Ocena nasilenia hemolizy we wczesnym okresie po operacjach
Transkrypt
Ocena nasilenia hemolizy we wczesnym okresie po operacjach
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 • Volume 48 • Number 1 • 33-39 Praca oryginalna • Original Article Ocena nasilenia hemolizy we wczesnym okresie po operacjach kardiochirurgicznych: porównanie trzech metod Evaluation of hemolysis after cardiovascular surgery in the early postoperative period: comparison of three methods Tadeusz Góralczyk1, Maciej Bochenek2, Zbigniew Samitowski2, Piotr Przybyłowski2, Rafał Drwiła2, Jerzy Sadowski2, Anetta Undas2 1 Laboratorium Analityczne, 2Klinika Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii, Instytut Kardiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego KSS im. Jana Pawła II w Krakowie Streszczenie Cel: Hemoliza jest ubocznym skutkiem zabiegów kardiochirurgicznych. Celem badania było porównanie trzech metod oceny badania hemolizy poprzez pomiar w osoczu wolnej hemoglobiny (FHb), haptoglobiny i indeksu hemolizy (HI) u pacjentów we wczesnym okresie pooperacyjnym. Materiał: Badanie obejmowało 130 pacjentów po zabiegach pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG), wszczepiania protezy zastawkowej serca, CABG ze wszczepianiem zastawki serca oraz po innych zabiegach, w tym: plastyce zastawki mitralnej, plastyce przegrody międzyprzedsionkowej i operacji tętniaka aorty z wymienieniem łuku aorty. FHb mierzono metodą kolorymetryczną, haptoglobinę metodą immunoturbidymetryczną, a do pomiaru HI zastosowano technikę bezpośredniego pomiaru optycznego. Wyniki: Mediany (zakresy) dla HI, FHb i haptoglobiny były odpowiednio: 13 (1 - 106) mg/dl, 30 (5 - 245) mg/dl i 72 (0 - 286) mg/dl. HI korelował silnie z FHb (r = 0,94, p < 0,0001). Zarówno HI, jak i FHb miały dodatnią korelację z całkowitym czasem operacji (r = 0,31, p = 0,001 i r = 0,28, p = 0,001), czasem krążenia pozaustrojowego (r = 0,44, p < 0,0001 i r = 0,42, p < 0,0001), czasem zakleszczenia aorty (r = 0,53, p < 0,0001 i r = 0,52, p < 0,0001), a ujemną z haptoglobiną (r = -0,20, p = 0,03 i r = -0,19, p = 0,03). Jednak średnia różnica między wynikami HI i FHb wynosiła -21 mg/dl (95% przedział ufności: -24 mg/dl do -18 mg/dl). Wnioski: Indeks hemolizy można wykorzystywać do oceny nasilenia stopnia hemolizy w osoczu po zabiegach kardiochirurgicznych, ale nie do mierzenia stężenia wolnej hemoglobiny. Summary Aim: Hemolysis is a side effect of cardiovascular surgery. The aim of this study was to compare three methods of evaluation of hemolysis by the measurement of plasma free hemoglobin (FHb), haptoglobin and hemolysis index (HI) in patients in the early postoperative period. Material: The study comprised 130 subjects undergoing coronary arterial bypass grafting (CABG), aortic or mitral valve replacement, CABG with valve replacement and other operations including mitral valvuloplasty, atrial septal defect dosure and aortic aneurysm surgery with the replacement of the aortic arch. FHb concentrations were measured by the colorimetric method, haptoglobin – immunoturbidimetric method and for HI determination a direct optical technique was used. Results: Medians (ranges) HI, FHb and haptoglobin were 13 (1 - 106) mg/dl, 30 (5 - 245) mg/dl and 72 (0 - 286) mg/dl, respectively. HI correlated strongly with FHb (r = 0.94, p < 0.0001). Both HI and FHb had positive correlation with total operation time (r = 0.31, p = 0.001 and r = 0.28, p = 0.001), extracorporeal circulation time (r = 0.44, p < 0.0001 and r = 0.42, p < 0.0001), aortic cross clamp time (r = 0.53, p < 0.0001 and r = 0.52, p < 0.0001), and inverse correlation with haptoglobin (r = -0.20, p = 0.03 and r = -0.19, p = 0.03). However the average difference between HI and FHb was -21 mg/dl (95% CI: -24 mg/dl