cobas EGFR Mutation Test

Transkrypt

cobas® EGFR Mutation Test
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
®
cobas DNA Sample Preparation Kit
DNA SP
24 Tests
P/N: 05985536190
EGFR
24 Tests
P/N: 06471463190
UWAGA: Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy wykorzystanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu
nukleinowego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz związanych z nią procesów w ramach
diagnostyki in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje
żadnego patentu ogólnego ani innej licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu.
ZASTOSOWANIE
Test cobas® EGFR Mutation Test jest oparty na reakcji PCR zachodzącej w czasie rzeczywistym, przeznaczony do
jakościowej detekcji i identyfikacji mutacji w eksonach 18, 19, 20 i 21 genu kodującego receptor naskórkowego czynnika
wzrostu (ang. epidermal growth factor receptor, EGFR) w DNA pochodzącym z utrwalonych w formalinie i zatopionych
w parafinie próbek tkanki (ang. formalin-fixed paraffin-embedded tissue, FFPET) niedrobnokomórkowego raka płuca
(ang. non-small cell lung cancer, NSCLC). Test służy do identyfikowania pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca
(ang. Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC), u których guz wykazuje obecność mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu
kodującego EGFR, a także do selekcjonowania pacjentów do leczenia drobnocząsteczkowymi inhibitorami kinazy
tyrozynowej (ang. tyrosine kinase inhibitor, TKI), ukierunkowanymi na gen EGFR. Próbki są przygotowywane przy użyciu
zestawu do ręcznego przygotowywania próbek cobas® DNA Sample Preparation Kit oraz analizatora cobas z 480, który
zapewnia automatyczną amplifikację i detekcję.
PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU
Uaktywnienie się mutacji genu kodującego EGFR następuje głównie w przypadku NSCLC i skutkuje konstytutywną aktywacją
białka EGFR, które wykazuje aktywność kinazy, przyczyniając się tym samym do rozwoju procesu onkogennego.1 Częstość
występowania tych mutacji w niewyselekcjonowanych przypadkach NSCLC wynosi około 10–30%2, 3. Jednak mutacje te
występują najczęściej (choć nie wyłącznie) u niepalących/palących rzadko pacjentek pochodzenia azjatyckiego, u których
w badaniach histopatologicznych wykrywa się gruczolakoraka4.
Dane z badań klinicznych wskazują, że pacjenci z zaawansowanym NSCLC z obecnością uaktywnionych mutacji genu
kodującego EGFR, występujących najczęściej pod postacią delecji w eksonie 19. lub mutacji punktowej L858R w eksonie 21.,
wykazują wysoki odsetek odpowiedzi na leczenie oraz długi okres przeżycia (ang. progression-free survival, PFS) bez
progresji choroby w przypadku terapii lekami TKI o aktywności anty-EGFR, zarówno w ramach leczenia pierwszego, jak
i drugiego rzutu.5-7 Inne, rzadsze mutacje w genie EGFR, takie jak substytucje G719X w eksonie 18., również pozwalają
przewidywać odpowiedź na leczenie środkami anty-EGFR.8-10 Mediana czasu przeżycia pacjentów z NSCLC z obecnością
mutacji w genie EGFR, leczonych TKI o działaniu anty-EGFR, wynosi obecnie około 2 lat11. W aktualnych wytycznych
postępowania klinicznego zaleca się rozważenie u pacjentów z zaawansowanym NSCLC z obecnością mutacji EGFR
wdrożenia terapii TKI o działaniu anty-EGFR jako leczenia pierwszego rzutu12,13.
U większości pacjentów z NSCLC z obecnością mutacji EGFR, leczonych TKI o działaniu anty-EGFR, ostatecznie dochodzi do
progresji choroby. W około połowie przypadków progresji można zidentyfikować pojawienie się wtórnych, opornych mutacji genu
kodującego EGFR, najczęściej mutacji T790M w eksonie 20.14 U niektórych pacjentów te wtórne, oporne mutacje można wykryć
w próbkach pobranych z guzów jeszcze przed leczeniem TKI o działaniu anty-EGFR. Pomimo tego, że w omawianej grupie
chorych nieleczonych TKI odsetek odpowiedzi na leczenie nadal jest wysoki, okres przeżycia bez progresji choroby u tych
pacjentów okazuje się znacznie krótszy niż w przypadku pacjentów z guzami bez wtórnych mutacji8,15.
ZASADY PROCEDURY
Test cobas® EGFR Mutation Test jest oparty na dwóch głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu
pozyskania genomowego DNA z próbek FFPET oraz (2) amplifikacji PCR i detekcji docelowego DNA z użyciem
komplementarnych par primerów oraz znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych. Test jest
przeznaczony do detekcji następujących mutacji:
 Ekson 18.: G719X (G719A, G719C i G719S)
 Ekson 19.: delecje i mutacje złożone
 Ekson 20.: S768I, T790M i insercje
 Ekson 21.: L858R
Detekcję mutacji uzyskuje się w toku analizy PCR za pomocą analizatora cobas z 480. Do każdego przebiegu testowego
włącza się kontrolę mutacji oraz kontrolę ujemną w celu potwierdzenia ważności przebiegu.
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
06356583001-06PL
1
Doc Rev. 6.0
Przygotowanie próbki
Przetwarzanie próbek FFPET oraz izolowanie genomowego DNA wykonuje się za pomocą zestawu do przygotowywania
próbek cobas® DNA Sample Preparation Kit według ogólnej metody ręcznego przygotowywania próbek, opartej na wiązaniu
kwasu nukleinowego przez włókna szklane. Pozbawiony parafiny skrawek próbki FFPET o grubości 5 µm zostaje poddany
lizie przez inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do lizy/wiążącym, który uwalnia
kwasy nukleinowe i chroni uwolniony genomowy DNA przed DNAzami. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której
dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym,
zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania genomowy DNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra.
Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku
wirowania. Zaadsorbowany kwas nukleinowy jest przemywany i poddany elucji roztworem wodnym. Ilość genomowego DNA
określa się spektrofotometrycznie i dostosowuje do ustalonego stężenia dodawanego do mieszaniny do amplifikacji/detekcji.
Następnie docelowy DNA amplifikuje się i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem odczynników do
amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas® EGFR Mutation Test.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
W zestawie cobas® EGFR Mutation Test wykorzystuje się primery określające specyficzne sekwencje par zasad każdej
z mutacji docelowych. W przypadku mutacji G719X w eksonie 18. docelowe są sekwencje liczące od 104 do 106 par zasad;
w przypadku mutacji pod postacią delecji w eksonie 19. docelowe są sekwencje liczące od 125 do 141 par zasad;
w przypadku mutacji S768I w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licząca 133 pary zasad; w przypadku mutacji T790M
w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licząca 118 par zasad; w przypadku insercji w eksonie 20. docelowe są sekwencje
liczące od 125 do 143 par zasad; w przypadku mutacji L858R w eksonie 21. docelowa jest sekwencja licząca 138 par zasad.
Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu kodującego EGFR między primerami; całość genu kodującego EGFR nie
ulega amplifikacji.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Do amplifikacji sekwencji docelowej wykorzystuje się polimerazę DNA Z05-AS1 pochodzącą ze szczepu Thermus species.
Mieszanina reakcyjna PCR jest najpierw podgrzewana w celu zdenaturowania genomowego DNA oraz odsłonięcia sekwencji
docelowych primerów. W miarę ochładzania się mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne hybrydyzują z docelowymi
sekwencjami DNA. Polimeraza DNA Z05 w obecności jonu dwuwartościowego metalu oraz nadmiaru
dezoksyrybonukleotydów (dNTP) wydłuża każdy przyłączony w wyniku hybrydyzacji primer i w ten sposób następuje synteza
drugiej nici DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA, zawierającej regiony genu
kodującego EGFR z docelowymi sekwencjami par zasad. Proces ten powtarza się wielokrotnie, przy czym w każdym z cykli
ilość zwielokrotnionego DNA (amplikonu) ulega podwojeniu.
Zautomatyzowana detekcja mutacji w czasie rzeczywistym
cobas® EGFR Mutation Test wykorzystuje technologię reakcji PCR zachodzącej w czasie rzeczywistym. W tej reakcji każda
swoista dla sekwencji docelowej sonda oligonukleotydowa jest znakowana barwnikiem fluorescencyjnym, służącym jako
reporter, a także cząsteczką pełniącą funkcję wygaszacza absorbującego (wygaszającego) emisje fluorescencyjne
pochodzące z barwnika reporterowego w nienaruszonej sondzie. W trakcie każdego cyklu amplifikacji sonda komplementarna
do sekwencji jednoniciowego DNA w amplikonie wiąże się z nią, a następnie ulega rozszczepieniu pod wpływem polimerazy
DNA Z05-AS1, wykazującej aktywność nukleazy w kierunku od końca 5' do końca 3' łańcucha. Po oddzieleniu się barwnika
reporterowego od wygaszacza wskutek aktywności nukleazy można zmierzyć promieniowanie fluorescencyjne
o charakterystycznej długości fali po wzbudzeniu barwnika reporterowego odpowiednim widmem światła. Do znakowania
mutacji docelowych dla tego testu użyto czterech różnych barwników reporterowych. Produkty amplifikacji sześciu sekwencji
wchodzących w skład genu kodującego EGFR są wykrywane niezależnie w toku trzech reakcji przez pomiar fluorescencji
o czterech charakterystycznych długościach fali w wydzielonych kanałach optycznych.
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikację wybiórczą docelowego kwasu nukleinowego z próbki podczas przeprowadzania testu cobas® EGFR Mutation
Test uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylazy) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP)17.
Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, lecz nie łańcuchów DNA
zawierających tymidynę. Dezoksyurydyna nie wchodzi w skład występującego w naturze DNA, jest natomiast zawsze obecna
w amplikonie wskutek użycia dUTP zamiast trójfosforanu dezoksytymidyny jako jednego z trójfosforanów nukleotydów
w odczynnikach Master Mix; dlatego wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość
zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase
zawarty w odczynnikach Master Mix katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt
dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu
termicznym przy wartościach pH oznaczających środowisko zasadowe łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, w którym
znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny
w temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, zatem nie niszczy on amplikonu docelowego.
Wykazano, że cobas® EGFR Mutation Test dezaktywuje co najmniej 103 kopii zawierającego dezoksyurydynę amplikonu
zmutowanego genu kodującego EGFR na każdą reakcję PCR.
06356583001-06PL
2
Doc Rev. 6.0
ODCZYNNIKI
cobas® DNA Sample Preparation Kit
Zestaw do przygotowywania próbek DNA cobas®
(P/N: 05985536190)
DNA TLB
(DNA Bufor do lizy tkanek)
Bufor Tris-HCl
Chlorek potasu
0,04% EDTA
0,1% Tritonu X-100
0,09% azydku sodu
PK
(Proteinaza K)
Proteinaza K (liofilizowana)
Xn
Proteinaza K
DNA SP
1 x 10 ml
1 x 100 mg
Produkt szkodliwy
DNA PBB
(DNA Bufor wiążący parafinę)
Bufor Tris-HCl
49,6% chlorowodorku guanidyny
0,05% mocznika
17,3% Tritonu X-100
Xn
49,6% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny
Produkt szkodliwy
WB I
(DNA Bufor płuczący I)
Bufor Tris-HCl
64% chlorowodorku guanidyny
Xn
64% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny
1 x 10 ml
1 x 25 ml
Produkt szkodliwy
WB II
(DNA Bufor płuczący II)
Bufor Tris-HCl
Chlorek sodu
DNA EB
(DNA Bufor do elucji)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
FT
(Probówki z filtrem i z zatyczkami)
CT
(Probówki zbiorcze)
06356583001-06PL
24 testy
1 x 12,5 ml
1 x 6 ml
1 x 25 sztuk
3 x 25 sztuk
3
Doc Rev. 6.0
EGFR
(P/N: 06471463190)
EGFR MMX-1
(EGFR Master Mix 1)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
3,13% dimetylosulfotlenku
0,09% azydku sodu
< 0,10% dNTP
< 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1 (bakteryjnej)
< 0,01% enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylazy) (bakteryjnej)
< 0,01% aptameru
< 0,01% primerów sensownych i antysensownych EGFR
< 0,01% sond EGFR znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym
EGFR MMX-2
(EGFR Master Mix 2)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
0,09% azydku sodu
< 0,10% dNTP
< 0,01% aptameru
EGFR MMX-3
(EGFR Master Mix 3)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
0,09% azydku sodu
< 0,10% dNTP
< 0,01% aptameru
MGAC
(Octan magnezu)
Octan magnezu
0,09% azydku sodu
EGFR MC
(EGFR Kontrola mutacji)
Bufor Tris
EDTA
Poli-rA RNA (syntetyczny)
0,05% azydku sodu
< 0,1% plazmidowego DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencje
eksonów: 18., 19., 20. i 21. genu kodującego EGFR
< 0,1% naturalnie występującego DNA genu kodującego EGFR (z hodowli komórkowej)
DNA SD
(DNA Rozcieńczalnik próbki)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
06356583001-06PL
4
24 testy
2 x 0,48 ml
2 x 0,48 ml
2 x 0,48 ml
6 x 0,2 ml
6 x 0,1 ml
2 x 3,5 ml
Doc Rev. 6.0
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
B. Niniejszy test jest przeznaczony do badania próbek FFPET NSCLC.
C. Nie należy pipetować za pomocą ust.
D. Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium.
E. Należy unikać kontaminacji odczynników bakteriami oraz DNA.
F. Należy wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki i odpady, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi,
stanowymi i lokalnymi.
G. Nie wolno używać zestawów po upływie ich dat przydatności.
H. Nie należy poddawać pulowaniu odczynników pochodzących z różnych zestawów lub serii.
I.
Aby zapobiec kontaminacji próbek i odczynników, należy nakładać rękawice i zmieniać je przed wznowieniem pracy
z tymi materiałami.
J.
Aby zapobiec kontaminacji roboczego odczynnika Master Mix (roboczego odczynnika MMX) próbkami DNA, należy
przeprowadzać amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed
przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu właściwego
oczyszczenia należy dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem
podchlorynu sodu, a następnie 70% roztworem etanolu.
K. Odczynniki DNA PBB i WB I zawierają chlorowodorek guanidyny. Jeśli płyn zawierający ten bufor ulegnie rozlaniu, do
czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania płynu
zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia danego obszaru należy użyć najpierw detergentu
laboratoryjnego i wody, a następnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu*. W razie rozlania płynu na powierzchni analizatora
cobas z 480 należy postępować zgodnie ze wskazówkami zamieszczonymi w Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
*UWAGA: Dostępne na rynku typowe płyny wybielające do zastosowania w gospodarstwach domowych zawierają
podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli
uzyskać roztwór 0,5% podchlorynu sodu.
L. Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie
jak określone w dokumentach: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories18 oraz CLSI Document M29-A3.19
M. Odczynniki: DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3, EGFR MC i DNA SD zawierają
azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi,
tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy
spłukać rury dużą ilością zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
N. Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny i podczas używania go należy korzystać z wyciągu chroniącego przed
chemikaliami. Należy go wyrzucać wraz z odpadami chemicznymi zgodnie z przepisami lokalnymi, stanowymi
i federalnymi.
O. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic
jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie
do kontaktu, trzeba natychmiast spłukać dany materiał dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie
działania lecznicze, może dojść do oparzeń. W razie rozlania się materiału należy przed wytarciem rozcieńczyć go wodą.
P. Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie należy ich używać powtórnie.
Q. Nie wolno używać przedmiotów jednorazowego użytku po upływie daty ważności.
R. Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (wybielacza). Czyszczenie
analizatora cobas z 480 należy przeprowadzać zgodnie z procedurami opisanymi w Instrukcji obsługi analizatora cobas
z 480.
S. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury mające na celu zmniejszenie ryzyka kontaminacji analizatora
cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
T. Zaleca się używanie jałowych, jednorazowych pipetorów oraz końcówek pipetorów, niezawierających DNazy.
06356583001-06PL
5
Doc Rev. 6.0
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
A. Nie wolno zamrażać odczynników z wyjątkiem odczynnika PK.
B. Odczynniki: DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT i CT należy przechowywać w temperaturze od 15°C do
30°C. Po otwarciu odczynniki: DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB i PK zachowują stabilność do 8-krotnego
użycia w ciągu 90 dni albo do daty ważności, zależnie od tego, który termin wypada wcześniej.
C. Po dodaniu do odczynnika PK jałowej wody niezawierającej nukleazy niezużyty, rozpuszczony odczynnik PK należy
przechowywać w porcjach o równych objętościach po 450 µl w temperaturze –20°C. Po rozpuszczeniu odczynnik PK
trzeba zużyć w ciągu 90 dni albo do daty ważności, zależnie od tego, który termin wypada wcześniej.
D. Po dodaniu etanolu bezwodnego odczynniki WB I i WB II należy przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C.
Wymienione roztwory robocze zachowują stabilność przez 90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, który
termin wypada wcześniej.
E. Odczynniki: MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3, EGFR MC i DNA SD należy przechowywać
w temperaturze od 2°C do 8°C. Po otwarciu wymienione odczynniki zachowują stabilność do 4-krotnego użycia w ciągu
90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej.
F. Odczynniki: EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 oraz roboczy odczynnik MMX (przygotowany przez dodanie
odczynnika MGAC do odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2, lub EGFR MMX-3) należy chronić przed długotrwałą
ekspozycją na światło.
G. Roboczy odczynnik MMX trzeba przechowywać w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2°C do 8°C. Przygotowane
próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika Master Mix w ciągu 1 godziny od jego przygotowania.
H. Przetwarzane próbki (wyizolowane DNA) są stabilne maksymalnie przez 24 godziny w temperaturze od 15°C do 30°C,
maksymalnie przez 14 dni w temperaturze od 2°C do 8°C, maksymalnie przez 60 dni w temperaturze od –15°C do –25°C lub
po przejściu 3 cykli zamrażania i rozmrażania przy przechowywaniu w temperaturze od –15°C do 25°C. Wyizolowane DNA
powinno zostać poddane amplifikacji podczas okresu przechowywania zalecanego w danych warunkach lub przed
upłynięciem daty ważności zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit użytego do wyizolowania DNA w zależności od
tego, co nastąpi wcześniej.
I.
Amplifikację trzeba rozpocząć w ciągu 1 godziny od chwili dodania przetworzonych próbek i kontroli do roboczego
odczynnika MMX (przygotowanego przez dodanie odczynnika MGAC do odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2,
lub EGFR MMX-3).
DOSTARCZONE MATERIAŁY
A. cobas® DNA Sample Preparation Kit
Zestaw do przygotowywania próbek DNA cobas®
(P/N: 05985536190)
DNA SP
24 testy
DNA TLB
(DNA Bufor do lizy tkanek)
PK
(Proteinaza K)
DNA PBB
(DNA Bufor wiążący parafinę)
WB I
(DNA Bufor płuczący I)
WB II
(DNA Bufor płuczący II)
DNA EB
(DNA Bufor do elucji)
FT
(Probówki z filtrem i z zatyczkami)
CT
(Probówki zbiorcze)
06356583001-06PL
6
Doc Rev. 6.0
B. cobas® EGFR Mutation Test
(P/N: 06471463190)
EGFR
24 testy
MGAC
(Octan magnezu) (zatyczka z żółtym przyciskiem)
EGFR MMX-1
(EGFR Master Mix 1) (zatyczka z białym przyciskiem)
EGFR MMX-2
(EGFR Master Mix 2) (zatyczka ze złotym przyciskiem)
EGFR MMX-3
(EGFR Master Mix 3) (zatyczka z turkusowym przyciskiem)
EGFR MC
(EGFR Kontrola mutacji) (zatyczka z czerwonym przyciskiem)
DNA SD
(DNA Rozcieńczalnik próbki)
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
 Ksylen (Sigma, nr kat. 247642 lub Fisher Scientific, nr kat. X5-4 albo odpowiednik)

