Analiza ekstraktów roślinnych metodą chromatografii

Analiza ekstraktów roślinnych metodą chromatografii

Analiza ekstraktów roślinnych metodą chromatografii
cienkowarstwowej.
mgr inż. Paweł Szczeblewski
Światło i jego barwa.
Wrażenie barwy jest wynikiem zespołu zmian fizjologicznych wynikających z przekazywania impulsów
nerwowych wywołanych działaniem określonego promieniowania elektromagnetycznego na siatkówkę oka z
zakresu 400-800nm.
Zrównoważona mieszanina fal (fotonów) światła o długości fali od 400 do 800 nm i częstości drgao od
15
14
0,75x10 -3,75x10 Hz wywołuje wrażenie barwy białej (światło białe np. słoneczne, lampy kwarcowej czy
żarówki elektrycznej). Poprzez rozszczepienie takiej wiązki światła (np. w pryzmacie) możemy uzyskad wiązki
promieniowania o wąskim zakresie długości fal, czyli światło monochromatyczne. Właściwością oka ludzkiego
jest zdolnośd do rozróżniania poszczególnych rodzajów światła monochromatycznego i przypisywania im
konkretnych barw: fioletowej, niebieskiej, zielonej, żółtej, czerwonej i purpurowej (tabela 1). Światło o
pośrednich długościach fal ma barwę pośrednią, np. wiązka o długości fali 500 nm powoduje wrażenie barwy
niebieskozielonej, o długości 560 nm - barwy żółtozielonej itp.
Długośd fali światła monochromatycznego
absorbowanego [nm]
400
460
520
580
640
720
Barwa
dopełniająca
(obserwowana)
zielonożółta
żółta
purpurowa
niebieska
niebieskozielona
zielona
Barwa światła
absorbowanego
fioletowa
niebieska
zielona
żółta
czerwona
purpurowa
Tabela 1. Długośd fali a barwa światła.
Barwa poszczególnych substancji wynika z ich odziaływania ze światłem białym. Substancje chemiczne
przepuszczają to światło, pochłaniają je lub odbijają. Jeżeli cała wiązka światła widzialnego zostaje
przepuszczona substancja daje wrażenie przezroczystej, gdy wiązka zostaje odbita przez związek chemiczny
odnosimy wrażenie barwy białej, jeśli zaś całkowicie zaabsorbowana – wzrok nasz odbierze ją jako czarną.
Najczęściej jednak spotykamy się ze zjawiskiem częściowej wybiórczej absorpcji pewnych zakresów
promieniowania, co powoduje, że do oka dociera mieszanina fal przepuszczonych lub odbitych o wywołując
wrażenie barwy. Nasze zmysły odbierają wrażenie barwy dopełniającej, czyli wiązki niepochłoniętej z zakresu
widma widzialnego. Barwy dopełniające dla odp. długości fal światła zaabsorbowanego przedstawiono w
tabeli 1.
Przykładowo, przepuszczając promieo światła białego przez substancję, która pochłania prawie całe światło
niebieskie (o dł. fal 480 +/- 30 nm) będziemy obserwowad barwę żółtą, gdyż barwa żółta jest barwą
dopełniającą w stosunku do niebieskiej. Taką barwę możemy nazwad również "resztkową", ponieważ powstaje
w wyniku odjęcia światła niebieskiego od wiązki światła białego. O złożonej fizjologii procesu widzenia barw
świadczy fakt, że wrażenie barwy żółtej można wywoład zarówno przez zaadsorbowanie światła niebieskiego,
którego centrum odpowiada fali o dł. 480 nm, z światła białego o widmie ciągłym, jak i za pomocą światła o
jednej długości fali, tzn. 580 nm. Ponadto, wrażenie barwy żółtej można wywoład poprzez zmieszanie światła
czerwonego i zielonego. Znajomośd sposobu powstawania barwy jest istotna, ponieważ pozwala przewidywad
barwę związku chemicznego o określonym widmie UV-Vis w zakresie światła widzialnego.
