Autoreferat - WCh PWR - Politechnika Wrocławska

Dr Łukasz Berlicki
Zakład Chemii Bioorganicznej
Wydział Chemiczny
Politechnika Wrocławska
Autoreferat
1. Stopnie naukowe.
a. magister chemii — 2000, Uniwersytet Wrocławski, Wydział Chemii;
b. magister inŜynier informatyki — 2000, Politechnika Wrocławska, Wydział
Elektroniki;
c. doktor nauk chemicznych — 2004, Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny,
rozprawa pt.: „Projektowanie i synteza inhibitorów syntetazy glutaminy”, promotor
prof. Paweł Kafarski.
2. Zatrudnienie w jednostkach naukowych.
a. 2004-2006, asystent, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska;
b. Od 2006, adiunkt, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska.
3. Osiągnięcie wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach
naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr
65, poz. 595 ze zm.): Projektowanie i analiza zaleŜności struktura-aktywność
inhibitorów ureazy i syntetazy glutaminy.
3.1 Lista publikacji
nr
1
2
3
4
5
6
Artykuła
Berlicki, Ł.; Kafarski, P. Computer-aided analysis of the interactions of
glutamine synthetase with its inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14,
4578 - 4585.
Vassiliou, S.; Grabowiecka, A.; Kosikowska, P.; Yiotakis, A.;
Kafarski, P.; Berlicki, Ł. Design, synthesis and evaluation of novel
organophosphorus inhibitors of bacterial ureases. J. Med. Chem. 2008,
51, 5736 - 5744.
Berlicki, Ł. Inhibitors of glutamine synthetase and their potential
application in medicine. Mini-reviews Med. Chem. 2008, 8, 869 - 878.
Vassiliou, S.; Kosikowska, P.; Grabowiecka, A.; Yiotakis, A.;
Kafarski, P.; Berlicki, Ł. Computer-aided optimization of phosphinic
inhibitors of bacterial ureases. J. Med. Chem. 2010, 53, 5597 - 5606.
Occhipinti, A.; Berlicki, Ł.; Giberti, S.; Dziędzioła, G.; Kafarski, P.;
Forlani, G. Effectiveness and mode of action of phosphonate inhibitors
of plant glutamine synthetase. Pest Manag. Sci. 2010, 66, 51 - 58.
Mucha, A.; Kafarski, P.; Berlicki, Ł. Remarkable potential of the
alpha-aminophosphonate/phosphinate structural motif in medicinal
chemistry. J. Med. Chem. 2011, 54, 5955 - 5980.
1
IFb
2.624
4.898
3.132
5.207
2.313
5.207
7
8
9
Kosikowska, P.; Berlicki, Ł. Urease inhibitors as potential drugs for
gastric and urinary tract infections: A patent review. Expert Opin. Ther.
Pat. 2011, 21, 945 - 957.
Berlicki, Ł.; Bochno, M.; Grabowiecka, A.; Białas, A.; Kosikowska,
P.; Kafarski, P. N-Substituted aminomethanephosphonic and
aminomethane-P-methylphosphinic acids as inhibitors of ureases.
Amino Acids 2012, DOI: 10.1007/s00726-011-0920-4.
Vassiliou, S.; Grabowiecka, A.; Kosikowska, P.; Berlicki, Ł. Three
component Kabachnik-Fields condensation leading to substituted
aminomethane-P-hydroxymethylphosphonic acids as a tool for
screening of bacterial urease inhibitors ARKIVOC 2012, 33 - 43.
SUMA
2.412
4.106
1.096
30.995
a
Autor do korespondencji („z gwiazdką”) został podkreślony.
b
Impact factor (wg listy Journal Citation Reports) podany jest dla roku opublikowania artykułu. Artykułom z roku
2011 i 2012 został przypisany Impact Factor z roku 2010.
3.2 Omówienie celu naukowego wyŜej wymienionych prac i osiągniętych wyników wraz
z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.