Etanol bezwodny (Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat. BP2818-500 albo odpowiednik)

Izopropanol (Sigma, nr kat. 190764 lub Fisher Scientific, nr kat. A451-1 albo odpowiednik)

Jałowa woda niezawierająca nukleazy (Applied Biosystems, woda o stopniu czystości odpowiednim do PCR,
nr kat. AM9937, lub Thermo Scientific, woda o stopniu czystości odpowiednim do zastosowań w biologii molekularnej,
nr kat. SH-3053801 albo odpowiednik)

Jałowe, jednorazowe pipety serologiczne: 5 i 25 ml

Płytka z mikrodołkami (płytka AD) systemu cobas® 4800 i folia uszczelniająca (Roche P/N 05232724001)

Aplikator folii uszczelniającej cobas® 4800 (Roche P/N 04900383001)

Pipetory zmiennopojemnościowe* (pojemność 10 µl, 20 µl, 200 µl i 1000 µl) z barierą aerozolową lub końcówkami
z wyrzutnikiem, niezawierającymi DNazy

Rękojeść pomocnicza do pipety: (Drummond, P/N: 4-000-100 lub jej odpowiednik)

Mikrowirówka stojąca laboratoryjna, umożliwiająca wirowanie z przyspieszeniem 8000 x g oraz od 16 000 do 20 000 x g
(Eppendorf 5417C lub jej odpowiednik)**

Dwa (2) suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki do temperatury 56°C i 90°C**

Jałowe probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml, niezawierające RNazy/DNazy, odpowiednie do
PCR (Eppendorf, nr kat. 022363212)

Spektrofotometr UV-Vis (NanoDrop ND-1000, ND-2000 firmy Thermo Scientific lub odpowiednik)**

Mieszadło wibracyjne**

Statywy do probówek do mikrowirówki

Rękawice jednorazowe bezpudrowe

Kalibrowane termometry do suchego bloku grzejnego**

Łaźnia wodna** umożliwiająca utrzymywanie temperatury 37°C
 Skalpel z jednostronnym ostrzem lub podobne narzędzie
* Pipetory powinny być konserwowane zgodnie z instrukcją producenta, a ich dokładność powinna mieścić się
w granicach 3% podanej objętości. W sytuacjach określonych w dokumentacji należy używać niezawierających DNazy
końcówek z barierą aerozolową lub wyrzutnikiem, aby zapobiec degradacji próbki i kontaminacji krzyżowej.
** Całe wyposażenie powinno być odpowiednio konserwowane zgodnie z instrukcją producenta.
Urządzenia i oprogramowanie
 Analizator cobas z 480

Jednostka sterująca systemu cobas® 4800 SR2 z obrazem OSXP

Oprogramowanie systemu cobas® 4800 SR2 w wersji 2.0 lub nowsze skonfigurowane z użyciem pakietu
oprogramowania do analizy genu EGFR

