1.2. interpretacja obrazów mikr.oskopowych

1.2. INTERPRETACJA OBRAZÓW MIKR.OSKOPOWYCH
Komórki są trójwymiarowe. W mikroskopie widzimy je w postaci obrazu płaskiego. Do obserwacji w mikroskopie zwykle przygotowuje się z komórek
cienkie skrawki, które są jedynie wycinkiem komórki. Naw~t wtedy, gdy oglą­
damy całe komórki w mikroskopie świetlnym, w miarę zwiększania powiększenia
zmniejsza się głębia ostrości i oglądamy wyrainie równiet jedynie określoną
płaszczyznę w obrębie komórki, tak zwany przekrój optyczny. Pod mikroskopem
widzimy wobec tego obraz płaski, dwuwymiarowy z reguły ,pewnego wycinka komórki. Gdy grubość wycinka zbl;2a się do zera~ oglądamy przek~ój ' komórki.
Z tych przekrojów wnioskujemy o trójwymiarowym wyglądzie komórki.
Przy pomiarach przekrojów struktur dokładność wzrasta, gdy grubość skraw~
ka maleje. Zmniejszenie grubości skrawków ograniczone jest przyczynami tech~
nicznymi. Z jednej strony ograniczeni jesteśmy m02liwością mikrotomu, a
z
drugiej - maleją c ym kontrastem między tłem a strukturą w zbyt cienkich skrawkach . W pra ktyce wybiera się opt y malną grubo ść skrawków, różną w badaniach
różnych obiektów różnymi metodami.
Wa ż ną strukturą komórki j est błona, stanowiąca i st otny składnik
różnych
organelli komór kowych . W mikroskopie świetlnym jest ona widoczna jedynie
jako granica między różnym i optycznie prze strzeniami . W mikroskopie
elektronowym, przy standardowej obróbce preparatu (utrwalanie' aldehydem glutarowym i czterotlenkiem osmu, kontrastowanie solami ołowiu i ,uranylu) , ,bl-ona,'
priekrojona prostopadle do powierZChni daje obraz w postaci dwóch równoleg łych warstw elektronowo gęstych ziarni s toś c i przedzielony c h warstwą o mniej szej gęstości (ryc. 6) . Gru~ość całości wynosi około 7 , 5 nm . ~
nie~tóryc~
błonach jedna lub obie warstwy elektron owo gęste mogą być pogrubi~ ne :
Na
obrazach mniej powiększonych warstwy te ziewaję się 'w j' edną ele ktrOri"ó'w'o " gę- '
stą
o •
••
Ss
o.,
.::-
::;:
',.
....
:..:
~.'.'
warstwę .
'.'
,.
•
..., ..."....
.~.:~~~}.
' .~ , ...
'"~'P.fP:""
·. ..' ... .'' ........
., .'
.
..'." ...
.
'.
. . . .. .. .." .
•
~~
•
~~
'
.· .. .,...
"
~.
...
•
•
2
;
•
,
1I
nm
3,5
'. .
" '
~4:f.:;;P.'Jff!łf~~ł\lji
•
"
•
········Wł~(f'···· ·~X
•
"II•
,, "
2
•
Ryc.6. Schematyczny obraz poprzecznego przekrOju błony oglądanej w mikroskopie
elektronowym po utrwaleniu czterotlenkiem osmu
Obraz błony przeds~awia się 'r ó żnie w zależno ś ci od kąta nachylen i a powierzchni błony do powierzchni pr zekroju. Ilu s tracją tego j est r yc ina 7 .
Na przekroju prostopadłym do powi e rz c hni błona tworzy ostro
ograniczoną
linię gęsto uło ż ony c h ziarni s tośc i . Na prz e krojach sko ś nych tworz y zna c znie
s zerszą, mniej ostro zaznaczoną linię bardZiej rozproszonych
ziarnistości .