Cel naukowy pracy. Ureaza i syntetaza glutaminy są waŜnymi enzymami metabolizmu
azotu. Ureaza katalizuje hydrolizę mocznika do amoniaku i kwasu karbaminowego, który
rozpada się spontanicznie dając kolejną cząsteczkę amoniaku i dwutlenek węgla (Rysunek
1).1 Następnie wolny amoniak moŜe być wprowadzony do połączeń organicznych przez
syntetazę glutaminy, która katalizuje reakcję syntezy glutaminy z kwasu glutaminowego i
jonu amonowego przy udziale ATP.2
Rysunek 1. Reakcje katalizowane przez ureazę (a) i syntetazę glutaminy (b).
Warto zauwaŜyć, Ŝe ureaza katalizuje reakcję hydrolizy wiązania amidowego, natomiast
syntetaza glutaminy reakcję syntezy wiązania amidowego, tak więc stany przejściowe tych
reakcji enzymatycznych mają analogiczną tetraedryczną strukturę. W obu przypadkach wiąŜe
się z tym moŜliwość zastosowania kwasów fosfonowych i fosfinowych jako inhibitorów
1
Mobley, H.L.; Hausinger, R.P. Microbial ureases: significance, regulation, and molecular characterization.
Microbiol. Rev. 1989, 53, 85 - 108.
2
Eisenberg, D.; Gill, H.S.; Pfluegl, G.M.; Rotstein, S.H. Structure-function relationships of glutamine synthetases.
Biochim. Biophys. Acta 2000, 1477, 122 - 145.
2
będących
analogami
tetraedrycznego
stanu
przejściowego
reakcji
enzymatycznej.3
Dodatkowo, w centrach aktywnych obu enzymów znajdują się jony metali (niklu w
przypadku ureazy i magnezu lub manganu w przypadku syntetazy glutaminy), co pozwala na
wykorzystanie właściwości kompleksujących wyŜej wymienionych klas związków w
konstrukcji odpowiednich ligandów. Celem niniejszej pracy było opracowanie nowych,
skutecznych inhibitorów obu enzymów w oparciu o znane struktury krystaliczne białek i
metody modelowania molekularnego. Komputerowo wspomagana analiza zaleŜności
struktura-aktywność i wskazanie kluczowych oddziaływań enzym-inhibitor umoŜliwiła
zrozumienie molekularnych podstaw biologicznej aktywności badanych związków.
Wyniki. Rozwijając tematykę doktoratu prowadziłem prace nad fosforoorganicznymi
inhibitorami syntetazy glutaminy. Na początku dokonałem szczegółowej analizy wiązania
szeregu znanych inhibitorów tego enzymu do miejsca aktywnego.4 Na podstawie struktury
krystalicznej syntetazy glutaminy z Mycobacterium tuberculosis w kompleksie z
fosforylowaną formą jednego z najaktywniejszych inhibitorów — sulfoksyiminy metioniny,5
zadokowałem szereg innych znanych inhibitorów i zoptymalizowałem struktury tych
kompleksów. PoniewaŜ część inhibitorów jest fosforylowana w miejscu aktywnym enzymu
przy udziale ATP, analizowałem obie moŜliwe formy (z/bez przyłączonej grupy
fosforanowej). Wykazałem dobrą korelację pomiędzy aktywnością zmierzoną a obliczoną
przy pomocy szeregu róŜnych funkcji oceniających (LUDI, D_SCORE, PMF_SCORE,
G_SCORE, CHEMSCORE). Co waŜne, udowodniłem, Ŝe oszacowanie aktywności
inhibitorowej jest znacznie lepsze, jeŜeli analizujemy fosforylowaną formę inhibitorów.
Dodatkowo pokazałem, Ŝe rozkład potencjału elektrostatycznego na powierzchni ligandów
jest silnie skorelowany z ich powinowactwem do enzymu.
Pomimo, Ŝe badania inhibitorów syntetazy glutaminy mają bardzo długą historię,6 do roku
2000 obejmowały one wyłącznie analogi kwasu glutaminowego.7 JednakŜe, związki z tej
klasy nie wykazują wysokiej selektywności pomiędzy enzymami z róŜnych organizmów, ze
Mucha, A.; Kafarski, P.; Berlicki, Ł. Remarkable potential of the α-aminophosphonate/phosphinate structural
motif in medicinal chemistry. J. Med. Chem. 2011, 54, 5955 - 5980.