Zewnętrzny czytnik kodów kreskowych, podłączany do portu USB

Drukarka HP P2055d
06356583001-06PL
7
Doc Rev. 6.0
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
A. Pobieranie próbek
Próbki FFPET NSCLC zostały zatwierdzone do badania za pomocą cobas® EGFR Mutation Test.
B. Transport próbek
Próbki FFPET NSCLC można transportować w temperaturze od 15°C do 30°C. Próbki FFPET muszą być transportowane
zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi, dotyczącymi transportu czynników etiologicznych.16
C. Przechowywanie próbek
Próbki FFPET NSCLC można przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C do 12 miesięcy od daty pobrania tkanki.
Osadzone na szkiełkach skrawki o grubości 5 mikronów można przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C przez
maksymalnie 60 dni.
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
UWAGA:
Do badania za pomocą testu cobas® EGFR Mutation Test można używać wyłącznie skrawków próbki
FFPET NSCLC o grubości 5 µm, zawierających co najmniej 10% tkanki guza z danego obszaru. Każdą
próbkę zawierającą mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru należy po pozbawieniu jej parafiny
przeciąć makroskopowo.
UWAGA:
Szczegółowe wskazówki dotyczące obsługi analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi
analizatora cobas z 480.
UWAGA:
Suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki, należy włączyć i nastawić na
temperaturę 56°C i 90°C.
Liczba testów w przebiegu
Pojedynczy przebieg testowy może obejmować od 1 do 30 próbek (plus kontrole) w każdej płytce z 96 mikrodołkami. Przy
przeprowadzaniu przebiegu testowego obejmującego więcej niż 24 próbki trzeba będzie użyć wielu zestawów testu cobas®
EGFR Mutation Test.
cobas® EGFR Mutation Test zawiera ilość odczynników wystarczającą do wykonania 8 przebiegów testowych po 3 próbki
(plus kontrole), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw.
Przebieg pracy
Proces przeprowadzania cobas® EGFR Mutation Test składa się z ręcznego przygotowywania próbek za pomocą zestawu
cobas® DNA Sample Preparation Kit, a następnie z amplifikacji/detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem zestawu
cobas® EGFR Mutation Test.
Przygotowanie odczynników
A. Rozpuścić proteinazę K (PK) przez dodanie do fiolki 4,5 ml jałowej wody niezawierającej nukleazy (o stopniu czystości
odpowiednim do PCR) za pomocą jałowej, jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Wymieszać zawartość,
odwracając fiolkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Dodać równe objętości po 450 µl rozpuszczonego odczynnika PK do
probówek do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze –20°C. Jeśli proteinaza K
została już rozpuszczona i zamrożona, przed pozbawieniem próbek parafiny rozmrozić liczbę równych objętości
odczynnika, wystarczającą do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego (każda
próbka wymaga 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK).
B. Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze 15–30°C powinny być klarowne. Jeżeli w którymkolwiek odczynniku
obecny jest osad, ogrzać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37°C aż do rozpuszczenia się osadu. Nie wolno używać
odczynnika do czasu rozpuszczenia się całego osadu.
C. Przygotować roboczy odczynnik DNA Bufor płuczący I (WB I) przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB I 15 ml etanolu
bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano do
niej etanol i wpisać datę. Odłożyć roboczy odczynnik WB I do przechowywania w temperaturze od 15°C do 30°C.
D. Przygotować roboczy odczynnik DNA Bufor płuczący II (WB II) przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB II 50 ml etanolu
bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano do
niej etanol i wpisać datę. Odłożyć roboczy odczynnik WB II do przechowywania w temperaturze od 15°C do 30°C.
06356583001-06PL
8
Doc Rev. 6.0
Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach
UWAGA:
Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy
wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział „Ostrzeżenia i środki
ostrożności”.
A. Włożyć szkiełko z osadzonym skrawkiem FFPET o grubości 5 µm do pojemnika z ksylenem w ilości wystarczającej do
przykrycia tkanki; pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut.
B. Przenieść szkiełko do pojemnika z etanolem bezwodnym w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do
nasiąknięcia przez 5 minut.
C. Wyjąć szkiełko z etanolu i odczekać, aż skrawek całkowicie wyschnie na powietrzu (od 5 do 10 minut).
D. Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru, należy przeciąć ją makroskopowo.
E. Oznakować jedną probówkę do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml na każdą próbkę informacjami
umożliwiającymi zidentyfikowanie próbki.
F. Dodać 180 µl odczynnika DNA TLB do probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml.
G. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK do probówki Safe-Lock, zawierającej odczynnik DNA TLB.
H. Zeskrobać tkankę ze szkiełka do probówki Safe-Lock. Zanurzyć tkankę w mieszaninie odczynników DNA TLB/PK.
I.
Kontynuować postępowanie od punktu A procedury izolacji DNA.
Pozbawienie parafiny skrawków FFPET nieosadzonych na szkiełkach
UWAGA:
Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek parafiny należy
wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział „Ostrzeżenia i środki
ostrożności”.
UWAGA:
Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru, należy osadzić skrawek na szkiełku
w celu makroskopowego przecięcia, a następnie postępować zgodnie z procedurą omówioną w rozdziale
„Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach”.
A. Włożyć jeden skrawek FFPET o grubości 5 mikronów do probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml,
oznakowanej informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie każdej próbki.
B. Dodać 500 µl ksylenu do probówki Safe-Lock, zawierającej skrawek FFPET.
C. Mieszać dokładnie na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
D. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C.
E. Dodać 500 µl etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
F. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C.
G. Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki.
Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych.
H. Dodać 1 ml etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
I.
Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez uszkodzenia peletki.
Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych.
UWAGA:
J.
Jeśli peletka unosi się w pozostałym supernatancie, wirować ponownie przez 1 minutę z przyspieszeniem
od 16 000 x g do 20 000 x g. Usunąć pozostały supernatant.
Suszyć peletkę tkanki przez 10 minut w bloku grzejnym o temperaturze 56°C w otwartej probówce.
UWAGA:
Przed przejściem do następnego etapu upewnić się, że etanol został całkowicie odparowany i peletka jest
sucha.
UWAGA:
W razie potrzeby suche peletki można przechowywać do 24 godzin w temperaturze od 2°C do 8°C.
K. Wytworzyć z peletki tkanki ponownie zawiesinę w 180 µl odczynnika DNA Bufor do lizy tkanek (DNA TLB).
L. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK.
M. Kontynuować postępowanie od punktu A procedury izolacji DNA.
06356583001-06PL
9
Doc Rev. 6.0
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Procedura izolacji DNA
UWAGA: Jednocześnie z próbką(ami) należy przeprowadzić przetwarzanie kontroli ujemnej. Przygotować kontrolę
ujemną przez połączenie 180 µl odczynnika DNA Bufor do lizy tkanek (DNA TLB) i 70 µl roztworu
odczynnika PK w probówce do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml, oznakowanej napisem
NEG CT. Przetwarzanie kontroli ujemnej powinno przebiegać według takiej samej procedury, jak
przetwarzanie próbek.
A. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund probówki zawierające mieszaninę próbka/DNA TLB/PK i mieszaninę
kontroli ujemnej (NEG CT).
UWAGA: Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK.
B. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 56°C i inkubować przez 60 minut.
C. Mieszać probówki na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
UWAGA: Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK.
D. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 90°C i inkubować przez 60 minut.
UWAGA: Podczas inkubacji należy przygotować wymaganą liczbę probówek z filtrem (FT) z zawiasowymi
zatyczkami, umieszczając każdą FT na probówce zbiorczej (CT) i oznakowując zatyczkę każdej FT
odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę.
UWAGA: Na każdą próbkę będą potrzebne: 1 FT, 3 CT i 1 probówka do elucji (probówka do mikrowirówki
o pojemności 1,5 ml).
UWAGA: Podczas inkubacji należy oznakować wymaganą liczbę probówek do elucji (probówek do mikrowirówki
o pojemności 1,5 ml) odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę.
E. Odczekać na ochłodzenie się probówek do temperatury od 15°C do 30°C. Po ochłodzeniu się probówek odwirować je
pulsacyjnie, aby zebrać płyn z zatyczek.
F. Dodać do każdej probówki 200 µl odczynnika DNA PBB i 3 razy wymieszać zawartość przez nabieranie pipetą
i wypuszczanie.
G. Inkubować probówki w temperaturze od 15°C do 30°C przez 10 minut.
H. Dodać do każdej probówki 100 µl izopropanolu i 3 razy wymieszać lizat przez nabieranie pipetą i wypuszczanie.
I.
Przenieść każdy lizat do właściwie oznakowanej jednostki FT/CT.
J.
Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę.
K. Umieścić każdą FT na nowej CT. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć w odpowiedni
sposób zużytą CT.
L. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB I do każdej FT.
UWAGA: Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w rozdziale „Przygotowanie odczynników”.
M. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę.
N. Wyrzucić zawartość z każdej CT do odpadów chemicznych. Umieścić FT z powrotem na tej samej CT.
O. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB II do każdej FT.
UWAGA: Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w rozdziale „Przygotowanie odczynników”.
P. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę.
Q. Umieścić każdą FT na nowej CT. Wyrzucić zawartość ze starej CT do odpadów chemicznych i usunąć w odpowiedni
sposób zużytą CT.
R. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem od 16 000 do 20 000 x g przez 1 minutę, aby osuszyć membrany filtrów.
S. Umieścić każdą FT w probówce do elucji (probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml), oznakowanej uprzednio
informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. Wyrzucić zawartość ze zużytej CT do odpadów chemicznych i usunąć
w odpowiedni sposób zużytą CT.
T. Dodać 100 µl odczynnika DNA EB na środek membrany każdej FT bez dotykania membrany FT.
U. Inkubować FT z probówką do elucji w temperaturze od 15°C do 30°C przez 5 minut.
V. Wirować FT z probówką do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę, aby zebrać eluat do probówki do elucji.
Usunąć w odpowiedni sposób zużytą FT.
W. Zamknąć zatyczkę na probówce do elucji. Probówka do elucji zawiera roztwór podstawowy DNA. Przejść do punktu A
w rozdziale Ocena ilościowa stężenia DNA.
UWAGA: Pomiar stężenia DNA należy przeprowadzać natychmiast po zakończeniu procedury izolacji DNA i przed
odłożeniem materiału do przechowywania.
06356583001-06PL
10
Doc Rev. 6.0
Ocena ilościowa stężenia DNA:
A. Mieszać każdy roztwór podstawowy DNA na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
B. Przeprowadzić ocenę ilościową stężenia DNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis (NanoDrop ND-1000, ND-2000 lub
odpowiednik) zgodnie z protokołem postępowania podanym przez producenta urządzenia. Do wyzerowania urządzenia
użyć odczynnika DNA EB. Należy obliczyć średnią z dwóch zgodnych odczytów. Wyniki dwóch pomiarów powinny
mieścić się w granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA ≥ 20,0 ng/µl. W przypadku odczytów
stężenia DNA < 20,0 ng/µl wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach ± 2 ng/µl. Jeżeli wyniki dwóch
pomiarów nie mieszczą się w granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA ≥ 20,0 ng/µl lub w granicach
± 2 ng/µl przy odczytach stężenia DNA < 20,0 ng/µl, należy uzyskać dodatkowe 2 odczyty, aby wymogi badania zostały
spełnione. Wówczas należy obliczyć średnią z dwóch nowych wyników pomiarów.
UWAGA:
Nie ma potrzeby wykonywania pomiarów w przypadku roztworu podstawowego DNA, pochodzącego
z przetworzonej kontroli ujemnej (NEG CT).
C. Stężenie roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbek, musi być ≥ 2 ng/µl, aby można było wykonać test
cobas® EGFR Mutation Test. Każdą próbkę poddaje się trzykrotnej amplifikacji/detekcji z użyciem w każdej
amplifikacji/detekcji 25 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl (co daje ogółem 50 ng DNA).
UWAGA:
Aby można było przeprowadzić test cobas® EGFR Mutation Test, każdy roztwór podstawowy DNA musi
mieć minimalne stężenie 2 ng/µl. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA jest < 2 ng/µl, należy
powtórzyć procedury: pozbawiania próbek parafiny, izolacji DNA i oceny ilościowej stężenia DNA
z użyciem dwóch skrawków FFPET tej próbki o grubości 5 µm. W przypadku próbek osadzonych na
szkiełkach po pozbawieniu ich parafiny należy połączyć tkankę z obu skrawków w jednej probówce,
zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK i przeprowadzić izolację DNA oraz ocenę ilościową
stężenia DNA w sposób opisany powyżej. W przypadku próbek nieosadzonych na szkiełkach należy
połączyć oba skrawki w jednej probówce i zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK, po czym
przeprowadzić izolację DNA oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. Jeżeli
stężenie roztworu podstawowego DNA nadal jest < 2 ng/µl, należy zwrócić się do ośrodka klinicznego,
zlecającego wykonanie badania, o przysłanie kolejnej próbki FFPET.
UWAGA:
Przetwarzane próbki (wyizolowane DNA) są stabilne maksymalnie przez 24 godziny w temperaturze od 15°C
do 30°C, maksymalnie przez 14 dni w temperaturze od 2°C do 8°C, maksymalnie przez 60 dni
w temperaturze od –15°C do –25°C lub po przejściu 3 cykli zamrażania i rozmrażania przy przechowywaniu
w temperaturze od –15°C do –25°C. Wyizolowane DNA powinno zostać poddane amplifikacji podczas
okresu przechowywania zalecanego w danych warunkach lub przed upłynięciem daty ważności zestawu
cobas® DNA Sample Preparation Kit użytego do wyizolowania DNA w zależności od tego, co nastąpi
wcześniej.
AMPLIFIKACJA I DETEKCJA
UWAGA:
Aby zapobiec kontaminacji roboczego odczynnika MMX próbkami DNA, należy przeprowadzać
amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed
przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu
właściwego oczyszczenia należy dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami
i pipetorami, 0,5% roztworem podchlorynu sodu, a następnie 70% roztworem etanolu. Dostępny w handlu
płynny wybielacz przeznaczony do zastosowań domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu
o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać roztwór 0,5%
podchlorynu sodu.
Konfiguracja urządzenia:
Szczegółowe wskazówki dotyczące konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora
cobas z 480.
Konfiguracja zlecenia testu:
Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu pracy podczas wykonywania badań genu kodującego EGFR
zamieszczono w podręczniku użytkownika systemu cobas® 4800, w części dotyczącej testu cobas® EGFR Mutation Test
(Podręcznik użytkownika testu cobas® EGFR).
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki:
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń od 2 ng/µl do 36 ng/µl
UWAGA:
Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio przed amplifikacją
i detekcją.
UWAGA:
Każdą próbkę poddaje się trzykrotnej (3 x) amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości rozcieńczonego
roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl, wynoszącej ogółem 75 µl (po 25 µl na każdą z trzech
reakcji) (ogółem 150 ng DNA).
A. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) roztworu podstawowego DNA:
liczba µl roztworu podstawowego DNA = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ stężenie roztworu podstawowego DNA [ng/µl]
06356583001-06PL
11
Doc Rev. 6.0
B. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) odczynnika DNA Rozcieńczalnik próbki (DNA SD):
liczba µl odczynnika DNA SD = 90 µl – liczba µl roztworu podstawowego DNA
Przykład:
Stężenie roztworu podstawowego DNA = 6,5 ng/µl
A. liczba µl roztworu podstawowego DNA = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ 6,5 ng/µl = 27,7 µl
B. liczba µl odczynnika DNA SD = (90 µl – 27,7 µl) = 62,3 µl
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń > 36 ng/µl
UWAGA:
Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio przed amplifikacją
i detekcją.
UWAGA:
Każdą próbkę poddaje się trzykrotnej (3 x) amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości rozcieńczonego
roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl, wynoszącej ogółem 75 µl (po 25 µl na każdą z trzech
reakcji) (ogółem 150 ng DNA).
A. W przypadku stężeń roztworu podstawowego DNA > 36 ng/µl do obliczania ilości odczynnika DNA Rozcieńczalnik próbki
(DNA SD), wymaganej do przygotowania co najmniej 90 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA, należy użyć
zamieszczonego poniżej wzoru. Ma to na celu zapewnienie, że do badania każdej próbki zostanie użyta objętość co
najmniej 5 µl roztworu podstawowego DNA.
B. Obliczyć dla każdej próbki objętość (µl) odczynnika DNA SD, potrzebną do rozcieńczenia 5 µl roztworu podstawowego
DNA do stężenia 2 ng/µl:
wymagana obj. DNA SD w µl =
((5 µl roztworu podstawowego DNA x stężenie roztworu podstawowego DNA w ng/µl) / 2 ng/µl) – 5 µl
Przykład:
Stężenie roztworu podstawowego DNA = 100 ng/µl
A.
wymagana obj. DNA SD w µl = ((5 µl x 100 ng/µl) / 2 ng/µl) – 5 µl = 245 µl
B.
Użyć obliczonej objętości odczynnika DNA SD do rozcieńczenia 5 µl roztworu podstawowego DNA.
Rozcieńczanie próbki
A. Przygotować stosowną liczbę probówek do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml na rozcieńczenia DNA,
oznakowując je odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę.
B. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu, przenieść pipetą obliczone objętości
odczynnika DNA SD do odpowiednio oznakowanych probówek. Przenieść pipetą 45 µl odczynnika DNA SD do probówki
Safe-Lock, oznakowanej napisem NEG CT.
C. Mieszać każdy roztwór podstawowy DNA i kontrolę ujemną na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund.
D. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu (nowa końcówka do przenoszenia każdej
próbki), delikatnie przenieść pipetą obliczoną objętość każdego roztworu podstawowego DNA do odpowiedniej probówki
zawierającej odczynnik DNA SD. Przenieść pipetą 45 µl kontroli ujemnej (wyodrębnionego eluatu) do probówki z napisem
NEG CT.
E. Zamknąć probówki zatyczkami i mieszać zawartość każdej z nich na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund.
F. Zmienić rękawiczki.
Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3)
UWAGA:
Odczynniki: EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 oraz roboczy odczynnik MMX są wrażliwe na
światło i należy je chronić przed długotrwałą ekspozycją na światło.
UWAGA:
Ze względu na lepkość odczynników EGFR MIX oraz roboczego odczynnika MMX przenoszenie pipetą
należy wykonywać powoli, aby zagwarantować podanie z końcówki całej objętości mieszaniny.
UWAGA:
Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2 i EGFR MMX-3 mogą przybierać zabarwienie jasnoniebieskie lub
zbliżone do purpury. Nie wpływa to na działanie odczynnika.
Przygotować w oddzielnych probówkach do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml trzy większe porcje odczynników
potrzebnych do sporządzenia roboczych odczynników MMX: jedną odczynnika EGFR MMX-1, jedną odczynnika
EGFR MMX-2 i jedną odczynnika EGFR MMX-3.
A. Obliczyć objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2, lub EGFR MMX-3, wymaganą do sporządzenia każdego
z odczynników roboczych MMX, według następującego wzoru:
wymagana objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2, lub EGFR MMX-3 = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 20 µl
06356583001-06PL
12
Doc Rev. 6.0
B. Obliczyć objętość odczynnika MGAC, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX, według
następującego wzoru:
wymagana objętość odczynnika MGAC = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 5 µl
Posługując się tabelą 1, określić objętość każdego odczynnika, potrzebną do przygotowania roboczego odczynnika MMX, na
podstawie liczby próbek włączonych do przebiegu testowego.
Tabela 1
Objętości odczynników, potrzebne do sporządzenia roboczego odczynnika MMX-1,
roboczego odczynnika MMX-2 i roboczego odczynnika MMX-3
MMX
20 µl
MGAC
5 µl
Całkowita obj. każdego
roboczego odczynnika MMX (µl)
1
80
20
2
100
25
3
120
30
4
140
35
100
125
150
175
Liczba próbek*
5
6
160
180
40
45
200
225
7
200
50
8
220
55
9
240
60
10
260
65
250
275
300
325
* Objętości odpowiadające liczbie próbek obliczono na podstawie sumy: liczba próbek + 2 kontrole + 1
C. Wyjąć odpowiednią liczbę fiolek z odczynnikami: EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 i MGAC z miejsca,
w którym były przechowywane w temperaturze od 2°C do 8°C. Przed użyciem każdego odczynnika mieszać go przez
5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzić płyn na dnie probówki. Oznakować jałową probówkę do
mikrowirówki, przeznaczoną na roboczy odczynnik MMX-1, roboczy odczynnik MMX-2 i roboczy odczynnik MMX-3.
D. Dodać obliczoną objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2, lub EGFR MMX-3 do odpowiedniej probówki
przeznaczonej na roboczy odczynnik MMX.
E. Dodać obliczoną objętość odczynnika MGAC do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX.
F. Mieszać zawartość probówek na mieszadle wibracyjnym od 3 do 5 sekund, aby zapewnić dostateczne wymieszanie
odczynnika.
UWAGA:
Próbki i kontrole należy dodać do płytki z mikrodołkami (płytki AD) w ciągu 1 godziny od przygotowania
roboczych odczynników MMX.
UWAGA:
Należy używać wyłącznie płytki z mikrodołkami (płytki AD) systemu cobas® 4800 oraz odpowiedniej folii
uszczelniającej (Roche P/N 05232724001).
Przygotowanie płytki
Rysunek 1
Rozmieszczenie próbek na płytce
Rysunek 1. Układ płytki do cobas® EGFR Mutation Test
Rząd/
kolumna
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
MUT
MMX-1
MUT
MMX-2
MUT
MMX-3
S7
MMX-1
S7
MMX-2
S7
MMX-3
S15
MMX-1
S15
MMX-2
S15
MMX-3
S23
MMX-1
S23
MMX-2
S23
MMX-3
B
NEG
MMX-1
NEG
MMX-2
NEG
MMX-3
S8
MMX-1
S8
MMX-2
S8
MMX-3
S16
MMX-1
S16
MMX-2
S16
MMX-3
S24
MMX-1
S24
MMX-2
S24
MMX-3
C
S1
MMX-1
S1
MMX-2
S1
MMX-3
S9
MMX-1
S9
MMX-2
S9
MMX-3
S17
MMX-1
S17
MMX-2
S17
MMX-3
S25
MMX-1
S25
MMX-2
S25
MMX-3
D
S2
MMX-1
S2
MMX-2
S2
MMX-3
S10
MMX-1
S10
MMX-2
S10
MMX-3
S18
MMX-1
S18
MMX-2
S18
MMX-3
S26
MMX-1
S26
MMX-2
S26
MMX-3
E
S3
MMX-1
S3
MMX-2
S3
MMX-3
S11
MMX-1
S11
MMX-2
S11
MMX-3
S19
MMX-1
S19
MMX-2
S19
MMX-3
S27
MMX-1
S27
MMX-2
S27
MMX-3
F
S4
MMX-1
S4
MMX-2
S4
MMX-3
S12
MMX-1
S12
MMX-2
S12
MMX-3
S20
MMX-1
S20
MMX-2
S20
MMX-3
S28
MMX-1
S28
MMX-2
S28
MMX-3
G
S5
MMX-1
S5
MMX-2
S5
MMX-3
S13
MMX-1
S13
MMX-2
S13
MMX-3
S21
MMX-1
S21
MMX-2
S21
MMX-3
S29
MMX-1
S29
MMX-2
S29
MMX-3
H
S6
MMX-1
S6
MMX-2
S6
MMX-3
S14
MMX-1
S14
MMX-2
S14
MMX-3
S22
MMX-1
S22
MMX-2
S22
MMX-3
S30
MMX-1
S30
MMX-2
S30
MMX-3
Gdzie: NEG = kontrola ujemna, MUT = kontrola mutacji, S# = identyfikator próbki, a MMX-# odpowiada odczynnikowi
Master Mix 1, 2 lub 3.
UWAGA: Każda próbka musi rozciągać się przez trzy kolejne kolumny w jednym rzędzie, aby możliwe było
utworzenie wyniku.
06356583001-06PL
13
Doc Rev. 6.0
A. Przenieść pipetą 25 µl roboczego odczynnika MMX do każdego dołka reakcyjnego płytki z mikrodołkami (płytki AD),
potrzebnego do przeprowadzenia przebiegu testowego. Nie dopuścić do tego, aby końcówka pipetora dotknęła płytki
poza obrębem dołka.
 Dodać roboczego odczynnika MMX-1 (zawierającego odczynnik EGFR MMX-1) do dołków płytki z mikrodołkami
(płytki AD) w kolumnach 1, 4, 7 i 10, zgodnie z potrzebą.
B. Przenieść pipetą 25 µl odczynnika EGFR MC do dołków: A1, A2 i A3 płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie
wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka.
C. Używając nowej końcówki pipetora, przenieść pipetą 25 µl odczynnika NEG CT do dołków: B1, B2 i B3 płytki
z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej
dwukrotnie w obrębie danego dołka.
UWAGA:
Każdy przebieg testowy musi zawierać kontrolę dodatnią (odczynnik EGFR MC) w dołkach A1, A2 i A3
oraz kontrolę ujemną (odczynnik NEG CT) w dołkach B1, B2 i B3; w przeciwnym razie przebieg testowy
zostanie odrzucony jako nieważny przez analizator cobas z 480.
UWAGA:
Należy zmieniać rękawice zgodnie z potrzebą, aby chronić próbki przed wzajemną kontaminacją
zawartym w nich materiałem oraz chronić probówki do reakcji PCR przed kontaminacją na ich
zewnętrznych powierzchniach.
D. Używając nowych końcówek pipetora do każdej rozcieńczonej próbki DNA, dodać 25 µl pierwszej próbki DNA do dołków:
C1, C2 i C3 płytki z mikrodołkami (płytki AD); używając nowej końcówki do dodawania próbki DNA do każdego dołka;
dokładnie wymieszać zawartość każdego dołka, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, przynajmniej
dwukrotnie w obrębie danego dołka. Powtórzyć tę procedurę z rozcieńczonym roztworem DNA z kolejnych próbek (dołki:
D1, D2 i D3). Postępować według szablonu przedstawionego na rysunku 1, aż rozcieńczone roztwory DNA ze wszystkich
próbek zostaną umieszczone na płytce z mikrodołkami (płytce AD). Upewnić się, że cały płyn zebrał się na dnie dołków.
E. Przykryć płytkę z mikrodołkami (płytkę AD) folią uszczelniającą (dostarczoną wraz z płytkami). Użyć aplikatora folii
uszczelniającej do szczelnego przytwierdzenia folii do płytki z mikrodołkami (płytki AD).
F. Przed rozpoczęciem reakcji PCR potwierdzić, że cały płyn zebrał się na dnie każdego z dołków.
UWAGA:
Amplifikacja i detekcja powinny rozpocząć się w ciągu 1 godziny od dodania rozcieńczonego roztworu
DNA z pierwszej próbki do roboczego odczynnika MMX.
Rozpoczęcie reakcji PCR
Szczegółowe wskazówki dotyczące etapów przebiegu pracy przy wykonywaniu badań genu kodującego EGFR zamieszczono
w Podręczniku użytkownika systemu cobas®.
06356583001-06PL
14
Doc Rev. 6.0
INTERPRETACJA WYNIKÓW
UWAGA: Cały przebieg testowy i walidację próbek przeprowadza oprogramowanie cobas® 4800.
UWAGA:
Ważny przebieg testowy może obejmować zarówno ważne, jak i nieważne wyniki badania próbek.
W przypadku ważnego przebiegu testowego wyniki badania próbek interpretuje się w sposób przedstawiony w tabeli 2.