, Wreszcie na przekroju równoległ y m widać rzadko rozpros zone ziarnisto ś ci
i
błona staje się niewidoczna. Ta różnorodnoś ć obrazów błon w mikrOSKopie e lektronowym powoduje pewien błąd w ich oc enie. Nawet gdy błona jes t
dobrze
widoczna, trudno czasami wnioskować o kształcie bryły otoczonej błoną.Obraz
w posta c i pierścienia może dać za~ ówno przekrój przez pęcherzy k , jak i przekrój przez cewkę.
, Do k ładny obraz konkr e tnej stru ktury uz ys kuje
się
wted y , gdy wy kona się
s erię \skrawków ~bej;ującę 7~łę-;t;;:kt~;ę:- 'zt;kiC-h- -;k'r;;'wkÓ~ o ż na--;-yk~;;a'ć-'
model ~.t tukt;:;;;~OdPOWi;dniOpoW i ęks'z'óne· obr a zy skrawków przenosi się na
' PłYtk1-"Z-'wo-s'k u modelowego tyle razy grubs ze od skrawków, ile wyn os i po-
Ryc.7. Schematyczny obraz błony oglądanej w mikroskopie elektronowym w zależno ści
od kąta nachylenia powierzchni błony; u góry - przekrój, ' u dołu - iilidQk skrawka i błony
z boku
większenie obrazu . W płytkach wycina się zarysy struktur i odpowiednio
ze s tawia wycinki . W ten sposób powstaje powiększony model struktury .
Przedstawiony wyżej obraz błony oglądanej w mikroskopie
elektronowym
jest typowy dla kaŻdej błony komórki, ale niewiele mówi o jej funkcjonowaniu.
tym dowiadujemy się między innymi z właściwości składników , błony. W
skład błon wchodzą polarne lipidy i białka . Wyekstrahowane lipidy błon, gdy
rozdzielają dwa roztwory wodne, układają się samorzutnie w podwójną warstewkę cząstecze k zwróconych grupami polarnymi na zewnątrz do roztworów wodnych,
jest
a ł ańcuchami hydrofobowymi do środka. Taka dwucząsteczkowa warstewka
termodynamicznie stabilna i może być zrębem strukturowym błony. Tak
samo
układają się cząsteczki lipidów w błonach komórk~ (ryc. BA). Część
białek
przylega do powierzchni błony lipidowej . Są to białka powierzchni~we, zwią­
zane siłami jonowymi. Inne białka zagłębiają się w błonę, sięgając z jednej
strony błony na drugą . Są to białka integralne,wiązane siłami hydrofobowymi.
Wiele informacji o budowie błony uzyskano dzięki technice łamania zamrożonych preparatów. Kroplę zawiesiny komórek lub wyizolowanych błon
zamraża
się gwałtownie na miedzianym stoliku i uderzeniem noża odłamuje jej
część
( ryc. 9A). Powierz c hnię łamania części kropli pozostającej na stoliku napyla się rozproszonym atomowo węgl e m i pod ,kątem 45 0 platyną. Węgiel
tworzy
trwałą warstewkę przylegającą szczelnie
do powierzchni łamania. Warstewk~
°
A
B
~d"
"
i.
i
"
I
Yc .12. Siatki pOl1liarowe do pomiarów stereologicznych: A - siatka równoległych linii biegę c ych w odległości d w dwóch prostopadłych do siebie kierunkach, B - układ linii o - długo­
ści d rOzrzuconych losowo
I
l i teratura
e i b e l E.R . , 1973, Stereological techniques for electron
microscopic morphometry, w: Principles and techniques of electron microscopy
( red. M.A . Hayat) . Van Nostrand Reinhold Co., New York.
e i b e l E.R., 1980, Stereological methods. ; 01. l, Practical methods
for bi ological morphometry. Vol. 2, Theoretical foundations . Academic Press.
London.