4
Berlicki, Ł.; Kafarski, P. Computer-aided analysis of the interactions of glutamine synthetase with its inhibitors.
Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 4578 - 4585.
5
Krajewski, W.W.; Jones, A.T.; Mowbray, S.L. Structure of Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase in
complex with a transition-state mimic provides functional insights. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2005, 102, 10499 10504.
6
Mastalerz, P. Inhibition of glutamine synthetase by phosphonic analogues of glutamic acid. Arch. Imm. Ter.
Dośw. 1959, 7, 201 - 210.
7
Berlicki, Ł. Inhibitors of glutamine synthetase and their potential application in medicine. Mini-reviews Med.
Chem. 2008, 8, 869 - 878.
3
3
względu na wysoką konserwatywność miejsca wiązania glutaminianu. Co ciekawe, pierwsze
doniesienie opisujące inhibitory syntetazy glutaminy spoza tej grupy struktur dotyczyło
aminometylenobisfosfonianów.8 Dlatego teŜ aminometylenobisfosfoniany wydają się być
bardzo obiecującą klasą inhibitorów analizowanego enzymu, jednakŜe sposób ich wiązania,
nie został w pełni wyjaśniony. Aby zbadać zaleŜność struktura-aktywność zaprojektowałem
serię analogów najaktywniejszego związku z tej grupy — kwasu 3,5-dichlorofenyloaminometylenobisfosfonowego. Modyfikacje dotyczyły zarówno fragmentu aromatycznego
jak i szkieletu aminometylenobisfosfonowego.9 Badania kinetyczne przeprowadzono w grupie
prof. Giuseppe Forlaniego (Uniwersytet w Ferrarze, Włochy) względem enzymu
wyizolowanego z kukurydzy zwyczajnej (Zea mays), dla którego znana jest struktura
krystaliczna syntetazy glutaminy.10 Dla wysokiej aktywności inhibitorowej niezbędna okazała
się obecność obu grup fosfonowych (analogiczne α-aminofosfoniany i α-hydroksyfosfoniany
wykazywały niską aktywność). RóŜnice w
podstawieniu pierścienia aromatycznego nie
miały natomiast znaczącego wpływu na
właściwości
inhibitorowe.
Obserwowane
zaleŜności struktura-aktywność były w pełni
zgodne
z
wymodelowaną
struktura
kompleksu bisfosfonian-syntetaza glutaminy
(Rysunek 2), która wskazuje na kluczową rolę
oddziaływań obu grup fosfonowych z jonami
metalu obecnymi w miejscu aktywnym,
natomiast aromatyczny podstawnik dobrze
wpasowuje się we wnękę enzymu.
Rysunek 2. Wymodelowana struktura kompleksu
kwasu
3,5-dichlorofenyloaminometylenobisfosfonowego i syntetazy glutaminy (Zea mays).
Głównym nurtem moich badań od roku 2006 jest rozwój fosforoorganicznych inhibitorów
ureazy. Pomimo waŜnych moŜliwości zastosowania tej grupy inhibitorów (terapeutyki w
leczeniu infekcji dróg moczowych i Ŝołądka) i wieloletnich badań, nie znaleziono grupy
8
Forlani, G.; Lejczak, B.; Kafarski, P. The herbicidally active compound N-2-(5-chloro-pyridyl) aminomethylene
bisphosphonic acid acts by inhibiting both glutamine and aromatic amino acid biosynthesis. Aust. J. Plant.
Physiol. 2000, 27, 677 - 683.
9
Occhipinti, A.; Berlicki, Ł.; Giberti, S.; Dziędzioła, G.; Kafarski, P.; Forlani, G. Effectiveness and mode of action
of phosphonate inhibitors of plant glutamine synthetase. Pest Manag. Sci. 2010, 66, 51 - 58.
10
Unno, H.; Uchida, T.; Sugawara, H.; Kurisu, G.; Sugiyama, T.; Yamaya, T.; Sakakibara, H.; Hase, T.; Kusunoki,
M. Atomic structure of plant glutamine synthetase: a key enzyme for plant productivity. J. Biol. Chem. 2006,
281, 29287 - 29296.