Tabela 2
Interpretacja wyniku testu mutacji EGFR cobas®
Wynik testu
Mutation
Detected
Mutation Not
Detected
lub
No Mutation
Detected*
Invalid
Failed
Wynik badania mutacji
Delecja w eksonie 19.
S768I
L858R
T790M
G719X (G719A, G719C, G719S)
Insercja w eksonie 20.
(może być obecna większa liczba mutacji
niż jedna)
Nie dotyczy
Nie dotyczy
Interpretacja
Wykryto mutację w określonym regionie docelowym
genu kodującego EGFR.
Nie wykryto mutacji w regionach docelowych genu
kodującego EGFR.
Wynik badania próbki jest nieważny. Powtórzyć test
próbek z nieważnymi wynikami, postępując zgodnie
z instrukcją przedstawioną poniżej w rozdziale
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami.
Przebieg testowy nie powiódł się wskutek awarii
sprzętu lub oprogramowania. Skontaktować się
z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
Nie dotyczy
* Wynik „Mutation Not Detected” lub „No Mutation Detected” nie wyklucza obecności mutacji w regionach docelowych genu
kodującego EGFR, ponieważ wyniki zależą od procentu zmutowanych sekwencji, dostatecznej integralności próbki, braku
inhibitorów i wystarczającej do wykrycia ilości DNA.
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami
A. Powtórzyć rozcieńczanie roztworu podstawowego DNA z próbki, która dała wynik nieważny, rozpoczynając od procedur:
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki i Rozcieńczanie próbki
w rozdziale AMPLIFIKACJA I DETEKCJA.
B. Po rozcieńczeniu roztworu podstawowego DNA do stężenia 2 ng/µl, co opisano w rozdziale Rozcieńczanie próbki,
kontynuować wykonywanie czynności opisanych w rozdziale Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix
(MMX-1, MMX-2 i MMX-3) oraz pozostałych czynności należących do procedury amplifikacji i detekcji.
UWAGA:
Jeżeli po ponownym testowaniu wynik badania próbki nadal jest nieważny lub jeśli nie było dostatecznej
ilości roztworu podstawowego DNA do przygotowania kolejnego rozcieńczenia zgodnie z opisem
w punkcie A rozdziału Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami — należy powtórzyć całą procedurę
testu tej próbki od etapu pozbawienia jej parafiny i izolacji DNA, używając nowego skrawka FFPET
o grubości 5 mikronów.
KONTROLA JAKOŚCI
Każdy przebieg testowy, liczący do 30 próbek, zawiera jeden zestaw kontroli mutacji do testu EGFR cobas® (EGFR MC)
i kontroli ujemnej (NEG CT) odczynników roboczych: MMX-1, MMX-2 i MMX-3. Przebieg testowy jest ważny, kiedy wyniki
oznaczeń w dołkach kontroli mutacji EGFR (EGFR MC) (dołki: A1, A2 i A3) oraz w dołkach kontroli ujemnej (NEG CT) (dołki:
B1, B2 i B3) są ważne. Jeśli wyniki oznaczeń kontroli mutacji EGFR (EGFR MC) lub kontroli ujemnej (NEG CT) odczynników
roboczych: MMX-1 lub MMX-2, lub MMX-3 są nieważne — cały przebieg testowy jest nieważny i trzeba go powtórzyć. Należy
wówczas przygotować świeże rozcieńczenie roztworu podstawowego DNA, wyizolowanego uprzednio z próbki, aby
skonfigurować nową płytkę z mikrodołkami (płytkę AD) wraz z kontrolami w celu przeprowadzenia amplifikacji i detekcji.
Kontrola dodatnia
Wynik oznaczenia kontroli mutacji EGFR (EGFR MC) odczynników roboczych: MMX-1, MMX-2 i MMX-3 musi nosić
określenie „Valid”. Jeżeli wyniki oznaczenia EGFR MC stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem
firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
06356583001-06PL
15
Doc Rev. 6.0
Kontrola ujemna
Wynik oznaczenia kontroli ujemnej (NEG CT) odczynników roboczych: MMX-1, MMX-2 i MMX-3 musi nosić określenie „Valid”.
Jeżeli wyniki oznaczenia NEG CT stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu
uzyskania pomocy technicznej.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie
zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy zachować wyjątkową
ostrożność, używając odczynników oraz mieszanin do amplifikacji, aby zapobiec ich kontaminacji.
OGRANICZENIA METODY
1. Do badań należy używać wyłącznie określonych rodzajów próbek. Test cobas® EGFR Mutation Test został zatwierdzony
wyłącznie do badania próbek guza FFPET NSCLC.
2. cobas® EGFR Mutation Test został zatwierdzony do użytku wyłącznie z zestawem cobas® DNA Sample Preparation Kit
(Roche P/N: 05985536190).
3. Detekcja mutacji zależy od liczby kopii obecnych w próbce, na którą wpływać może integralność próbki, ilość
wyizolowanego DNA i obecność substancji zakłócających detekcję.
4. Wiarygodność wyników zależy od dostatecznego utrwalenia próbki, jej transportu, przechowywania i przetwarzania.
Należy przestrzegać procedur opisanych w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania testu oraz w Podręczniku
użytkownika cobas® EGFR Mutation Test.
5. Wpływ innych możliwych zmiennych, takich jak te związane z utrwaleniem próbki, nie został zbadany.
6. Dodanie do odczynnika Master Mix testu cobas® EGFR Mutation Test enzymu AmpErase umożliwia selektywną
amplifikację docelowego DNA; jednak dla uniknięcia kontaminacji odczynników konieczne jest stosowanie dobrej praktyki
laboratoryjnej i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania testu.
7. Tego produktu mogą używać wyłącznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i używania systemu cobas® 4800.
8. Do użycia z tym produktem został zatwierdzony wyłącznie analizator cobas z 480. Z tym produktem nie wolno używać
żadnego innego termocyklera z systemem optycznym do detekcji w czasie rzeczywistym.
9. Z uwagi na nieodłączne różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik
przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia różnic występujących pomiędzy
nimi.
10. Mutacje w obrębie regionów genomowego DNA tworzącego gen kodujący EGFR, z którymi wiążą się primery i/lub sondy
używane w teście cobas® EGFR Mutation Test, chociaż rzadkie, mogą spowodować niewykrycie obecności mutacji
w eksonach 18., 19., 20., 21. (wyniki „Mutation Not Detected”).
11. Obecność inhibitorów PCR może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych lub nieważnych.
12. Chociaż zdarza się to rzadko, w przypadku niektórych mutacji w teście cobas® EGFR Mutation Test występują wyniki
„Mutation Not Detected”, a także ograniczona reaktywność krzyżowa (wyniki „Mutation Detected”) w przypadkach mutacji
otaczających regiony mutacji docelowych w eksonach: 18., 19., 20. i 21.
13. Test cobas® EGFR Mutation Test został zatwierdzony do zastosowania z DNA w ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
Nie zaleca się stosowania początkowych ilości DNA na poziomie niższym niż 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
14. W celu wykrycia w tle DNA z naturalnie występującymi sekwencjami ≥5% zmutowanych sekwencji genu EGFR20
obejmujących mutacje przedstawione w tabelach 15 i 16 należy postępować zgodnie z procedurą opisaną powyżej.
15. Próbki NSCLC FFPET zawierające zdegradowany DNA mogą wpływać na zdolność testu do wykrycia mutacji w genie
EGFR.
16. Próbki z wynikami oznaczonymi jako „Mutation Not Detected” mogą zawierać mutacje w genie EGFR niewykrywane
przez to oznaczenie.
17. Test cobas® EGFR Mutation Test wykazuje reaktywność krzyżową (wyniki „Mutation Detected”) z mutacją L747S
w eksonie 19., rzadką mutacją nabytą, która może odpowiadać za oporność na leczenie TKI21.
06356583001-06PL
16
Doc Rev. 6.0
OCENA DZIAŁANIA W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
Czułość analityczna
Czułość analityczna testu cobas® EGFR Mutation Test badana z użyciem mieszanin plazmidowych
Sześć konstruktów plazmidowego DNA, zawierających najczęściej obserwowane mutacje w każdej z klas mutacji
wykrywanych przez niniejszy test, zmieszano z naturalnie występującym DNA pochodzącym z linii komórkowych w docelową
strukturę końcową, zawierającą 5% zmutowanych sekwencji, opracowanych na podstawie odpowiedników z genomowego
DNA. Przygotowano seryjne rozcieńczenia roztworów podstawowych, zawierających 5% zmutowanych sekwencji, po czym
zbadano 24 powtórzenia każdego elementu panelu z użyciem każdej z 3 serii zestawów cobas® EGFR Mutation Test.
Czułość analityczną określono na podstawie najmniejszej ilości DNA, która dała odsetek wyników „Mutation Detected”,
dotyczących mutacji docelowej genu kodującego EGFR, wynoszący co najmniej 95%. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.
Tabela 3
Czułość testu cobas® EGFR Mutation Test z zastosowaniem DNA
pochodzącego z plazmidu i mieszanin linii komórkowych
Ekson
genu
kodującego
EGFR
Mutacja genu
kodującego EGFR
Sekwencja docelowego kwasu
nukleinowego
Najmniejsza ilość DNA (ng) w 5%
elementów panelu mutacji genów dla
każdego dołka reakcyjnego konieczna do
uzyskania ≥ 95% odsetka wyników
„Mutation Detected” (N=72 powtórzeń)
18
19
20
20
20
21
G719A
Delecja w eksonie 19
S768I
T790M
Insercja w eksonie 20
L858R
2156 G>C
2235-2249del15
2303 G>T
2369 C>T
2307_2308ins9 (GCCAGCGTG)
2573 T>G
3,13
0,78
0,78
3,13
3,13
0,78
Czułość analityczna, badana z użyciem mieszanin pochodzących z próbek FFPET
Izolaty DNA próbek FFPET zawierające docelowe mutacje dla testu zmieszano z izolatami próbek FFPET naturalnie
występującego genu kodującego EGFR w celu uzyskania mieszanin z próbkami o docelowym poziomie mutacji 10%, 5,0%,
2,5% i 1,25%, zgodnie z zatwierdzonym pyrosekwencyjnym, równoległym sekwencjonowaniem metodą 454 na wielką skalę
(firma 454 Life Sciences, Branford, Connecticut, Stany Zjednoczone). Dla każdej mieszaniny próbek przygotowano seryjne
rozcieńczenia i przetworzono osiem powtórzeń każdego elementu panelu z wykorzystaniem każdego z 3 serii zestawów cobas®
EGFR Mutation Test (n = 24/element panelu). Czułość każdej próbki określono na podstawie najmniejszej ilości DNA, która
dała odsetek wyników „Mutation Detected”, dotyczących mutacji docelowej genu kodującego EGFR, wynoszący co najmniej
95%; wyniki przedstawiono w tabeli 4.
06356583001-06PL
17
Doc Rev. 6.0
Tabela 4
Czułość analityczna testu cobas EGFR Mutation Test badana z użyciem mieszanin pochodzących z próbek FFPET
®
Mutacja genu
kodującego
EGFR
Delecja
w eksonie 19.
L858R+
T790M
S768I
Insercja
w eksonie 20.
G719X
Próbka
Sekwencja kwasu
nukleinowego genu
kodującego EGFR
Odsetek mutacji w elemencie panelu
konieczny do uzyskania odsetka
≥95% wyników „Mutation Detected”
przy początkowym poziomie DNA
w ilości 50 ng w każdym dołku
reakcyjnym (n = 24 powtórzenia)
Próbka nr 1
Próbka nr 2
Próbka nr 3
Próbka nr 11
Próbka nr 12
Próbka nr 13
Próbka nr 14
Próbka nr 15
Próbka nr 16
Próbka nr 17
Próbka nr 18
Próbka nr 4
Próbka nr 5
Próbka nr 6
Próbka nr 7
Próbka nr 7
Próbka nr 8
2235_2249del15
2236_2250del15
2238_2252del15
2239_2248>C
2240_2254del15
2240_2257del18
2237_2253>TTGCT*
2237_2255>T*
2239_2256del18*
2238_2252del15*
2239_2257>GT*
2573 T>G
2573 T>G
2573 T>G
2573 T>G
2369 C>T
2303 G>T
1,4
2,5
2,4#
2,2
7,2
13,4**
6,3
4,1
4,7
5,5#
6,0
4,0
4,2
4,3
5,3
2,0
2,4
Próbka nr 9
2310_2311insGGT
1,3
Próbka nr 10
Próbka nr 8
2156 G>C
2155 G>T
2,5
5,6
* Dla tych niedominujących delecji w eksonie 19. występujących w kohorcie badania EURTAC przebadano
jedynie poziomy sekwencji docelowych zawierających około 5% mutacji. Mieszaniny próbek DNA zostały
przebadane w 3 ośrodkach biorących udział w badaniu.
** Czułość analityczna testu cobas® EGFR Mutation Test w przypadku detekcji tej mutacji jest większa niż
10% z zastosowaniem standardowej początkowej ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
# Przebadano dwie niezależne próbki dla delecji w eksonie 19. (2238_2252del15).
+
Przebadano cztery niezależne próbki dla mutacji L858R.
Wyniki tego badania wskazują, że test cobas® EGFR Mutation Test umożliwia wykrywanie mutacji w eksonach 18., 19., 20.
i 21. genu kodującego EGFR przy poziomie mutacji o wartości co najmniej 5% z zastosowaniem standardowej początkowej
ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
Minimalna zawartość tkanki guza
Przebadano łącznie 73 niezależne próbki z mutacjami genu EGFR (tj. 35 próbek z delecją w eksonie 19., 31 próbek z mutacją
L858R w eksonie 21., jedną próbkę z mutacją S768I w eksonie 20., dwie próbki z mutacją G719X w eksonie 18. i cztery
próbki z insercją w eksonie 20.) o zawartości tkanki guza mieszczącej się w przedziale 25–99% w celu określenia minimalnej
zawartości tkanki guza wymaganej do wykrycia mutacji w genie EGFR w próbkach NSCLC. W żadnej z przebadanych próbek
nie stwierdzono jednoczesnego występowania delecji w eksonie 19. i mutacji L858R w eksonie 21. Każdą próbkę przebadano
bez wykonania przecięcia makroskopowego (w stanie niezmienionym) oraz po przecięciu makroskopowym. Obserwowane
wartości CtR dla próbek niezmienionych i poddanych przecięciu makroskopowemu przeanalizowano z użyciem regresji
Deminga oraz wykresu Blanda-Altmana (różnice w funkcji wartości średniej). Wyniki potwierdzają zasadność stosowania
próbek z zawartością tkanki guza przekraczającą 25% bez przecięcia makroskopowego.
W badaniu fazy 3. EURTAC dotyczącym stosowania erlotynibu w porównaniu z chemioterapią opartą na cisplatynie próbki
NSCLC FFPET z zawartością tkanki guza poniżej 10% zostały przecięte makroskopowo przed analizą mutacji w genie EGFR.
Podgrupa próbek przebadanych przesiewowo w badaniu EURTAC została oceniona pod kątem statusu mutacji w genie
EGFR z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test oraz równoległego sekwencjonowania na wielką skalę (ang. massively
06356583001-06PL
18
Doc Rev. 6.0
parallel sequencing, MPS). W zamieszczonych poniżej tabelach 5 oraz 6 uwzględniono próbki NSCLC z ważnymi wynikami
