Prof. dr hab. Andrzej Skoczowski Kraków, dnia 31 grudnia 2016 r

Prof. dr hab. Andrzej Skoczowski
Uniwersytet Pedagogiczny
im Komisji Edukacji Narodowej
Ul. Podchorążych 2
30-084 Kraków
Kraków, dnia 31 grudnia 2016 r.
Ocena
rozprawy doktorskiej mgr Magdaleny Kingi Szwed
pt. ”Allelopatyczny wpływ gryki zwyczajnej (Fagopyrum esculentum Moench)
na procesy metaboliczne niektórych chwastów”
napisanej pod kierunkiem prof. dr hab. Marcina Horbowicza.
Wzajemne oddziaływania pomiędzy roślinami były znane i opisywane od ponad
dwóch tysięcy lat. Jednak zjawisko to zostało zdefiniowanie jako „allelopatia”
dopiero w latach 30-tych XX wieku. Pojęcie „allelopatia” wprowadził do
literatury w 1937 roku austriacki fizjolog roślin Hans Molisch w swojej książce
zatytułowanej „Der Einfluss einer Pflanze auf die andere – Allelopathie”.
Zjawisko allelopatii występuje powszechnie w różnych ekosystemach,
zarówno naturalnych, jak i zagospodarowanych. Prawdziwy rozkwit badao nad
tym zagadnieniem nastąpił wraz z rozwojem technik ekstrakcji, izolacji
i identyfikacji związków chemicznych. Aspekt poznawczy dotyczył głównie
chwastów i roślin uprawnych. Coraz więcej wskazywało na to, że organizmy te
wprowadzają do środowiska substancje chemiczne, które mogą byd toksyczne
zarówno dla nich samych, jak i dla innych gatunków. Negatywne efekty
oddziaływao allelopatycznych ze szczególnym nasileniem występują
w uprawach monokulturowych. Dowiodły tego wyniki kompleksowych badao
nad ekologicznymi procesami, które zachodzą w monokulturowych uprawach
zbóż. W ostatnich latach potencjalne wpływy allelopatii na rolnictwo są
intensywnie badane i dotyczą możliwości wykorzystania roślin uprawnych
wykazujących potencjał allelopatyczny w celu zahamowania wzrostu chwastów
w agrocenozach.
1
Obecnie trwają bardzo intensywne poszukiwania związków, które
mogłyby znaleźd zastosowanie jako naturalne herbicydy. Jest to spowodowane
kilkoma bardzo istotnymi względami. Po pierwsze syntetyczne herbicydy są
szkodliwe dla środowiska. Po drugie obecnie mamy do czynienia z wieloma
gatunkami chwastów, które uodporniły się na znane i używane do tej pory
środki ochrony roślin. Po trzecie bardzo słabo rozwija się synteza nowych
herbicydów o innych mechanizmach działania, niż te, które zostały dotychczas
poznane. Wszystkie te czynniki spowodowały wzrost zainteresowania nowymi
sposobami walki z niepożądanymi wśród upraw chwastami. W nurt tych badao
wpisuje się praca mgr Magdaleny Kingi Szwed.
Praca liczy 175 stron i ma układ prawie typowy dla prac doktorskich.
Piszę „układ prawie typowy” bowiem w pracach cenzusowych zwykle przegląd
piśmiennictwa poprzedza (bo uzasadnia) cel pracy. W dysertacji Doktorantki
jest odwrotnie, ale to odstępstwo jest oczywiście dopuszczalne. W pracy
zamieszczono 20 rycin, 21 tabel, oraz 332 pozycje piśmiennictwa. Zamieszczone
pozycje są aktualne i adekwatnie przytaczane. Pracę kooczy aneks zawierający
detaliczne wyniki wykonanych analiz statystycznych (wyniki analiz wariancji).
Aneks ten jest moim zdaniem zbędny, ale do tego zagadnienia powrócę
w dalszej części recenzji.
Praca napisana jest, z nielicznymi wyjątkami, bardzo dobrym językiem
i nienagannie przygotowana od strony edytorskiej. W części „przegląd
piśmiennictwa” natknąłem się jedynie na nieliczne błędy i nieścisłości.