4
związków o optymalnych właściwościach.11 Jedyny inhibitor ureazy obecny na rynku
farmaceutycznym — kwas acetohydroksamowy charakteryzuje się umiarkowaną aktywnością
i powaŜnymi efektami ubocznymi.12 Natomiast najaktywniejsze znane inhibitory tego enzymu
— fosforodiamidy mają zbyt niską stabilność hydrolityczną.13 Dlatego teŜ zaproponowałem
hydrolitycznie stabilne analogi fosforodiamidów — kwasy aminofosfinowe, które zawierają
inertne wiązanie P-C w miejscu labilnego połączenia P-N. Zaplanowane związki są
rozszerzonymi analogami stanu przejściowego reakcji enzymatycznej opartymi na szkielecie
strukturalnym kwasu aminometano-P-metylofosfinowego (Rysunek 3).
Rysunek 3. Porównanie klasycznych i rozszerzonych analogów stanu przejściowego.
W pierwszej części badań analizowałem moŜliwości optymalizacji grupy aminowej związku
wiodącego.14 UŜywając komputerowo wspomaganych metod zaprojektowałem szereg
struktur potencjalnych inhibitorów, w tym pochodnych N-alkilowych i dipeptydowych.
Związki te zostały otrzymane we współpracy z zespołem prof. Athanasiosa Yiotakisa z
Uniwersytetu Ateńskiego (dr Stamatia Vassiliou). Badania kinetyczne względem enzymów
bakteryjnych (dr Agnieszka Grabowiecka i mgr Paulina Kosikowska) wykazały wysoką
aktywność inhibitorową otrzymanych struktur potwierdzając słuszność załoŜeń projektowych.
Wymodelowanie struktur kompleksów enzym-inhibitor pozwoliło na przeprowadzenie
szczegółowej analizy zaleŜności struktura-aktywność. Najciekawsze okazało się porównanie
stałych inhibicji związków z wzrastającą liczbą podstawników N-metylowych.15 Okazało się,
11
a) Kosikowska, P.; Berlicki, Ł. Urease inhibitors as potential drugs for gastric and urinary tract infections: A
patent review. Expert Opin. Ther. Pat. 2011, 21, 945 - 957. b) Amtul, Z.; Atta-ur-Rahman; Siddiqui, R. A.;
Choudhary, M. I. Chemistry and mechanism of urease inhibition. Curr. Med. Chem. 2002, 9, 1323 - 1348.
12
a) Bailie, N. C.; Osborne, C. A.; Leininger, J. R.; Fletcher, T. F.; Johnston, S. D.; Ogburn, P. N.; Griffith D. P.
Teratogenic effect of acetohydroxamic acid in clinically normal beagles. Am. J. Vet. Res. 1986, 47, 2604 - 2611.
b) Griffith, D.P.; Gleeson, M.J.; Lee, H.; Longuet, R.; Deman, E.; Earle, N. Randomized, double-blind trial of
Lithostat (acetohydroxamic acid) in the palliative treatment of infection-induced urinary calculi. Eur. Urol. 1991,
20, 243 - 247.
13
Pope, A. J.; Toseland, C. D.; Rushant, B.; Richardson, S.; McVey, M.; Hills, J. Effect of potent urease inhibitor,
fluorofamide, on Helicobacter sp. in vivo and in vitro. Dig. Dis. Sci. 1998, 43, 109 - 119.
14
Vassiliou, S.; Grabowiecka, A.; Kosikowska, P.; Yiotakis, A.; Kafarski, P.; Berlicki, Ł. Design, synthesis and
evaluation of novel organophosphorus inhibitors of bacterial ureases. J. Med. Chem. 2008, 51, 5736 - 5744.
15
Berlicki, Ł.; Bochno, M.; Grabowiecka, A.; Białas, A.; Kosikowska, P.; Kafarski, P. N-Substituted
aminomethanephosphonic and aminomethane-P-methylphosphinic acids as inhibitors of ureases. Amino Acids
2012, DOI: 10.1007/s00726-011-0920-4.