sparowanymi dla mutacji w eksonie 19. genu EGFR lub mutacji L858R uzyskanymi łącznie w teście cobas EGFR Mutation
Test oraz sekwencjonowaniu MPS. Podczas korzystania z sekwencjonowania MPS jako metody referencyjnej wyniki
wykazały, że w przypadku próbek NSCLC FFPET po przecięciu makroskopowym z zawartością tkanek guza poniżej 10%
uzyskano porównywalną dokładność analityczną jak w przypadku próbek NSCLC FFPET nieprzeciętych makroskopowo.
Razem te badania potwierdzają, że przed przeprowadzeniem testu cobas® EGFR Mutation Test wymagane jest przecięcie
makroskopowe w przypadku próbek NSCLC FFPET o zawartości tkanki guza poniżej 10%.
Tabela 5
Skuteczność testu cobas® EGFR Mutation Test w przypadku próbek NSCLC FFPET z zawartością tkanki guza ≤10%
(przeciętych makroskopowo)
Test cobas® EGFR
Mutation Test
(metoda badana)
Mutation Detected
a
b
Mutation Not Detected
Ogółem
Sekwencjonowanie MPS
(metoda referencyjna)
Mutation Detecteda
Mutation Not Detectedb
Ogółem
35
3
38
1
52
53
55 (60,4%)
91
36 (39,6%)
PPA (95% CI)
35/36 = 97,2% (85,8%; 99,5%)
NPA (95% CI)
52/55 = 94,5% (85,1%; 98,1%)
OPA (95% CI)
87/91 = 95,6% (89,2%; 98,3%)
a
Wynik Mutation Detected wskazuje obecność mutacji złożonych w eksonie 19. genu EGFR lub L858R.
Wynik Mutation Not Detected wskazuje brak mutacji złożonych w eksonie 19. genu EGFR lub L858R.
Uwaga: CI = (punktacja) przedział ufności.
b
Tabela 6
Skuteczność testu cobas® EGFR Mutation Test w przypadku próbek NSCLC FFPET z zawartością tkanki guza >10%
(nieprzeciętych makroskopowo)
Test cobas® EGFR
Mutation Test
(metoda badana)
Mutation Detected
a
Razem wyniki ważne
Sekwencjonowanie MPS
(metoda referencyjna)
Mutation Detecteda
Ogółem
107
3
110
8
199
207
115 (36,3%)
202 (63,7%)
317
PPA (95% CI)
107/115 = 93,0% (86,9%; 96,4%)
NPA (95% CI)
199/202 = 98,5% (95,7%; 99,5%)
OPA (95% CI)
306/317 = 96,5% (93,9%; 98,1%)
a
Wynik Mutation Detected wskazuje obecność mutacji złożonych w eksonie 19. genu EGFR lub L858R.
Wynik Mutation Not Detected wskazuje brak mutacji złożonych w eksonie 19. genu EGFR lub L858R.
Uwaga: CI = (punktacja) przedział ufności.
b
Korelacja z metodą referencyjną
201 próbek FFPET NSCLC poddano badaniom porównawczym z wykorzystaniem każdego z 2 serii testu cobas® EGFR
Mutation Test i z zastosowaniem dwukierunkowego sekwencjonowania 2X (metodą Sangera) w celu rozstrzygnięcia
procentowej zgodności wyników dodatnich, ujemnych i zgodności ogólnej. Wyniki rozbieżne pomiędzy testem cobas® EGFR
Mutation Test a wynikami otrzymanymi metodą Sangera zostały przeanalizowane z zastosowaniem sekwencjonowania
metodą 454 w celu rozstrzygnięcia niezgodności. Próbki z nieważnymi wynikami testu cobas® EGFR Mutation Test i/lub
sekwencjonowania metodą Sangera zostały wyłączone z analizy. Wyniki testu cobas® EGFR Mutation Test uznaje się za
nieważne, gdy którekolwiek lub każde z rozpoznań mutacji zostanie oznaczone jako „invalid” (tabela 2). Wyniki
sekwencjonowania metodą Sangera uznaje się za nieważne, gdy co najmniej jeden z czterech eksonów dla każdej próbki nie
da ważnych wyników.
06356583001-06PL
19
Doc Rev. 6.0
Wyniki testu cobas® EGFR Mutation Test i sekwencjonowania metodą Sangera
Spośród 201 próbek poddanych ocenie w ramach porównania 49 próbek nie mogło zostać ocenionych pod kątem zgodności
ze względu na uzyskanie nieważnych wyników jednej lub obu metod. Nieważne okazały się wyniki 48 próbek poddanych
sekwencjonowaniu metodą Sangera (23,8%), 6 próbek poddanych analizie za pomocą 1. serii testu cobas® EGFR Mutation
Test (3,0%) oraz 5 próbek oznaczonych za pomocą 2. serii testu cobas® EGFR Mutation Test (2,5%). Rozkład nieważnych
wyników dla każdej z metod przedstawiono w tabeli 7.
Tabela 7
Rozkład nieważnych wyników dla różnych metod
Wyniki nieważne dla każdej z metod
Tylko nieważne wyniki dla metody Sangera
Tylko nieważne wyniki dla testu cobas®
Nieważne wyniki dla metody Sangera i testu cobas®
Ogółem
Test cobas® EGFR Mutation Test
Seria nr 1
Seria nr 2
43
44
1
1
5
4
49
49
Porównanie 152 ważnych wyników dla metody Sangera i testu cobas® EGFR Mutation Test przedstawiono w tabeli 8.
Tabela 8
Analiza zgodności wyników testu cobas® EGFR Mutation Test (z uwzględnieniem serii)
w porównaniu do wyników sekwencjonowania metodą Sangera
Metoda Sangera
MD
MND
Ogółem
MD
69
2
71
Test
cobas®,
MND
3
78
81
Seria 1
Ogółem
72
80
152
Zgodność wyników dodatnich = 95,8% (95% CI = 88,3–99,1%)
Zgodność wyników ujemnych = 97,5% (95% CI = 91,3–99,7%)
Ogólna zgodność = 96,7% (95% CI = 92,5–98,9%)
MD: Mutation Detected
MND: Mutation Not Detected
Metoda Sangera
MD
MND
Ogółem
MD
69
2
71
Test
cobas®,
MND
3
78
81
Seria 2
Ogółem
72
80
152
Zgodność wyników dodatnich = 95,8% (95% CI = 88,3–99,1%)
Zgodność wyników ujemnych = 97,5% (95% CI = 91,3–99,7%)
Zgodność pomiędzy wynikami testu cobas® EGFR Mutation Test w porównaniu z wynikami sekwencjonowania metodą
Sangera wyniosła 96,7% (5 wszystkich wyników niezgodnych) dla serii 1. i 96,7% (5 wszystkich wyników niezgodnych) dla
serii 2.
W ramach porównania wyników testu cobas® EGFR Mutation Test i metody Sangera poddano ocenie sześć sekwencji
docelowych dla każdej z próbek. Na podstawie wyników 152 ważnych próbek uzyskano 912 rozpoznań. Tabela 9 i tabela 10
przedstawia porównanie wyników testu cobas® EGFR Mutation Test i metody Sangera na podstawie każdego z rozpoznań
odpowiednio dla serii 1. i serii 2. Odnotowano rozbieżność wyników dwóch ważnych próbek pomiędzy serią 1. a serią 2. testu
cobas® EGFR Mutation Test: w przypadku jednej próbki rozpoznano insercję w eksonie 20 dla serii 1. i wynik „Mutation Not
Detected” dla serii 2.; w przypadku drugiej próbki rozpoznano delecję eksonu 19 dla serii 2. i wynik „Mutation Not Detected”
dla serii 1.
06356583001-06PL
20
Doc Rev. 6.0
Tabela 9
Porównanie rozpoznań w teście cobas® EGFR Mutation Test (seria 1) z wynikami uzyskanymi metodą Sangera
Test
cobas®,
Seria 1
G719X
Del.
w eks. 19
S768I
Ins.
w eks. 20
T790M
L858R
MND
Ogółem
Metoda Sangera
Del.
G719X
w eks. 19
5
-
-
-
-
-
-
-
5
-
39
-
-
-
-
-
-
39
-
-
3
-
-
-
-
-
3
-
-
-
2
-
-
2
-
4
2
7
1
40
3
2
1
1
23
23
833
835
1*
1
1
23
837
912
Ins.
w eks. 20
S768I
T790M
L858R
MND
Inne
Ogółem
* Wynik uzyskany metodą Sangera dla jednej z próbek został oznaczony jako G719D, natomiast za pomocą testu cobas®
EGFR Mutation Test nie wykryto mutacji docelowej. Wynik tej próbki został sklasyfikowany do analizy jako „Mutation Not
Detected” dla obu metod.
Tabela 10
Porównanie rozpoznań w teście cobas® EGFR Mutation Test (seria 2) z wynikami uzyskanymi metodą Sangera
Test
cobas®,
Seria 2
G719X
Del.
w eks. 19
S768I
Ins.
w eks. 20
T790M
L858R
MND
Ogółem
Metoda Sangera
Del.
G719X
w eks. 19
5
-
-
Ins.
w eks. 20
-
-
-
-
-
5
39
-
-
-
-
1
-
40
-
-
3
-
-
-
-
-
3
-
-
-
2
-
-
1
-
3
2
7
1
40
3
2
1
1
23
23
833
835
1*
1
1
23
837
912
S768I
T790M
L858R
MND
Inne
Ogółem
06356583001-06PL
21
Doc Rev. 6.0
Analiza niezgodności wyników z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454
Na podstawie wyników porównania z metodą Sangera 5 próbek oznaczono jako ważne i rozbieżne dla każdej z serii testu
cobas® EGFR Mutation Test. Próbki, których wyniki były rozbieżne dla testu cobas® EGFR Mutation Test i metody Sangera
poddano analizie z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454 i przedstawiono w tabeli 11. Zmodyfikowaną analizę
zgodności przeprowadzono na podstawie wyników uzyskanych metodą sekwencjonowania 454. W ramach tej analizy, próbki
poddane oznaczeniu metodą sekwencjonowania 454, którego wynik był zgodny z wynikiem testu cobas® EGFR Mutation
Test uznano za zgodne. Próbki, których wyniki uzyskane metodą sekwencjonowania 454 były zgodne z wynikami metody
Sangera uznano za niezgodne.
Tabela 11
Rozstrzygnięcie niezgodności próbek z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454
Metoda
Sangera
G719A
G719S
Del. w eks. 19
MND
MND
MND
Próbka
Próbka 1
Próbka 2*
Próbka 3
Próbka 4**
Próbka 5
Próbka 6
Test cobas®,
Seria 1
MND
MND
MND
MND
Ins. w eks. 20
Ins. w eks. 20
Test cobas®,
Seria 2
MND
MND
MND
Del. w eks. 19
Ins. w eks. 20
MND
Rozstrzygnięcie z wykorzystaniem
sekwencjonowania metodą 454
MND
G719S (poziom mutacji 1,1%)
MND
Del. w eks. 19 (poziom mutacji 3,0%)
Ins. w eks. 20 (poziom mutacji 13,7%)
MND
* Za pomocą sekwencjonowania metodą 454, przy poziomie mutacji 1,1%, potwierdzono oznaczenie wyniku próbki 2. jako
G719S. Jest to poniżej granicy wykrywalności testu cobas® EGFR Mutation Test.
**Za pomocą sekwencjonowania metodą 454, przy poziomie mutacji 3,0%, potwierdzono oznaczenie wyniku próbki 4. jako
delecja w eksonie 19. Jest to bliskie lub bardzo bliskie granicy wykrywalności testu cobas® EGFR Mutation Test.
Po rozstrzygnięciu niezgodności wyników testu cobas® EGFR Mutation Test i wyników uzyskanych metodą Sangera
z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454 zgodność wszystkich wyników dla wszystkich docelowych klas mutacji
wyniosła 98,7% dla serii 1. i 99,3% dla serii 2. testu cobas® EGFR Mutation Test, jak przedstawiono w tabeli 12.
Tabela 12
Analiza zgodności wyników testu cobas® EGFR Mutation Test (z uwzględnieniem serii)
w porównaniu do wyników sekwencjonowania metodą Sangera z rozstrzygnięciem niezgodności
z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454
Test
®
cobas ,
Seria 1
Wyniki sekwencjonowania metodą
Sangera, rozstrzygane za pomocą
Wyniki sekwencjonowania metodą
Sangera, rozstrzygane za pomocą
MD
MND
Ogółem
MD
MND
Ogółem
MD
70
1
71
MD
71
0
71
MND
1
80
81
MND
1
80
81
Ogółem
71
81
152
Ogółem
72
80
152
Zgodność wyników dodatnich = 98,6% (95% CI = 92,4–100%)
Zgodność wyników ujemnych = 98,8% (95% CI = 93,3–100%)
Test
®
cobas ,
Seria 2
Zgodność wyników dodatnich = 98,6% (95% CI = 92,5–100%)
Zgodność wyników ujemnych = 100% (95% CI = 96,3–100%)
Ogólna zgodność = 99,3% (95% CI = 96,4–100%)
Tabele 13 i 14 przedstawiają porównanie wyników testu cobas® EGFR Mutation Test i metody Sangera z rozstrzygnięciem
niezgodności wyników z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454 na podstawie każdego z rozpoznań odpowiednio
dla serii 1. i serii 2.
06356583001-06PL
22
Doc Rev. 6.0
Tabela 13
Porównanie rozpoznań w teście cobas® EGFR Mutation Test (seria 1) z metodą Sangera
z rozstrzygnięciem niezgodności wyników z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454
Test
cobas®,
Seria 1
G719X
Del. w
eks. 19
S768I
Ins. w
eks. 20
T790M
L858R
MND
Ogółem
Wyniki sekwencjonowania metodą Sangera, rozstrzygane za pomocą
Ins.
Del.
T790M L858R
MND
S768I
G719X
w eks. 20
w eks. 19
5
-
-
5
-
39
-
-
-
-
-
-
39
-
-
3
-
-
-
-
-
3
-
-
-
3
-
-
1
-
4
1
6
39
3
3
1
1
23
23
835
836
1*
1
1
23
837
912
Inne
Ogółem
Tabela 14
Porównanie rozpoznań w teście cobas® EGFR Mutation Test (seria 2) z metodą Sangera
z rozstrzygnięciem niezgodności wyników z wykorzystaniem sekwencjonowania metodą 454
Test
cobas®,
Seria 2
G719X
Del. w
eks. 19
S768I
Ins. w
eks. 20
T790M
L858R
MND
Ogółem
Wyniki sekwencjonowania metodą Sangera, rozstrzygane za pomocą
Del.
Ins.
S768I
T790M
L858R
MND
G719X
w eks. 19
w eks. 20
5
-
-
5
-
40
-
-
-
-
-
-
40
-
-
3
-
-
-
-
-
3
-
-
-
3
-
-
-
-
3
1
6
40
3
3
1
1
23
23
835
835
1*
1
1
23
837
912
Inne
Ogółem
06356583001-06PL
23
Doc Rev. 6.0
Badanie reprezentatywności z wykorzystaniem plazmidów
Wykazano, że test cobas® EGFR Mutation Test umożliwia wykrycie następujących mutacji przedstawionych w tabeli 15 przy
poziomie ≥5% alleli z mutacją.
Tabela 15
Mutacje wykryte przez test cobas® EGFR Mutation Test
Ekson 18 – rozpoznanie mutacji G719X
Mutacja
Zmiana aminokwasu
2155 G>A
G719S
2155 G>T
G719C
2156 G>C
G719A
Identyfikator COSMIC21
6252
6253
6239
Ekson 19 – Rozpoznanie mutacji w postaci delecji w eksonie 19
Mutacja
Zmiana aminokwasu
2235_2249del15
E746_A750del
6223
2236_2250del15
E746_A750del
6225
2240_2257del18
L747_P753>S
12370
2240_2254del15
L747_T751del
12369
2239_2256del18
L747_S752del
6255
2239_2251>C
L747_T751>P
12383
2237_2251del15
E746_T751>A
12678
2237_2255>T
E746_S752>V
12384
2239_2248TTAAGAGAAG>C
E747_A750>P
12382
2239_2253del15
L747_T751del
6254
2239_2247del9
L747_E749del
6218
2235_2252>AAT
E746_T751>I
13551
2236_2253del18
E746_T751del
12728
2237_2254del18
E746_S752>A
12367
2238_2255del18
E746_S752>D
6220
2238_2248>GC
L747_A750>P
12422
2238_2252>GCA
L747_T751>Q
12419
2239_2258>CA
L747_P753>Q
12387
2240_2251del12
L747_T751>S
6210
2233_2247del15
K745_E749del
26038
2253_2276del24
S752_I759del
13556
2235_2248>AATTC
E746_A750>IP
13550
2237_2252>T
E746_T751>V
12386
2235_2251>AATTC
E746_T751>IP
13552
2235_2255>AAT
E746_S752>I
12385
2237_2253>TTGCT
E746_T751>VA
12416
2237_2257>TCT
E746_P753>VS
18427
2238_2252del15
L747_T751del
23571
2239_2256>CAA
L747_S752>Q
12403
2240T>C
L747S
26704
06356583001-06PL
24
Doc Rev. 6.0
Tabela 15
Mutacje wykryte przez test cobas® EGFR Mutation Test (ciąg dalszy)
Ekson 20 – rozpoznanie mutacji T790M, S768I oraz insercji eksonu 20
Mutacja
Zmiana aminokwasu
2303 G>T
S768I
6241
2369 C>T
T790M
6240
2319_2320insCAC
H773_V774insH
12377
2310_2311insGGT
D770_N771insG
12378
2307_2308ins9GCCAGCGTG
V769_D770insASV
12376
2309_2310AC>CCAGCGTGGAT
V769_D770insASV
13558
2311_2312ins9GCGTGGACA
D770_N771insSVD
13428
Ekson 21 – rozpoznanie mutacji L858R
Mutacja
Zmiana aminokwasu
2573 T>G
L858R
2573_2574TG>GT
L858R
6224
12429
Reprezentatywność w przypadku mieszanin pochodzących z próbek FFPET
Wykazano, że test cobas® EGFR Mutation Test umożliwia wykrycie następujących mutacji przedstawionych w tabeli 16 przy
poziomie ≥5% alleli z mutacją.
Tabela 16