to -18 mg/dl). Conclusions: HI may be used for hemolysis evaluation in plasma after cardiovascular surgery, but not for the measurement of free hemoglobin concentrations. Słowa kluczowe:haptoglobina, hemoliza, indeks hemolizy, wolna hemoglobina Key words:free hemoglobin, haptoglobin, hemolysis, hemolysis index 33 Ocena nasilenia hemolizy we wczesnym okresie po operacjach kardiochirurgicznych: porównanie trzech metod Wstęp Hemoliza wewnątrznaczyniowa towarzyszy zabiegom kardiochirurgicznym, podczas których stosuje się krążenie pozaustrojowe [1, 2, 3, 4]. Na stopień uszkodzenia krwinek czerwonych mają wpływ płyny infuzyjne użyte do hemodylucji, prędkość minutowa przepływu krwi i techniki ssania krwi z pola operacyjnego [5]. Hemoliza występuje również u chorych, u których stosuje sie urządzenia do wspomagania pracy komór (VAD) [6]. Nasiloną hemolizę obserwowano, gdy stosowano pompy rolkowe [1]. W czasie przepływu krwi przez złącza, reduktory i filtry erytrocyty ulegają zniszczeniu wskutek fragmentacji, kolizji, gwałtownym przyspieszeniom lub zwolnieniom przepływu [5, 7]. Uwolniona hemoglobina jest wiązana przez haptoglobinę, a hem przez hemopeksynę i są usuwane z krążenia. Przy nasilonej hemolizie mechanizmy te mogą być niewydolne i wówczas wzrasta poziom wolnej hemoglobiny (FHb – free hemoglobin) w osoczu i moczu [8]. Nadmiar FHb skutkuje szeregiem szkodliwych dla organizmu efektów: ogranicza biodostępność tlenku azotu (NO) [8], powoduje odkładanie hemosyderyny w kanalikach nerkowych [8], wywołuje dystonię mięśni gładkich, waskulopatię i dysfunkcję śródbłonka [9]. Żelazo hemowe reagując z endogennym nadtlenkiem wodoru powoduje powstanie wolnych rodników, które są przyczyną dużych uszkodzeń, szczególnie w nerkach [10]. Podwyższone stężenie uwalnianych do krążenia składników krwinek czerwonych wpływa niekorzystnie na układową i płucną oporność naczyniową, funkcję płytek, czynność kanalików nerkowych, a co najważniejsze pogarsza rokowanie u chorych operowanych [4]. Walidacja mechanizmów niekorzystnego działania wolnej hemoglobiny obserwowanej w osoczu i w moczu najbardziej wpływających na wyniki operacyjne jest trudna do oceny klinicznej. Efekty obkurczenia łożyska naczyniowego wywołane zmniejszeniem dostępności NO poprzez obecność wolnej hemoglobiny w osoczu zwiększają częstość ostrego uszkodzenia nerek (AKI) [11]. Zwraca się uwagę także na agregację FHb w kwaśnym ultraprzesączu i tworzenie wałeczków, co przyczynia się do rozwoju AKI [12]. Możliwości skorelowania poziomu wolnej hemoglobiny w surowicy Hemoglobina uwolniona z erytrocytów do osocza łączy się z haptoglobiną. Wątroba produkuje trzy rodzaje haptoglobiny: HPT 1-1 (85 kD), HPT 2-1 (200 kD) i HPT 2-2 (400 kD) o czasie półtrwania 3 – 4 dni [15]. Haptoglobina może wiązać około 0,07 do 0,15 g/dl (42 – 90 μmol/l) hemoglobiny w zależności od allotypu [8]. Kompleks hemoglobina-haptoglobina jest wychwytywany przez receptory CD163 makrofagów i monocytów, a następnie pochłaniany i degradowany w układzie siateczkowo-śródbłonkowym [6]. W przypadku masywnej hemolizy poziom osoczowej haptoglobiny może spaść do wartości nieoznaczalnych. Wątroba wytwarza także hemopeksynę, która jest białkiem o masie cząsteczkowej 80 kDa [15] i dużym powinowactwie do hemu [16]. Nadmiar wolnej hemoglobiny łączy się również z hemopeksyną. Kompleksy hemoglobina-hemopeksyna są usuwane z krążenia poprzez komórki wątroby, co prowadzi do obniżenia poziomu hemopeksyny. Pozostała wolna hemoglobina może być mierzona w osoczu [6]. Techniki pomiaru wolnej hemoglobiny można podzielić na „optyczne” i „chemiczne”. Pierwsze oparte są o pomiar absorbancji oksyhemoglobiny przy długościach fal 415, 541 lub 577 nm w próbkach nierozcieńczonego osocza (metody Crippsa, Kahna, Portera, Shinowara) lub