POMIAR OBJĘTOŚCI WZGLĘDNEJ BRYŁ
W celu zmierzenia przekrojów brył wykonuje się na przezroczystej płytce
dwóch grup równoległych linii ustawionych względem siebie prostoJadle . Linie rozmieszczone sę w identycznych odległościach - równych
d
~ ryc. 12 ). Miejsca przecięć
linii siatki twortę system równomiernie rozlieszczonych punktów . Najmniejsza odległość między punktafT!,i d jest
równa
Jdległości między liniami. Każdy punkt siatki reprezentuje identycznę
po,ierzchnię równę d 2 . Siatk~ nakłada się na zdjęcia przekroju komórki
li; zy liczbę punktów Pi w obrębie interesujęcej nas struktury i ~raz
liczbę
Junktów P w obrębie całego przekroju, np. komórki. Objętość względną strukt u~y określa równanie
i iatkę
(6)
gdzie: Vv jest objętością względną struktury i, Pi - sumaryczną liczbą
punktów iznajdującYCh się w obrębie przekrojów struktury i, P - sumaryczną liczbą punktów znajdujących się w obrębie całego przekroju. Powie.kszenie
~djęcia i Odległoścllinii siatki -·~·~ optymalnie dobrane, gdy w
przekrój
pOjedynciej struktury trafia nie więcej nit jeden punkt.
•
s
POMIAR POWIERZCHNI
WZGLĘDNEJ
BŁON
W pomiarach wykorzystuje się liniową zale2ność długości linii przekrobłon od powierzchni błon . Długość linii przekrojów
można
określić
za
omocą kwadratowej siatki pomiarowej przedstawionej na rycinie 12A . ~a ~rze~
roj ac h mierzy się sumaryczną długość wszystkich linit" siafki pomiar'dW'ej "w
brębi e przekroju badanej struktury (tkanki, komórki, cytoplazmy itp.) oraz
iczbę p~zecięć linii siatki pomiarowej z przekrojami błon. Przy obliczaiu wyników korzysta się z następującego wzoru:
ów
sV
=
łl
(7)
L
dzi e: Sv to powierzchnia względna błon w danym obiekcie (tkance, komórc e,
ytoplazmie itp.), I - liczba przecięć linii siatki pomiarowej z przekroami błon, L - sumaryczna długość linii pomiarowych w obrębie przekroju dalego obiektu.
W praktyce nie liczy się przecięć na przekroja c h, lecz na powiększon yc h
,brazach tych przekrojów. Wobec tego długość linii należy po~zielić przez
l owiększenie, natomiast wzór 7 przyjmuje postać:
21
l
J
'a
wag a!
W pomiarach powierzchn i
(B)
powiększenie
błon
należy
zwrócić
uwagę
na trzy iród-
błędu:
M ier ząc powierzchnię błon należy pamiętać o założeniu,
że
przebieg
jest losowy. Gdy błony w komórce są zorientowane w jednym kierunku,
1ależy kierunek linii siatki pomiarowej ustawiać na przekroju w sposób
10iOW y a lb o stosować si a tkę pomiarową o losowym układzie linii (ryc.12B).
b) Błony przekrojone pod ostrym kątem mogą być niewidoczne, co powoduje
~aniżenie wyników.
c) Badania stereologiczne oparte sę na założeniu, że pomiarów dokonuje
,ię na przekrojach dwuwymiarowych . W praktyce skrawki mają
określoną
gruIOŚĆ. Skutkiem
tego błony drobnych struktur (siateczka śródplazmatyczna,
jrzebienie mitochondrialne itp.) mogę być widoczne, mimo że wchodZą
do
należy
3krawka jedynie na małą głębokość (ryc. 13). W takich przypadkach
.prowadzić Odpowiednią poprawkę do wyników (Weibel i Paumgartner,
1978).
Jwagi przedstawione w punkcie b i c mogę spowodować równie2 błęd w ocenie
a)
)łDn
Jbjętości brył.
Ryc.13.