I tak na stronach 16 oraz 22 Autorka pisze o roślinach motylkowych. Jest
to nieaktualne już określenie roślin z rodziny bobowatych (rząd bobowce).
Wybaczam jednak ten błąd bowiem częste zmiany systematyki botanicznej
powodują, że w środowisku fizjologów roślin funkcjonują nadal, dobrze
utrwalone, stare nazwy botaniczne.
Na str. 21 Doktorantka napisała, że „odmiany ryżu o właściwościach
alopatycznych charakteryzowały się obecnością w glebie mniejszej liczby
drobnoustrojów niż odmiany nie posiadające takich właściwości”. Myślę, że to
jedynie niezręcznośd. Odmiana jakiejś rośliny może powodowad zmniejszenie
ilości drobnoustrojów w glebie, ale nie traktowałbym tej właściwości jako cechy
charakteryzującej odmianę.
2
Przechodząc do omówienia części „Materiał i metody” pragnę zauważyd,
że Autorka wykonała ogrom pracy eksperymentalnej z wykorzystaniem
różnorodnych technik analitycznych. W ww. części pracy Doktorantka nie
ustrzegła się jednak drobnych błędów i nieścisłości.
Moja pierwsza uwaga dotyczy wprowadzonego przez Doktorantkę
określenia „wariant doświadczenia” (po raz pierwszy na str. 43).
W podrozdziale 4.2 pt. „Biotesty” opisane są dwa warianty doświadczenia: in
vitro (na bibule) oraz w glebie (czyli zmienne bibuła lub gleba). Natomiast
w podrozdziale 4.2.2. pt. „Testy glebowe” (str. 45) Doktorantka wprowadza
ponownie dwa warianty badao. Tym razem wariant I to gleba zawierająca całe
rośliny gryki oraz wariant II – gleba zawierająca wyłącznie korzenie tej rośliny
(czyli wg. mnie zmienne to rodzaj tkanek donorowych – cała roślina lub korzeo).
Nie robiłbym z tego powodu problemu gdyby nie fakt, że Doktorantka w dalszej
części pracy używa w analizie statystycznej terminu „wariant doświadczenia”
ukrywając pod tym terminem różne zmienne. I tak np. na stronach 59 (Tabela
1), 60 (Tabela 2), 62 (Ryc. 3) wariant doświadczenia to traktowanie badanych
roślin wodą lub 1% ekstraktem z gryki (czyli zmienne to stężenie ekstraktu –
0 lub 1%). Opisane postępowanie nie prowadzi oczywiście do błędów
w rozumowaniu Autorki przy omawianiu wyników, ale stwarza czytelnikowi
problemy w rozszyfrowaniu, o wpływ jakich zmiennych Doktorantce w danym
momencie chodzi.
Napisałem wcześniej, że zamieszczony w pracy Aneks uważam za
niepotrzebny. Jednym z powodów jest właśnie fakt, że na 18 zamieszczonych
w nim tabel tylko w trzech nie ma określenia „wariant doświadczenia”. Szkoda,
że Autorka zamiast używad słowa „wariant” nie posłużyła się określeniami
„rodzaj podłoża”, „rodzaj tkanki donorowej” czy wreszcie „stężenie ekstraktu”
(0 – kontrola lub 1%). To bardzo ułatwiłoby lekturę. Oczywiście „wariant
doświadczenia” jako nazwa zmiennej w analizie wariancji to rzecz
dopuszczalna, tyle tylko, że nie niesie informacji biologicznej. Ponadto nie
zawsze pokazywanie szczegółowych wyników analizy wariancji (zwłaszcza
wieloczynnikowych) ma sens. Większośd tych danych nie nadaje się do
jednoznacznej interpretacji fizjologicznej lub brzmi bardzo niezręcznie. Np. str.