rozcieńczonego (metody Harboe i Fairbanks’a AII) [17]. Metody drugiej grupy polegają na pomiarze absorbancji kolorowego produktu reakcji hemoglobiny z dodanymi substancjami takimi jak tetrametylbezydyna lub żelazicyjanek (metoda cyjanmethemoglobinowa) [17]. Powstały także urządzenia przyłóżkowe, tzw. point of care device, w których hemoglobina jest przekształcana w azydek methemoglobiny i pomiar dokonywany jest przy fali o długości 570 i 880 nm [18]. Nowoczesne analizatory oznaczają tzw. wskaźniki surowicze, które mają pomóc w wykryciu czynników interferujących z pomiarami parametrów biochemicznych i immunochemicznych. Stopień hemolizy, bilirubinemii i lipemii (Haemolysis, Icterus, Lipaemia) jest określany liczbowo. Gdy wartość chociaż jednego z tych wskaźników przekracza granice przyjęte dla pomiaru danego analitu, jest to sygnałem obniżenia wiarygodności otrzymanego wyniku [19]. z wczesnym markerem uszkodzenia nerek jakim jest N-acetyl-β-(D)-glukozaminidaza (NAG) stanowi ciekawą hipotezę badawczą rozszerzającą nasze możliwości wczesnego wykrywania i profilaktyki tego niebezpiecznego powikłania [11]. Nasilenie hemolizy po operacji kardiochirurgicznej jest związane w dużej mierze z czasem trwania zabiegu [13]. Postęp techniczny i stosowanie nowocześniejszych urządzeń ogranicza powstawanie hemolizy w czasie operacji [14]. Wielkość hemolizy można oceniać poprzez pomiar: 1.wzrostu stężenia składników erytrocytów w surowicy lub osoczu takich jak: hemoglobina (Hb) i dehydrogenaza mleczanowa (LDH). 2.obniżenia stężenia składników surowicy lub osocza, które po związaniu się z uwolnionymi składnikami erytrocytów ulegają szybkiej eliminacji z ustroju takich jak haptoglobina i hemopeksyna. Celem pracy było porównanie różnych metod pomiaru nasilenia hemolizy wewnątrznaczyniowej występującej tuż po zabiegach kardiochirurgicznych poprzez oznaczenie w osoczu stężenia wolnej hemoglobiny i haptoglobiny oraz tzw. indeksu hemolizy (HI – hemolysis index). 34 Material i metody Pacjenci Grupę badaną stanowiło 130 kolejnych pacjentów poddawanych planowym operacjom kardiochirurgicznym w lipcu i sierpniu 2011 roku w Klinice Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii IK CM UJ na bloku operacyjnym Krakowskiego Szpitala Specjalistycznego im. Jana Pawła II. Zebrano dane demograficzne i kliniczne dotyczące rodzaju zabiegu, czasu trwania zabiegu, czasu krążenia pozaustrojowego, czasu zakleszczenia aorty oraz zastosowanej kardioplegii. Metody laboratoryjne Oznaczenia parametrów biochemicznych (haptoglobina, kinaza kreatynowa - CK, aktywność izoenzymu MB kinazy kreatynowej - CKMB, kreatynina) i immunochemicznych (wysoko czuła troponina T - TnT) wykonano na analizatorze cobas 6000 (moduły cobas c501 i cobas e601) używając zestawów odczynnikowych producenta (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy). Analizator Sysmex XT 2000i (Sysmex, Japonia) wykorzystano do oznaczeń morfologii, w tym liczby leukocytów (WBC) i poziomu hemoglobiny (Hb). Próbki do oznaczeń wskaźników hemolizy (HI, FHb i haptoglobina) pobierano jeszcze na sali operacyjnej, a przed przekazaniem chorego na oddział intensywnej opieki medycznej (OIOM). Pozostałe oznaczenia wykonano z próbek pobranych już na OIOM-ie. Krew do pomiaru indeksu hemolizy pobierano na heparynę litową używając probówek systemu zamkniętego Sarstedt. HI wyznaczano na module cobas c501 korzystając z zestawu Serum Index Gen. 2 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy). Po odwirowaniu (10 min 3000g) otrzymywano osocze. W automatycznie rozcieńczanej badanej próbce (w 0,9 % roztworze NaCl) mierzono absorbancję przy długości fal 583 (pierwotna) i 629 (wtórna) nm. Na podstawie zmierzonej absorbancji i zastosowania odpowiednich współczynników wyniki wyrażano w mg/dl i