Różne położenie pęcherzyków
padłej
- P w stosunku do skrawka - S. Widok od strony prostodo powierzchni ,skrawania
~ojów zewnętLznej
błony
mitochondLialnej oLaz sumaLyczną długość linii
iatki w obLębie cytoplazmy hepatocytów z mitochondLiami włącznie. Obliczela i dalsze opLacowanie wyników pLzepLowadt jak w ćwiczeniu 21.
~as analizy 10 zdjęć: 70 minut.
n
M a t e
L i a ł:
z mikLoskopu elektLonowego fOLmatu 18 x 24 cm o powiększeniu koń­
lwym 15 000 x jak w ćwiczeniu 20, kwadLatowa siatka pomiaLowa o liniach od19łych o 15 mm, kalkulatoL.
zdjęć
POMIAR
ŚREONICY
STRUKTUR KULISTYCH
Za pomocą steLeologii można określić pneciętną średnicę i inne wy~~i~ ,rX"
:Luktur komóLkowych, jeżeli znany jest ich kształt. Stosunkowo prostym
:zykładem są stLuktury kuliste. 5tLuktuLY innych kształtów wymagają z
Fe- ,
Iły skomplikowanego matematycznego opLacowania wyników.
00 okLeślenia średnicy stLuktuL kulistych posługujemy się idealną kulą
Iko modelem. Kula pokLojona na dużą liczbę skrawków równej gLubości daje
' zekroje o Lóżnej średnicy. Średnice uszeLegowane w klasy według wielko:i dają chaLakteLystyczny histogram (LYC. 14), z któLego wynika, że
li: ebność pLzekLójów wzrasta w miarę zbliżania się do Lzeczywistej
śLednicy
IIi.
Podobnie postępujemy z przekrojami komóLek . Mierzymy na nich średnice
lżej
liczby przekrojów kulistych stLuktur, np. jądeL' i układamy je w
,asy odpowiednich wielkości. Wyniki pLzedstawione gLaficzniedają histogram '
~obny jak na Lycinie 14. Różnica polega głównie na tym, że po przekLocze, ~ najliczniej Leprezentowanej klasy wielkości otLzymujemy mniej
liczne
, ększe pLzekLoje. Odchylenie od waLtości teoretycznych przedstawionych
na
lądeL.
'cinie 14 jest skutkiem pewnych różnic w wielkości poszczególnych
' zeciętną śLednicą j,deL nie jest wobec tego średnica największa
pLzekroiw jak w modelu, lecz śLodek najliczniejszej klasy.
lICZENIE V
Imiar
przeciętnej
średnicy
kulistych
jąder
Do pomiaLów można wykoLzystać zdjęcia z ćwiczenia 18 lub dokonać pomiaiw bezpośLednio na prepaLatach w mikLoskopię z mikLometLem okulaLowym wy:alowanym według skali WzoLcowej (patLz ćw.17).
PomieLz śLednice 750 losowo wybLanych przekrojÓW jądeL . Wyniki zestaw
co najmniej dziesięciu, a najwyżej szesnastu klasach wielkości i pLzedstaw
liczeb, histogLamie, tak jak na rycinie 14. ŚLodek klasy o największej
Iści jest pLzeciętną śLednicą jąder. Dokładniejsze wyliczenie tej śLednicy
okLeślenie błędu standaLdowego wymaga baLdziej skomplikowanych obliczeń .
:as ćwiczenia: 120 minut.
°
Ryc.14. HistogLam
0,2
średnic
0,4
0,6
1
0,8
seryjnych skLawków równej grubOŚCi z idealnej kuli;
liczebność przekrojów w klasie
n
oznacza
m a t e r i a ł:
S P L Z ę t
i
WZOLMikroskop z mikrometLem okularowym,szkiełko podstawowe z podziałką
cową, pLepaLaty mikLoskopowe z wątLoby szczura lub innej tkanki przygotowane jak' w ćwiczeniu 12 i 14, 'papier milimetrowy,.