84 Autorka napisała – „Również interakcja gatunku i organu roślinnego nie
modyfikowała zawartości karotenoidów w badanych roślinach”. Powiem
3
szczerze nie znam takich mechanizmów regulacji zawartości karotenoidów
w roślinach. A jaka korzyśd płynie z informacji, że liście chwastnicy
jednostronnej rosnącej w glebie z dodatkiem całych roślin gryki mają większą
przepuszczalnośd błon plazmatycznych niż liście przytulii czepnej rosnącej
w glebie z dodatkiem korzeni z gryki (Ryc. 15)? A jak Doktorantka zinterpretuje
dane z załącznika nr 10 (str. 167), w którym wykazuje istotnośd interakcji
„Gatunek x Organ rośliny x Wariant doświadczenia x Rodzaj kwasu
tłuszczowego). Jestem przekonany, że nie zinterpretuje – ja też nie potrafię.
Koocząc ten przydługi wywód mam nadzieję, że Doktorantka przygotowując
materiał do publikacji uwzględni powyższe uwagi, a przede wszystkim
powstrzyma się od zamieszczania tak szczegółowych danych wynikających
z analizy statystycznej. O tym , że są one mało przydatne świadczy najlepiej
fakt, że Autorka sama ani razu nie nawiązuje do tych danych w dyskusji.
Z obowiązku recenzenta muszę podkreślid, że zastosowane metody
statystyczne są prawidłowe, a zamieszczone w tabelach i na rycinach wyniki
analizy testu post-hoc są absolutnie wystarczające.
Podając warunki wirowania w różnych procedurach analitycznych
zamieszczonych w omawianym rozdziale Doktorantka raz podaje obroty na
minutę (np. str. 47), a innym razem wielokrotnośd przyspieszenia ziemskiego
(str. 48). Oczywiście warunki wirowania można podawad na dwa sposoby, ale
w pierwszym przypadku konieczne jest podanie typu wirówki i typu rotora
(tylko to umożliwia bowiem powtórzenie warunków wirowania w innym
laboratorium). W przypadku podania wartości „g” warunki wirowania są zawsze
możliwe do odtworzenia poprzez skojarzenie średnicy rotora i prędkości
kątowej na dowolnej wirowce. Ponadto na str. 57 (podrozdział 4.4.2.3.3
Zawartośd antocyjanów) Autorka myli prędkośd kątową z wielokrotnością
wartości przyspieszenia ziemskiego (12.000g to nie prędkośd). Ja wiem, że
w przypadku, gdy chodzi po prostu o sklarowanie roztworu wartośd „g” ma
drugorzędne znaczenie, ale dla porządku trzeba jednak trzymad się przyjętych
zasad przy opisie procedur analitycznych.
Autorka używa też zamiennie określeo „próba zerowa” (str. 46), „próba
ślepa” (str. 51) lub „próba ujemna” (str. 52). Przypuszczam, że chodzi o to
samo, czyli o próbę ślepą (lub inaczej kontrolną), ale i tu trzeba przyjąd jednolity
sposób przekazu.
4
Z drobniejszych spraw to określenie „worteksowano” nie jest moim
zdaniem najszczęśliwsze (nie brzmi dobrze po polsku). Vortex laboratoryjny to
po prostu typ wytrząsarki i można przecież napisad, że próbki wytrząsano na
worteksie.
Zasada oznaczanie całkowitej zawartości fenoli (str. 46) oparta jest na
reakcji utleniania (a nie redukcji) przez fenole molibdenu (IV) do molibdenu
(V). Natomiast wolne formy związków fenolowych wydzielano, jak sądzę, przez
rozpuszczenie osadów w jakimś roztworze kwasu (bo pH = 2), a nie w wodzie
jak napisała Doktorantka na str. 47.
Przy opisie uzyskanych w pracy wyników Doktorantka bardzo często
określa zmiany zawartości badanych związków chemicznych jako „zmiany
poziomu fenoli” (str. 59), zmiany „poziomu białka” (str. 62) itd.. Ja wiem, że
używając słowa „poziom” podświadomie stosujemy tłumaczenie angielskiego
„level” wszechobecnego w publikacjach zachodnich. To, że w publikacjach
angielskojęzycznych używa się określenia „level” nie oznacza poprawności
opisu zmian zawartości czy też stężenia jakichkolwiek substancji. „Poziom” nie
ma wymiaru (inaczej jednostki). A zatem, zmiana poziomu informuje jedynie
o tym, że jakaś wartośd uległa zmianie, ale nie wiadomo czy chodzi o ilośd,
zawartośd czy też o stężenie. Określenie „poziom” to jest kolokwializm.