odpowiadały one przeciętnemu stężeniu hemoglobiny (wg informacji na ulotce producenta). Współczynnik zmienności (CV) na poziomie 6,1 mg/dl wynosił 9,3 %. Stężenie wolnej hemoglobiny oceniano metodą wprowadzoną w latach 80-tych XX wieku do stosowania w krakowskim ośrodku kardiochirurgicznym przez profesora Antoniego Dziatkowiaka. Materiałem do badań było osocze szczawianowe (4,5 ml krwi + 0,5 ml 1,65 % szczawianu potasu). Do 3 ml 10 % NaOH dodawano 1 ml odwirowanego osocza, a następnie 30 mg dwutionianu sodu (Na2S2O4), który redukuje hemoglobinę. Zredukowana postać hemoglobiny cechuje się maksimum absorpcji przy fali długości 558 nm. Miarą zawartości FHb była różnica absorbancji przy długościach fal 558 i 580 nm. Odczytów dokonywano na spektrokolorymetrze SPEKOL 11 (Carl Zeiss, Jena, Niemcy). Wyniki podawano wg krzywej wzorcowej w mg/dl. Współczynnik zmienności (CV) na poziomie 18,4 mg/dl wynosił 3,8 %. Wartości referencyjne dla tej metody poniżej 6,5 mg/dl ustalono 30 lat temu na podstawie wykonywanych wtedy pomiarów. Haptoglobinę mierzono w tych samych próbkach osocza heparynowego, w których oceniano HI. Oznaczenia wykonano metodą immunoturbidymetryczną z wykorzystaniem zestawu odczynnikowego Tina-quant[a]Haptoglobin ver.2 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy). Wskutek aglutynacji haptoglobiny ze specyficzną surowicą powstają strąty. Pomiar turbidymetryczny następuje przy długości fali 340 nm. Wyniki wyrażano w mg/dl. CV na poziomie 86,5 mg/dl wynosił 3,0 %. Zakres referencyjny dla haptoglobiny mieścił się w granicach 30 – 200 mg/dl. Całą badaną populację podzielono na tercyle względem stę- żenia FHb i porównano poziom markerów hemolizy oraz parametrów biochemicznych w tych grupach. Dokonano także porównań w grupach pacjentów wyróżnionych ze względu na rodzaj przeprowadzonego zabiegu. Analiza statystyczna Normalność rozkładów badano testem Shapiro-Wilka. Wyniki parametrów o rozkładzie nie normalnym wyrażono w medianach (zakresach), korelacje między nimi wyrażono współczynnikiem R Spearmana, a do badania różnic między nimi użyto test ANOVA Kruskala-Wallisa i test wielokrotnych porównań średnich rang dla wszystkich prób. Jako statystycznie istotną przyjęto wartość p < 0,05. Obliczenia wykonano korzystając z pakietu Statistica 9.0 (Statsoft, Tulsa, USA). Wyniki W badanej grupie było 83 mężczyzn i 47 kobiet w wieku 21 – 91 lat (tab. I). Pacjenci byli poddawani następującym Tabela I. Charakterystyka pacjentów. n = 130 Wiek (lata) Mężczyźni, n (%) 65 (21 - 91) 83 (64) Zabieg CABG, n (%) 70 (54) ZAST, n (%) 36 (28) CABG+ZAST, n (%) 12 (9) INNE, n (%) 12 (9) Czas trwania zabiegu (min) 210 (80 - 550) Czas krążenia pozaustrojowego (min) 90 (40 - 408) Czas zakleszczenia aorty (min) 50 (15 - 155) EF (%) 58 (20 - 75) Kardioplegia, n 120 Krystaliczna, n (%) 35 (29) Krwista, n (%) 85 (71) FHb (mg/dl) 30 (5 - 245) Haptoglobina (mg/dl) 72 (0 - 286) HI (mg/dl) 13 (1 - 106) WBC (tys/µl) 12,1 (1,9 – 35,0) Hb (g/dl) 10,5 (7,1 – 13,1) Kreatynina (µmol/l) 85 (40 - 1237) CK (U/l) 430 (89 - 3109) CKMB (U/l) 49 (14 - 338) TnT (pg/ml) 442 (69 - 13200) Wyniki wyrażono jako liczebność (procent) lub mediana (zakres); CABG - pomostowanie aortalno-wieńcowe, ZAST - wszczepianie protezy zastawkowej serca, EF – frakcja wyrzutowa lewej komory, FHb – wolna hemoglobina, HI – indeks hemolizy, WBC – liczba leukocytów, Hb – hemoglobina, CK – kinaza kreatynowa, CKMB – izoenzym MB kinazy kreatynowej, TnT – troponina T. 35 Ocena nasilenia hemolizy we wczesnym okresie po operacjach kardiochirurgicznych: porównanie trzech metod zabiegom z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego: pomostowaniu aortalno-wieńcowemu (CABG) – 70 (54 %), wszczepianiu protezy zastawkowej serca (ZAST) – 36 (28 %), pomostowaniu ze wszczepianiem