Mutacje wykryte przez test cobas® EGFR Mutation Test
Ekson 19. — rozpoznanie mutacji w postaci delecji w eksonie 19.
Mutacja
Zmiana aminokwasu
2235_2249del15
E746_A750del
6223
2236_2250del15
E746_A750del
6225
2240_2257del18
L747_P753>S
12370
2240_2254del15
L747_T751del
12369
2239_2256del18*
L747_S752del
6255
2239_2251>C
L747_T751>P
12383
2237_2255>T
E746_S752>V
12384
2239_2248TTAAGAGAAG>C
E747_A750>P
12382
2237_2253>TTGCT
E746_T751>VA
12416
2237_2257>TCT
E746_P753>VS
18427
2238_2252del15
L747_T751del
23571
2239_2257>GT
L747_P753>V
Nie stwierdzono
2234_2251>AAT
K745_T751>K
Nie stwierdzono
2236_2244del9
E746_R748>E
Nie stwierdzono
2236_2252>AT
E746_T751>I
26680
2236_2263>GAAGCAT
E746_A755>E
Nie stwierdzono
2237_2251>AAC
E746_751T>E
Nie stwierdzono
2239_2253>CAA
L747_T751>Q
51527
* Wykryta przy poziomie alleli z mutacją ≥10%.
Ekson 21. — rozpoznanie mutacji L858R
Mutacja
Zmiana aminokwasu
2573 T>G
L858R
06356583001-06PL
25
6224
Doc Rev. 6.0
Reaktywność krzyżowa
Drobnoustroje występujące w płucach
Stwierdzono, że jednostki tworzące kolonie Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae w ilości 1 x 106 CFU nie
wykazują reaktywności krzyżowej ani nie zakłócają działania testu cobas® EGFR Mutation Test po dodaniu podczas etapu
lizy tkanki do próbek zawierających naturalnie występujące sekwencje genu kodującego EGFR.
Plazmidy homologów EGFR
Wykazano, że powiązane strukturalnie sekwencje analogowe białka receptora naskórkowego o aktywności kinazy tyrozynowej
(EGFR/HER1, HER2, HER3 i HER4) nie reagują krzyżowo w teście cobas® EGFR Mutation Test w przypadku dodania przed
procedurą amplifikacji/detekcji do roztworu podstawowego wyizolowanego DNA potencjalnej sekwencji reagującej krzyżowo
w liczbie kopii genomowych równoważnej 50 ng na reakcję PCR. Uwzględniono warunki kontrolne bez dodatku DNA
plazmidowego. Wyniki wykazały, że obserwowane mutacje dla wszystkich 10 przebadanych próbek FFPET były zgodne
z oczekiwanymi mutacjami określonymi w drodze sekwencjonowania zarówno w obecności, jak i przy braku dodanego DNA
plazmidowego genu HER. Dodatkowo pod kątem reaktywności krzyżowej przebadano mutację L747S w eksonie 19. genu
EGFR. Wyniki wykazały, że test cobas® EGFR Mutation Test reaguje krzyżowo z mutacją L747S w eksonie 19. genu EGFR.
Substancje wpływające na wynik testu
Wykazano, że triglicerydy (≤ 37 mM, granica podwyższonego stężenia, zalecana przez Clinical and Laboratory Standards
Institute [CLSI]22) i hemoglobina (≤ 2 mg/ml, granica podwyższonego stężenia, zalecana przez CLSI22) nie zakłócają działania
testu cobas® EGFR Mutation Test w przypadku dodania potencjalnej substancji zakłócającej podczas procedury
przygotowania próbki na etapie lizy.
Wykazano, że próbki zawierające do 85% tkanki martwiczej nie zakłócają działania testu cobas® EGFR Mutation Test.
Odporność na błędy
Odporność na błędy testu cobas® EGFR Mutation Test określono z wykorzystaniem jednej próbki FFPET mutacji L858R
genu kodującego EGFR z poziomem mutacji wynoszącym 22%. Próbkę do analizy podzielono na 100 osobnych skrawków
o grubości 5 µm. DNA wyizolowano z każdego skrawka za pomocą zestawu do przygotowywania próbek cobas® DNA
Sample Preparation Kit. Dla każdego ze 100 skrawków dla próbki przebadano pojedyncze powtórzenie wyizolowanego DNA.
100% wyników powtórzeń zostało oznaczonych za pomocą testu cobas® EGFR Mutation Test jako „Mutation Detected” dla
mutacji L858R, co oznacza, że odsetek wyników fałszywie ujemnych wyniósł 0%.
Powtarzalność
Powtarzalność testu cobas® EGFR Mutation Test poddano ocenie z wykorzystaniem sześciu próbek FFPET i obejmowała
ona: 2 próbki naturalnie występujących sekwencji; 4 próbki zawierające odpowiednio mutację w postaci delecji w eksonie 19.,
mutacje S768I i G719X, mutacje L858R i T790M oraz mutację w postaci insercji w eksonie 20. Próbki te badało dwukrotnie
dwóch operatorów, używając dwóch różnych serii odczynników i dwóch analizatorów cobas z 480 w ciągu 4 dni. Odsetek
prawidłowych rozpoznań testu cobas® EGFR Mutation Test wyniósł 98% (188/192).
Powtarzalność przygotowywania próbek
Powtarzalność działania zestawu do przygotowywania próbek DNA Sample Preparation Kit przebadano z użyciem skrawków
uzyskanych z trzech bloków z próbkami FFPET — jednego zawierającego delecję w eksonie 19., jednego z mutacją L858R
oraz jednego z sekwencją występującą naturalnie. Każdą próbkę badano w dwóch powtórzeniach w każdym ośrodku
każdego dnia. Skrawki danej próbki zostały poddane randomizacji i przebadane w ciągu sześciu dni w trzech ośrodkach
przez jednego operatora w każdym ośrodku, z użyciem jednego analizatora cobas z 480 w każdym ośrodku, trzech serii
zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit oraz jednej serii testu cobas EGFR Mutation Test. Każdego dnia każdy
operator prowadził izolację i analizę DNA pochodzącego z dwóch skrawków NSCLC FFPET w przypadku każdej próbki
z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test. W ciągu sześciu dni prowadzenia testów dla wszystkich próbek uzyskano
ważne i prawidłowe wyniki. Dla połączenia wszystkich próbek i operatorów odsetek prawidłowych rozpoznań testu cobas®
EGFR Mutation Test wyniósł 100% (108/108).
OCENA SKUTECZNOŚCI KLINICZNEJ
Powtarzalność kliniczna
Przeprowadzono badanie zewnętrzne w celu oceny powtarzalności testu cobas® EGFR Mutation Test z udziałem
3 zewnętrznych ośrodków badawczych (2 operatorów na ośrodek) i użyciem 3 serii odczynników przez 5 niekolejnych dni
badania z 13-elementowym panelem próbek DNA uzyskanych ze skrawków FFPET próbek NSCLC z naturalnie występującą
sekwencją (ang. wild type, WT) oraz obarczonych mutacją (ang. mutant type, MT). Ten panel obejmował mutację L858R
w eksonie 21. oraz pięć różnych mutacji w eksonie 19. w postaci delecji. Na 92 cykle pracy 90 (97,8%) było prawidłowych.
Ogółem dla każdego z 13 członów panelu w 90 ważnych cyklach pracy wykonano 2340 testów; wszystkie wyniki testu były
ważne. Nie stwierdzono wyników Mutation Detected w 180 ważnych testach dla elementów panelu WT, co skutkowało 100%
zgodnością. W przypadku 10 spośród 12 elementów panelu MT uzyskano zgodność rzędu 100%. Dla elementu
EX19_2240_2257del18 — 5% mutacji panelu zgodność wyniosła 62,8% (67 ze 180 wyników testu stanowiły wyniki Mutation
not Detected). Dla elementu EX19_2240_2257del18 — 10% mutacji panelu zgodność wyniosła 99,4% (1 ze 180 wyników
testu był wynikiem Mutation not Detected). Wyniki według ogólnej zgodności przedstawiono w tabeli 17 poniżej. Współczynnik
zmienności (CV) wyniósł <6% w przypadku wszystkich elementów panelu mutacji. W przypadku każdego elementu panelu
wartość CV wyniosła <3,5%. Dla kontroli zewnętrznej ogólna wartość CV wyniosła <1,3%. Wartość procentowa CV wyniosła
<0,5% między seriami i <1,2% w ramach serii.
06356583001-06PL
26
Doc Rev. 6.0
Tabela 17
Ogólne oszacowania zgodności według elementów panelu w badaniu powtarzalności
testu cobas® EGFR Mutation Test
Człon panelu
Liczba ważnych
testów
Zgodność (n)
Odsetek zgodności
(95% CI)a
Naturalnie występująca
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_ 2235_2249del15 — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_ 2235_2249del15 — 10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2236_2250del15 — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2236_2250del15 — 10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2239_2248>C — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2239_2248>C — 10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2240_2254del15 — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2240_2254del15 — 10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2240_2257del18 — 5% mutacji
180
113
62,8 (55,3; 69,9)*
EX19_2240_2257del18 — 10% mutacji
180
179
99,4 (96,9; 100,0)*
EX21_ 2573T>G=L858R — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX21_ 2573T>G=L858R — 10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
Uwaga: Wyniki uznawano za zgodne, gdy dla elementu panelu mutacji uzyskano ważny wynik Mutation Detected lub gdy dla
elementu panelu sekwencji występujących naturalnie uzyskano ważny wynik Mutation Not Detected.
a
95% CI = 95% przedział ufności na podstawie dokładnej metody dwumianowej.
®
* Czułość analityczna testu cobas EGFR Mutation Test w przypadku detekcji tej mutacji jest większa niż 10% z zastosowaniem
standardowej początkowej ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
Korelacja z metodą referencyjną w przypadku korzystania z próbek z badania fazy 3.
Skuteczność kliniczną testu cobas® EGFR Mutation Test oceniono poprzez porównanie z dwiema metodami referencyjnymi
— dwukierunkowym sekwencjonowaniem 2X metodą Sangera oraz ilościowym równoległym sekwencjonowaniem na wielką
skalę (MPS) — korzystając z 487 utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki guza płuc pochodzących
od pacjentów z zaawansowanym NSCLC, których poddano badaniu przesiewowemu w ramach badania fazy 3. EURTAC
dotyczącego stosowania erlotynibu w porównaniu z chemioterapią opartą na cisplatynie23, 24. Charakterystyka kliniczna
i demograficzna pacjentów, których próbki były dostępne do tego badania retrospektywnego, była porównywalna
z charakterystyką pacjentów spełniających pod innym względem kryteria kwalifikacji do badania (557), w przypadku których
próbki nie były dostępne do przeprowadzenia ponownego badania.
W ramach badania EURTAC badaniu przesiewowemu z użyciem skojarzenia testów opracowanych laboratoryjnie,
określanych wspólnie mianem oznaczenia badania klinicznego (ang. clinical trial assay, CTA) poddano łącznie
1276 pacjentów. Po wykluczeniu pacjentów niespełniających kryteriów badania oraz bez wyników oznaczenia CTA do
badania potencjalnie kwalifikowało się 1044 pacjentów. W grupie 1044 pacjentów kwalifikujących się do badania próbki
225 z nich uzyskały dodatni wynik dla mutacji w oznaczeniu CTA, próbki 792 pacjentów dały wynik naturalnie występującej
sekwencji w badaniu CTA, a 27 próbek miało niejednoznaczny wynik w badaniu CTA. W przypadku 487 spośród
1044 pacjentów potencjalnie kwalifikujących się do badania dostępne były próbki do przeprowadzenia ponownego badania
z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test.
Wszystkie 487 próbek przebadano metodą ślepej próby z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test oraz sekwencjonowania
metodą Sangera. Spośród nich w przypadku 406 próbek uzyskano ważne wyniki w teście cobas® i sekwencjonowaniu
metodą Sangera, 38 próbek dało wynik nieważny w teście cobas® i sekwencjonowaniu metodą Sangera, a w przypadku
38 i 5 próbek uzyskano nieważne wyniki odpowiednio tylko w sekwencjonowaniu metodą Sangera oraz tylko w teście cobas®.
Spośród 487 próbek dostępnych do ponownego badania z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test 444 próbki dały ważny
wynik w teście cobas® i zostały również przebadane z użyciem sekwencjonowania MPS. Spośród nich uzyskano
36 nieważnych wyników w drodze sekwencjonowania MPS; z tego powodu 408 próbek uzyskało ważne wyniki w teście
cobas® i sekwencjonowaniu MPS. Dokładność analityczna testu cobas® EGFR Mutation Test w porównaniu z każdą metodą
referencyjną została oceniona poprzez oszacowanie odsetka zgodności wyników dodatnich (ang. positive percentage
agreement, PPA), odsetka zgodności wyników ujemnych (ang. negative percentage agreement, NPA) oraz procentowej
zgodności ogółem (ang. overall percentage agreement, OPA), a także odpowiednich 95% przedziałów ufności dla mutacji
w postaci delecji w eksonie 19. i L858R łącznie oraz oddzielnie.
W kohorcie badania EURTAC test cobas® EGFR Mutation Test umożliwił wykrycie następujących mutacji w eksonie 19. genu
EGFR: 2234_2251>AAT, 2235_2249del15, 2240_2254del15, 2238_2252del15, 2240_2257del18, 2236_2244del9,
2236_2263>GAAGCAT, 2236_2250del15, 2236_2252>AT, 2237_2255>T, 2237_2257>TCT, 2239_2248>C, 2239_2251>C,
2237_2251>AAC, 2239_2253>CAA, 2239_2256del18, 2239_2257>GT, oraz 2237_2253>TTGCT. Test cobas® EGFR
Mutation Test umożliwił również wykrycie następujących mutacji w eksonie 21. genu EGFR w postaci substytucji L858R:
2573 T>G. Spośród mutacji wykrytych w kohorcie badania EURTAC wykazano czułość analityczną w odniesieniu do mutacji
przedstawionych w tabeli 4 powyżej.
06356583001-06PL
27
Doc Rev. 6.0
W analizie zgodności uwzględniono łącznie 406 próbek z ważnymi wynikami testu cobas® i sekwencjonowania metodą
Sangera. Wartość PPA pomiędzy testem cobas® EGFR Mutation Test i sekwencjonowaniem metodą Sangera wyniosła
96,6% (95% CI: od 91,5% do 98,7%), a wartość NPA — 88,3% (95% CI: od 84,1% do 91,5%) w przypadku łącznej analizy
delecji w eksonie 19. i mutacji L858R, co przedstawiono w tabeli 18. Wartość OPA wyniosła 90,6% z dolną granicą 95%
przedziału ufności przekraczającą 87%. Wartości PPA, NPA oraz OPA w przypadku detekcji mutacji w postaci delecji
w eksonie 19. przekroczyły 92%. Wartości PPA, NPA oraz OPA w przypadku detekcji mutacji L858R przekroczyły 95%.
Tabela 18
Porównanie testu cobas® EGFR Mutation Test z sekwencjonowaniem metodą Sangera
w przypadku detekcji mutacji w postaci delecji w eksonie 19. genu EGFR i mutacji L858R
Wyniki testu
®
cobas dla
mutacji w genie
EGFR
MD
MND
Ogółem
PPA (95% CI)
NPA (95% CI)
OPA (95% CI)
Wynik sekwencjonowania metodą Sangera
Wyniki łącznie
Mutacja w eksonie 21.
MD
MND
Ogółem
MD
MND
Ogółem
MD
MND
Ogółem
112
4
116
34
256
290
146
260
406
71
2
73
25
308
333
96
310
406
41
2