Stosowanie kolokwializmu w innej niż potoczna formie wypowiedzi jest błędem
językowym, a Doktorantka prezentuje rozprawę naukową. Dziwi więc, gdy
doktorantka w Tabeli 1 pisze poprawnie „Zmiany całkowitej zawartości
związków fenolowych (mg w 100 cm3)…”, a w tekście niepoprawnie „zmiany
poziomu fenoli”, lub na Ryc. 3. pisze o zawartości białka (opis osi „Y” oraz
podpis pod ryciną), a w tekście „poziom białka” (str. 62). Nie poświęcałbym tej
sprawie tyle miejsca gdyby nie fakt, że Doktorantka stosuje, krytykowaną
przeze mnie terminologię, nagminnie. Mam nadzieję, że moje pouczenia
przydadzą się podczas ewentualnego opracowywania wyników do publikacji.
Przy omawianiu uzyskanych w pracy wyników Doktorantka kilkakrotnie
pisze, że np. (str. 62): „wykazano zwiększony o 26,7%, jednak nieistotny
statystycznie, poziom białka”. Podobnie, na str. 85 czytamy: „…wykazano
zwiększony wyciek elektrolitów z komórek, który osiągnął wartości o 17,0%
oraz 37,9% wyższe niż u roślin kontrolnych…. Uzyskane rezultaty nie były jednak
istotne statystycznie”. Podobnie str. 87 – dane odnośnie peroksydacji lipidów,
5
lub na str. 88 – dane na temat „akumulacji” kwasu palmitynowego, których „nie
potwierdziła analiza statystyczna”. Jeśli nie stwierdzono istotności statystycznej
to nie było wzrostu ani spadku wartości. W takiej sytuacji porównywane
wielkości są podobne w granicach założonego błędu statystycznego
i omawianie o jaki procent wzrosła albo zmalała ich wartośd nie ma sensu. Aby
móc jednoznacznie powiedzied co jest, a co nie jest od siebie różne
Doktorantka naprawdę mocno się napracowała wykonując skomplikowane
analizy statystyczne. Po co to psud?
W kilku miejscach pracy Doktorantka odnosi wyniki swoich badao do
czasu „trwania doświadczenia” lub inaczej „trwania eksperymentu” (np.
podrozdział 5.1.3.2 – opis wyników i podpis pod Ryc. 3 – 7). Takie podejście
uważam za niewłaściwe bowiem zmienną fizjologiczną jest czas wzrostu roślin
(2 lub 5 dni), a nie czas prowadzenia doświadczenia. Pomimo tej samej liczby
dni różnica znaczeniowa ogromna. Ta samo dotyczy danych pokazanych na
stronach 93-96 dotyczących zmian całkowitej aktywności antyoksydacyjnej
i aktywności peroksydazy.
Nawiasem mówiąc sposób prezentacji danych z wymienionych powyżej
eksperymentów (Ryc. 18 i 19) uważam za znacznie lepszy od poprzednich.
Odrębne pokazanie reakcji badanych gatunków na skład podłoża jest
korzystniejsze. Istotą prowadzonych badao jest bowiem to czy kierunek zmian,
w odpowiedzi na skład chemiczny podłoża, jest taki sam u przytulii czepnej jak
u chwastnicy jednostronnej. Porównywanie wprost przytulii z chwastnicą jest
mniej interesujące. Można spodziewad się różnic gatunkowych w składzie
chemicznym i to bez skomplikowanych analiz statystycznych.
Drobne uwagi edytorskie mam do zamieszczonych w pracy dużych tabel
(nr 4 oraz 10 – 15 i następnych). Tabele te byłyby z pewnością bardziej czytelne,
gdyby Autorka zdecydowała się pominąd pokazane w nich błędy standardowe.