zastawki serca (CABG+ZAST) – 12 (9 %) oraz 12 (9 %) innym zabiegom (INNE), w tym: plastyce zastawki mitralnej (n=4), plastyce przegrody międzyprzedsionkowej (n=5) i operacji tętniaka aorty z wstawieniem łuku aorty (n=3). Wyniki HI występowały w zakresie od 1 do 106 mg/dl, w tym 21 (16 %) poniżej wartości 5 mg/dl podawanej przez producenta jako dolna granica wykrywalności oraz 3 (2 %) powyżej 50 mg/dl. Stwierdzono silną korelację HI z FHb (r = 0,94, p < 0,0001). Punkty na wykresie rozrzutu (ryc. 1) układają się wzdłuż linii regresji opisanej równaniem: HI (mg/dl) = -0,31 + 0,46*FHb (mg/dl). 2 (1,5 %) przypadki, w których wartość HI była wyższa od FHb. HI wykazał słabą ujemną korelację z haptoglobiną (r = -0,20, p = 0,03) (ryc. 3). HI korelował dodatnio z czasem trwania zabiegu (r = 0,31, p = 0,001), czasem krążenia pozaustrojowego (r = 0,44, p < 0,0001) i czasem zakleszczenia aorty (r = 0,53, p < 0,0001). Stwierdzono dodatnie korelacje miedzy HI i parametrami uszkodzenia mięśnia sercowego, tj. z CK (r = 0,46, p < 0,0001), CKMB (r = 0,61, p < 0,0001) i TnT (r = 0,44, p < 0,0001). Nie wykazano korelacji HI z wiekiem, płcią, liczbą leukocytów, hemoglobiną i kreatyniną. Rycina 3. Korelacja indeksu (r = -0,20, p = 0,03). Rycina 1. Korelacja indeksu hemolizy (HI) i stężenia wolnej hemoglobiny (FHb) (r = 0,94, p < 0,0001). Zgodność wyników FHb i HI przedstawiono na wykresie Blanda-Altmana (ryc. 2). Wyniki HI były średnio mniejsze od wyników FHb o 21 mg/dl (95% CI: -24 mg/dl do -18 mg/dl). Różnica ta zwiększała się wraz ze wzrostem mierzonych stężeń. Zanotowano Rycina 2. Wykres Blanda-Altmana porównujący indeks hemolizy (HI) ze stężeniem wolnej hemoglobiny (FHb). 36 hemolizy (HI) i haptoglobiny (HPT) Po podziale tercylowym stężeń FHb stwierdzono, że mediany HI wzrastały proporcjonalnie do wzrostu FHb (tab. II) Istotne różnice między tymi tercylami zaobserwowano w odniesieniu do czasu trwania zabiegu (p = 0,02), a zwłaszcza czasu krążenia pozaustrojowego (p < 0,0001) i czasu zakleszczenia aorty (p < 0,0001). W tercylu najwyższym FHb mediany tych czasów były największe. Nie zaobserwowano istotnych Rycina 4. Indeks hemolizy po operacjach kardiochirurgicznych: CABG – pomostowanie aortalno-wieńcowe, ZAST – wszczepianie protezy zastawkowej serca, CABG+ZAST – pomostowanie z wszczepianiem zastawek, INNE – m.in. plastyka zastawki mitralnej, plastyka przegrody międzyprzedsionkowej; * ANOVA Kruskala-Wallisa, ** test wielokrotnych porównań średnich rang dla wszystkich prób. Tabela II. Charakterystyka pacjentów w tercylach (T1 – T3) stężenia wolnej hemoglobiny (FHb). T1 (FHb: < 21 mg/dl) Wiek (lata) Mężczyźni, n (%) T2 (FHb: 21-46 mg/dl) T3 (FHb: > 46 mg/dl) n = 45 n = 42 n = 43 67 (51 - 83) 64 (21 - 82) 67 (21 - 91) 36 (80) 24 (57) 23 (53) Zabieg p 0,42 0,02 < 0,0001 CABG, n (%) 42 (94) 19 (45) 9 (21) ZAST, n (%) 1 (2) 12 (29) 23 (54) CABG+ZAST, n (%) 1 (2) 4 (9) 7 (16) INNE, n (%) 1 (2) 7 (17) 4 (9) Czas trwania zabiegu (min) 198 (80 - 320) 203 (100 - 390) 223 (115 - 550) 0,02 Czas krążenia pozaustrojowego (min) 76 (40 - 142) 89 (40 - 220) 110 (54 - 408) <0,0001 Czas zakleszczenia aorty (min) 39 (17 - 73) 49 (15 - 152) 70 (25 - 155) <0,0001 EF (%) 55 (30 - 70) 57 (30 - 75) 60 (20 - 75) 0,50 40 39 41 Krystaliczna, n (%) 5 (13) 17 (44) 13 (32) Krwista, n (%) 35 (87) 22 (56) 28 (68) FHb (mg/dl) 14 (5 - 20) 30 (21 - 46) 60 (47 - 245) Haptoglobina (mg/dl) 86 (0 - 197) 59 (0 - 286) 68 (0 - 151) 0,002 5 (1 - 9) 13 (3 - 49) 27 (19 - 106) <0,001 Kardioplegia, n HI (mg/dl) WBC (tys/µl) 11,5 (5,8 – 26,2) 11,0 (1,9 – 35,0) 12,8 (3,8 – 26,4) 0,26 Hb (g/dl) 10,4 (7,5 – 12,5) 10,5 (7,7 – 12,8) 10,7 (7,1 – 13,1) 0,52 Kreatynina (µmol/l) 82 (59 - 574) 89 (51 - 1001) 83 (40 - 1237) 0,90 CK (U/l) 335 (89 - 791) 441 (168 - 959) 550 (105 - 