5
Ŝe róŜnica energii swobodnej wiązania (∆∆G) inhibitorów róŜniących się jedną grupą
metylową (pochodna niepodstawiona względem N-metylowej i N-metylowa względem N,Ndimetylowej) jest zbliŜona do energii wiązania wodorowego (odpowiednio 1.7 oraz 2.0
kcal/mol). Stwierdziłem, Ŝe w kaŜdym z 3 przypadków tworzone jest jedno wiązanie
wodorowe pomiędzy grupą aminową a enzymem, a róŜnice w aktywności wynikają z
konieczności zerwania odpowiednio róŜnej liczby wiązań wodorowych z rozpuszczalnikiem
w procesie wiązania się liganda do miejsca aktywnego. Ostatecznie, najaktywniejszym
znalezionym związkiem z tej grupy był kwas N,N-dimetyloaminometano-P-metylofosfinowy
(Ki = 0.62 µM, rysunek 4).
Rysunek 4. Struktury najaktywniejszych inhibitorów z omawianych grup wraz z stałymi inhibicji względem ureazy
z Bacillus pasteurii.
W celu zwiększenia energii oddziaływania badanych związków z jonami niklu obecnymi w
miejscu aktywnym ureazy, wprowadzony został atom siarki do struktury grupy fosfinowej.
Najaktywniejszym
otrzymanym
związkiem
z
tej
grupy
był
kwas
N-
benzyloksykarbonyloglicyloaminometano-P-metylotiofosfinowy (Ki = 170 nM, Rysunek 4).
Przebadane zostały takŜe analogiczne do P-metylofosfinianów, N-podstawione kwasy
aminometanofosfonowe. W tej serii takŜe związek N,N-dimetylowy okazał się być
najaktywniejszy (Ki = 13 µM względem enzymu z B. pausteurii). Warto jednak zwrócić
uwagę, Ŝe jego aktywność była o ponad rząd słabsza niŜ w przypadku analogicznego związku
P-metylowego (Ki = 0.62 µM), co pokazuje, Ŝe P-metylofosfiniany są bliŜszymi analogami
stanu przejściowego reakcji enzymatycznej.
6
Następnym etapem optymalizacji badanej klasy
inhibitorów
było
zastąpienie
P-metylowej,
podstawnikiem
grupy
P-hydroksy-
metylowym.16 Ta modyfikacja, znaleziona przy
uŜyciu programu LUDI, dawała moŜliwość
tworzenia dodatkowego wiązania wodorowego
w kompleksie inhibitor-enzym,
przez
powinno
aktywność
znacząco
nowych
inhibitorową
niepodstawionego
kwasu
zwiększać
związku
struktur.
wiodącego
co
Dla
—
aminometano-P-hydroksymetylo-
Rysunek 5. Wymodelowana struktura kompleksu
ureazy
z
kwasem
N-metyloaminometano-Phydroksymetylofosfinowym.
fosfinowego stała inhibicji była ponad rząd mniejsza niŜ dla analogicznego związku z grupą
P-metylową (Ki = 27.5 µM względem Ki = 425 µM dla enzymu z P. vulgaris).
Zaprojektowałem szereg N-podstawionych pochodnych, z których najaktywniejszy zbadany
związek (kwas N-metyloaminometano-P-hydroksymetylofosfinowy, Rysunki 4 i 5) miał stałą
inhibicji Ki = 430 nM. Co ciekawe, przebadanie zarówno róŜnorodnych podstawień atomu
węgla grupy hydroksymetylowej jak i grupy aminowej nie pozwoliło na
zwiększenie
aktywności inhibitorowej (Ki powyŜej 90 µM).17 Jest to najprawdopodobniej związane z
bardzo ograniczoną objętością miejsca aktywnego.
Ewentualne wykorzystanie wyników. Ze względu na rolę obu enzymów w metabolizmie
azotu, ich inhibitory znajdują szereg waŜnych i ciekawych zastosowań. UŜycie inhibitorów
syntetazy glutaminy jako herbicydów totalnych, znane od wielu lat, było głównym
czynnikiem stymulującym ich rozwój w XX wieku.18 Badania te doprowadziły do
komercjalizacji fosfinotricyny, jednego z najsilniejszych znanych inhibitorów tego enzymu.
