJ i Rigas B. The role of cyclooxygenase inhibition in the antineoplastic effects of nonsteroidal antiinflammatory
drugs (NSAIDs). J Exp Med 1999; 190: 445-450.
9. Behari J, Zeng G, Otruba W i wsp. R-Etodolac decreases beta-catenin levels along with survival and proliferation of hepatoma cells. J. Hepatol. 2007; 46: 849-857.
10. Kolluri SK, Corr M, James SY, Bernasconi M, Lu D, Liu W, Cottam HB, Leoni LM, Carson DA, Zhang XK. The Renantiomer of the nonsteroidal antiinflammatory drug etodolac binds retinoid X receptor and induces tumor-selective apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2005; 102: 2525-2530
11. Kargman SL, O'Neill GP, Vickers PJ i wsp. Expression of prostaglandin G/H synthase-1 and -2 protein in human colon
cancer. Cancer Res. 1995; 55: 2556-2559.
74
P. ROBAK i wsp.
12. Leporrier M, Chevret S, Cazin B, i wsp. French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukemia. Randomized
comparison of fludarabine, CAP and CHOP in 938 previously untreated stage B and C chronic lymphocytic leukemia patients Blood. 2001; 98: 2319-2325.
13. Boolbol SK, Dannenberg AJ, Chadburn A i wsp. The mechanism of tumor cell clearance by rytuksymab in vivo in patients
with B-cell chronic lymphocytic leukemia: evidence of caspase activation and apoptosis induction. Blood. 1999; 1038 –
1043.
14. Dannenberg AJ, Altorki NK, Boyle JO i wsp. Cyclo-oxygenase 2: a pharmacological target for the prevention of cancer.
Lancet Oncol. 2001; 2: 544-551.
15. Dannenberg AJ i Subbaramaiah K. Targeting cyclooxygenase-2 in human neoplasia: rationale and promise. Cancer Cell.
2003; 4: 431-436.
16. Humber LG, Demerson CA, Swaminathan Pi wsp. Etodolac (1,8-diethyl-1,3,4,9-tetrahydropyrano[3,4-b] indole- 1-acetic
acid): a potent antiinflammatory drug. Conformation and absolute configuration of its active enantiomer. J. Med. Chem.
1986; 29: 871 – 874.
17. Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, i wsp. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation
genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J. Exp. Med. 2001; 194: 1639-1647.
18. Reya T, O'Riordan M, Okamura R, i wsp. Wnt signaling regulates B lymphocyte proliferation through a LEF-1 dependent
mechanism. Immunity. 2000; 13: 15-24.
19. Qiang YW, Endo Y, Rubin JS i wsp. Wnt signaling in B-cell neoplasia. Oncogene. 2003; 22: 1536-1545.
20. Ulrich CM, Bigler J, Potter JD. Non-steroidal anti-inflammatory drugs for cancer prevention: promise, perils and pharmacogenetics. Nat. Rev. Cancer. 2006; 6: 130-140.
21. Yasui H, Hideshima T, Hamasaki M, i wsp. SDX -101, the R-enantiomer of etodolac, induces cytotoxicity, overcomes
drug resistance and enhances the activity of dexamethasone in multiple myeloma. Blood. 2005; 106: 706-712.
22. Ma H, Nguyen C, Lee KS, Kahn M. Differential roles for the coactivators CBP and p300 on TCF/beta-catenin-mediated
survivin gene expression. Oncogene. 2005; 24: 3619-3631.
23. Tetsu O i McCormick F. Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells. Nature. 1999; 398: 422426.
24. Lu D, Zhao Y, Tawatao R. i wsp. Activation of the Wut signaling pathway in chronic lymphocytic leukemia. Proc. Natl.
Acad .Sci. 2004; 101: 3118-3123.
25. Behari J, Zeng G, Otruba W i wsp. R-Etodolac decreases beta-catenin levels along with survival and proliferation of hepatoma cells. J. Hepatol. 2007; 46: 849-857.
26. Ougolkov AV, Bone ND, Fernandez-Zapico ME i wsp. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 activity leads to epigenetic silencing of nuclear factor kappaB target genes and induction of apoptosis in chronic lymphocytic leukemia B
cells.Blood. 2007; 110: 735-742.
27. Baeuerle PA i Baltimore D. I kappa B: a specific inhibitor of the NF-kappa B transcription factor. Science. 1988; 242:
540-546
28. Beinke S i Ley SC. Functions of NF-kappaB1 and NF-kappaB2 in immune cell biology. Biochem. J. 2004; 382: 393-409.
29. Feng R, Anderson G, Xiao G i wsp. SDX-308, a nonsteroidal anti-inflammatory agent, inhibits NF-kappaB activity, resulting
in strong inhibition of osteoclast formation/activity and multiple myeloma cell growth. Blood. 2007; 109: 2130-2138.
30. Ogasawara T, Yasuyama M i Kawauchi K. Constitutive activation of extracellular signal-regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase in B-cell lymphoproliferative disorders. Int. J. Hematol. 2003; 77: 364–370
31. Furman RR, Asgary Z, Mascarenhas JO i wsp. Modulation of NF-kappa B activity and apoptosis in chronic lymphocytic
leukemia B cells. J. Immunol. 2000; 164: 2200–2206.
32. Tsujii M i DuBois RN. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin
endoperoxide synthase 2. Cell. 1995; 83: 493-501.
33. Tsujii M, Kawano S i DuBois RN. Cyclooxygenase-2 expression in human colon cancer cells increases metastatic potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1997; 94: 3336-3340.
Praca wpłynęła do Redakcji 13.01.2010 r. i została zakwalifikowana do druku 25.01.2010 r.
Adres Autora:
Paweł Robak
Zakład Hematologii Doświadczalnej
Katedry Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi
93-510 Łódź, ul. Ciołkowskiego2
e-mail: [email protected]