3109) 0,0001 CKMB (U/l) 37 (14 - 77) 51 (29 - 150) 63 (26 - 338) <0,0001 TnT (pg/ml) 281 (69 - 2790) 524 (99 - 1530) 535 (71 - 13200) <0,0001 Wyniki wyrażono jako liczebność (procent) lub mediana (zakres); CABG - pomostowanie aortalno-wieńcowe, ZAST - wszczepianie protezy zastawkowej serca, EF – frakcja wyrzutowa lewej komory, FHb – wolna hemoglobina, HI – indeks hemolizy, WBC – liczba leukocytów, Hb – hemoglobina, CK – kinaza kreatyny, CKMB – izoenzym MB kinazy kreatynowej, TnT – troponina T. różnic między tercylami FHb w parametrach hematologicznych (WBC i Hb), jak i w stężeniu kreatyniny. Stwierdzono natomiast istotnie niższe CK (p < 0,05), CKMB (p < 0,001) i TnT (p < 0,001) w tercylu najniższym w porównaniu do tercyla środkowego i najwyższego. Rycina 4 przedstawia wartości HI w zależności od rodzaju zabiegu. Najniższą medianę obserwowano w grupie CABG (6 mg/dl, zakres (1 - 106)), która różniła się istotnie od grupy ZAST (p < 0,001), CABG+ZAST (p < 0,001), jak i od INNE (p = 0,005). Jednak w grupie CABG znalazł się jeden wynik HI bardzo wysoki (106 mg/dl). Między pozostałymi grupami (ZAST, CABG+ZAST i INNE) nie stwierdzono istotnych różnic w wartościach HI. Stężenia FHb występowały w zakresie 5 – 245 mg/dl, z tego tylko 2 (1,5 %) wyniki mieściły się w zakresie referencyjnym. 31 (24 %) wyników przekraczało 50 mg/dl, a 4 (3 %) były wyższe, niż 100 mg/dl. Maksymalny wynik FHb wynoszący 245 mg/dl otrzymano w tej samej próbce, co maksymalny wynik HI (106 mg/dl). Podobnie jak w przypadku HI, także dla FHb stwierdzono istotne korelacje z czasem zabiegu (r = 0,28, p = 0,001), czasem krążenia pozaustrojowego (r = 0,42, p < 0,0001), czasem zakleszczenia aorty (r = 0,52, p < 0,0001) oraz parametrami uszkodzenia mięśnia sercowego: CK (r = 0,46, p < 0,0001), CKMB (r = 0,58, p < 0,0001) i TnT (r = 0,43, p < 0,0001) oraz słabą ujemną korelację z haptoglobiną (r= -0,19, p = 0,03). Natomiast podobnie jak dla HI nie wykazano korelacji FHb z wiekiem, płcią, liczbą leukocytów, hemoglobiną i kreatyniną. Grupa CABG cechowała się istotnie niższymi wynikami FHb w porównaniu do grup ZAST (p < 0,001), CABG+ZAST (p < 0,001) i INNE (p = 0,006). Stężenia haptoglobiny mieściły się w przedziale 0 – 286 37 Ocena nasilenia hemolizy we wczesnym okresie po operacjach kardiochirurgicznych: porównanie trzech metod mg/dl. Mediana (zakres) haptoglobiny w grupie CABG była 81 mg/dl (12 - 197), 57 mg/dl (0 - 286) w ZAST, 79 mg/dl (0 - 130) w CABG+ZAST i 39 mg/dl (0 - 104) w INNE. Wyniki haptoglobiny grupy CABG były istotnie wyższe, niż w grupach ZAST (p = 0,005) i INNE (p = 0,01). Między pozostałymi nie było różnic istotnych statystycznie. W tercylach stężenia wolnej hemoglobiny mediany haptoglobiny były istotnie różne (p = 0,002), przy czym najniższe wartości były w tercylu środkowym. Czasy trwania poszczególnych rodzajów zabiegów nie różniły się istotnie (p = 0,13). Czas trwania krążenia pozaustrojowego w grupie ZAST był wyższy od czasu trwania krążenia pozaustrojowego w grupach CABG (p < 0,001) i INNE (p = 0,02), a nie różnił się istotnie od grupy CABG+ZAST (p = 1,0). Czasy zakleszczenia aorty w grupach CABG i INNE nie różniły się od siebie (p = 1,0), ale były niższe krótsze od tego obserwowanego w grupach ZAST i CABG+ZAST (p < 0,01). Dyskusja W naszej pracy wykazaliśmy bardzo silną korelację HI z poziomem FHb oznaczanym dotychczas używaną metodą. HI był skorelowany z tymi samymi czynnikami wpływającymi na hemolizę okołooperacyjną, takimi jak czas trwania zabiegu, krążenia pozaustrojowego, zakleszczenia, co FHb. Silniejsze korelacje obserwowano w przypadku czasu krążenia pozaustrojowego oraz CKMB. Przedstawione dane wskazują, że zastosowana w naszej Klinice metoda oceny hemolizy pooperacyjnej może być przydatna w praktyce. Prawidłowy poziom