Bioreaktor membranowy Produkcja alkoholu przez drożdże

Bioreaktor membranowy Produkcja alkoholu przez drożdże

Wrocław, 4.01.17
Bioreaktor membranowy
Produkcja alkoholu przez drożdże Saccharomyces cerevisiae z
permeatu serwatki
(zajęcia odbywać się będą w sali nr 32 – C6)
1. Wstęp
Reaktor membranowy jest rodzajem reaktora działającego w trybie ciągłym, który ma na
celu immobilizację objętościową katalizatora. W bioreaktorze membranowym za sprawą filtra
membranowego miejsce ma zatrzymanie komórek, a więc ich recyrkulacja.
W procesach okresowych komórki rozmnażają się do momentu wystąpienia:
1) Krytycznego
stężenia
czynnika
ograniczającego;
zwykle
zużycia
C
lub
rozpuszczonego O2
2) Krytycznego stężenia hamującego wzrost (np. stężenia etanolu w fermentacji
alkoholowej lub kwasu mlekowego w fermentacji mlekowej)
Komórki są głównym źródłem przemian biochemicznych, dlatego szybkość procesu
fermentacji uzależniona jest od koncentracji komórek (maks. 50 – 80 g. s.m./l). Ograniczenie
koncentracji biomasy w bioreaktorze zmniejsza szybkość fermentacji. Stan ten spowodował
podjęcie próby przełamania tych barier przez wprowadzenie tzw. kultur o wysokiej
koncentracji komórek oraz unieruchomienie komórek na różnego rodzaju nośnikach.
Osiągnięcie bardzo wysokich stężeń komórek (wielokrotnie przewyższających ich naturalne
stężenie) pozawala na znaczne przyspieszenie procesów fermentacyjnych i zmniejszenie
pojemności bioreaktorów, częściowe oczyszczenie metabolitów na membranie lub z innej
strony pozyskiwanie z nich produktów.
Bioreaktory połączone z zewnętrznym filtrem membranowym nazywane są bioreaktorami
membranowymi. Separacja membranowa ma wiele zalet: niskie koszty inwestycyjne i
eksploatacyjne, wysoką selektywność rozdziału, łagodne oddziaływanie mechaniczne na
komórki, neutralność chemiczna względem pożywek i możliwość pracy ciągłej.
Filtr membranowy o przepływie stycznym do przegrody filtracyjnej zatrzymuje cząstki
zawiesiny o rozmiarach 0.02 do 10 μ, a więc o wielkości typowych komórek. Przepływ z
dużą prędkością styczną do powierzchni membrany zapobiega zjawisku jej polaryzacji i
osadzaniu się na jej powierzchni komórek. Najczęściej stosowane membrany zbudowane są z
octanu celulozy, polimerów syntetycznych (polisulfonu, polipropylenu) oraz ceramiczne. Te
ostatnie wykazują największą wytrzymałość mechaniczną oraz możliwość wielokrotnej
sterylizacji.
W procesach biotechnologicznych związek między koncentracją biomasy komórkowej i
ilością produkowanych przez nią metabolitów może przedstawić się następująco:
1) Metabolity tworzone są w czasie wzrostu biomasy a i ich ilość jest proporcjonalna do
stężenia biomasy (matabolity I – rzędowe)
2) Metabolity tworzone są równolegle ze wzrostem komórek oraz po zatrzymaniu ich
wzrostu w fazie stacjonarnej (metabolizm mieszany)
3) Metabolity tworzone są tylko w fazie stacjonarnej (metabolity II – rzędowe).
Ważnym czynnikiem jest czas trwania hodowli i wynikające stąd konsekwencje,
objawiające się śmiercią komórek zamkniętych w pętli fermentacyjnej. W rzeczywistości w
pożywce mamy mieszaną populację komórek żywych i martwych, co zmniejsza efektywność
bioreaktora, utrudniając jednocześnie ciągłą separację komórek. Stan ten wymusza
stosowanie częściowego odbioru biomasy komórkowej (ang. bleeding), aby stworzyć miejsce
dla nowych komórek. Odbioru dokonuje się pomiędzy bioreaktorem a modułem