W ostatnich latach wykazano moŜliwość zastosowania tej grupy związków w leczeniu
gruźlicy, poprzez specyficzne dla patogena hamowanie budowy struktury poli-glutaminianglutamina
w
ścianie
komórkowej.19
Badane
16
w
ramach
moich
prac
Vassiliou, S.; Kosikowska, P.; Grabowiecka, A.; Yiotakis, A.; Kafarski, P.; Berlicki, Ł. Computer-aided
optimization of phosphinic inhibitors of bacterial ureases. J. Med. Chem. 2010, 53, 5597 - 5606.
17
Vassiliou, S.; Grabowiecka, A.; Kosikowska, P.; Berlicki, Ł. Three component Kabachnik-Fields condensation
leading to substituted aminomethane-P-hydroxymethylphosphonic acids as a tool for screening of bacterial
urease inhibitors. ARKIVOC 2012, 33 - 43.
18
Evstigneeva, Z. G.; Solov'eva, N. A.; Sidel'nikova, L. I. Methionine sulfoximine and phosphinothrycin: a review
of their herbicidal activity and effects on glutamine synthetase. Appl. Biochem. Microbiol. 2003, 39, 539 - 543.
19
Harth, G.; Horwitz, M.A. Inhibition of Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase as a novel antibiotic
strategy against tuberculosis: demonstration of efficacy in vivo. Infect. Immun. 2003, 71, 456 - 464.
7
aminometylenobisfosfoniany wykazywały właściwości herbicydowe (testy przeprowadzone
w grupie prof. Giuseppe Forlaniego). Natomiast właściwości hamowania syntetazy glutaminy
z Mycobacterium tuberculosis są obecnie testowane w Zakładzie Chemii Bioorganicznej
przez mgr Paulinę Kosikowską — wstępne wyniki są bardzo obiecujące.
W przypadku ureazy udowodniono jej kluczową rolę w infekcjach układu pokarmowego
przez Helicobacter pylori oraz układu moczowego przez bakterie Proteus.20 Aktywność
zewnątrzkomórkowej ureazy Helicobacter pylori powoduje znaczące zwiększenie pH
otoczenia patogenu i umoŜliwia mu kolonizację Ŝołądka. Powstający amoniak niszczy
nabłonek i przyczynia się do powstawania wrzodów Ŝołądka. Wykazano, Ŝe zastosowanie
inhibitorów ureazy skutecznie hamuje rozwój tego patogenu. Część bakterii infekujących
układ moczowy (np.: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris) wykazuje wysoką aktywność
ureolityczną. To powoduje zwiększenie pH moczu i bardzo szybkie powstawanie kamieni
moczowych. TakŜe w tym przypadku wykazano, Ŝe zastosowanie inhibitorów ureazy hamuje
niekorzystny proces alkalizacji moczu. Kolejnym problemem związanym z aktywnością
ureazy jest szybki mikrobiologiczny rozkład mocznika zawartego w nawozach mineralnych.
Wykazano, Ŝe dodatek inhibitorów ureazy efektywnie spowalnia ten proces i zwiększa
skuteczność nawoŜenia. We wszystkich wyŜej opisanych przypadkach, kluczowe jest
opracowanie wysokoaktywnych i hydrolitycznie stabilnych inhibitorów ureazy. Część
związków opisanych w przedstawionych pracach wydaje się być dobrymi kandydatami do
dalszych badań w tych kierunkach. Niektóre z otrzymanych związków zostały juŜ przebadane
jako dodatki do nawozów sztucznych zawierających mocznik — badania prowadzono we
współpracy z Instytutem Nawozów Sztucznych w Puławach (zespół prof. Andrzeja
Winiarskiego). Ze względu na trudności syntetyczne otrzymania multigramowych ilości
niektórych inhibitorów, przetestowano tylko związki o średniej aktywności. Pomimo to, udało
się wykazać ich skuteczność w hamowaniu mikrobiologicznego rozkładu mocznika w glebie,
chociaŜ wcześniej znany n-butylotiofosforotriamid okazał się wydajniejszy.