hemoglobiny we krwi wynosi 12-16 g/dl. Widoczna „gołym okiem” hemoliza w osoczu jest, gdy stężenie FHb przekracza 300 mg/dl (0,3 g/dl). Wartości prawidłowe FHb są poniżej 10 mg/dl [17]. Niepokój kardiochirurgów może wzbudzić FHb przekraczająca 50 mg/dl lub gdy utrzymuje się tendencja wzrostowa w ciągu 3 dni po zabiegu. Przyjętą wartością alarmową jest poziom 100 mg/dl. W naszym badaniu odsetek chorych z tak wysokim stężeniem był niewielki i wynosił zaledwie 3 % (n=4). Dane sugerujące wystąpieniu przecieku okołozastawkowego, co może powodować istotną hemolizę po operacji mogą pochodzić z badań krwi, a także z badania moczu, w którym stwierdza się obecność hemoglobiny (hemoglobinuria), czy wyników echokardiografii. Jak się spodziewano wyższe wartości wskaźników hemolizy obserwowano u chorych po operacji zastawkowej, gdzie kontakt krwi ze sztucznymi powierzchniami jest większy. Co ciekawe, w największej grupie chorych poddawanych CABG stwierdzono duże różnice w wynikach, ale jednak większość chorych (n=62, 89 %) miała FHb poniżej 50 mg/dl, czyli poniżej przyjętego w naszym laboratorium poziomu ostrzegawczego. Nasilenie stopnia hemolizy można oceniać metodami kolorymetrycznymi używanymi od wielu lat, ale można też do tego celu wykorzystać tzw. indeks surowiczy. Jest to test stosowany w nowoczesnych analizatorach biochemicznych do wykrywania czynników interferujących w czasie pomiarów: 38 hemolizy, bilirubinemii i lipemii. Wyniki indeksu hemolizy mimo, że mogą być wyrażane w mg/dl, nie są równoważne stężeniu hemoglobiny w mg/dl. Wysoka korelacja z rutynowo stosowaną metodą kolorymetryczną, pozwala przypuszczać, że równie dobrze wyniki HI odzwierciedlają nasilenie hemolizy w osoczu lub surowicy [20]. Mogą istnieć jednak przypadki, w naszym materiale widoczne w postaci punktów odstających na rycinie 1, w których proporcje między wynikami z tych dwóch metod są inne, niż zazwyczaj. Można przypuszczać, że wynika to z różnic metodycznych. W teście kolorymetrycznym zachodzi reakcja między hemoglobiną i użytymi odczynnikami. W teście HI nie ma żadnej reakcji, tylko rozcieńczenie surowicy (osocza) i odczyt absorbancji przy dobranej długości fali. Należy pamiętać, że wynik pomiaru hemoglobiny także może ulec zafałszowaniu przy obecności w próbce wysokiego poziomu bilirubiny, lipemii, czy nawet wskutek niewprawnego pobierania krwi do badań. Jak przewidywano stężenie haptoglobiny nie jest dobrą metodą do oceny hemolizy w trakcie zabiegu i w pierwszych godzinach po operacji kardiochirurgicznej. Haptoglobina jest markerem hemolizy, gdyż jej poziom maleje wraz ze wzrostem poziomu FHb w osoczu. Jednak obniżenie stężenia haptoglobiny może nastąpić także w niewydolności wątroby [6]. Natomiast w razie wystąpienia reakcji ostrej fazy jej stężenie zwiększa się. Należy pamiętać także o tym, że haptoglobina posiada szeroki zakres referencyjny. Reakcja z hemoglobiną zależy od fenotypu haptoglobiny. Występujące trzy fenotypy: HPT 1-1, HPT 2-1 i HPT 2-2 różnią się powinowactwem do hemoglobiny i szybkością usuwania z osocza ich kompleksów z hemoglobiną [10, 21]. Te uwarunkowania utrudniają, a nawet uniemożliwiają ocenę nasilenia hemolizy, zwłaszcza przy tylko pojedynczym pomiarze haptoglobiny. W tej pracy ograniczono porównania do dostępnych metod oceny hemolizy stosowanych w naszym laboratorium. Brak porównań oznaczeń HI i FHb z metodą referencyjną (cyjanmethemoglobinową) uniemożliwia stwierdzenie, która z metod jest dokładniejsza w oznaczaniu stężenia wolnej hemoglobiny. Wnioski Indeks hemolizy można wykorzystywać do oceny nasilenia stopnia hemolizy po zabiegach kardiochirurgicznych. Jednak do zmierzenia stężenia wolnej hemoglobiny w osoczu należy użyć metody bardziej swoistej w stosunku do tego analitu. Piśmiennictwo 1. Ding MJ, Xu SW, Zhang J, et al. Trauma to erythrocytes induced by long term In vitro pumping using a roller pump. Cell Biol Int 2007; 31: 763-767. 