membranowych. Wielkość strumienia odbioru wynosi zwykle około 2 – 10% w stosunku do
objętości świeżej pożywki wprowadzonej do bioreaktora.
Problem związanym ze szybkim przepływem komórek przez układ aparaturowy są
mechaniczne oddziaływania, mogące uszkodzić ściany komórkowe mikroorganizmów i w
konsekwencji spowodować ich lizę i uwalnianie substancji wewnątrzkomórkowych.
Mechaniczne oddziaływania, nazywane siłami ścinającymi, występują tam, gdzie stosuje się
intensywne mieszanie lub przetłaczanie cieczy w rurach i innych elementach aparatury.
Głównym źródłem takich uszkodzeń są mieszadła mechaniczne (łopatkowe), szczeliny
zaworów, elementy pomp, a także wysokie wartości sił ścinających na membranie. Mamy
więc do czynienia z „konfliktem interesów’, gdyż dążenie do dużych wartości strumienia
wzdłuż membrany skutkuje ograniczeniem negatywnego zjawiska osadzania się komórek na
membranie i jednocześnie powoduje ich niszczenie.
Ulokowanie membrany na wylocie z bioreaktora ma głownie na celu zatrzymanie
aktywnej biomasy. Do tego celu stosuje się membrany mikrofiltracyjne. Jeśli natomiast,
mamy na celu zatrzymanie jeszcze nieprzereagowanego substratu musimy zastosować
membranę o mniejszej porowatości, np. ultra- lub nanofiltracyjną. By jednak ograniczyć
fouling separacja powinna być dwustopniowa:
1) Separacja mikroorganizmów – mikrofiltracja
2) Separacja permeatu uzyskanego z mikrofiltracji w celu odzyskania substratu –
nanofiltracja
Prowadzenia hodowli w reaktorach membranowych może mieć na celu:
1) Obniżenie zawartości pewnych składników (biodegradacja), a więc interesuje nas
stężenie strumienia wylotowego z reaktora (permeatu) względem wlotowego –
generalnie powinno być niższe
2) Produkcja pewnych składników przez mikroorganizmy, a więc interesuje nas
obecność i stężenie produktu w permeacie.
Reaktor membranowy jest rodzajem reaktora pracującego w systemie ciągłym, a więc w
celu jego opracowania należy wcześniej rozpoznać proces podstawowy jakim jest reaktor
ciągły. Wydajność takiego procesu jest zazwyczaj wyższa niż hodowli okresowej, a nawet
może być korzystny proces półciągły, w którym unika się wysokich częstotliwości mutacji
mikrobiologicznych. W procesach półciągłych można również uniknąć trudności związanych
z utrzymaniem jałowości procesu. Istota hodowli ciągłej polega na tym, że po wstępnym
okresie namnażania drobnoustrojów rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli strumieniem
świeżego podłoża, połączone z ciągłym odbiorem, przy zachowaniu stałej objętości.
Postępowanie takie umożliwia przedłużenie na stosunkowo długi czas logarytmicznej fazy
rozwoju drobnoustrojów. Bioreaktory przeznaczone do hodowli drobnoustrojów metodą
ciągłą pracują na zasadzie turbidostatu – utrzymywania stałego zmętnienia pożywki lub
gęstości optycznej bakterii, albo chemostatu, tj. utrzymywania stałego stężenia określonego
substratu na stałym poziomie. W hodowli ciągłej ustala się równowaga pomiędzy szybkością
zużywania substratu S na syntezę biomasy X a szybkością jej dostarczania:
dX
dS
Y
dt
dt
gdzie: Y – współczynnik wydajności ze zużytego substratu
Najprostszy model kinetyki zaproponował Monod:
   max
CS
K M  CS
gdzie: μmax – maksymalna właściwa szybkość wzrostu w warunkach nielimitowanych, KS
– stała Monoda, CS – stężenie substratu limitującego w równowadze.
W przypadku reaktora działającego w trybie ciągłym operuje się pojęciem czasu
przebywania czyli:

V

V

gdzie: V – objętość reaktora, V - strumień pożywki (=strumień płynu pohodowlanego)
Reaktor membranowy jest modyfikacją reaktora ciągłego i polega ona na umieszczeniu
membrany na strumieniu wylotowym, by zwiększyć stężenie komórek i tym samym
wydajność procesu.
2. Wykonanie eksperymentu
Hodowla ciągła
Przeprowadzenie fermentacji permeatu serwatki w bioreaktorze membranowym jest
skomplikowanym i wieloetapowym procesem.
W pierwszej kolejności należy opracować kinetykę dobranego szczepu biodegradującego.
W tym celu należy prowadzić hodowle w reaktorze działającym w trybie ciągłym (stały
odbiór płynu pohodowlanego przy jednoczesnym dozowaniu pożywki, jaką jest roztwór
laktozy) dla różnych stężeń równowagowych laktozy w podłożu (nie dozowaniu!), ponieważ
w stanie ustalonym i dla odpowiednio dobranego czasu przebywania, stężenie laktozy w
strumieniu wylotowym powinno być stałe. Z racji braku możliwości przeprowadzenia
hodowli dla różnych stężeń (różnych wartości τ), podczas laboratorium ograniczymy się do
jednego czasu wynoszącego 5h i określimy czy jest wystarczający by zredukować zawartość
laktozy w strumieniu wlotowym.
Do tego celu należy podłączyć do reaktora (Rys.1) zbiornik (Z1) ze sterylnym r-rem
laktozy (2gL-1) (stężenie zostanie podane w czasie zajęć) i ustawić obroty pompy P1, tak by
strumień był odpowiedni dla czasu przebywania wynoszącego 5h (objętość reaktora 1L). W
reaktorze znajduje się hodowla szczepu Saccharomyces cerevisiae na podłożu laktozowym.
Odbiór nadmiaru płynu pohodowlanego ma miejsce po osiągnięciu wysokości h1, który jest
wysokością przelewu.
Rys. 1. Schemat reaktora ciągłego
Każda z grup monitoruje stężenie laktozy (DNS) oraz biomasy w strumieniu wylotowym
z reaktora. Stężenia laktozy obliczamy z krzywych standardowych zamieszczonych w
instrukcji na temat mikrofiltracji, natomiast stężenie biomasy należy obliczyć na podstawie
krzywej standardowej, wykonanej na podstawie oznaczenia zawartości suchej masy:
Cbiomasy[g·L-1]=0.5·A550nm
Należy również zbierać próbki, by wykonać analizę zawartości alkoholu przy pomocy
chromatografu gazowego – zostanie wykonana po za zajęciach przez prowadzącego, a wyniki
zostaną dostarczone na maila.
Przyjmując, że stan ustalony następuje po 4 wymianach objętości reaktora, grupa
realizująca zadanie laboratoryjne w piątek uzyska taki stan. Wszystkie spośród grup powinny
wymienić się wynikami, ponieważ każda posiada inne dane:
1) Grupa czwartkowa – 815 – czas procesu od 0 do 4h – w trakcie pierwszej wymiany
objętości
2) Grupa czwartkowa – 1315 – czas procesu od 5 od 9h – koniec pierwszej i początek
drugiej wymiany objętości – uczestnicy pod koniec zajęć muszą podłączyć do reaktora
zbiornik pożywki, który musi zasilać reaktor przez noc
3) Grupa piątkowa – 815 – czas procesu 25 – 29 – stan ustalony
Hodowle okresowe
W celu porównania szybkości fermentacji ciągłej z procesem okresowym, równolegle
prowadzona będzie hodowla okresowa (zamknięta) w takich samych warunkach – próbki
należy pobierać co godzinę i analizować tak samo jak dla hodowli w systemie ciągłym.
Reaktor membranowy (realizowany w kolejnym tygodniu zajęciowym – 18-20.01.16)
Kolejnym etapem fermentacji jest prowadzenie go w reaktorze membranowym. Za
reaktorem działającym w sposób ciągły umieszcza się membranę mikrofiltracyjną (o średnicy
porów 0.14μm), która w sposób ciągły zatrzymuje populację komórkową w reaktorze.
Retentat z biomasą zawracany jest do bioreaktora, natomiast permeat, to płyn o zredukowanej
zawartości laktozy.
Podłączenie membrany do reaktora ma miejsce, gdy reaktor (ciągły) pracuje w stanie
ustalonym. Warunki ulegną zmianie i ponownie należy poczekać, aż stan procesu się
ustabilizuje, w związku z tym monitorujemy zawartość laktozy i białka w permeacie, mierząc
te stężenia co 0.5h. Strumień dozowanej pożywki musi być identyczny, jak odbieranego
permeatu. Jego wartość musi zostać ustawiona przy pomocy pompy nr (I).
Rys. 1. Schemat reaktora membranowego
W czasie eksperymentu nie odbieramy nadmiaru biomasy, więc mierzymy jej stężenie w
bioreaktorze, pobierając próbkę zawartości reaktora przez specjalnie przygotowaną do tego
rurkę, zapewniającą sterylność układu.
3. Wykonanie sprawozdania (całościowe – po drugiej części – po 20 stycznia)
TRYB OKRESOWY:
a) Obliczyć szybkość przekształcania laktozy (dc/dt) w hodowlach okresowych dla
całego procesu (wszystkie trzy grupy – ok 27h)
b) Obliczyć właściwą szybkość wzrostu biomasy dla danej hodowli okresowej
c) Wykreślić zależność stężenia laktozy, alkoholu oraz biomasy w zależności od czasu
dla hodowli okresowych
d) Obliczyć współczynnik wydajności biomasy (hodowle okresowe)
TRYB CIĄGŁY:
e) Wykreślić zależność stężenia laktozy, alkoholu oraz biomasy w zależności od czasu
dla reaktora ciągłego dążącego do stanu ustalonego
f) Obliczyć szybkość biodegradowania laktozy i wzrostu biomasy i produkcji alkoholu
dla czasu przebywania wynoszącego 5h
g) Obliczyć współczynnik wydajności biomasy dla hodowli ciągłej i porównać jego
wartość z uzyskaną z wyników dla hodowli okresowej
h) Wykreślić zależność stężenia laktozy, alkoholu w strumieniu wylotowym w reaktorze
membranowym w zależności od czasu
i) Wykreślić zależność stężenia biomasy w reaktorze membranowym od czasu
j) Policzyć i porównać wydajności produktu do zużytego substratu oraz powstającej
biomasy dla hodowli okresowej i ciągłej (dla 27h)
Opracowała: Dr inż. Magdalena Lech