20
Burne, R. A.; Chen, Y. M. Bacterial ureases in infectious diseases. Microb. Infect. 2000, 2, 533 - 542.
8
4. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
Dyskryminatory chiralności. Wieloletni projekt poszukiwania nowych metod analizy składu
enancjomerycznego przy uŜyciu spektroskopii NMR i analiza molekularnych podstaw
procesów enancjodyskryminacji zaowocował szeregiem ciekawych wyników (we współpracy
z dr Ewą Rudzińską). Udało się opracować prostą, szybką i powtarzalną metodę oznaczania
składu enancjomerycznego szeregu róŜnych pochodnych kwasów fosfonowych (kwasy
aminofosfonowe,21
N-benzyloksykarbonyloaminofosfonowe,22
hydroksyfosfonowe23)
z
uŜyciem cyklodekstryn. Co waŜne, metodologia ta jest obecnie rutynowo stosowana w
róŜnych projektach badawczych.24 Dodatkowo przebadaliśmy moŜliwość uŜycia chininy i jej
pochodnych (karbamoilowych i fosforanowych) do enancjoróŜnicowania róŜnych grup
związków, a w szczególności aminokwasów karboksylowych i fosfonowych i ich
pochodnych.25 We wszystkich przypadkach analizowano sposób oddziaływania liganda z
chiralnym związkiem solwatującym (cyklodekstryną lub chininą). W niektórych przypadkach
zbadaliśmy zaleŜność od pH roztworu i udowodniliśmy, Ŝe oddziaływanie z cyklodekstryną
moŜe róŜnicować pKa grup fosfonowych poszczególnych enancjomerów, co dodatkowo
zwiększa efekt enancjodyskryminacji obserwowany na widmie
Natomiast
w
badaniach
dotyczących
21
31
P NMR dla pH ≈ pKa.26
9-O-dietylofosforylochininy
i
9-O-
Berlicki, Ł.; Rudzińska, E.; Kafarski, P. Enantiodifferentiation of aminophosphonic and aminophosphinic acids
with α- and β-cyclodextrins. Tetrahedron-Asymmetry 2003, 14, 1535 - 1539.
22
a) Berlicki, Ł.; Rudzinska, E.; Mucha, A.; Kafarski, P. Cyclodextrins as NMR probes in the study of the
enantiomeric compositions of N-benzyloxycarbonylamino-phosphonic and phosphinic acids. TetrahedronAsymmetry 2004, 15, 1597 - 1602. b) Rudzińska, E.; Berlicki, Ł.; Mucha, A.; Kafarski, P. Chiral discrimination of
ethyl and phenyl N-benzyloxycarbonyl-aminophosphonates by cyclodextrins. Tetrahedron Asymmetry 2007, 18,
1579 - 1584.
23
Rudzińska, E.; Dziędzioła, G.; Berlicki, Ł.; Kafarski, P. Enantiodifferentiation of α–hydroxyalkanephosphonic
31
acids in P NMR with application of α–cyclodextrin as chiral discriminating agent. Chirality 2010, 22, 63 - 68.
24
a) Brzezińska-Rodak, M.; Klimek-Ochab, M.; Żymańczyk-Duda E.; Kafarski, P. Biocatalytic resolution of
enantiomeric mixtures of 1-aminoethanephosphonic acid. Molecules 2011, 16, 5896 - 5904. b) Błażewska, K.M.;
Ni, F.; Haiges, R.; Kashemirov, B.A.; Coxon, F.P.; Stewart, C.A.; Baron, R.; Rogers, M.J.; Seabra, M.C.; Ebetino,
F.H.; McKenna, C.E. Synthesis, stereochemistry and SAR of a series of minodronate analogues as RGGT
inhibitors Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 4820-4826. c) Molaabasi, F.; Talebpour, Z. Enantiomeric discrimination
and quantification of the chiral organophosphorus pesticide fenamiphos in aqueous samples by a novel and
31
selective P nuclear magnetic resonance spectroscopic method using cyclodextrins as chiral selector. J. Agric.
Food Chem. 2011, 59, 803-808.