2. Ishibashi N, Kasegawa H, Koyanagi T, et al. Mechanism of hemolysis after mitral valve repair and new surgical management: prosthetic annuloplasty ring covered with autologous pericardium. J Heart Valve Dis 2005; 14: 588-591. 3. Shin H, Yozu R, Maehara T, et al. Vacuum assisted cardiopulmonary bypass In minimalny invasive cardiac surgery: its fea- sibility and effects on hemolysis. Artif Organ 2000; 24: 450-453. 4. Vercaemst L. Hemolysis In cardiac surgery patients undergoing cardiopulmonary bypass: a review in search of a treatment algorithm. J Extra Corpor Technol 2008; 40: 257-267. 5. Antoszewski Z, Skalski J, Maciejewski D. Sposoby autotransfuzji. Hemotransfuzja, autohemotransfuzja i hemodylucja sterowana w zastosowaniu klinicznym. Śląsk, Katowice 2000; 111-118. 6. Heilmann C, Geisen U, Benk C, et al. Haemolysis In patients with ventricular assist devices: major differences between systems. Eur J Cardiothorac Surg 2009; 36: 580-584. 7. Gungunes A, Akpinar I, Dogan M, et al. Do all hemolytic anemia that occur after mitral valve rep air require surgical treatment? Clin Cardiol 33, 12, E76-E78. 8. Rother RP, Bell L, Hillmen P, et al. The clinical sequel of intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin. JAMA 2005; 293: 1653-1659. 9. Ascenzi P, Bocedi A, Visca P, et al. Hemoglobin and heme scavenging. Life 2005; 57: 749-759. 10. Nielsen MJ, Moestrup SK. Receptor targeting of hemoglobin mediated by the haptoglobins: roles beyond heme scavenging. Blood 2009; 114: 764-769. 11. Vermeulen Windsant IC, Snoeijs MG, et al. Hemolysis is associated with acute kidney injury during major aortic surgery. Kidney Int 2010; 77: 913-920. 12. Haase M, Haase-Fielitz A, Bagshaw SM, et al. Cardiopulmonary bypassassociated acute kidney injury: a pigment nephropathy? Contrib Nephrol 2007; 156: 340-353. 13. Vanek T, Snircova J, Spegar J, et al. Increase in plasma free hemoglobin during cardiopulmonary bypass in heart valve surgery: assessment of renal dysfunction by RIFLE classification. Perfusion 2009; 24: 179-183. 14. Jegger D, Horisberger J, Jachertz M, et al. A novel device for reducing hemolysis provoked by cardiotomy suction during open heart cardiopulmonary bypass surgery: a randomized prospective study. Artif Organs 2007; 31: 23-30. 15. Thomas L. Plasma proteins, Clinical laboratory diagnostics. Thomas L, TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt/Main Germany 1998; 641-688. 16. Morello N, Bianchi FT, Marmiroli P, et al. A role for hemopexin in oligodendrocyte differentiation and myelin formation. PLoSOne 2011; 6: e20173. 17. Malinauskas RA. Plasma hemoglobin measurement techniques for the in vitro evaluation of blood damage caused by medical devices. Artif Organs 1997; 21: 1255-1267. 18. Morris LD, Pont A, Lewis SM. Use of a New HemoCue system for measuring hemoglobin at low concentrations. Clin Lab Haem 2001; 23: 91-96. 19. Lippi G, Luca Salvagno G, Blanckaert N, et al. Multicenter evaluation of the hemolysis index in automated clinical chemistry systems. Clin Chem Lab Med 2009; 47: 934-939. 20. Unger J, Filippi G, Patsch W. Measurements of free hemoglobin and hemolysis index: EDTA- or lithium-heparine plasma? Clin Chem 2007; 53: 1717-1718. 21. Na N, Ouyang J, Taes YEC, et al. Serum free hemoglobin concentrations in healthy individuals are related to haptoglobin type. Clin Chem 2005; 51: 1754-1755. Adres do korespondencji: mgr Tadeusz Góralczyk Laboratorium Analityczne Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II 31-202 Kraków, ul. Prądnicka 80 Tel. (12) 6143156, faks (12) 6143157 email: [email protected] Zaakceptowano do publikacji 06.02.2012 39