43
9
354
363
50
356
406
112/116 = 96,6% (91,5%; 98,7%)
256/290 = 88,3% (84,1%; 91,5%)
368/406 = 90,6% (87,4%; 93,1%)
71/73 = 97,3% (90,5%; 99,2%)
308/333 = 92,5% (89,2%; 94,9%)
379/406 = 93,3% (90,5%; 95,4%)
41/43 = 95,3% (84,5%; 98,7%)
354/363 = 97,5% (95,4%; 98,7%)
395/406 = 97,3% (95,2%; 98,5%)
W analizie zgodności uwzględniono łącznie 408 próbek z ważnymi wynikami testu cobas® i sekwencjonowania MPS. Po
porównaniu pomiędzy łącznymi wynikami testu cobas® EGFR Mutation Test i sekwencjonowania MPS w przypadku detekcji
delecji w eksonie 19. i mutacji punktowej L858R wartości PPA oraz NPA wyniosły odpowiednio 94,0% (95% CI: od 89,1% do
96,8%) i 97,7% (95% CI: od 95,0% do 98,9%), co przedstawiono w tabeli 19. Wartość OPA wyniosła 96,3% z dolną granicą
95% przedziału ufności wynoszącą 94,0%. Wartości PPA, NPA i OPA w przypadku wykrywania delecji w eksonie 19.
przekroczyły 95%, a wszystkie dolne granice 95% przedziału ufności były wyższe od 90%. Wartości PPA, NPA i OPA
w przypadku detekcji mutacji L858R również przekroczyły 95%, a wszystkie dolne granice 95% przedziału ufności
wyniosły 95% z wyjątkiem PPA (90%), co wynikało z małej liczby wykrytych mutacji L858R.
Tabela 19
Porównanie testu cobas® EGFR Mutation Test z sekwencjonowaniem MPS
w przypadku detekcji mutacji w postaci delecji w eksonie 19. genu EGFR i mutacji L858R
Wyniki testu
cobas® dla
mutacji w genie
EGFR
MD
MND
Ogółem
PPA (95% CI)
NPA (95% CI)
OPA (95% CI)
Wyniki MPS
Wyniki łącznie
Mutacja w eksonie 21.
MD
MND
Ogółem
MD
MND
Ogółem
MD
MND
Ogółem
142
9
151
6
251
257
148
260
408
94
4
98
1
309
310
95
313
408
48
5
53
5
350
355
53
355
408
142/151 = 94,0% (89,1%; 96,8%)
251/257 = 97,7% (95,0%; 98,9%)
393/408 = 96,3% (94,0%; 97,8%)
94/98 = 95,9% (90,0%; 98,4%)
309/310 = 99,7% (98,2%; 99,9%)
403/408 = 98,8% (97,2%; 99,5%)
48/53 = 90,6% (79,7%; 95,9%)
350/355 = 98,6% (96,7%; 99,4%)
398/408 = 97,5% (95,5%; 98,7%)
Dane dotyczące wyniku klinicznego
Badanie EURTAC to wieloośrodkowe, randomizowane badanie 3. fazy, prowadzone metodą otwartej próby w celu
porównania stosowania produktu leczniczego Tarceva® (erlotynib) ze standardową chemioterapią dwulekową związkami
platyny jako leczenia pierwszego rzutu u pacjentów z zaawansowanym NSCLC, u których nie stosowano chemioterapii
i którzy są obarczeni mutacjami w postaci delecji w eksonie 19. lub substytucji w eksonie 21. (L858R) genu EGFR ocenionych
z użyciem oznaczenia badania klinicznego (CTA). Badanie było sponsorowane przez hiszpański zespół badań nad rakiem
płuca (Spanish Lung Cancer Group, SLCG). Do udziału w badaniu zakwalifikowano łącznie 174 pacjentów. Wyniki badania
wykazały, że w przypadku pacjentów otrzymujących produkt leczniczy Tarceva® stwierdzono statystycznie istotną różnicę
w długości okresu przeżycia bez progresji choroby (PFS) (mediana wartości PFS 10,4 miesiąca w por. z 5,1 miesiąca)
w porównaniu z pacjentami leczonymi chemioterapią ze współczynnikiem hazardu wynoszącym 0,34 (p <0,0001, 95% CI
[0,23; 0,49]). Odsetek odpowiedzi na leczenie w przypadku grupy pacjentów otrzymujących produkt leczniczy Tarceva® był
wyższy niż u pacjentów leczonych z użyciem chemioterapii (odpowiednio 65,1% i 16,1%). Nie zaobserwowano istotnej
różnicy w całkowitym czasie przeżycia (ang. overall survival, OS) w obu grupach, gdyż 76% pacjentów otrzymujących
standardową chemioterapię przeniesiono do grupy leczonej z użyciem produktu leczniczego Tarceva®.
Spośród 174 pacjentów włączonych do udziału w badaniu EURTAC 134 przypadki (77% populacji badanej, w tym
69 pacjentów z grupy otrzymującej erlotynib oraz 65 pacjentów z grupy leczonej z użyciem chemioterapii) były dostępne do
ponownego badania i zostały przebadane retrospektywnie z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test. Spośród
134 przypadków przebadanych ponownie z użyciem testu cobas® dla 116 pacjentów (59 pacjentów z grupy otrzymującej
erlotynib oraz 57 pacjentów z grupy leczonej z użyciem chemioterapii) uzyskano wynik „Mutation Detected” w teście cobas®
EGFR Mutation Test. Analiza podgrupy 116 pacjentów wykazała, że osoby leczone z użyciem produktu leczniczego Tarceva
06356583001-06PL
28
Doc Rev. 6.0
cechowało istotne wydłużenie czasu PFS (mediana wartości PFS 10,4 miesiąca w porównaniu z 5,4 miesiąca) i mniejsze
prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia progresji choroby lub zgonu (HR = 0,34; 95% CI [0,21; 0,54], p <0,0001) niż
w przypadku pacjentów leczonych z użyciem chemioterapii (rysunek 2). Częstość odpowiedzi na leczenie w grupie leczonej
produktem leczniczym Tarceva była większa w porównaniu z grupą otrzymującą chemioterapię (odpowiednio 59,3% i 14,0%).
Nie zaobserwowano istotnej różnicy w wartości OS pomiędzy dwiema grupami. Obserwowana korzyść kliniczna w podgrupie
pacjentów przebadanych z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test była porównywalna ze stwierdzoną w całej populacji
badania (tabela 20 poniżej).
Przeprowadzono dodatkową analizę skuteczności w celu uwzględnienia pacjentów, dla których uzyskano dodatni wynik
w teście cobas® EGFR Mutation Test i ujemny lub nieważny wynik w oznaczeniu CTA. Dane uzyskane w najgorszym
scenariuszu (przy założeniu współczynnika hazardu wynoszącego 1 dla pacjentów z dodatnim wynikiem w teście cobas®
i ujemnym wynikiem oznaczenia CTA) wykazały współczynnik hazardu wynoszący 0,42 (95% CI [0,26; 0,57]).
Rysunek 2
Wykres Kaplana-Meiera dla wartości PFS według metody leczenia
w przypadku pacjentów z mutacją wykrytą w teście cobas® EGFR Mutation Test (ocena badacza)
1,0
Prawdopodobieństwo przeżycia
0,9
0,8
HR: 0,34
P <0,0001
0,7
0,6
0,5
0,4
Erlotynib (N=59)
Mediana: 10,4 miesiąca
0,3
0,2
Chemioterapia (N=57)
Mediana: 5,4 miesiąca
0,1
0,0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
Miesiące od zakończenia leczenia
Tabela 20
Korzyści kliniczne w przypadku pacjentów przebadanych z użyciem testu cobas® EGFR Mutation Test są
porównywalne z obserwowanymi w populacji badania EURTAC
Parametr
PFS
Mediana (miesiące)
Współczynnik hazardu
95% przedział ufności
współczynnika hazardu
Wartość p
(test logarytmiczny rang)
Populacja z dodatnim wynikiem testu cobas®
n = 116
Chemioterapia
Erlotynib
n = 57
n = 59
5,4
10,4
EURTAC
n = 173*
Chemioterapia
Erlotynib
n = 87
n = 86
5,1
10,4
0,34
[0,21; 0,54]
0,34
[0,23; 0,49]
<0,0001
<0,0001
*Uwaga: Jeden pacjent wycofał zgodę po zakończeniu badania EURTAC, co skutkowało zestawem danych o wielkości n = 173.
06356583001-06PL
29
Doc Rev. 6.0
PIŚMIENNICTWO
1. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nature Reviews
Cancer. 2007;7:169-181.
2. Pao W, Chmielecki J. Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Nat Rev Cancer.
2010;10:760-774.
3. Zhou C, Wu Y-L, Chen G, et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR
mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3
study. Lancet Onc. 2011; 12:735-742
4. Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, et al. Clinical outcomes in non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations:
pooled analysis. J Cell Mol Med 2010;14:51-69.
5. Mok TS, Wu Y-L, Thongprasert S, et al. Gefitinib or carboplatin–paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. New England
Journal of Medicine. 2009.
6. Maemondo M, Inoue A, Kobayashi K, et al. Gefitinib or chemotherapy for non–small-cell lung cancer with mutated EGFR.
New England Journal of Medicine. 2010;362:2380-2388.
7. Rosell R, Moran T, Queralt C, et al. Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. New
England Journal of Medicine. 2009;361:958-969.
8. Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath N, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. New
England Journal of Medicine. 2008;359:366-377.
9. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying
responsiveness of non–small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 2004;350:2129-2139.
10. Jackman DM, Miller VA, Cioffredi L-A, et al. Impact of epidermal growth factor receptor and KRAS mutations on clinical
outcomes in previously untreated non–small cell lung cancer patients: Results of an online tumor registry of clinical trials.
Clinical Cancer Research. 2009;15:5267-5273.
11. Pao W, Chmielecki J. Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Nat Rev Cancer.
2010;10:760-774.
12. D'Addario G, Fruh M, Reck M, Baumann P, Klepetko W, Felip E. Metastatic non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical
Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2010;21 Suppl 5:v116-119.
13. Keedy VL, Temin S, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology Provisional Clinical Opinion: Epidermal
Growth Factor Receptor (EGFR) Mutation Testing for Patients With Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer Considering
First-Line EGFR Tyrosine Kinase Inhibitor Therapy. J Clin Oncol.
14. Balak MN, Gong Y, Riely GJ, et al. Novel D761Y and common secondary T790M mutations in epidermal growth factor
receptor-mutant lung adenocarcinomas with acquired resistance to kinase inhibitors. Clin Cancer Res. 2006;12:64946501.
15. Rosell R, Molina MA, Costa C, et al. Pretreatment EGFR T790M Mutation and BRCA1 mRNA Expression in ErlotinibTreated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer Patients with EGFR Mutations. Clin Cancer Res. 2011;17:1160-1168.
16. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition. 2011.
17. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in
polymerase chain reactions. Gene. 93:125-128.
18. Chosewood, L.C. and Wilson, D.E. Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Fifth #
edition.(CDC) 21-1112. 2009.
19. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections.
Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Villanova, PA:CLSI, 2005.
20. Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic.
21. Costa DB, Nguyen KS, Cho BC, Sequist LV, Jackman DM, Riely GJ, Yeap BY, Halmos B, Kim JH, Jänne PA, Huberman
MS, Pao W, Tenen DG, Kobayashi S. Effects of erlotinib in EGFR mutated non-small cell lung cancers with resistance to
gefitinib. Clin Cancer Res. 2008 Nov 1;14(21):7060-7
22. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP7-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved
Guidelines – Second Edition, Appendix D 2005.
23. Tarceva® (erlotinib) Package Insert
24. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced
EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. The
Lancet Oncology. 2012;13 v3:239-246.
06356583001-06PL
30
Doc Rev. 6.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 4.0
07/2013
Zaktualizowane instrukcje dotyczące przechowywania i użytkowania.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche.
Doc Rev. 5.0
10/2013
Zaktualizowano rozdział Urządzenia i oprogramowanie.
Dodano „lub No Mutation Detected” jako typ wyniku testu w tabeli 2 w rozdziale INTERPRETACJA
WYNIKÓW.
Zaktualizowano opisy na stronie z ujednoliconymi symbolami, znajdującej się na końcu ulotki
dołączonej do opakowania.
Z informacji o prawach autorskich usunięto tekst „Wszystkie prawa zastrzeżone”.
Doc Rev. 6.0
11/2013
Dokument ujednolicono i zaktualizowano o dodatkowe dane z badań.
Zaktualizowano adres, aby odzwierciedlał fakt, że autoryzowanym producentem jest RDG.
Zaktualizowano opisy na stronie z ujednoliconymi symbolami, znajdującej się na końcu ulotki
dołączonej do opakowania.
06356583001-06PL
31
Doc Rev. 6.0
Wyprodukowano w Stanach Zjednoczonych
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Distributed by
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273-3433)
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
COBAS, COBAS Z i AMPERASE są znakami towarowymi firmy Roche.
Technologia zapobiegania zanieczyszczeniu preparatu enzymu AmpErase resztkami jest chroniona patentem USA
nr 5,035,996 oraz jego zagranicznymi odpowiednikami, będącymi w posiadaniu firmy Invitrogen Corporation; udostępniono na
zasadzie licencji firmie Roche Molecular Systems, Inc.
EPPENDORF jest znakiem towarowym firmy Eppendorf AG.
PIPET-AID jest znakiem towarowym firmy Drummond Scientific.
NANODROP jest znakiem towarowym firmy Thermo Scientific.
© 2013 Roche Molecular Systems, Inc.
11/2013
Doc Rev. 6.0
06356583001-06PL
06356583001-06
32
Doc Rev. 6.0
Na etykietach produktów diagnostycznych Roche PCR stosuje się obecnie następujące oznaczenia.
Oprogramowanie pomocnicze
Kod partii
Autoryzowany Przedstawiciel we
Wspólnocie Europejskiej
Zagrożenie biologiczne
Arkusz kodów kreskowych
Numer katalogowy
SW
Sprawdź w instrukcji obsługi
Wyłącznie do oceny działania w badaniach IVD
Zawartość wystarczająca na <n> testów
Dolna granica przypisanego zakresu
Zawartość zestawu
Producent
Dystrybucja
Przechowywać z dala od światła
Wyrób do diagnostyki in vitro
Przestrzegać zakresu temperatury
Plik definicji testów
Użyć przed
TDF
Górna granica przypisanego zakresu
Ten produkt spełnia wymogi dyrektywy Wspólnoty Europejskiej 98/79/WE dotyczącej diagnostycznych
urządzeń medycznych do stosowania in vitro.
Linia pomocy technicznej dla klientów w Stanach Zjednoczonych 1-800-526-1247
06356583001-06PL
33
Doc Rev. 6.0

cobas EGFR Mutation Test

Transkrypt

Podobne dokumenty

Innowacyjne wdrażanie standardów postępowania medycznego

Analiza DNA - praktyka - Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Jak pobrać materiał genetyczny do testu DNA

manipulacje i mutacje DNA

Przykładowe zadania z BioLoGii

Andrzej Kasprzak