Struktura związku a jego barwa.
Z chemicznego punktu widzenia ważne jest ustalenie zależności pomiędzy budową cząsteczki organicznej a jej
zdolnością do absorbowania określonego promieniowania widzialnego, co jest warunkiem wystąpienia barwy
substancji absorbującej.
Warunkiem barwności związku jest obecnośd ugrupowania atomowego, zwanego grupą chromoforową
(gr. chróma- kolor + gr. phorós- niosący). Podstawowe chromofory to ugrupowania wiązao nienasyconych, w
tym aromatycznych zawierających elektrony typu π (rys poniżej). Pod wpływem promieniowania świetlnego
(fotonów) następuje wzbudzenie cząsteczki, posiadającej takie ugrupowanie, które polega na przeniesieniu
elektronu wiązania π z orbitalu wiążącego na antywiążący (ze stanu podstawowego do jednego ze stanów
wzbudzonych). Powstanie barwy lub jej zmiana są zawsze związane z deformacją normalnej struktury
elektronowej cząsteczki.
Obecnośd w cząsteczce zw. organicznego jednej silnej grupy chromoforowej związanej z pierścieniem
aromatycznym jest wystarczająca, aby wywoład barwę związku. Pojedyncze słabe chromofory wprawdzie
powodują przesunięcie maksimum absorpcji związku z dalekiego nadfioletu (100-200nm) w kierunku widzialnej
granicy światła (400nm), ale nie są w stanie wywoład jego barwy. Warunkiem pojawienia się barwy jest
występowanie kilku takich ugrupowao sprzężonych lub skumulowanych ze sobą. Przedstawicielami połączeo
organicznych tego typu są m.in występujące w komórkach roślinnych naftochinony, z charakterystycznym
układem chinoidowym.
Barwniki roślinne i ich identyfikacja na podstawie barwy.
Barwniki roślinne są niezwykle istotne dla prawidłowego funkcjonowania roślin. Chlorofile i karotenoidy
uczestniczą w procesach fotosyntezy, flawonoidy biorą udział w procesach oksydoredukcyjnych i wykazują
właściwości owado- i grzybobójcze, jeszcze inne pełnią funkcję ekologiczną (atraktanty).
Związki te występują w komórkach roślinnych najczęściej w postaci związanej z cukrami (glikozydy), rzadziej z
białkami. Barwniki rozpuszczalne w wodzie (antocyjany, betalainy) znajdują się w cytozolu, natomiast te o
charakterze hydrofobowym występują w plastydach: chlorofil w chloroplastach, a karotenoidy w
chromoplastach.
Barwniki roślinne stanowią niejednolitą grupę związków pod względem budowy chemicznej. W zależności od
ich struktury wyróżnia się:
•
Chlorofile- oparte na bazie heterocyklicznych pierścieni pięcioczłonowych.
•
Karotenoidy (karoteny, ksantofile) – 40-węglowe terpenoidy.
β-karoten
•
Flawonoidy – oparte na szkielecie 2-fenylochromonu.
Pelargonidyna
•
Chinony – zawierające układ chinoidowy.
Juglon
Nośnikiem barwy w cząsteczkach barwników roślinnych jest zawsze sprzężony układ wielu wiązao podwójnych
najczęściej współdziałających z elektronami układów aromatycznych.
Jednym z bardziej znanych barwników roślinnych jest przedstawiony powyżej β-karoten (czerwony barwnik
marchwi i pomidora). Jest to związek z rodziny węglowodorów izoprenoidowych, w którego cząsteczce
występuje 11 sprzężonych ze sobą wiązao podwójnych.
