Warszawa, 20 czerwca 2015 r. Szanowny Pan Prof. nadzw. dr hab

Warszawa, 20 czerwca 2015 r.
Szanowny Pan
Prof. nadzw. dr hab. Sergiusz Markowicz
Przewodniczący Komisji ds. Przewodów Doktorskich
Centrum Onkologii-Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie
w Warszawie
OCENA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ
MGR ANNY POLAK
ZATYTUŁOWANEJ: "ROLA KINAZ MEK/ERK W INDUKOWANIU OPORNOŚCI NA
GLIKOKORTYKOSTEROIDY W KOMÓRKACH OSTREJ BIAŁACZKI
LIMFOBLASTYCZNEJ (OBL)"
Próba identyfikacji nowych mechanizmów oporności blastów białaczkowych na działanie
glikokortykosteroidów oraz zaproponowanie i walidacja strategii przełamywania tej
oporności, której podjęła się w swojej pracy doktorskiej pani mgr Anna Polak, bez
wątpienia wpisuje się w aktualną tematykę badań w zakresie hematoonkologii.
Rozprawa ma klasyczny układ i została przygotowana bardzo starannie pod
względem edytorskim. Wstęp stanowi w pełni aktualne i bardzo dobrze zredagowane
podsumowanie wiedzy na temat biologii ostrej białaczki limfoblastycznej (OBL). Ponadto,
Doktorantka
omówiła
glikokortykosteroidów
w
oraz
nim
znane
mechanizmy
i
przeciwnowotworowego
potencjalne
przyczyny
oporności
działania
komórek
nowotworowych na te leki. Cele pracy zostały określone jasno, a wykonane
doświadczenia i uzyskane wyniki umożliwiły ich realizację. Metodyka została opisana
kompetentnie i zwięźle (może nawet niekiedy zbyt zwięźle). Zabrakło mi w niej podania
numeru zgody Komisji Biotycznej na pobranie materiału od chorych na OBL. Wyniki
dr hab. med. Dominika Nowis
ul. Banacha 1A budynek F
02-097 Warszawa
tel. +48 22 599 21 98
fax.+48 22 599 21 94
e-mail: [email protected]
przedstawione zostały klarownie, w seriach oceniających kompleksowo badane zjawisko,
każda z nich opatrzona została krótkim podsumowaniem, czasem również interpretacją
uzyskanych rezultatów na tle dostępnej literatury. Uwagi do tej części rozprawy
pozwoliłam sobie wypunktować poniżej. Dyskusja wyników jest wyczerpująca i
merytoryczna, co potwierdza dobre przygotowanie naukowe Doktorantki. Wnioski z
przeprowadzonych badań zostały wyciągnięte poprawnie. Piśmiennictwo obejmuje 210
pozycji, zdecydowana większość przytaczanych artykułów została opublikowana w ciągu
ostatnich 5 lat w prestiżowych recenzowanych, anglojęzycznych czasopismach.
Odniesienia do światowej literatury zostały przygotowane prawidłowo i wspierają treść
rozprawy.
We
wstępnych
badaniach
Doktorantka
dokonała
re-analizy opublikowanych
wcześniej danych mikromacierzowych dotyczących profilu ekspresji genów w blastach
białaczkowych wrażliwych i opornych na glikokortykosteroidy i zidentyfikowała szlak
MAPK/ERK jako nadmiernie aktywny w komórkach opornych. Następnie oceniła
aktywację tego szlaku w posiadanych przez Nią ustalonych ludzkich liniach
komórkowych
ostrej
białaczki
limfoblastycznej
wrażliwych
i
niewrażliwych
na
glikokortykosteroidy oraz działanie inhibitora kinazy MEK1 na te komórki. W kolejnych
badaniach wprowadziła do komórek OBL steroidowrażliwych gen dla konstytutywnie
aktywnej kinazy MEK1, co spowodowało oporność tych komórek na deksametazon. W
kolejnych doświadczeniach Doktorantka zaobserwowała między innymi indukcję
ekspresji proapoptotycznego białka BIM oraz nasilenie autofagii w komórkach OBL
inkubowanych
deksametazonem
i
selumetynibem
w
porównaniu
do
komórek
kontrolnych, jak i inkubowanych pojedynczo z wymienionymi substancjami. Ponadto,
udowodniła, że wzmożenie autofagii w omawianych komórkach prowadzi do ich śmierci i
jest zależne, przynajmniej częściowo, od zwiększenia w nich ilości białka DEPTOR i
związanej z nim inaktywacji kompleksu białkowego mTORC1. Na koniec swoje
obserwacje Doktorantka częściowo potwierdziła w pierwotnych blastach białaczkowych
izolowanych od chorych na OBL.
