Ćwiczenie nr 1,2 BADANIE ZDOLNOŚCI UTLENIANIA SIARKI

Ćwiczenie nr 1,2 BADANIE ZDOLNOŚCI UTLENIANIA SIARKI

Ćwiczenie nr 1,2
dr Sławomir Wierzba, dr Teresa Farbiszewska
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytetu Opolskiego
BADANIE ZDOLNOŚCI UTLENIANIA SIARKI PRZEZ BAKTERIE
ACIDITHIOBACILLUS THIOXIDANS
I. Charakterystyka mikrobiologiczna bakterii Acidithiobacillus thiooxidans.
Gramujemne bakterie wyodrębnione przez Waksmana i Joffa w 1922r. Kształt pałeczek o rozmiarach 0,5-0,8
µm x 1-2µm z jedną polarną spiralną rzęską. Są typowymi chemoautotrofami. Źródłem energii, potrzebnej w
procesie wiązania i redukcji CO2, jest dla At. thiooxidans głównie proces utleniania siarki do kwasu siarkowego:
2 S° + 3 O2 + 2 H2O →2 H2SO4
Rozwój bakterii At. thiooxidans przebiega w pożywce o pH = 1,5-4,8, przy optymalnym pH = 2,5. Nie giną
nawet w 2N roztworze H2SO4. Giną natychmiast, jeżeli wilgotność środowiska spada poniżej 2,8%. Są
organizmami silnie aerobowymi.
II. Hodowla bakterii At. thiooxidans.
Hodowlę prowadzi się w pożywce Waksmana o składzie:
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4 x 7H2O
CaCl2 x 6H2O
H2O
- 0,2 g
- 3,0 g
- 0,5 g
- 0,25 g
- 1000 cm3
S0
- 10 g
Pożywkę (bez siarki) sterylizuje się w autoklawie w temp. 120ºC przez 20 min.
Siarkę sterylizuje się alkoholem etylowym.
III. Mechanizm utleniania siarki przez bakterie At. thiooxidans.
Proces ten jest stosunkowo mało poznany. Bierze w nim udział układ cytochromowy, a uwalniana energia
jest magazynowana w ATP. Powszechnie uważa się, że utlenianie siarki zachodzi w bezpośrednim kontakcie
komórki bakterii z materiałem. Przez dłuższy czas nie był wyjaśniony fakt, czy proces zachodzi wewnątrz komórki,
czy poza nią. Wiadomo, że aby organizm wykorzystał energię reakcji egzotermicznej, musi ona zachodzić
wewnątrzkomórkowo, zaś siarka jest nierozpuszczalna w wodzie i ektoenzym nie może jej rozpuścić.
Wg Piwowarskiej komórka At. thiooxidans otoczona jest trójwarstwową błoną, przez którą siarka może przenikać.
W komórce stwierdzono obecność ziarenek lipidowych, zlokalizowanych bezpośrednio przy błonie
cytoplazmatycznej. Bakteria przylega ściśle do drobiny siarki, która styka się bezpośrednio z ziarnem lipidowym
cytoplazmy. Siarka jest rozpuszczalna w tłuszczach, wnika więc do ziarna lipidowego, po czym utlenianie siarki
następuje już wewnątrz komórki.
IV. Wykonanie ćwiczenia.
1. Do dwóch sterylnych kolb o poj. 250-300 cm³ wlać po 100 cm³ jałowej pożywki Waksmana, oraz zważyć i
dodać do każdej kolby po 1,0 g wysterylizowanej siarki.
Do rozlewania pożywki do kolb używać cylindrów miarowych.
2. Do jednej z kolb wprowadzić 2 cm³ aktywnej hodowli bakterii At. thiooxidans - HODOWLA. Do drugiej
kolby, ZAMIAST BAKTERII, dodać niewielką ilość sproszkowanego tymolu - KONTROLA.
Do pobierania hodowli bakteryjnej używać sterylnych pipet.
Kolby zatkać korkami z waty lub ligniny.
Ćwiczenie nr 1,2
dr Sławomir Wierzba, dr Teresa Farbiszewska
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytetu Opolskiego
3. Opisać kolby markerem wg wzoru:
HODOWLA: imię i nazwisko; nr grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli; rodzaj użytych
bakterii.
KONTROLA: imię i nazwisko; numer grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli.
4. Zmierzyć wartość pH w obydwu kolbach. Pomiar powtórzyć po około 15 minutach. Do obliczeń wyniki
pomiarów pH hodowli – uśrednić. To samo postąpić w przypadku wyników dwóch pomiarów próby
kontrolnej. Jeżeli zachodzi taka konieczność należy przed pomiarem wykalibrować pH-metr w
ROZTWORZE BUFOROWYM dostarczonym przez prowadzącego.
5. Po wykonaniu pomiarów, opisane kolby odstawić na miejsce wskazane przez prowadzącego.
6. Pomiary powtórzyć po tygodniu. Po zakończeniu ćwiczenia należy umyć używane szkło laboratoryjne.
Wyniki muszą być podpisane przez prowadzącego. Dopiero po ich zaakceptowaniu można wylać
zawartość kolb i umyć je.
7. Sporządzić 200 cm3 pożywki Waksmana (bez siarki) i przygotować kolbę z pożywką do wyjałowienia.
Sprawozdanie do ćwiczenia:
8. Przestawić na wykresie zmianę kwasowości (pH) hodowli i układu kontrolnego.
9. Ze zmian pH układów i na podstawie równania reakcji utleniania siarki
2 S° + 3 O2 + 2 H2O →2 H2SO4
obliczyć: zawartości jonów wodorowych w hodowli i kontroli w pierwszym i ostatnim dniu trwania
doświadczenia, ilość utlenionej przez bakterie siarki i ilość wytworzonego kwasu siarkowego.
V. Zagadnienia teoretyczne:
1. Charakterystyka bakterii At. thiooxidans.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Autotrofizm.
Chemosynteza.
Sposoby odżywiania bakterii.
Mechanizm utleniania siarki.
Organizmy aerobowe.
Kwasowość roztworów.
Obliczanie pH roztworów.
Obliczanie stężenia jonów wodorowych, mając dane pH roztworów.
VI. Literatura:
1. Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998
2. Russel S.; Biotechnologia; Wyd. PWN; Warszawa; 1990
3. Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
4. Ostrowski M., Sokołowska A., Małe bakterie wielka miedź – czytelnia (B.W. ul. Oleska).