25
a) Rudzińska, E.; Berlicki, Ł.; Kafarski, P.; Lämmerhofer, M.; Mucha, A. Cinchona alkaloids as privileged chiral
solvating agents for enantiodiscrimination of N-protected aminoalkanephosphonates - a comparative NMR
study. Tetrahedron Asymmetry 2009, 20, 2709 - 2714. b) Górecki, Ł.; Berlicki, Ł.; Mucha, A.; Kafarski, P.;
Ślepokura, K.; Rudzińska-Szostak, E. Phosphorylation as a method of tuning the enantiodiscrimination potency
of quinine – an NMR Study. Chirality 2012, 24, 318 - 328.
26
Rudzińska, E.; Berlicki, Ł.; Mucha, A.; Kafarski, P. Analysis of pD dependent complexation of Nbenzyloxycarbonylaminophosphonic acids by α-cyclodextrin. Enantiodifferentation of phosphonic acid pKa
values. Chirality 2007, 19, 764 - 768.
9
difenylofosforylochininy pokazaliśmy, Ŝe dla pomiarów przeprowadzonych w temperaturze
180 K, moŜliwe jest obserwowanie poszczególnych kompleksów diastereomerycznych Ofosforylowana chinina — N-podstawiony aminokwas na widmie 31P NMR, co moŜe ułatwiać
analizę w przypadku analitów nie zawierających atomu fosforu.
Inhibitory
reduktazy
kwasu
pirolino-5-karboksylowego
(P5CR).
Kwasy
aminometylenobisfosfonowe okazały się takŜe dobrymi inhibitorami jednego z waŜnych
enzymów metabolizmu proliny. Badania kinetyczne przeprowadzone w grupie prof. Giuseppe
Forlaniego (Uniwersytet w Ferrarze, Włochy) względem enzymu wyizolowanego z
Arabidopsis thaliana wykazały, Ŝe niektóre z badanych pochodnych wykazują aktywność
inhibitorową w zakresie mikromolarnym (Ki = 10.3 µM dla najaktywniejszego związku).27
Pomimo nieobecności jonów metali w centrum aktywnym P5CR, które są najczęściej
rozwaŜane jako główne elementy strukturalne odpowiedzialne za wiązanie bisfosfonianów,
dokowanie wybranych pochodnych do miejsca aktywnego wykazało dobre dopasowanie
inhibitora do enzymu. Następnie w współpracy z dr Bogusławem Nockiem (zespół prof.
Andrzeja Joachimiaka, Argonne National Laboratory, USA), rozszerzyliśmy projekt na
badania enzymu bakteryjnego (białko rekombinowane z Streptococcus pyogenes).28 W tym
przypadku powinowactwo aminometylenobisfosfonianów do P5CR okazało się jeszcze
wyŜsze (Ki = 110 nM dla najaktywniejszej pochodnej), co skłoniło nas do badań in vivo.
Wykazano, Ŝe zastosowanie badanych pochodnych hamuje wzrost patogennych bakterii
(Streptococcus pyogenes), co wykazuje na moŜliwość stworzenia zupełnie nowej strategii
antybiotykowej opartej na hamowaniu szlaku biosyntezy proliny.
Foldamery. W ramach staŜu odbytego w grupie prof. Oliviera Reisera na Uniwersytecie w
Ratyzbonie (Niemcy) zajmowałem się badaniami peptydów zawierających strukturalnie
usztywnione reszty aminokwasowe. Zaprojektowałem i otrzymałem serię peptydów
zawierających resztę kwasu cis-2-aminocyklopentanokarboksylowego w kombinacji z
27
Forlani, G.; Giberti, S.; Berlicki, Ł.; Petrollino, D.; Kafarski, P. Plant P5C reductase as a new target for
aminomethylenebisphosphonates. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4340 - 4347.
28
1
Forlani, G.; Petrolino, D.; Fusetti M.; Romanini, L.; Nocek, B.; Joachimiak, A.; Berlicki, Ł.; Kafarski, P. δ Pyrroline-5-carboxylate reductase as a new target for therapeutics: inhibition of the enzyme from
Streptococcus pyogenes and effects in vivo. Amino Acids 2012, DOI: 10.1007/s00726-011-0970-7.
10