Warto podkreślić, że Doktorantka w swojej rozprawie przedstawia „kompletną
historię” – od obserwacji w odpowiednio dobranych modelowych liniach komórek
nowotworowych, poprzez wyjaśnienie jej molekularnego mechanizmu, do potwierdzenia
najważniejszych zjawisk w pierwotnych komórkach nowotworowych. Z przykrością
muszę zauważyć, że w większości polskich rozpraw doktorskich wciąż jest to rzadkość.
2
Tym bardziej całościowe podejście do badanego zjawiska pani Anny Polak zasługuje na
podkreślenie.
Wyniki przedstawione w przesłanej mi do recenzji rozprawie nie zostały do tej pory
opublikowane w formie oryginalnego artykułu, co stanowi w mojej ocenie jej największy
mankament, o ile w ogóle można o takowym mówić. Ponadto, nie znalazłam w bazie
PubMed żadnej publikacji autorstwa Doktorantki. Uzyskane przez panią Annę Polak
wyniki były przedstawiane na najwyższych rangą konferencjach hematologicznych, jak
Kongres Europejskiego Towarzystwa Hematologicznego (EHA, 2014, Mediolan, Włochy)
czy International Conference on Malignant Lymphoma (2015, Lugano, Szwajcaria).
Podczas lektury rozprawy doktorskiej pani Anny Polak nasunęły mi się następujące
pytania i przemyślenia:
1. Co zadecydowało o wyborze 200 nM stężenia selumetynibu do badań w
ustalonych liniach komórkowych OBL? Czy Doktorantka sprawdzała wpływ
mniejszych stężeń tego związku na fosforylację ERK i p90RSK? Czy
zastosowane przez Nią stężenie było najmniejszym z działających (na rycinie
6b widać, że stężenie 100 nM porównywalnie do stężenia 200 nM zmniejsza
żywotność komórek linii SEMK2)?
2. Co zadecydowało o wyborze 72-godzinnej ko-inkubacji glikokortykosteroidów
z selumetynibem? Czy Doktorantka oceniała indukcję apopotozy w badanych
komórkach w innych przedziałach czasowych?
3. Jak Doktorantka skomentuje skuteczność selumetynibu w komórkach OBL
wykazujących ekspresję zmutowanych genów dla MEK1 (F129L oraz Q56P)?
Emery CM i wsp. w swojej pracy z PNAS z 2009 r. pokazują, że mutacja
F129L utrudnia wiązanie selumetynibu do centrum katalitycznego MEK1.
Dlaczego zatem nie utrudnia ona wiązania badanego związku w komórkach
OBL? Czy, aby dokładniej przyjrzeć się temu zjawisku, nie należałoby
dokonać ekspresji MEK1 z podstawieniami F129L oraz Q56P na tle
wyciszenia genu dla dzikiej kinazy MEK1?
4. Na
rycinie
9
(wynik
analizy
Western
blot
oceniającej
ekspresję
proapoptotycznego białka BIM) zabrakło wyjaśnienia, co znaczą skróty BIMEL,
BIML i BIMS. Nie znalazłam go również w rozdziale dotyczącym metodyki
Western blot.
Doktorantka nie ustrzegła się nielicznych, drobnych błędów językowych, jak dla
przykładu: „pacjenci OBL” (str. 50), „wzrost poziomu białka” (str. 55).
3
W podsumowaniu chciałabym podkreślić, że przedłożoną mi do recenzji rozprawę
oceniam wysoko, a powyższe uwagi są jedynie przyczynkiem do dyskusji z Doktorantką.
Oceniana przeze mnie rozprawa doktorska spełnia warunki określone w art. 13 Ustawy z
dnia 14 marca 2003r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule
w zakresie sztuki (Dz.U.nr 65,poz.595 z późn.zm.). W związku z tym zwracam się do
Wysokiej Rady o dopuszczenie mgr Anny Polak do dalszych etapów przewodu
doktorskiego.
dr hab. med. Dominika Nowis
4