Pokazywanie błędu nie jest moim zdaniem absolutnie konieczne kiedy wartości
opatrzone są symbolami literowymi wynikającymi z analizy testów post-hoc.
Nawiasem mówiąc pokazane błędy są minimalne, można było podad, że nie
przekraczały np. x% wartości średniej i to załatwiłoby problem, a czytelnośd
tabeli byłaby znacznie lepsza. Uwaga ta jest jednak czysto techniczna, a sposób
przedstawienia wyników w omawianych tabelach należy uznad za prawidłowy.
6
Z innych drobiazgów to oznaczenia chlorofili a i b powinny byd pisane
kursywą (str. 82 i następne). W nagłówkach do niektórych tabel wkradł się błąd
– wartości „p” powinny byd mniejsze, a nie większe od 0,05 (np. Tabela 16 i 21).
Moje największe wątpliwości budzą dane dotyczące profilu kwasów
tłuszczowych. Po pierwsze używanie słowa „akumulacja” kwasu stearynowego
czy też innego, de facto dowolnego, kwasu tłuszczowego jest niepoprawne.
W takich organach jak liście, epikotyle lub łodygi kwasy tłuszczowe występują
głównie w cząsteczkach fosfo- lub gliko- lipidów budujących błony biologiczne.
Trudno zatem mówid o akumulacji kwasów tłuszczowych. Jeśli akumulacja to
gdzie? Po drugie niepokoi fakt niewykrycia przez Doktorantkę kwasu
linolenowego (18:3) w tkankach badanych roślin. Przyznam szczerze, że badając
przez wiele lat zmiany składu kwasów tłuszczowych w tkankach różnych roślin
(z glonami włącznie) nie spotkałem się z brakiem kwasu 18:3 w składzie
kwasów tłuszczowych, którego zawartośd sięga zazwyczaj od kilku do kilkunastu
procent. Będę zatem wdzięczny Doktorantce za wyjaśnienie tego zjawiska.
Nawiasem mówiąc płynnośd błon biologicznych jest oczywiście funkcją
stosunku sumy kwasów nienasyconych do nasyconych, który oblicza Autorka,
ale przyjmuje się, że głównie zależy ona od wartości stosunku kwasów
18:3/18:2 w lipidach polarnych. A kwasu 18:3 brak!
W tabelach 16 oraz 21 Doktorantka pokazuje ujemną korelację pomiędzy
wzrostem badanych chwastów a, odpowiednio, zawartością fenoli lub
flawonoidów w liściach. Ta informacja mnie nie zaskakuje. Jestem wręcz
zaskoczony, że Doktorantce udało się tak ładnie udowodnid te relacje.
Ponieważ Doktorantka nie dyskutuje tych wyników (przynajmniej ja nie
znalazłem ich w dyskusji) proszę, aby wyjaśniła fizjologiczne przyczyny tej
zależności.
Rozdział „Dyskusja” został bardzo zgrabnie napisany i dobrze się go czyta.
Niepokój mój budzi jedynie brak odniesieo do faktu niewykrycia przez Autorkę
kwasu linolenowego w tkankach badanych roślin. Mam nadzieję, że zostanie to
jednak wyjaśnione podczas obrony pracy.
7
Wniosek końcowy
Niezależnie od zawartych w recenzji uwag krytycznych, dotyczących głównie
kwestii językowych oraz różnic w podejściu do określeo nomenklaturowych
stwierdzam, że treśd i forma przedstawionej rozprawy pt. ”Allelopatyczny
wpływ gryki zwyczajnej (Fagopyrum esculentum Moench) na procesy
metaboliczne niektórych chwastów”, spełnia wszystkie warunki stawiane
rozprawom doktorskim zgodnie z ustawą z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach
naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki.
W związku z tym wnioskuję do Rady Wydziału Przyrodniczego
Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistycznego w Siedlcach o dopuszczenie
mgr. Magdaleny Kingi Szwed do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
Prof. dr hab. Andrzej Skoczowski
8