W oparciu o strukturę, widmo absorpcyjne i znajomośd barw dopełniających możemy przewidzied jego barwę:
Widmo absorpcyjne karotenoidów i chlorofili
Na powyższym widmie zauważamy, że β-karoten absorbuje światło widzialne w zakresie 430 -550 nm, co
oznacza, że przepuszcza bądź odbija on wiązkę światła białego pozbawioną fal z tego zakresu, czyli pozbawionej
światła fioletowo-niebiesko-zielonego. Do oka obserwatora dochodzi więc mieszanina fal, które nie zostały
zaabsorbowane przez β-karoten. Obserwator odnosi wrażenie barwy czerwonej, która jest barwą dopełniającą
dla światła o barwie fioletowo-niebiesko-zielonej.
Instrukcja do dwiczeo:
Otrzymywanie (ekstrakcja) barwników roślinnych:
1. Przygotowad ekstrakty z następujących materiałów roślinnych: świeża nad pietruszki, liście mleczu, świerk
oraz przechowywane przez tydzieo igły świerku (temp. pokojowa, dostęp światła).
W tym celu:
Rozetrzed w moździerzu 1 g tkanki roślinnej w 3 ml acetonu schłodzonego do temp ~0°C. Zawiesinę acetonową
pozostawid na 2 minuty i ostrożnie zdekantowad do probówki osłoniętej folią aluminiową i przechowywad w
chłodnym miejscu.
Otrzymane w ten sposób ekstrakty analizowad za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.
Chromatograficzny rozdział barwników:
1. Przygotowad eluenty o następującym składzie objętościowym:
a) heksan
b) heksan: octan etylu 1,5:0,5 (v/v)
c) heksan: octan etylu 2: 1,5 (v/v)
i wypełnid nimi komory chromatograficzne na wysokośd ok 1 cm od dna. Pozostawid do ustalenia się warunków
w komorach.
2. Przygotowad 3 płytki o szerokości około 5 cm i długości 7 cm. W odległości około 1,5 cm od dołu delikatnie
zaznaczyd ołówkiem linię startu, na którą nanosid przy pomocy koocówki kapilarnej przygotowane ekstrakty
roślinne, w kolejności: nad pietruszki, mlecz, świerk, świerk tygodniowy. Po nałożeniu całej objętości odczekad
chwilę aż miejsce nakładania podeschnie, po czym nałożyd w to samo miejsce kolejną porcję barwnika.
Czynnośd powtórzyd 3-razy. Pozostawid płytkę do wyschnięcia na około 5 minut.
Wysuszoną płytkę wstawid pionowo do komory chromatograficznej wypełnionej eluentem (przygotowanym w
3
punkcie 2). Ilośd eluentu powinna sięgad poniżej poziomu naniesionych ekstraktów barwników (<1,5 cm ).
Przykryd naczynie. Rozdział chromatograficzny prowadzid aż do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika znajdzie
się 1-2 cm przed górną krawędzią płytki.
Uwaga: Nie należy pobrudzid, ani uszkodzid płytki; płytkę należy trzymad pincetą tylko za jej krawędź. Nakładad
kolejne objętości kapilary tak, by tworzący się na płytce ślad miał średnicę nie większą niż 5 mm.
3. Płytkę wyjąd z komory, pozostawid do wyschnięcia i zarejestrowad obraz chromatograficzny (za pomocą
aparatu). Obliczyd współczynniki podziału Rf dla każdej z substancji obecnej na chromatogramie.
Sprawozdanie powinno zawierad:
1.
2.
3.
4.
5.
Cel dwiczenia,
Wyniki analiz (chromatogramy) z wyliczonymi dla każdej substancji wartościami Rf.
W oparciu o barwę plam na chromatogramie zaproponowad widmo UV-Vis porównując z tymi, które
przedstawiono na rysunku. Uwzględniając powyższą charakterystykę UV-Vis określid ruchliwośd
poszczególnych barwników na chromatogramie i podjąd próbę ich identyfikacji.
Dokonad analizy jakościowej i półilościowej poszczególnych ekstraktów.
Porównad zastosowane eluenty i ocenid ich przydatnośd w prowadzonej analizie.
Zagadnienia na kartkówkę:
- materiał z części teoretycznej dwiczeo,
- chromatografia cienkowarstwowa TLC.